UA47428C2 - Спосіб контролю кількості сіалової кислоти, спосіб одержання химерного глікопротеїну (варіанти), препарат, що містить химерний глікопротеїн (варіанти), терапевтична композиція - Google Patents

Abstract

Описаний новий спосіб отримання глікопротеїнів за допомогою культури клітин ссавця при якому вміст сіалової кислоти в продукованому глікопротеїні контролюють в широкому діапазоні значень, варіюючи кількісний склад середовища для культивування клітин. Вміст сіалової кислоти в глікопротеїні модифікують, змінюючи параметри культивування клітин, що впливають на питому продуктивність клітин. Більш прийнятні варіанти здійснення винаходу містять способи культивування клітин, в яких під час фази продукування протеїну культурою клітин контролюють осмоляльність клітинної культури, а також концентрацію енхансеру транскрипції. Крім того, винахід стосується нових препаратів, що містять розчинний фактор некрозу пухлини типу 1 і імуноглобулін G1, і до їхнього застосування для лікування запальних захворювань або розладів, пов'язаних з імунною системою.

Description

Опис винаходу

Даний винахід відноситься до способів контролю вмісту сіалової кислоти в глікопротеїнух,продукованих в 2 культурі клітин ссавця. Винахід відноситься до способів, що дозволяють збільшувати і зменшувати вміст сіалової кислоти в глікопротеїнух, продукованих в культурі клітин ссавця. Крім того, винахід відноситься до способів отримання химер, що складаються з рецептора чинника некрозу пухлини(ТМЕК) і імуноглобуліну (Ід), а також до нових препаратів на основі ТМЕК - Ідс. і до їхнього застосування для діагностики і лікування різноманітних запальних захворювань і імунних розладів. 70 В нинішній час відмінності в характерах глікозилювання глікопротеїнів, отриманих рекомбінантним шляхом, є предметом підвищеного інтересу вчених, оскільки припускається, що отримані рекомбінантні протеїни можуть знайти застосування в медицині для профілактики і терапії хвороб. Олігосахаридні бокові ланцюги глікопротеїнів виявляють вплив на функцію протеїнів(МУНемег А. і Ножага 5. С.(1990) Віоспет., 29: 4175 - 4180), на внутрішньомолекулярні взаємодії між частинами глікопротеїну, що визначають конформацію, і 12 обумовлюють третичну структуру глікопротеїну (Напй(1992) Сип. Ор. СеїІ Віої., 4: 1017 -1023; Сооснее і ін«1991) Віо/Тесппоіоду, 9: 1347 - 1355; Рагекпи Кк. В.(1991) Сит. Ор. ігисі Віої. 1: 750 - 754).

Олігосахариди також можуть служити для орієнтації даного поліпептиду по відношенню до певних структур за допомогою специфічних клітинних вуглеводних рецепторівІВемІасадца М. Р. і Меївоп К. М., (1993) 9. Сп.

Іпмеві. 91: 379 - 387; Меївоп К. М. | ін.(1993) У. Сп. Іпмеві. 91: 1157 - 1166; Могдага К. БЕ. І ін.(1993)

Ргос. МаїЇ. Асад. сі. ОБА, 90: 1068 - 1072; Ітаї! У. 1 ін.(1993) Майте 361: 555 - 557). Кінцевий компонент - сідлова кислота - в олігосахаридному боковому ланцюзі глікопротеїну виявляє вплив на абсорбцію, період напіввиведення з сироватки і на кліренс з сироватки, а також на фізичні, хімічні і імуногенні властивості глікопротеїну (Рагеки К. В., див вище; МагКкі А.(1993) СіІусоБіоїюду, 3: 97 - 100; Рацівоп .(1989) ТІВ5, 14: 272 - 276; Сооспее і ін((1991) ВіобїесппоЇоду, 9: 1347 - 1355; Корайа А.(1992) Еицг. У. Віоспет, 209: 483 - с 501). Отже, важливо підтримувати певний вміст сіалової кислоти в глікопротеїнух, зокрема в таких протеїнух, (39 що призначені для застосування як терапевтичні засоби.

Велика увага була приділена чинникам, що впливають на глікозилювання в процесі продукування рекомбінантного протеїну, таким, як спосіб вирощування(адгезивний або суспензійний), наявність в складі середовища фетальної бичачої сироватки, щільність середовища, насичення киснем, значення рН, схеми со очистки і т. п.МУегтег К. | Мое МУ(1993) Огид Кев., 43: 1134 - 1249; Науїег і ін.(1992) Віоїес!и. апа сч

ВіІоепд., 39: 327 - 335; Вогув і ін.(1994) Віоїесп. апа Віоепо., 43: 505 - 514; Вогуз і ін.(1993)

ВіІоЛесппоіоду, І: 720 - 724; Неагіпд і ін;(/1989) 9. Се Віої, 108: 339 - 353; бооспее і ін., в Егоп(еге в

Іп Віоргосеззіпд ІІ, під ред. Тода і ін.(1992) Атегісап Спетіса! Босіегу, С. 199 - 240; патент США 5096816; ча

СпоНдеаї МУ.,1994) Суюїесп., 15: 217 - 221). Декілька груп дослідників вивчали вплив параметрів середовища, при культивуванні на якому продукуються рекомбінантні протеїни, і, зокрема, вплив складу середовища на М продукування рекомбінантних протеїнів|Рагк і ін.(1992) Віоїес!и. апа Віоепо., 40: 686 - 696; Сох і

МесСішге,(1983). іп МІго, 19: 1 - 6; Мігщапі і ін.(1992) Віоспет. Віорпуз. Кев5. Сотт., 187: 664 - 669; Їе

Сгоз і ін.(1985) утри. Кез., 4(3): 221 - 227). «

Відомо, що додання алканових кислот, таких, як олійна кислота, викликає нестійку експресію чужорідної ДНК З в рекомбінантній культурі клітинІРгазай і Зіпра(1976) Іп МІго, 12: 125 - 132; заявка на патент Японії 62 - с 18936; заявка на патент Японії 55 - 150440; Кіейг і ін.(1992) Віоспет., 31: 3222 - 3229; Сегтап і

Із» Номжага(1983) МисіеІс Асіа Кев., 11: 7631 - 7648). Однак бутират натрію по - різному діє на експресію гена в залежності від ліній клітин і складів середовища|О'Аппа і ін.(1980) Віоспет., 19: 2656 - 2671; Надоріап Н.

К.(1977) Сеїї, 12: 855 - 860)| і на продукування протеїну|МіІпаца(1980) 9. Сей РНузіоЇ. 104: 163 - 170; заявка на патент Великобританії ОВ 2122207АЇ, дозволяючи припустити, що бутират може модифікувати Учап і шк ін.(1985) 3). ВіоІ. Спет., 3778 - 37831 або інгібувати експресію певних генів ГУ чап і ін., див. вище). -І В європейській заявці 023929281 описаний спосіб підсилення продукування протеїну в присутності алканової кислоти, такий, як олійна кислота або її солі. Однак в літературі є невелика кількість даних про підбір т- відповідних концентрацій такої добавки, але однак відсутні дані про вплив добавки на глікозилювання протеїну. ка 20 В інших публікаціях описано, що додання низьких концентрацій(О - 1,5МмМ) бутирату натрію в середовище для культивування клітин з метою збільшення питомої клітинної продуктивності призводить до супутнього со збільшення кількості кислих глікоформ(іщо відповідає збільшенню вмісту сіаловрі кислоти) одержуваного рекомбінантного протеїну (Спойдеаї і ін.«1994) Суюїеср. 15: 217 -2211.

