KR102639552B1

KR102639552B1 - 구리염을 이용한 재조합 혈장 단백질의 생산 방법

Info

Publication number: KR102639552B1
Application number: KR1020230104175A
Authority: KR
Inventors: 임진혁; 한성혁; 양정은
Original assignee: 주식회사 녹십자
Priority date: 2023-08-09
Filing date: 2023-08-09
Publication date: 2024-02-26
Anticipated expiration: 2043-08-09

Abstract

본 발명은 재조합 혈장 단백질의 단량체 함량 증진용 조성물 및 이를 이용한 단량체 함량 증진 방법에 관한 것이다. 본 발명은 혈장 단백질, 구체적으로는 ADAMTS13 단백질을 발현하는 숙주세포 배양액에 적정 농도의 구리염, 구체적으로는 30 내지 1000 μM의 황산제이구리(CuSO₄)를 첨가하는 간단한 공정만으로도 ADAMTS13 단백질의 응집을 억제하고 단량체 함량을 현저하게 증가시킴으로써 치료적 유효량의 활성 단백질을 용이하게 수득할 수 있다. 이에, 본 발명은 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP)을 비롯, 대부분이 난치성 희귀질환인 다양한 ADAMTS13 기능이상 질환에 대한 효과적인 단백질의 효율적인 재조합적 생산 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

구리염을 이용한 재조합 혈장 단백질의 생산 방법{A Method for Producing a Recombinant Serum Proten Using Copper salt}

본 발명은 구리염, 구체적으로는 황산제이구리(CuSO₄)를 숙주 세포의 배양액에 첨가함으로써 재조합적으로 생산되는 혈장 단백질의 응집을 방지하고 단량체 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

치료용 단백질을 재조합적으로 대량 생산하기 위해서는 포유류 세포 등의 숙주 세포가 효율적으로 성장할 수 있는 배양 배지의 조성이 중요하다. 숙주 세포의 배양 환경 내에는 목적 단백질의 응집, 침전, 변성과 같은 가역적, 비가역적 변화를 유발할 수 있는 다양한 자극이 존재한다는 점에서 치료용 단백질의 안정화 및 활성 유지는 매우 어렵고 정교한 과정이다. 이에, 배양에서 정제까지의 공정 전반에 걸쳐 최종 생산물인 단백질의 고활성, 고수율을 달성하기 위해 최적의 숙주 세포 배양조건을 선정하는 것은 특히 인간 혈장 단백질의 생산 효율성을 좌우하는 중요한 문제이다.

한편, ADAMTS(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif) 단백질은 아연-의존성 촉매 도메인, 시스테인-풍부 도메인, 디스인테그린-유사 도메인을 포함하는 멀티도메인 세포외 프로테아제 효소의 패밀리에 속하는 단백질로서, 이의 대표적인 효소 기능은 프로콜라겐(procollagen) 및 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor, vWF)의 프로세싱과 어그레칸(aggrecan), 베르시칸(versican), 브레비칸(brevican) 및 뉴로칸(neurocan)의 절단을 통한 세포외 기질의 리모델링이다. 이에, ADAMTS 단백질은 수많은 병적 상태에 대한 잠재적 치료 타겟으로 주목받고 있다.

혈전성 혈소판 감소성 자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP)은 몸 전체의 작은 혈관에서 혈전이 형성되어 즉시 치료받지 못하면 사망에 이르는 혈전성 미세혈관 병증(thrombotic microangiopathy)에 속하는 희귀한 혈액질환이다. 발병률은 연간 100만명 당 1.5 - 6건 정도로 알려져 있으며, 주로 평균 40세의 성인과 여성에서 발병 확률이 높다(Miesbach et al., 2019). 병리학적 특징으로는 혈소판의 감소, 적혈구 감소, 헤마토크릿(hematocrit, HCT)의 증가 등이 있으며, 혈전으로 인해 신장, 심장, 뇌 등의 여러 장기에 기능 장애가 발생하는 것으로 알려져 있다. 증상으로는 멍이 들고, 발열, 권태, 호흡곤란, 의식혼란, 두통 등이 나타난다(Hovinga et al., 2017). 혈전성 혈소판 감소성 자반증은 총 19개의 ADAMTS 패밀리 중 하나인 ADAMTS13을 코딩하는 유전자의 기능 이상으로 인해 선천성 ADAMTS13 기능 결핍을 야기하는 cTTP(congenital TTP)와, 후천적인 원인으로 인한 ADAMTS13 활성 감소에 의해 발생하는 aTTP(aquired TTP)의 두 가지로 구분된다. 일반적으로 ADAMTS13의 활성이 정상 대비 10% 미만일 경우 TTP로 진단되며, aTTP의 원인으로는 박테리아 감염, 특정 약물, 루푸스(lupus)와 같은 자가면역질환, 임신 등이 관련되어 있음이 보고되었으며, ADAMTS13 효소의 활성 저하로 인해 vWF의 큰 다량체를 작은 단위로 분해하는 고유의 역할을 수행하지 못함으로써 혈소판과 함께 혈전을 과다 생성하여 질환을 유발한다.