Декілька груп дослідників вивчали вплив осмоляльності на клітинне зростання і продукування 29 поліпептиду(О2ішцгкК і Раївззоп,(1991) Віоїеси. апа Віоепо., 37: 989 - 993; 5ІШББІеПеїй і ін.(1960) Сапсег

ГФ) Кезеагсп, 20: 1646 - 1655; Сагсіа - Реге і ін.(1989) доцгпаі ої Віоіодісаї! Спетівігу, 264(28): 16815 - 16821; Міпег і ін.Х1981) Іпмазіоп Мегазіавів., 1: 158 - 174; патент Великобританії 2251249; європейська о заявка 481791; патент США 5151359; патент США 4724206; патент США 5122469; і МО 89/04867). Були запропоновані різноманітні діапазони осмоляльності для зростання клітин або для продукування поліпептиду. В 60 цілому, осмоляльність середовища для культури клітин збільшують за допомогою додання Масі або амінокислот. Стрес, пов'язаний з навколишнім середовищем, наприклад, збільшення концентрацій солей, в деяких випадках призводить до збільшення продукування клітинного продукту. Було висловлене припущення про те, що підвищена експресія в культурах клітин ссавця таких продуктів, як протеїн ссавця, може бути досягнута за допомогою стресу, викликаного розчиненими речовинами, наприклад, шляхом додання в живильне бо середовище солі, молочної кислоти, аміаку|міжнародна заявка МО 89/04867). Такі стреси звичайно інгібують зростання, але сприяють питомій клітинній продуктивності.

Інші дослідники обговорювали вплив концентрації глюкози на зростання клітин і/або продукування поліпептиду в рекомбінантній культурі клітин див., наприклад, Рак і ін.(1992) ВіоїесппоІоду апа

ВіІоепадіІпеегіпо, 40: 686 - 696; Ниапа і ін.Х1991) дошгпа! ої Віоїесппоіоду, 18: 161 - 162; ЕР 387840; Кеймепу і ін.Х1986) доцгпа! ої Іттипоіодісаї Меййосдз, 86: 53 - 59; РіІпе і ін.(1976) іп МІго, 12(103: 693 - 701;

ОігсК ії ін.(1987) Ехр. Еуе Кев., 44: 951 - 958; Міг2щеапі ї ін.«1992) Віоспетіса! апа Віорпузіса| Кезеагсі

Соттипісайопв, 187(2): 664 - 669; Зийдіига(1992) Віоїесппоїоду апа Віоепдіпеегіпо, 39: 953 - 959; МО 88/01643; Огаї і ін.(19893 ОЕСНЕМА Віоїесппої. Сопі., 3: 615 - 618; заявка на патент Японії УР 1 - 101882; /о патент США 3926723; МО 87/00195; і РІеІвснаКег Ог., РИ. О. Тпевзіз, Маззаспизейв ІпзцШшіе ої Тесппоіоду, С. 196 - 229(червень 1982). Однак в попередніх дослідженнях не був вивчений вплив різноманітних параметрів процесу на вміст сіалової кислоти в зрілому протеїні, тобто чинника в продукуванні глікопротеїну, що рівноцінний кліничному успіху.

Даний винахід відноситься до способів контролю вмісту сіалової кислоти в глікопротеїнах, продукованих в /5 Культурі клітин ссавця.

Стисле викладення суті винаходу

Згідно з винаходом було встановлено, що певні параметри процесу при культивуванні клітин ссавця виявляють вплив на питому клітинну продуктивність, а також на ступінь і тип глікозилювання продукованих протеїнів. Зокрема, було виявлено, що певні чинники, які посилюють питому клітинну продуктивність, виявляють зворотний вплив на вміст сіалової кислоти в продукованому протеїні. Таким чином, згідно з даним винаходом пропонуються різноманітні способи культивування клітин, які сприяють збільшенню певних глікоформ глікопротеїнів, продукованих в культурі клітин ссавця.

Отже, винахід відноситься до способу контролю вмісту сіалової кислоти глікопротеїну, продукованого культурою клітин ссавця. Відповідно до цього предмету винаходу зміна швидкості продукування глікопротеїну в сч ов фазі продукування цього протеїну культурою клітин призводить до змін у змісті сіалової кислоти в зрілому протеїні. Зокрема, збільшення питомої клітинної продуктивності під час фази продукування глікопротеїну і) призводить до зменшення вмісту сіалової кислоти в зрілому протеїні і, навпаки, зниження питомої клітинної продуктивності призводить до збільшення вмісту сіалової кислоти в зрілому протеїні.

Даний винахід відноситься далі до зміни питомої клітинної продуктивності при використанні як клітини - со зо господаря, якою є клітина ссавця, під час фази продукування протеїну в культурі клітин ссавця шляхом контролю за чинниками, що виявляють вплив на питому клітинну продуктивність. Відповідно до одного з варіантів с контролюють концентрацію чинників, що посилюють транскрипцію ДНК. В іншому варіанті виконання «г контролюють питому клітинну продуктивність, підтримуючи осмоляльність культури клітин в певних межах.

Згідно з винаходом контролюють будь - які згадані вище параметри - окремо або в комбінації - з метою впливати ї- зв НВ вміст сіалової кислоти в зрілому глікопротеїні. В одному з варіантів виконання даного винаходу чинником, «Е що посилює транскрипцію ДНК, є алканова кислота або її сіль, така, як бутират натрію, в концентрації від приблизно 0,1мМ до приблизно 20мММ. Згідно ще з одним з варіантів осмоляльність культури клітин підтримують приблизно від 250 до 600 мосмолей. В іншому варіанті температуру культури клітин підтримують приблизно на рівні 30 - 3776. «

Винахід також належить до способу збільшення вмісту сіалової кислоти в зрілому глікопротеїні, з с продукованому культурою клітин ссавця, який містить підтримання зниженої питомої клітинної продуктивності шляхом контролю будь - якого або всіх зазначених вище параметрів процесу, необов'язково разом з іншими ;» параметрами, відомими в даній галузі техніки. Згідно з переважним варіантом клітину - господаря культивують при концентрації алканової кислоти або її солі від приблизно 0,1МмМ до приблизно бмМ і необов'язково при одночасному підтриманні осмоляльності культури клітин на рівні приблизно 300 - 450 мосмолей, що призводить їх до отримання протеїну зі збільшеним вмістом сіалової кислоти.

Винахід далі належить до способу зменшення вмісту сіалової кислоти в зрілому глікопротеїні, що

Ш- продукується культурою клітин ссавця, який включає збільшення питомої клітинної продуктивності культури їх клітин. У переважному варіанті питому клітинну продуктивність підвищують за допомогою процесу культивування бор клітин, що містить будь - який з наступних способів: культивування клітини - господаря при концентрації ю алканової кислоти або її солі від приблизно бмМ до приблизно 12мМ і підтримання осмоляльності культури с клітин на рівні приблизно 450 - ббОмосмолей.

Крім того, відповідно до винаходу пропонується метод культивування клітин з використанням трьох фаз культури клітин. Таким чином, винахід відноситься до способу контролю вмісту глікопротеїну, продукованого дв Культурою клітин ссавця, що містить стадії культивування клітини - господаря, експресуючої протеїн у фазі зростання, впродовж такого періоду часу і в таких умовах, щоб забезпечити максимальне зростання клітин.

Ф) Відповідно до цього за фазою зростання йде перехідна фаза, під час якої вибирають і встановлюють параметри ка культивування клітин, необхідні для отримання потрібної кількості сіалової кислоти у зрілому глікопротеїні.

За перехідною фазою йде фаза продукування протеїну культурою клітин, під час якої підтримують параметри, во відібрані в перехідній фазі, одержують і виділяють цільовий продукт у вигляді глікопротеїну. Зміна питомої клітинної продуктивності під час фази продукування культури клітин шляхом додання під час перехідної фази в культуру клітин алканової кислоти або її солі в концентрації від приблизно 0,1ММ до приблизно 20мММ і підтримання осмоляльності культури клітин на рівні приблизно 250 - ббОмосмолей, необов'язково у сполученні цих параметрів один з одним, призводить до отримання протеїну з різними кількостями сіалової кислоти. 65 Винахід також відноситься до способу контролю кількості сіалової кислоти, що присутня в химерному протеїні, що містить рецептор розчинного чинника некрозу пухлини типу (ТМЕКТ) і імуноглобулін. (1904)

ІТМЕКІ - Ід). Згідно з винаходом було встановлено, що за певних умов культивування в фазі продукування можуть бути отримані нові препарати на основі глікоформи ТМЕК1 - дб, які виявляють потрібні властивості тривалого кліренсу з крові, зберігаючи при цьому функціональну активність. Тривалий період напіввиведення цієї речовини при збереженні його функціональної активності дає можливість використовувати спрощене введення необхідної дози у вигляді болюсу і сприяє ефективності Іп мімо отриманого глікопротеїну, що дозволяє застосовувати більш низькі дозовані форми глікопротеїну.

Згідно з цим способом отримують молекулу глікопротеїну ТМЕКІ - дб, що містить збільшену кількість залишків сіалової кислоти. Параметри культивування клітин в фазі продукування ТМЕКІ - ІдС 4 відбирають /0 таким чином, щоб отримати потрібну кількість сіалової кислоти. В переважному варіанті в фазі продукування присутній бутират натрію в концентрації від приблизно 0.1мМ до приблизно бмМ, а осмоляльність підтримують на рівні приблизно 300 - 4А5Омосмолей. В більш прийнятному варіанті концентрація бутирату натрію складає приблизно 1мМ, а осмоляльність підтримують на рівні приблизно 350 - 400 мосмолей.

Даний винахід належить також до препарату на основі глікопротеїну ТМЕКІ - ЇДб4, отриманого за допомогою способу за даним винаходом. Згідно з цим пропонується препарат, що містить ТМЕК1 - Ід, причому значення рі препарату перебуває в діапазоні приблизно 5,5 - 7,5. Крім того, пропонується препарат на основі ТМЕКІ1 -

Ідб1, в якому молярне відношення сіалової кислоти до протеїну складає від приблизно 4 до приблизно 7 і переважно від приблизно 5 до приблизно 6. У винаході пропонується далі препарат на основі ТМЕК1 - Ід, що має від приблизно 1 до приблизно 2 молей незахищених залишків М - адетилглюкозаміну на моль протеїну. Ще в 2о одному з варіантів молярне відношення сіалової кислоти до М - ацетилглюкозаміну в препараті складає від приблизно 0,35 до приблизно 0,5, переважно від приблизно 0,4 до приблизно 0,45.

Даний винахід також належить до терапевтичної композиції, що містить вищезазначений препарат і придатної для лікування патологічних станів, опосередкованих ТМ.

Опис креслень сч

На фіг. 1А їі 1Б проілюстрований спосіб, що застосовується для обчислення питомої продуктивності при типовому способі культивування клітин в фазі продукування. Питома продуктивність може бути виражена в і) вигляді функції кількості життєздатних клітин(інтеграл по часу (у днях) від життєздатних клітин), як зображено на фіг. 1А, або обсяг клітинної маси(РСУ), як зображено на фіг 1Б. Питома швидкість продукування дана з 9095 довірительним інтервалом. со зо На фіг.2А і 2Б показана кореляція поміж питомим продукуванням, визначеним на основі інтеграла по часу(уу днях) від життєздатних клітин(фіг. 2А) і обсяг клітинної маси(РСМ) (фіг. 2Б) під час фази продукування, і с вмістом сіалової кислоти(МАМА) в отриманому продукті. Надані дані для 9 різних процесів (А - РІ). Крапки на «г графіку являють собою дані незалежних процесів продукування, що описані в таблиці 1.

Детальний опис винаходу - 1. Визначення «Е

У контексті даного опису вуглеводневі фрагменти слід розглядати у відповідності з номенклатурою, звичайно застосованної для опису олігосахаридів. Обсяг по хімії вуглеводів, в якому використована ця номенклатура, опублікован Нирбага і Імайф(1981) Апп.Кем. Віоспет., 50: 555 - 583. Ця номенклатура містить, наприклад, значення Мап для манози; СІсМАс для 2 - М - ацетилглюкозамина; баї для галактози; і біс для глюкози. Сіалові «

Кислоти описані у відповідності до абревіатури МсиМАс для 5 - ацетилнейрамінової кислоти і МешМсСе для 5 - з с гліколілнейрамінової кислоти|у.ВіоЇ.Спет., 1982, 257:3347; У.ВІоІ.Спет., 1982, 257:3352)

Осмоляльність являє собою міру осмотичного тиску часток розчиненої речовини у водному розчині. Частки ;» розчиненої речовини включають як іони, так і неіонізирувані молекули. Осмоляльність проявляють у вигляді концентрації осмотично активних часток(тобто осмолей), розчинених в кг розчина(1мосмоль/кг НьО при 387С еквівалентний осмотичному тиску 19мм рт.ст.). В протилежність цьому осмолярність означає кількість часток їх розчиненої речовини, що розчинений в ї1л розчина. У контексті цього опису абревіатура мосмолі означає кількість в мілліомолях/кг розчина.

Ш- В контексті цього опису поняття глікопротеїн звичайно відноситься до пептидів і протеїнум, що містять ї5» більш приблизно десяти амінокислот і по крайній мірі одну олісахаридний боковий ланцюг. Глікопротеїни можуть бути гомологічними клітині - господарю, або переважно вони є гетерологічними, тобто чужорідними по о відношенню до використовуючої клітини - господарю, як наприклад, у випадку протеїну людини, що продукується с клітиною яїчника китайського хом'яка. Переважно використовують глікопротеїни ссавця(глікопротеїни, первісно виділені з організму ссавця), найбільш переважно такі, які безпосередньо виділяються в живильне середовище.