이에, ADAMTS 단백질의 기능 저하가 다수의 혈전성 질환에 연관되어 있으며 제형화 및 투여에 적합한 높은 활성과 안정성을 갖는 재조합 ADAMTS 단백질의 대규모 생산 방법 개발에 대한 요구가 커지고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

특허문헌 1. 일본공개특허공보 제2018-203781호

본 발명자들은 혈장 단백질을 생산하는 숙주세포에 최적의 배양환경을 제공함으로써 치료용 단백질을 안정적으로 대량생산하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 숙주세포의 배양액에 적정 농도의 구리염(copper salt), 구체적으로는 황산제이구리(CuSO₄)를 첨가하는 간단한 공정만으로도 숙주세포에서 분비된 혈장 단백질의 응집이 유의하게 억제되고 단량체 함량이 현저하게 증가함을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 재조합 혈장 단백질의 단량체 함량 증진용 조성물 및 이를 이용한 재조합 혈장 단백질의 단량체 함량 증진 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 혈장 단백질의 응집 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 구리염(copper salt)을 유효성분으로 포함하는 재조합 혈장 단백질의 단량체 함량 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 혈장 단백질을 생산하는 숙주세포에 최적의 배양환경을 제공함으로써 치료용 단백질을 안정적으로 대량생산하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 숙주세포의 배양액에 적정 농도의 구리염(copper salt), 구체적으로는 황산제이구리(CuSO₄)를 첨가하는 간단한 공정만으로도 숙주세포에서 분비된 혈장 단백질의 응집이 유의하게 억제되고 단량체 함량이 현저하게 증가함으로써 치료용 단백질의 효율적인 재조합적 생산 방법으로 유용하게 이용될 수 있음을 발견하였다.

본 명세서에서, 용어 “혈장 단백질(Plasma protein)”은 인간 또는 동물의 혈장에 존재하는 수용성 단백질을 총칭하는 의미로서, 핼액 속에 포함된 단백질 중 백혈구와 적혈구에 포함된 것 이외의 모든 단백질 성분을 포괄한다. 혈장 단백질은 전체 혈장의 약 8% 정도를 차지하며, 지혈작용(프로트롬빈, 피브리노겐), 호르몬의 수송(혈청알부민과 지질단백질 등), 면역작용(면역글로불린과 보체 단백질)을 담당한다. 혈장 단백질은 당업계에 알려진 다양한 분획 및 정제 방법에 의해 수득될 수 있으나, 장기간 보관 및 환경 변화에 따른 화학적 불안정성 및 물리적 불안정성 문제가 극복되어야 한다. 물리적 불안정성은 단백질에서 공유결합 변화를 유도하지 않는 변형, 즉 흡착, 응집 및 침전을 형성하며, 화학적 불안정성은 탈아미드화, 라세미체화, 가수분해, 산화, 베타 제거 및 디설파이드 교환 등의 변형을 수반한다. 이러한 불안정성은 고유의 생물학적 활성의 왜곡 및 약리 효과의 감소로 이어진다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물을 이용하여 단량체 함량이 증가될 수 있는 혈장 단백질은 ADAMTS13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif, member 13) 단백질, 이의 변이체 또는 이의 기능적 일부 절편이다.

본 명세서에서, 용어 “변이체”는 단백질을 구성하는 천연의 아미노산 잔기의 일부가 치환(substitution), 결실(deletion) 및/또는 삽입(insertion)을 통해 인위적으로 변형된 단백질을 의미하며, 구체적으로는 아미노산 잔기의 일부가 치환된 단백질을 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 ADAMTS13 단백질의 변이체는 서열목록 제1서열의 85, 93, 126, 135, 278, 282, 308, 314, 317, 334, 364, 376, 413, 427, 452, 465, 567, 578, 585, 589, 607, 608, 609, 612, 618, 624, 630, 635, 643, 650, 651, 654, 655, 656, 658, 664 및 672번째 잔기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 변이 단백질 또는 이의 기능적 일부 절편을 의미한다.

보다 구체적으로는, 상기 ADAMTS13 단백질의 변이체는 다음 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 각 변이 단백질들로 구성된 군으로부터 선택된다:

- 85 및 317번째 잔기; 612번째 잔기; 282, 465 및 672번째 잔기 중 둘 이상; 635번째 잔기; 452 및 612번째 잔기; 278, 334 및 427번째 잔기 중 둘 이상; 618번째 잔기; 135번째 잔기; 126, 567 및 651번째 잔기 중 둘 이상; 413번째 잔기; 334번째 잔기; 314번째 잔기; 93, 364 및 376번째 잔기 중 둘 이상; 308번째 잔기; 656번째 잔기; 607번째 잔기; 612 및 624번째 잔기; 589번째 잔기; 650 및 656번째 잔기; 643번째 잔기; 585 및 658번째 잔기; 630, 654 및 664번째 잔기 중 둘 이상; 589, 608, 609, 624 및 655번째 잔기 중 넷 이상; 578번째 잔기; 585번째 잔기; 314 및 635번째 잔기; 및 314 및 612번째 잔기.