Приклади глікопротеїнів ссавця містять такі молекули, як цитокіни і їх рецептори, а також химерні протеїни, дв ЩО містять цитокіни або їх рецептори (ТМЕК-1; ЕР 417563, публікація 20 березня 1991; і ТМЕК-2; ЕР 417014, публікація 20 березня і991) і їх похідни; ренін; гормон росту, в тому числі гормон росту людини і бичий (Ф, гормон росту; фактор, що визволяє гормон росту; паратірсоїдний гормон; тиреотропний гормон; ліпопротеїни; ка альфа-1-антитрицеїн; А-ланцюг інсуліну; В ланцюг інсуліна; проінсулін; фолікулостимуліруючий гормон; кальцитонін; лютеінізируючий гормон; глюкагон; чинники звертання крові, такі, як чинник МПС, чинник ІХ, во тканевий чинник і чинник фон Віллебрандса; чинники, що перешкоджає звертанню крові, такі, як протеїн С; пересерцевий натріуретичний чинник; поверхнево-активна речовина, що утворює мономолекулярний шар на альвеолярній поверні легень; активатор плазміногену, такий, як урокіназа або активатор плазміногену сечі людини або тканевоспецефічний активатор плазміногена(і-РА); бомбезин; тромбін; гемопоетичний чинник росту; енкефаліназа; КАМТЕ5(контролюючий активність експресії і серекції у нормальних Т-клітин); запалювальний 65 протеїн макрофага людини(МІР-1-альфа); сивороточний альбумін, такий, як сивороточний альбумін людини; мулеріан-інгібуюча речовина; А-ланцюг релаксину; прорелаксин; щуровий пептид, що зв'язан з гонадотропіном;

мікробний протеїн, такий, як бета-лактамаза; ДНкКаза; інгібін; активін; судинний ендотеліальний чинник зростання(МЕСЕ); чинники зростання рецепторів гормонів; інтегрін; протеїн А або О; ревматоїдні чинники; нейротропний чинник, такий, як кістковий нейротропний чинник(«ВОМЕ), нейротропні - З, - 4, - 5 або - 6(МТ-3,

МТ-4, МТ-5 або МТ-6), або чинник зростання нерву, такий, як МОБ-В; тромбоцитарний чинник зростання(РОСРБЕ); чинник зростання фібробласта, такий, як агсоб і БЕОЕ; епідермальний чинник зростання(ЕСЕ); чинник, що трансформує зростання(ТОЕ), такий, як ТоОг-альфа і ТОБ-бета, включаючи ТОБ-В1, ТОБ-В2, ТОБ-ВЗ3, ТОБ-84 або ТОБЕ-В5; інсуліноподібний чинник зростання-! ШЦІСБ-1 ї ІСЕ-11); зв'язувальні протеїни інсуліноподібного чинника зростання дез(1-3)-ІСЕ-1 (І6Б-1 мозку); СЮО-протеїни, такі, як СО-3, СО-4, СО-8 і СО-19; еритропоетин; /о остеоіндуктивні чинники; іммунотоксини; морфогенетичний протеїн кістки(ВМР); інтерферон, такий, як інтерферон-альфа, бета і гама; колонієстимулюючі чинники(С5Е), наприклад, М-С5Е, ЗМ-С8Е і о-С5БЕ; інтерлейкіни(1!), наприклад, від 11-1 до 11-10; супероксиддисмутаза; рецептори Т-клітин; протеїни поверхні мембрани; прискорюючий розклад чинник; вірусний антиген, такий, як, наприклад, фрагмент оболонки вірусу

СНІД; транспортні протеїни; "хомінг-рецептори; аддрессіни; регуляторні протеїни; антитіла; химерні /5 протеїни, такі, як іммуноадгезіни, і фрагменти будь-яких перерахованих вище поліпептидів.

Поняття "середовище для культури клітин" і "культуральне середовище" належать до поживного розчину, що застосовується для росту клітин ссавця. Це середовище звичайно містить принаймні один компонент, вибраний з однієї або декількох наступних категорій: 1) джерело енергії, звичайно в формі вуглеводу, такого, як глюкоза; 2) всі незамінні амінокислоти і звичайно основний набір з двадцятих амінокислот плюс цистеїн;

З) вітаміни і/або інші органічні сполуки, необхідні в низьких концентрациях; 4) вільні жирні кислоти; 5) мікроелементи, причому під поняттям "мікроелементи" розуміють неорганичні сполуки або елементи, що зустрічаються в природніх умовах, які звичайно необхідні в дуже низьких концентраціях, звичайно близьких до с Мікромолярного рівня.

Поживний розчин необов'язково може бути доповнений одним або декількома компонентами, обраними з (8) однієї з таких категорій: 1) гормони і інші чинники росту, такі, як, наприклад, інсулін, трансферин і епідермальний чинник росту; 2) солі і буфери, такі, як, наприклад, тіб що включають кальций, магній і фосфат; со зо З) нуклеозіди і основи, такі, як, наприклад, аденозін, тімідін і гіпоксантін; 4) білкові і тканинні гідролізати. с

Поняття "клітина-хазяїн, що являє собою клітину ссавця", "клітина-хазяїн", "клітина ссавця" і т.п. «г належить до ліній клітин з ссавців, які при уміщенні їх або в моношарову культуру, або в суспензіонну культуру здатні рости і виживати в середовищі, що містить відповідні поживні речовини і чинники росту. ї-

Необхідні чинники росту для конкретної лінії клітин легко виозначає емпіричним шляхом, не проводячи великої «Е кількості експериментів, на основі даних, викладених, наприклад, в Маттаїйап Сеї!ї Сийиге Іред. МайПег 4). Р.,

Ріепит Ргевзв, М. У. (19841, і у Вагпез і бай, (1980) СеїІЇ, 22: 649). Як правило, клітини здатні експресувати і секретувати великі кількості певного глікопротеїну, що становить інтерес, в культуральне середовище.

Приклади придатних клітин-хазяєв, якими є клітини ссавців, в контексті даного винаходу включають клітини « яичника китайського хом'яка--ВНРК (СНО, Огіаць і Спазіп, Ргос. Май. Асад. сі. ОБА, 77: 4216 (|1980); з с клітини лінії арі2. СНО (ЕР 307247, публікація 15 березня 1989); лінію почки мавпи СМІ, 5М40 (СО5-7, АТСС СН 16511; лінію що трансформувалася почки ембріона людини(293-клітини або 293-клітини, субклонирування для ;» зростання в суспензійної культурі, ОСгапйат і ін., У. Сеп. МігоІ., 36: 59 (|1977)); клітини почки детениша хом'яка(ВНК, АТСС СС 10); клітини Сертоли миши (ТМА4, МаїНег, ВіоІЇ. Кергод., 23: 243-251 |19801|; клітини почки мавпи(СМІ, АТСС СС. 70); клітини почки африканської зеленої мартишки(МЕКО-76, АТТС СТІ-1587); їх клітини цервикальної карциноми людини(НЕГА, АТСС СС 2); клітини почки собака "МОСК, АТСС ССІ 34); клітини печінки криси-буйвола(ВКІ ЗА, АТСС СК. 1442); клітини легкої людини(М/138, АТСС СС 75); клітини

Ш- печінки людини(Нер 02, НВ 8065); клітини пухлини молочної залози миши(ММтТ 060562, АТСС СС 51); ї5» ТКІ-клітини(Маїйег і ін.. Аппаів М. М. Асай. Зсі, 383: 44-68119821)) МИС б5Б-клітини; Е54-КАеткКн; і лінію 5р Гепатоми людини(Нер 52). де Переважні клітини-господарі включають клітини яіїчника китайського хом'яка/-"ВНРР ІСНО, Мгпіаць і Спавіп, с Ргос. Май). Асад. Зсі. ОА, 77: 4216 (19801); клітини лінії дрі2. СНО (ЕР 307247, публікація 15 березня 1989).