보다 더 구체적으로는, 상기 아미노산 잔기의 치환은 85번째 잔기의 Phe로의 치환, 93번째 잔기의 Val으로의 치환, 126번째 잔기의 Met으로의 치환, 135번째 잔기의 Ile으로의 치환, 278번째 잔기의 Ile으로의 치환, 282번째 잔기의 Ala으로의 치환, 308번째 잔기의 Lys으로의 치환, 314번째 잔기의 Thr으로의 치환, 317번째 잔기의 His으로의 치환, 334번째 잔기의 Thr 또는 Val으로의 치환, 364번째 잔기의 Arg으로의 치환, 376번째 잔기의 Asp으로의 치환, 413번째 잔기의 Asp으로의 치환, 427번째 잔기의 Asn으로의 치환, 452번째 잔기의 Ile으로의 치환, 465번째 잔기의 Asp으로의 치환, 567번째 잔기의 Ser으로의 치환, 578번째 잔기의 Leu으로의 치환, 585번째 잔기의 Asn 또는 Met으로의 치환, 589번째 잔기의 Gln으로의 치환, 607번째 잔기의 Arg으로의 치환, 608번째 잔기의 Met으로의 치환, 609번째 잔기의 Leu으로의 치환, 612번째 잔기의 Phe 또는 Tyr으로의 치환, 618번째 잔기의 Ser으로의 치환, 624번째 잔기의 Asp 또는 Cys으로의 치환, 630번째 잔기의 Leu으로의 치환, 635번째 잔기의 Val으로의 치환, 643번째 잔기의 Phe으로의 치환, 650번째 잔기의 His으로의 치환, 651번째 잔기의 Asp으로의 치환, 654번째 잔기의 Gly으로의 치환, 655번째 잔기의 Val으로의 치환, 656번째 잔기의 Arg 또는 His으로의 치환, 658번째 잔기의 His으로의 치환, 664번째 잔기의 Asn으로의 치환, 672번째 잔기의 Val으로의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.

본 명세서에서, 용어“기능적 일부”는 전장 단백질에서 일부 아미노산 잔기가 삭제된 절편으로서 그 본연의 생물학적 활성 및 기능을 유지하는 전장 단백질의 유사체를 의미한다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열은 1427개 아미노산으로 구성된 ADAMTS13 단백질의 아미노산 서열이다. 이에, 본 발명의 ADAMTS13 변이 단백질 또는 이의 기능적 일부 절편은 전장(1427a.a) ADAMTS13 단백질 또는 75-685번 영역을 포함하는 이의 일부 절편 내에 상기 나열된 변이가 도입된 ADAMTS13 변이체일 수 있다. 75-685번 영역을 포함하는 일부 절편은 예를 들어 1-685 (685 a.a) 또는 75-685 (611 a.a)일 수 있다.

본 발명의 ADAMTS13 단백질 및 이의 기능적 일부 절편이 필수적으로 포함하는 아미노산 서열인 서열목록 제1서열은 상기 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함한다. 실질적인 동일성이란, 상기 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석할 시, 최소 70%의 상동성, 구체적으로는 최소 80%의 상동성, 보다 구체적으로는 최소 90%의 상동성, 가장 구체적으로는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 구리염은 황산제이구리(Copper(Ⅱ) sulfate, CuSO₄) 인산제이구리(Copper(Ⅱ) phosphate, Cu₃(PO₄)₂), 산화제이구리(Copper(Ⅱ) oxide, CuO), 아세트산제이구리(Copper(Ⅱ) acetate, Cu(OAc)₂), 탄산제이구리(Copper(Ⅱ) carbonate, CuO₃), 수산화제이구리(Copper(Ⅱ) hydroxide, Cu(OH)₂), 질산제이구리(Copper(Ⅱ) nitrate, Cu(NO₃)₂) 및 염화제이구리(Copper(Ⅱ) chloride, CuCl₂)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이며, 보다 구체적으로는, 황산제이구리(CuSO₄)이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 구리염은 30 내지 1000μM의 농도로 포함되며, 보다 구체적으로는 30 내지 500μM의 농도로 포함되고, 보다 더 구체적으로는 30 내지 400 μM의 농도로 포함되며, 보다 더 구체적으로는 40 내지 300 μM의 농도로 포함되고, 보다 더 구체적으로는 40 내지 200 μM의 농도로 포함되며, 가장 구체적으로는 40 내지 150μM의 농도로 포함된다.