Під поняттям "пептон" в контексті даного винаходу розуміють додаток до середовища, який являє собою сильно гідролізований тваринний протеїн. Джерелом цього протеїну можуть бути тваринні відходи зі скотобоен, очищений желатин або рослинний матеріал. Протеїн звичайно гідролізують, використовуючи кислоту, нагрівання або різноманітні ферментні препарати. Переважними пептонними сумішами є, наприклад, "Ргітайпе КІ" і

Ф) "Ргітаюпе Нез'"(обидві є комерційно доступними(фірма Зпейіеїд, Великобританія)). ка "Питома клітинна продуктивність", "питома швидкість продукування протеїну кліткою" і т.п. в контексті даного опису означає питому, тобто в перерахунку на клітину або на одиницю клітинної маси або обсягу, бо Швидкість експресії продукту. Питому клітинну продуктивність вимірюють, наприклад, в грамах протеїну, що продукується кліткою в день. Питому клітинну продуктивність зручно вимірювати в відповідності з наступним інтегральним способом: арР/аеарХ або

Ра:аріх а, 65 де ар означає константу питомої клітинної продуктивності, Х означає кількість клітин або еквіваленти обсягу клітин або маси клітин, а аР/аї означає швидкість продукування протеїну. Отже, величина др може бути отримана з графіка залежності концентрації продукту від іинтегралу по часу від жизнеспособних клітин(ЇхХаї являє собою "інтеграл по часу(в днях) від життєздатних клітин"). Відповідно до з цією формулою, якщо побудувати графік залежності кількості виробленого глікопротеїнового продукту від інтегралу по часу(в днях)

Від життєздатних клітин, то тангенс куту наклона буде рівний питомої швидкості експресії продукту клітиною.

Життєздатні клітини можна визначити різноманітними вимірами, наприклад, за допомогою вимірів біомаси, швидкості вбирання О», лактатдегідрогенази(І ОН), обсягу клітинної маси або мутности. "Фаза зростання" культури клітин відноситься до періоду експоненциального зростання клітин(логарифмічна фаза), під час якої клітини звичайно швидко діляться. Під час цієї фази клітини культивирують впродовж 7/0 певного періоду часу, звичайно складає 1 - 4 дня, і в таких умовах, при яких відбувається максимальне клітинне зростання. Визначення циклу зростання для клітини-господаря може бути здійснене для конкретної передбачуваної клітини-господаря без проведення великої кількості експериментів. "Період часу і такі умови, при яких відбувається максимальне клітинне зростання" і т.п. відносяться до таких умов культивування, в відношенні яких встановлене, що для конкретної лінії клітин вони є оптимальними для зростання і ділення 7/5 клітин. Під час фази зростання клітини культивирують в живильному середовищі, що містить необхідні додатки, звичайно при температурі 30 - 40"С в зволоженій контрольованій атмосфері, при якій досягається оптимальне зростання конкретної лінії клітин. Клітини вирощують в фазі зростання впродовж періоду часу приблизно від одного до чотирьох днів, звичайно від двох до трьох днів. "Перехідна фаза" культури клітин відноситься до періоду часу, впродовж якого задаються умови

Культивування для фази продукування. Під час перехідної фази чинники навколишнього середовища, такі, як температура культивування клітин, осмоляльність середовища і т. п., зсувають від умов, характерних для зростання, до умов, характерних для продукування. "Фаза продукування протеїну" культурою клітин відноситься до періоду часу, впродовж якого зростання клітин вийшло на плато. Під час фази продукування закінчене логарифмічне зростання клітин, а основним є с продукування протеїну. Під час цього періоду часу середовище звичайно доповнюють з метою підтримати безперервне продукування протеїну і отримати необхідний продукт у вигляді глікопротеїну. о

Поняття "експресія" або "експресирувати" в контексті даного опису відноситься до транскрипції і трансляції, що відбуваються в клітині-господарі. Рівень експресії продукту гена в клітині-господарі може бути визначений на основі або кількості відповідній мРНК, що присутній в клітині, або кількість протеїну, с Кодируємого геном, що продукується клітиною. Наприклад, мРНК, транскрибируєму виходячи з гену, доцільно кількісно оцінювати за допомогою нозерн-гібридизації |див ЗатбгооК і ін., МоїІесшаг Сіопіпд: А І арогайгу с

Мапмцаї, стор. 7.3 - 7.57, Соїй Зргіпд Нагрог І арогаїогу Ргезв, 1989). Протеїн, кодируємий геном, може бути «ж кількісно оцінений або на основі аналізу біологічної активності протеїну, або з застосуванням способів, що не залежать від такої активності, такими, як вестерн-блотинг або радисіммуноаналіз з використанням антитіл, - здатних вступати в взаємодію з протеїном |див Ззатргоок і ін., Моіесшаг Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапиа!Ї, стор. «ф 18.1 - 18.88, Соїа 5ргіпд Нагбог І арогайїогу Ргезз, 1989).

Під алкановою кислотою або її сіллю розуміють алканову кислоту з прямим або розгалуженим ланцюгом, насичену або ненасичену, або її сіль. Алканова кислота звичайно має від одного до десяти атомів вуглецю, більш переважно від трьох до шести атомів вуглецю. Прикладом алканової кислоти є олійна кислота, а «

Відповідна їй сіль являє собою бутират натрію. шщ с ІІ. Способи культивування клітин й Згідно винаходу було встановлене, що чинники, що збільшують питому клітинну продуктивність під час фази «» продукування глікопротеїну культурою клітин ссавця, виявляють зворотний вплив на вміст сіалової кислоти в отриманому глікопротеїні. Оскільки експресируючі протеїни, що містять один або декілька залишків сіалової

Кислоти на один складний олігосахаридний фрагмент, характеризуються Іп мімо більш тривалим часом кліренса, «їз» той час кліренса продукуємого глікопротеїну можна змінювати в широких межах, варіюючи рівень сіалілірування препарату в цілому. Даний винахід відноситься до способів контролю ступеня сіалілірування глікопротеїну, і продукуємого культурою клітин ссавця. По способу, викладеному в даному описі, можна точно визначити ї» параметри процесу, що забезпечують необхідний вміст сіалової кислоти в глікопротеїні, продукуємом культурою Клітин ссавця. де Відповідно до даного винаходу клітину-господаря ссавця культивують для отримання продукту-глікопротеїну, со що вивільнюється. Загальний вміст сіалової кислоти в глікопротеїні контролюють, змінюючи параметри культивування клітин, що діють на питому клітинну продуктивність. Чинники, що діють на питому клітинну продуктивність, добре відомі в даній області техніки і містять, але не обмежені ними, чинники, що справляють

Вплив на кількість копій ДНК/РНК, чинники, що справляють вплив на РНК, такі, як чинники, які стабілізують

РНК, живильні речовини і інші добавки до середовища, концентрацію енхансерів транскрипції, осмоляльність іФ) культурального середовища, температуру і рН культивування клітин і т.п. Відповідно до даного винаходу ко регулювання цих чинників, окремо або в комбінації, для збільшення питомої клітинної продуктивності призводить до отримання протеїну з пониженим вмістом сіалової кислоти. Регулювання цих чинників, окремо або в бо комбінації, для зменшення питомої клітинної продуктивності призводить до отримання зрілого протеїну з підвищеним вмістом сіалової кислоти.