본 명세서에서, 용어“단량체 함량 증진”은 숙주세포가 발현한 혈장 단백질이 분비 후 배양 환경 내에서 응집되어 다량체(multimer)를 형성하지 않고 단량체(monomer) 상태로 남아있는 비율이 측정 가능한 정도로 증가하는 것을 의미한다. 구체적으로는, 다량체 대비 단량체 비율이 대조군에 비해 20% 이상 증가하는 것을 의미하며, 보다 구체적으로는 30% 이상 증가하는 것을 의미하고, 보다 더 구체적으로는 40% 이상 증가하는 것을 의미하며, 가장 구체적으로는 50% 이상 증가하는 것을 의미한다.

생리학적 환경 내에서 단백질의 다량체화(multimerization)는 단백질 단량체 표면 간의 공유결합, 소수성 상호작용, 수소결합, 이온결합을 비롯한 다양한 상호작용을 매개로 한 자발적 응집으로 인해 일어날 수도 있고, 단백질의 농도 또는 환경 요인에 의해 일어날 수도 있다. 혈장 단백질의 응집 및 다량체화는 고유의 생물학적 활성 감소로 이어지며, 특히 ADAMTS13 단백질은 다량체화될 경우 폰빌레브란트인자(vWF)를 특이적으로 인식하여 이를 분해하는 고유의 프로테아제 기능을 상실함으로써 ADAMTS13 결핍 질환에 대한 치료제로서의 효용성이 크게 떨어지게 된다. 이에, 본 명세서의 용어“단량체 함량 증진”은“응집 억제”또는“활성 증진”과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 재조합 혈장 단백질의 단량체 함량 증진 방법을 제공한다:

(a) 재조합 혈장 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 세포의 배양액에 구리염(copper salt)을 첨가하는 단계; 및

(b) 상기 세포를 배양하는 단계.

본 발명에서 이용되는 구리염 및 이의 농도, 본 발명의 방법으로 생산하고자 재조합 혈장 단백질에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서, 용어 "세포" 또는 "숙주 세포"는 표적 유전자가 삽입된 유전자 전달체가 도입되어 표적 유전자에 대한 발현 숙주로 기능하는 형질전환 세포를 의미한다.

본 명세서에서, 용어 “핵산분자”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드(gDNA 및 cDNA) 또는 리보뉴클레오타이드 분자를 포괄적으로 포함하는 의미로서, 특별하게 달리 언급되어 있지 않은 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명에 따르면, 본 발명의 핵산 분자는 혈장 단백질, 구체적으로는 ADAMTS13 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산분자이며, 예를 들어 A314T 및 S612F 변이를 포함하는 MDTCS(Metalloprotease, Disintegrin-like, Thrombospondin type 1(TSP1) repeat, Cys-rich, 및 Spacer) 절편(DM2)을 인코딩하는 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 혈장 단백질은 IgG4 면역글로불린의 Fc 영역이 접합될 수 있다. 본 발명의 ADAMTS13 변이 단백질에 IgG4 면역글로불린 유래의 Fc 영역을 접합시킬 경우, 고유의 vWF 절단 활성 및 중화항체 회피 활성을 그대로 유지하면서도 생체 내 안정성이 크게 증가하며, 특히 ADAMTS13의 C-말단 일부가 제거된 개방형(open form) 절편들에서 나타나는 구조적 불안정성이 현저히 개선될 수 있다.

본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 Fc 영역은 서열목록 제2서열의 22, 24 및 26번째 잔기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 아미노산 잔기의 치환은 22번째 잔기의 Tyr으로의 치환, 24번째 잔기의 Thr으로의 치환 및 26번째 잔기의 Glu으로의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제2서열은 IgG4 면역글로불린 유래의 Fc 영역(217a.a)이다. 전술한 ADAMTS13 변이 단백질 또는 이의 기능적 일부 절편에 22, 24 및 26번째 잔기가 각각 Tyr, Thr 및 Glu으로 치환된 IgG4 면역글로불린 유래의 Fc 영역[IgG4(YTE)]을 융합시킬 경우 혈중 반감기가 극대화되어 투여 후 생리 활성이 장기간 지속될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 혈장 단백질과 상기 IgG4 면역글로불린의 Fc 영역 사이에 IgG1 면역글로불린의 힌지(hinge) 영역이 추가적으로 포함될 수 있다. 본 발명에 따르면, IgG1 면역글로불린 유래의 힌지(hinge) 영역은 서열목록 제3서열(15a.a)로 표시될 수 있다.

본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에 첨부된 서열목록에서 특정하는 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다. 뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(코돈의 축퇴성), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 70%의 상동성, 구체적으로는 80%의 상동성, 보다 구체적으로는 90%의 상동성, 가장 구체적으로는 95%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

본 발명의 핵산 분자로서 mRNA가 사용될 경우, 혈장 단백질의 발현(번역) 효율을 향상시키기 위해, 예를 들어 poly(A) 테일 길이의 변화 또는 아데닌의 치환, 5’cap의 변형 및 변이염기(예를 들어 수도유리딘(pseudouridine), N1-메틸수도유리딘(N1-Methylpseudouridine) 또는 m5C (5-methylcytosine) 등)의 적용 등 다양한 변형이 가해질 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “유전자 전달체”또는“유전자 전달 시스템(gene delivery system)”은 유전자를 세포 내로 운반하여 해당 세포 내에서 발현시키는 모든 수단을 의미하며, 유전자 전달은 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.

본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 숙주세포 형질전환에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 구체적으로는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Act . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Metho s in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “발현” 또는 “발현하다”는 대상 세포가 외래(exogenous) 유전자를 발현하게 하거나 또는 내인성(endogenous) 유전자의 자연적 발현량을 증가시키기 위해 유전자 전달체를 이용하여 인위적으로 이를 도입함으로써 유전자가 대상체 세포 내에서 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 용어 “발현시키다”는 외인성 유전자를 인위적으로 발현시키는 것을 의미한다. 따라서, 용어“발현” 은 “형질전환(transformation)”, "형질주입 (transfection)" 또는 "형질도입(transduction)"과 동일한 의미이다.

본 발명의 유전자 전달체를 제조하기 위해, 본 발명의 핵산 분자는 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재할 수 있으며, 상기 컨스트럭트 내에서 본 발명의 표적 유전자 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서, 용어“작동적으로 결합된”은 핵산 발현조절 서열(프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명의 표적 유전자에 결합된 프로모터는, 본 발명의 숙주 세포에서 작동하여 표적 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대 CMV(포유동물 사이토 메갈로 바이러스) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 세포는 포유류 세포이며, 보다 구체적으로는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포이다.

본 명세서에서, 용어 "세포 배양액" 또는“세포 배양 배지”는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 무기질 등과 같이 세포의 성장 및 증식에 필수적인 요소를 포함하는, 시험관 내(in vitro)에서 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다. 배양 배지는 대상 세포의 종류에 따라 최적화될 수 있으며, 예를 들어 세포로부터 단백질 생산을 촉진하도록 조제된 세포 배양 생산 배지 또는 영양소들을 고농도로 농축시켜 만든 농축 배지일 수 있다. 상기 세포 배양 배지에 포함될 수 있는 성분은 글리세린, L-알라닌, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-시스테인 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-글루타민, L-히스티딘 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-리신 하이드로클로라이드, L-메티오닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-발린, L-아스파라긴-모노하이드레이트, L-아스파르트산, L-시스틴 2HCl, L-글루탐산, L-이소류신, L-류신, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-티로신 디소듐염 디하이드레이트, i-이노시톨, 티아민 하이드로클로라이드, 나이아신아미드, 피리독신 하이드로클로라이드, 바이오틴, D-판토텐산칼슘, 엽산, 리보플라빈, 비타민 B₁₂, 염화나트륨(NaCl), 탄산수소나트륨(NaHCO₃), 염화칼륨(KCl), 염화칼슘(CaCl₂), 인산수소나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO₄-H₂O), 황산제이철 헵타하이드레이트(FeSO₄-7H₂O), 염화마그네슘(무수), 황산마그네슘(MgSO₄), 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄), 황산아연 헵타하이드레이트(ZnSO₄-7H₂O), D-글루코즈(덱스트로즈), 소듐 피루베이트, 히포크산틴 Na, 리놀렌산, 리포산, 푸트레신 2HCl 및 티미딘으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 인위적으로 제조하여 사용하거나, 상업적으로 시판되는 것을 사용할 수 있다. 상업적으로 시판되고 있는 세포 배양 배지의 예는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), cellgro SCGM, X-VIVO, AIM-V 등이 있다.

본 발명의 상기 단계 (a)는 재조합 혈장 단백질 생산용 숙주세포의 배양을 위한 배양액에 구리염을 먼저 첨가 후 세포를 접종할 수도 있고, 배양액 내 세포를 먼저 접종한 후 구리염을 첨가할 수도 있다. 구체적으로는, 배양액에 구리염을 먼저 첨가 후 세포를 접종함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 상기 세포의 배양액을 생물반응기에 접종함으로써 수행된다.

본 명세서에서 용어 "생물반응기"는 용존 산소 농도, 용존 이산화탄소 농도, pH 및 온도 등 세포 배양에 영향을 미치는 일련의 조건의 연속적인 조절이 가능한 배양 장치를 의미한다.

보다 구체적으로는, 상기 세포는 상기 배양액 내 2 × 10⁵내지 10 × 10⁵cells/mL의 농도로 포함된다. 보다 더 구체적으로는, 2 × 10⁵내지 7 × 10⁵cells/mL의 농도로 포함되며, 가장 구체적으로는 2 × 10⁵내지 5 × 10⁵cells/mL의 농도로 포함된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 구리염(copper salt)을 유효성분으로 포함하는 재조합 혈장 단백질의 응집 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 이용되는 구리염 및 이의 농도, 본 발명의 방법으로 생산하여 응집을 억제하고자 재조합 혈장 단백질에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 재조합 혈장 단백질의 단량체 함량 증진용 조성물 및 이를 이용한 단량체 함량 증진 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 혈장 단백질, 구체적으로는 ADAMTS13 단백질을 발현하는 숙주세포 배양액에 적정 농도의 구리염, 구체적으로는 30 내지 1000 μM의 황산제이구리(CuSO₄)를 첨가하는 간단한 공정만으로도 ADAMTS13 단백질의 응집을 억제하고 단량체 함량을 현저하게 증가시킴으로써 치료적 유효량의 활성 단백질을 용이하게 수득할 수 있다.