Нижче винахід описаний з посиланням на різноманітні, в тому числі добре відомі, способи і принципи культивування клітин.

Відповідно до даного винаходу клітини ссавця культивують з отриманням цільового глікопротеїнового б5 продукту. При виборі клітини-господаря для отримання глікопротеїну згідно з винаходом важливо враховувати, що різноманітні клітини-господарі мають характерні і специфічні механізми трансляційного (

пост-трансляційного процесингу і модифікаці(наприклад, глікозилювання, розщіплення) експресованого протеїну. З метою забезпечити можливість здійснення потрібних пост-трансляційних модифікацій мають бути вибрані відповідні лінії клітин. В альтернативному варіанті клітини-господарі можуть бути модифіковані таким

ЧИНОМ, щоб експресувати потрібний генний продукт, необхідний для специфічної пост-трансляційної модифікації.

Зокрема, клітини ссавця, експресируючі необхідний протеїн, повинні також експресирувати ферменти, або ж вони можуть бути видозмінені таким чином, щоб експресирувати конкретні ферменти, що при відповідних умовах, наведених в даному описі, можуть здійснювати Іп мімо відповідну пост-трансляційну модифікацію.

Ферменти включають такі, необхідні для доповнення і добудовування М - і О - зв'язаних вуглеводів, таких, як 7/0 описані вище у Ниррага і мап для М - зчеплених олігосахаридів. Ферменти необов'язково включають олігосахарил-трансферазу, альфа-глюкозидазу і, альфа-глюкозидазу ІІ, ЕК - альфа (1.2) манозидазу, Гольджи альфа-манодазу 1, М - ацетилглюкозамініл-трансферазу 1, Гольджи альфа-манодазу 1, М - ацетилглюкозамініл-трансферазу ІІ, альфа(1.6) фукозилтрансферазу і Р (1.4) галактозилтрансферазу. Крім того, клітина-господар може експресирувати відповідну сіалілтрансферазу(як частина генома клітини-господаря), що, /5 певно, може приєднувати кінцеву сіалову кислоту в певному положенні і утворювати зв'язок. Клітка-господар необов'язково може бути сконструйована таким чином, щоб експресирувати відповідні сіалілтрансферази за допомогою, наприклад, трансфекції клітини-господаря ДНК, кодируючої сіалілтрансферазу.

Слід очікувати, що описані вище сіалілтрансферази можуть приєднувати залишок кінцевої сіалової кислоти до відповідного олігосахаридному ядра, такого, як саїВІ - 4СІСМАс. Відповідні сіалілтрансферази в контексті даного винаходу включають такі сіалілтрансферази, які каталізують комплексне сіаліліровання і розгалуження М - 10 - зв'язані олігосахаридів, але не обмежені ними.

Для культивування клітин ссавців, експресируючих необхідний протеїн і здатних додавати необхідні вуглеводи в певному положенні і утворювати зв'язок, можуть використовуватися численні умови культивування, при цьому слід приділяти особливу увага тому, що клітина-господар підлягає культивируванню. Придатні умови с об Культивування для клітин ссавця добре відомі в даній області техніки|уУ. Іттипої. Меїйодз (1983), 56: 221 - 234) або можуть бути легко визначені фахівцем в даній області техніки (див, наприклад, Апіта! Сеїї Сийиге: А і)

Ргасіїса! Арргоасі, 2-е вид., ред. КісКкмоод О. І Натез В. 0О., Охіога ОпімегеНу Ргевзв, Мем/ МЖогк (1992)| і варіюються в відповідності з конкретною вибраною клітиною- господарем.

Культуру клітин ссавця за даним винаходом одержують в середовищі, придатному для конкретної клітини, що о зо Підлягає культивируванню. Прикладами живільних розчинів є комерційно доступні середовища, такі, як середа

Хама РІО ІНАМ БЕ - 10І(фірма Зідта), мінімальна середа ,що підтримує МЕМІ, фірма Зідта), КРМІ - 1640(фірма с

ЗіІдта), по способу Дульбекко середа що модифікувалася ИглаФОМЕМІ, фірма Зідта). Крім того, як «г культуральне середовище може використовуватися будь-яке з середовищ, описаних у Нат і У/аІПасе,(1979)

Меїй. Еп2., 58: 44; Вагпез І За, (1980) Апаї. Віоспет., 102: 255; в патентах США 4767704; 4657866; 4927762; в. 5122469 або 4560655; в УМО 90/03430 і МО 87/00195; опис всіх означених публікацій включене в нинішній опис як «г заслання. Будь-яке з цих середовищ при необхідності може бути доповнене гормонами і/або іншими чинниками зростання(такими, як інсулін, трансферин або епідермальний чинник зростання), солями(такими, як хлорид натрію, кальцію, магнію і фосфат),. Буферами(такими, як НЕРЕ5), нуклеозидами(такими, як аденозин і тимідин), антибіотиками(такими, як ліки гентамицин "М), мікроелементами(під якими розуміють неорганічні сполучення, « 70 звичайно присутні в кінцевих концентраціях, близьких до мікромолярного рівня), ліпідами(такими, як - с лінолейинова або інші жирні кислоти) і відповідними їм носіями, а також глюкозою або еквівалентним їй джерелом ц енергії. Можуть бути також включені в відповідних концентраціях будь-які інші необхідні додатки, що відомі в и"? даній області техніки.

В одному з варіантів здійснення клітина-господар, якою є клітина ссавця, являє собою клітку СНО, більш прийнятну клітку др12. СНО, а придатна середа містить основний компонент середи, такий, як склад на основі «г» ОМЕМ/НАМ РЕ - 12|склад сред ОМЕМ і НАМ РЕ - 12см, наприклад, в розділі про композиціях культуральних середовищ в Атегісап Туре Сийиге СоПесцоп Сайаіодце ої СеїЇ І Іпез апа Нубргідотав, б - е изд., 1988, стор. 7 346 - 349| Інайбільш придатний склад середовища, описаний в патенті США 5122469), зі зміненими «г» концентраціями деяких компонентів, таких, як амінокислоти, солі, цукру і вітаміни, і необов'язково містить гліцин, гіпоксантин і тимідин; рекомбинантний людський інсулін; гідролізований пептон, такий, як Ргітаюплпе Н5 ді або Ргітаюглпе КіІ(фірма Зпейеїа, Великобританія) або еквівалентний їм; захисну клітку агент, такий, як (Че Рішгопіс Е68, або еквівалентний плуронієвий поліол; гентаміцин; і мікроелементи.

Глікопротеїни за даним винаходом можуть продуцируватися зростаючими клітинами, що експресують необхідний протеїн в різноманітних умовах культивування клітин. Наприклад, для здійснення даного винаходу потенційно придатні спосіби культивування клітин як для крупномасштабного, так і для маломасштабного отримання протеїнів. Способи включають, але не обмежені ними, використання біореактора з псевдоожиженним о шаром, біореактора з системою полих волокон, культивування в роллерфлаконі або ж може застосовуватися ко біореакторна система на основі резервуару з мішалкою, причому дві останні системи можуть бути з мікроносіями або без них і їх використають для здійснення винаходи або в періодичному режимі, або в періодичному режимі з бо підживленням, або в безперервному режимі.