(c) 본 발명은 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP)을 비롯, 대부분이 난치성 희귀질환인 다양한 ADAMTS13 기능이상 질환에 대한 효과적인 단백질의 효율적인 재조합적 생산 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 CuSO₄의 농도에 따른 ADAMTS13 단백질의 재조합적 생산을 위한 숙주세포의 성장(도 1a) 및 생존율(도 1b)를 각각 확인한 결과를 보여주는 그림이다.
도 2는 ADAMTS13 단백질의 생산에서 숙주세포의 배양환경 내 CuSO₄의 농도에 따른 활성의 변화를 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 3은 ADAMTS13 단백질의 생산에서 CuSO₄의 농도가 단백질의 생산량(역가)에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 4는 ADAMTS13 단백질의 생산에서 CuSO₄의 농도 따른 목적 단백질의 단량체(monomer) 및 다량체(multimer) 간 비율 변화를 보여주는 그림이다.
도 5는 ADAMTS13 단백질의 생산에서 CuSO₄의 농도에 따른 세포 농도 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 ADAMTS13 단백질의 생산에서 CuSO₄의 농도에 따른 배양액의 락테이트(Lac) 농도를 확인한 결과이다.
도 7은 ADAMTS13 단백질의 생산에서 CuSO₄의 농도에 배양액의 NH⁴⁺농도를 확인한 결과이다.
도 8은 ADAMTS13 단백질의 생산에서 CuSO₄의 농도에 배양액의 삼투압 변화를 보여주는 그림이다.
도 9는 ADAMTS13 단백질의 생산에서 CuSO₄의 농도에 따른 9 내지 13일째의 활성의 변화를 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 10은 ADAMTS13 단백질의 생산에서 CuSO₄의 농도에 따른 9 내지 13일째의 단백질의 생산량(역가)을 보여주는 그림이다.
도 11은 ADAMTS13 단백질의 생산에서 CuSO₄의 농도에 따라 9 내지 13일째의 단량체(단색) 및 다량체(빗금)의 비율을 나타낸 결과이다.
도 12는 ADAMTS13 단백질의 재조합적 생산을 위한 전체적인 공정 흐름에 대한 모식도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

세포주의 세포수 확보를 위한 종배양

본 발명에서 이용되는 ADAMTS13 단백질(서열목록 제5서열)을 인코딩하는 유전자를 종래에 보고된 pMSID2 벡터(한국 등록특허 제10-1591823호)에 클로닝하여 pMSID2-ADAMTS13-IgG1-YTE 발현벡터를 제작한 뒤 화학적으로 규명된 배지(Thermo Fisher Scientific, USA)에 적응된 CHO DG44숙주세포에 이를 형질감염시켜 ADAMTS13 단백질을 고발현하는 세포주를 제작하였다. 제작된 상기 세포주를 250 mL 플라스크에 10 × 10⁵cells/mL 이상으로 총 50 mL이 되도록 접종하고 36℃ 내지 38℃, 4% 내지 6% CO₂조건에서 배양한 후, 2 내지 4일 간격으로 플라스크의 부피를 늘려가면서 2 × 10⁵내지 10 × 10⁵cells/mL의 세포주를 총 200 mL 내지 800 mL이 되도록 접종하는 단계를 반복하여 세포수를 확보하였다. 플라스크에서 확보된 세포를 2 × 10⁵cells/mL 내지 10 × 10⁵cells/mL의 농도로 생물반응기에 접종한 후 36℃ 내지 38℃, pH 6.8 내지 pH 7.2, 10% 내지 90%의 용존 산소 및 100 rpm 내지 200 rpm의 교반속도의 조건에서 현탁 배양하여 세포수를 확보하였다.

ADAMTS13 단백질 생산을 위한 배양

상술한 방법으로 세포수를 확보한 GC1129A 세포주를 2 × 10⁵내지 10 × 10⁵cells/mL의 세포 농도로 생물반응기(Eppendorf, BioFlo320)에 접종한 후, 29℃ 및 37℃ 사이의 온도로 pH 6.8 및 pH 7.2, 10% 내지 90%의 용존산소 및 100 rpm 내지 300 rpm의 교반속도의 조건에서 현탁배양하였다.

ADAMTS13 단백질 정량 분석

HPLC 장비 및 POROS A/20 컬럼(Thermo fisher scientific, 1-5024-12)을 이용하여 ADAMTS13 단백질 정량 분석을 수행하였다. 구체적으로, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0의 500 mM 염화나트륨 및 pH 2.5의 100 mM 글리신을 각각 버퍼로 사용하여 농도 구배를 가하여 정량을 확인하였다.

ADAMTS13 단백질의 활성 분석

본 발명자들은 TECHNOZYM ADAMTS13 Activity ELISA(Technoclone, 5450701)를 사용하여 본 발명의 방법으로 생산된 ADAMTS13 단백질의 활성을 측정하고자 하였다. 구체적으로, 키트 내 포함된 GST-vWF73을 96-웰 플레이트에 100 μL/well로 첨가하고 60분 간 반응을 수행한 뒤 키트 내 포함된 세척 용액으로 300 μL/well로 3회 세척하였다. 표준액, 검체 및 대조군 혈장 각각 5μL와 반응 완충액 150 μL를 딥-웰 플레이트에서 혼합한 다음 96-웰 플레이트에 100 μL/well로 첨가하고 실온에서 30분간 반응하였다. 그 후 해당 키트 내 포함된 세척 용액으로 300 μL/well로 3회 세척을 진행하였다. TMB 기질을 테스트 100 μL/well로 분주 후 실온에서 30분간 반응을 수행하였다. 정지 용액(Stopping solution)을 100 μL/well로 분주 후 반응을 종결하였으며, 마이크로플레이트 리더로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과

세포 농도에 따른 역가 및 활성 확인

생물반응기에 접종한 세포 농도에 따른 영향을 확인하기 위하여 대조군 (5.0 × 10⁵cells/mL)과 실험군(10.0 × 10⁵cells/mL)으로 나누어서 배양을 수행한 결과, 하기 표 1에서 보는 바와 같이 대조군에 비하여 실험군의 역가는 2배, 활성은 1.38배 증가하였다. 하지만, 단량체 비율은 대조군 대비 감소함으로써 접종농도를 10.0 × 10⁵cells/mL로 설정하는 것은 역가에서는 이점이 있으나, 단량체 비율에서는 부정적인 영향을 끼침을 알 수 있었다.

	상대역가	상대활성	단량체 (%)
대조군	10	58	44.1
실험군	21.1	80	40.1

CuSO ₄ 의 첨가에 따른 영향 확인

생산배양 단계 중 생산배지를 제조하는 시점에 CuSO₄를 첨가하였다. CuSO₄의 첨가 여부가 ADAMTS13 단백질의 생산에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 계대 배양에서 세포수를 확보한 ADAMTS13 단백질 생산 세포주를 5 × 10⁵cells/mL의 농도로 플라스크 및 생물 반응기에 접종하여 현탁배양을 수행하였다. CuSO₄를 첨가하지 않거나 다양한 농도의 CuSO₄를 첨가한 플라스크 및 생물 반응기를 이용하여 동일한 배양조건으로 현탁배양을 수행한 결과, 2000 μM 이상의 CuSO₄를 첨가할 경우 세포의 성장이 저해되고 생존도가 감소하였다(도 1).

CuSO₄의 첨가량에 따른 ADAMTS13 단백질의 역가, 활성, 단량체 비율 변화를 면밀하게 조사하기 위하여 보다 다양한 농도(0, 50, 100, 250, 500 및 1000 μM)의 농도로 첨가 후 세포배양을 수행하였다. 그 결과, CuSO₄를 첨가로 인한 ADAMTS13 단백질의 생산성에는 변화가 없었지만(도 3), CuSO₄의 첨가는 모든 농도에서 ADAMTS13 단백질의 단량체 비율을 대조군 대비 약 1.5배 향상시켰으며(도 4), 단백질의 활성 역시 대조군 대비 약 6배 이상 증가한 것을 알 수 있다(도 2). 이에, ADAMTS13 단백질의 재조합적 생산에 있어 숙주 세포의 배양 성분에 CuSO₄를 첨가할 경우 목적 단백질의 단량체 비율과 활성이 크게 개선됨을 알 수 있었다.

한편, 도 5에서 보는 바와 같이, 50, 100, 250 및 500 μM의 CuSO₄를 첨가한 그룹은 115 × 10⁵ 내지 125 × 10⁵cells/mL 사이의 최대 세포농도를 유지함에 비해 대조군의 경우 세포 농도가 급격하게 감소하였으며, 1000 μM의 CuSO₄를 첨가한 그룹은 다른 농도 첨가군은 물론 대조군에 비해서도 낮은 세포 농도를 보였다.

도 6에서 보는 바와 같이, 대조군의 경우 12일차 이후부터 50, 100, 250, 500 μM의 CuSO₄를 첨가한 그룹보다 락테이트 농도가 높았으며, 1000 μM의 CuSO₄를 첨가한 그룹은 다른 실험군에 비해 4일차 이후부터 락테이트의 농도가 높게 유지되었다. 이에, 대조군에서는 최대 5 g/L의 락테이트 농도를 나타낸 반면, 모든 실험군에서 3.7 g/L 이하의 락테이트 농도를 나타내었다.