В найбільш переважному варіанті здійснення культивування клітин за даним винаходом проводять в біореакторній системі на основі резервуару з мішалкою, використовуючи при цьому періодичний режим з підживленням. В найбільш переважному варіанті культивування в такому режимі клітини-господарі, якими є клітини ссавця, і культуральне середовище спочатку вносять в судину для культивування і в процесі 65 Культивування в культуру безупинно або дискретними порціями додають додаткові живільні речовини для культури, здійснюючи(або не здійснюючи) періодичний збір клітин і/або продукту до закінчення культивування.

Культивирування в режимі з підживленням може включати, наприклад, напівнепреривне культивування з підживленням, при якому всю культуру(включаючи клітини і середу) періодично вилучають і замінюють свіжим середовищем. Культивування в режимі з підживленням відрізняється від культивування в періодичному режимі, при якому всі компоненти для культивування клітин(включаючи клітини і живильні речовини культури) вносять в судину для культивування напочатку процесу культивування. Крім того, культивування в режимі з підживленням відрізняється від культивування спосібом перфузії тим, що супернатант не вилучають з судини для культивування під час процесу(при культивуванні способом перфузії клітини імобілізують в культурі, наприклад, шляхом фільтрації, інкапсулірування, зв'язування з мікроносіями тощо, а культуральне середовище беззупинно 7/0 або періодично вводять і вилучають з судини для культивування).

Крім того, клітини культури можуть бути розмножені в відповідності з будь-якою схемою або спосібом, що можуть бути придатні для конкретної клітини-господаря і конкретного передбачуваного плану отримання продукту. Отже, нинішній винахід припускає використання одностадійного або багатостадійного процесу культивування. При одностадійному культивуванні клітини-господарі вносять в середовище для культивування, ув а обробку за данним винаходом здійснюють під час єдиної фази продукування продукту культурою клітин. В альтернативному варіанті припускається багатостадійне культивування. При багатостадійному культивуванні клітини можна культивувати з використанням декількох стадій або фаз. Наприклад, клітини можуть бути вирощені на першій стадії або в фазі зростання, коли клітини, можливо отримання з банку, вносять в середу, придатну для стимулювання зростання і високої життездібності. Клітини можна підтримувати в фазі зростання 2о впродовж необхідного періоду часу, додаючи свіже середовище до культури клітини-господаря.

Відповідно до з переважним варіантом для підсилення зростання клітин ссавця в фазі зростання культури клітин запропоновані умови культивування в режимі з підживленням або в безперервному режимі. В фазі алканова кислота може являти собою будь-яку з алканових кислот з прямим або розгалуженим ланцюгом, що посилює транскрипцію протеїнів ссавця. В переважному варіанті здійснення алканова кислота являє собою сч олійну кислоту, а її сіллю переважно є бутират натрію.

Відповідно до з нинішнім винаходом контролюють концентрацію бутирата натрію з метою контролювати і) питому клітинну продуктивність. Використають концентрації бутирата натрію від 0,1 до 20мММ їі змінюють їх в залежності від конкретної культивируючої клітини-господаря і необхідного вмісту сіалової кислоти в одержуваному глікопротеїні. Для отримання протеїну з необхідним вмістом сіалової кислоти вибирають таку со зо концентрацію бутирата натрію, що забезпечує найбільш високу питому клітинну продуктивність з найбільш переважним профілем сіалових кислот. Таким чином, в відповідності з нинішнім винаходом концентрації с енхансера транскрипції, такого, як бутират натрію, вибирають таким чином, щоб отримати необхідний вміст «Е сіалової кислоти.

Для підвищення вмісту сіалової кислоти в зрілому глікопротеїні звичайно використають більш низькі ї- концентрації енхансера транскрипції. Більш низькі концентрації призводять до підсилення транскрипції, але «Е забезпечують більш низьку питому клітинну продуктивність, підтримуючи однак життєздатність культури клітини-господаря. Звичайно використані концентрації енхансера транскрипції, такого, як бутират натрію, складають від приблизно 0,1ММ до приблизно 8мММ. В найбільш переважному варіанті концентрації складають від приблизно 1ЛОММ до приблизно бОмМ. Згідно з ще одним варіантом здійснення використають концентрацію « бутирата натрію приблизно бмМ. В іншому варіанті здійснення використають концентрацію бутирата натрію з с приблизно 1мММ.

Ще в одному варіанті здійснення одержують глікопротеїн з пониженим рівнем сіалової кислоти. Відповідно до ;» з цим варіантом клітини ссавця культивують в умовах, при яких зростає питома клітинна продуктивність.

Концентрацію алканової кислоти або іншого відповідного енхансера транскрипції вибирають далі таким чином, щоб завдяки збільшеної питомій клітинній продуктивності одержувати протеїн з необхідним профілем сиалових їх кислот. В найбільш переважному варіанті концентрація алканової кислоти або солі складає приблизно від 5 до 20ММ і найбільш переважно приблизно від бмМ до 12мМ. В другм варіанті концентрація бутирата натрію складає

Ш- приблизно 1 2мМ. їх Визначення відповідної концентрації енхансера транскрипції, такого, як алканова кислота або її сіль, може бути здійснене в відповідності з фіг.2, а також з таблицею 1, наведеної нижче в прикладі 1. Відповідно до з ю нинішнім винаходом більш низькі концентрації бутирата натрію звичайно призводять до пониженої питомої с клітинної продуктивності. Відповідно до з винаходом концентрації бутирата натрію вибирають, зважаючи на інші параметри процесу, такі як осмоляльність в фазі продукування. Як описане більш докладно нижче, осмоляльність може впливати на питому клітинну продуктивність. Концентрації бутирата вибирають з ов урахуванням конкретної осмоляльності, що повинна підтримуватися під час фази продукування.

В альтернативному варіанті для інших клітин-господарів, якими є клітини ссавця, і інших гликопротеїнов (Ф, можуть бути отримані невеликі тест-культури, для яких може бути визначена швидкість продукування ка глікопротеїнового продукту, тобто питома клітинна продуктивність, і кінцевий вміст сіалової кислоти, що може бути використаний для отримання аналогічних таблиці і графіка, відповідних конкретній культивируемой во клітці--осподарю, зважаючи на, що зменшення питомої клітинної продуктивності призводить до збільшення вмісту сіалової кислоти в одержуваному глікопротеїні. Алкановую кислоту або її сіль, таку, як бутират натрію, або інший відповідний енхансер. Транскрипції додають в культуру клітини-господаря під час або приблизно під час, коли починається фаза продукування продукту клітинною культурою. Звичайно в процесі культивування до фази продукування застосовують перехідну фазу, під час якої умови культивування клітин, як описане вище, 65 Задають таким чином, щоб досягнути необхідної питомої клітинної продуктивності і, отже, необхідного профіля глікоформ.

Алканову кислоту або її сіль додають по способам, добре відомим в даній області техніки. В переважному варіанті бутират натрію додають в вигляді порції-дози до системи для культивування в напівнеперервному режимі з підживленням разом або без інших відповідних живильних речовин, як це вказане в нинішньому описі або відомо фахівцям в області культур клітин ссавця.