도 7에서 보는 바와 같이, 대조군의 경우 NH⁴⁺농도가 최대 8.4 mM인 반면, 모든 실험군에서는 7.3 mM 이하의 농도로 유지되었다.

도 8에서 보는 바와 같이, 대조군의 경우 최대 490 mOsmol/kg의 삼투압을 나타낸 반면, 50, 100, 250, 500 μM의 CuSO₄를 첨가한 실험군에서는 440 mOsmol/kg의 삼투압이 측정되었다.

이를 종합하면, 50, 100, 250, 500 μM의 CuSO₄를 첨가한 실험군에서 대조군 보다 세포농도 및 배양 부산물(락테이트, NH⁴⁺, 삼투압)의 측면에서 우수한 배양 특성을 관찰함으로써, 해당 농도 범위의 CuSO₄ 첨가가 숙주 세포의 배양에 현저한 이점을 가져옴을 확인할 수 있었다.

CuSO₄의 첨가가 ADAMTS13 단백질의 생산 효율에 미치는 영향을 추가적으로 확인하기 위하여 0, 50, 100, 250, 500, 1000 μM의 CuSO₄를 첨가한 뒤 배양 9 내지 13일째의 ADAMTS13 단백질의 역가, 활성 및 단량체 비율을 시계열적으로 측정하였다. 그 결과, 50, 100, 250 및 500 μM의 CuSO₄를 첨가군에서 단백질의 역가 및 활성은 구리이온으로 인해 부정적인 영향을 받지 않았다(도 9 및 도 10). 아울러, 대조군에서 단량체의 비율이 시간 경과에 따라 80%에서 50%까지 감소한 반면 CuSO₄ 첨가군은 모든 농도 범위에서 시간이 경과하여도 단량체 비율이 감소하지 않을 뿐 아니라 배양 13일째 기준으로 CuSO₄의 첨가가 단량체 비율을 약 1.5배 향상시킴을 확인하였다(도 11). 즉, CuSO₄의 첨가에 따른 단량체 비율 증가 및 활성 개선 효과는 시간의 경과에 따라 보다 명확해짐을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

40 내지 300 μM의 구리염(copper salt)을 유효성분으로 포함하는 ADAMTS13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif, member 13) 단백질, 이의 변이체 또는 이의 기능적 일부 절편의 단량체 함량 증진용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 구리염은 황산제이구리(Copper(Ⅱ) sulfate, CuSO₄) 인산제이구리(Copper(Ⅱ) phosphate, Cu₃(PO₄)₂), 산화제이구리(Copper(Ⅱ) oxide, CuO), 아세트산제이구리(Copper(Ⅱ) acetate, Cu(OAc)₂), 탄산제이구리(Copper(Ⅱ) carbonate, CuO₃), 수산화제이구리(Copper(Ⅱ) hydroxide, Cu(OH)₂), 질산제이구리(Copper(Ⅱ) nitrate, Cu(NO₃)₂) 및 염화제이구리(Copper(Ⅱ) chloride, CuCl₂)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 구리염은 황산제이구리(Copper(Ⅱ) sulfate, CuSO₄)인 것을 특징으로 하는 조성물.
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다음의 단계를 포함하는 재조합 혈장 단백질의 단량체 함량 증진 방법:
(a) ADAMTS13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif, member 13) 단백질, 이의 변이체 또는 이의 기능적 일부 절편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 세포의 배양액에 40 내지 300 μM의 구리염(copper salt)을 첨가하는 단계; 및
(b) 상기 세포를 배양하는 단계.
제 6 항에 있어서, 상기 구리염은 황산제이구리(Copper(Ⅱ) sulfate, CuSO₄) 인산제이구리(Copper(Ⅱ) phosphate, Cu₃(PO₄)₂), 산화제이구리(Copper(Ⅱ) oxide, CuO), 아세트산제이구리(Copper(Ⅱ) acetate, Cu(OAc)₂), 탄산제이구리(Copper(Ⅱ) carbonate, CuO₃), 수산화제이구리(Copper(Ⅱ) hydroxide, Cu(OH)₂), 질산제이구리(Copper(Ⅱ) nitrate, Cu(NO₃)₂) 및 염화제이구리(Copper(Ⅱ) chloride, CuCl₂)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 구리염은 황산제이구리(Copper(Ⅱ) sulfate, CuSO₄)인 것을 특징으로 하는 방법.
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제 6 항에 있어서, 상기 세포는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 세포의 배양액을 생물반응기에 접종함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 세포는 상기 배양액 내 2 × 10⁵내지 10 × 10⁵cells/mL의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
40 내지 300 μM의 구리염(copper salt)을 유효성분으로 포함하는 ADAMTS13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif, member 13) 단백질, 이의 변이체 또는 이의 기능적 일부 절편의 응집 억제용 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 구리염은 황산제이구리(Copper(Ⅱ) sulfate, CuSO₄)인 것을 특징으로 하는 조성물.
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