Відповідно з винаходом в доповнення до зазначених вище чинників здійснюють контроль за осмоляльністью навколишньої середи культури клітини з тієї метою, щоб регулювати ступінь сіалілірування зрілого глікопротеїну. В одному з варіантів здійснення осмоляльність контролюють з тієї метою, щоб контролювати вміст сіалової кислоти в зрілому протеїні незалежно від інших чинників, що впливають на питому клітинну 7/0 продуктивність. В іншому варіанті осмоляльність контролюють в доповнення до контролю за іншими чинниками, що виявляють вплив на питому клітинну продуктивність. В переважному варіанті здійснення контролюють як осмоляльність, так і концентрацію алканової кислоти.

Осмоляльність навколишньої середи культури клітини контролюють з метою отримати необхідний баланс між питомою клітинної продуктивністю і профілем сіалових кислот утвореного протеїну. В цілому, питома клітинна 7/5 продуктивність зростає з збільшенням осмоляльності. Осмоляльність, при якій продукується протеїн з необхідним вмістом сіалової кислоти, вибирають з урахуванням того, що збільшення осмоляльності звичайно призводить до збільшення швидкості продукування конкретного протеїну. Для зниження швидкості продукування і підвищення вмісту сіалової кислоти в зрілому глікопротеїні осмоляльність звичайно підтримують на більш низькому рівні для конкретного типу культури, що підлягає культивуванню.

Для культури клітин ссавця осмоляльність культурального середовища звичайно складає приблизно 290 -

ЗЗОмосмолей. Однак збільшення осмоляльності звичайно призводить до збільшення швидкості продукування протеїнів. Осмоляльність вибирають таким чином, щоб швидкість продукування відповідала необхідному профілю продукту. Для збільшення кількості сіалової кислоти понижают швидкість продукування, а осмоляльність звичайно підтримують в більш низьких межах, зважаючи на конкретну клітку, що підлягає с об Культивуванню-господаря. Осмоляльність в діапазоні від приблизно 250мосмолей до приблизно 450мосмолей придатна для отримання підвищеного вмісту сіалової кислоти. Найбільш переважну осмоляльність підтримують і) в діапазоні приблизно від 300 до 450мосмолей, ще найпереважно від 350 до 400мосмолей і найбільш переважно на рівні приблизно 40О0мосмолей.

Для зменшення вмісту сіалової кислоти вибирають таку осмоляльність, що призводить до підвищення со зо Швидкості продукування. Згідно даному варіанту осмоляльність підтримують приблизно на рівні 350 - бООмосмолей, більш прийняти на рівні приблизно 450 - 55О0мосмолей. с

Для фахівця-практика в даній області техніки очевидно, що осмоляльність середовища залежить від «г концентрації осмотично активних часток в культуральній рідині і що на осмоляльність впливає велика кількість змінних складових, що входять в складне культуральне середовище для клітини ссавця. Початкову - з5 Оосмоляльність культурального середовища визначають по складу культурального середовища. Осмоляльність «г може бути зміряна за допомогою осмометра, наприклад, такого, як що поставляється фірмою РІзпег Зсіепітіс,

РІКБриго, Реппзуїмапіа під маркою ОЗМЕТТЕ(або модель Озтейе 2007, що поставляється фірмою Ргесівіоп

Зувіетв, Іпс., Майск МА). Для отримання осмоляльності в необхідному діапазоні можна регулювати концентрацію різноманітних складових культурального середовища. «

Розчинені речовини, що можуть бути додані в культуральне середовище для підвищення її осмоляльності, з с включають протеїни, пептиди, амінокислоти, гідролизованние тваринні протеїни, такі, як пептони, неметаболизированние полімери, вітаміни, іони, солі, цукру, метаболіти, органічні кислоти, ліпіди і т.п. В ;» одному з варіантів осмоляльність контролюють шляхом додання пептона в культуру клітини разом з іншими компонентами культурального середовища при культивуванні в періодичному режимі з підживленням.

Відповідно з нинішнім винаходом осмоляльність підтримують або доводять до необхідного діапазону шляхом ї5» додання, наприклад, основного складу середовища, включаючого в доповнення до пептону амінокислоти і різноманітні солі(наприклад, Мас). В переважному варіанті здійснення культуральне середовище доповнюють, ш- наприклад, основним культуральним середовищем, що містить надлишок амінокислот |див, наприклад, їх середовище "З!урег" в патенті США 5122469), глюкозу і пептон.

Однак очевидно, що концентрацію (ї) інших складових культурального середовища можна змінювати з метою ю отримати зазначений вище діапазон осмоляльності. Контролюючи або періодичні, або постійно концентрацію, с наприклад, глюкози(первинного джерела енергії) в культуральному середовищі в процесі культивування, можна підтримувати осмоляльність середи в необхідному конкретному діапазоні. Контроль за концентрацією глюкози сприяє забезпеченню клітин адекватним джерелом вуглецю і водночас контролює продукцію молочною кислоти в Клітинами-господарями. Перевагою в цьому випадку є те, що при цьому обмежується зменшення значення рН в культурального середовища, що вимагає додання нейтралізаторів(наприклад, підстави, такого, як Ма 5СО3 або (Ф) Ммаон), що призводить до збільшення осмоляльності. ка Для підтримання осмомоляльності в необхідному інтервалі середовище може бути доповнене в відомих межах в відповідності з будь-якою схемою, що застосовується для підтримання культури клітин. В переважному бр варіанті система для культивування являє собою систему культивування в періодичному режимі з підживленням і середу доповнюють підживлючою порцією-дозою під час фази продукування продукту культурою клітин. Крім того, середовище може бути доповнене під час фази продукування, як описане нижче.

В альтернативному варіанті може бути здійснений паралельний порційний відбір зразків культурального середовища. Після цього при необхідності осмоляльність культурального середовища може бути модифікована б5 Шляхом модуляції підкивлюючого розчину.

Для фахівця в даній області техніки очевидно, що способи культивування клітини за данним винаходом вибирають таким чином, щоб досягнути необхідного рівня сіалілірування одержуваного протеїну. В доповнення до наведених в нинішньому описі параметри процесу, що виявляють вплив на ступінь сіалілірування, включають рівень кисня і рівень глюкози. На сіалілірування також впливають щільність культури, час і умови зберігання, такі, як температура. Мається на увазі, що нинішній винахід включає такі додаткові параметри процесу, що найбільш важливі для збільшення сіалілірування.

І. Відновлення глікопротеїну

Після фази продукування поліпептиду становлячий інтерес поліпептид виділяють з культурального середовища за допомогою способів, узвичаєних в даній області техніки. 70 Цей поліпептид виділяють з культурального середовища в вигляді секретованого поліпептиду, хоча він також може бути виділений з лізатів клітини-господаря.

На першій стадії культуральне середовище або лізат центрифугують для вилучення часток клітинного дебрису. Після цього поліпептид очищують від забруднювачей - розчинених протеїнів і поліпептидів - в відповідності з способами, прикладами яких є наступні способи очистки: фракціонування за допомогою 7/5 іммуноафінної хроматографії або на іонообмінних колонках; осадження етанолом; ЖХВР з звернутою фазою; хроматографія на силікагеле або на катіонобмінній смолі, такий, як ОЕАЕ; хроматофокусирування; електрофорез в ПААГ-ДСН; осадження сульфатом амонію; гель-фільтрація з використанням, наприклад,

Зерпадех 0-75; і протеїн А-сефарозніколонки для вилучення таких забруднювачей, як до. Для інгібування протеолітичного розкладу в процесі очистки може бути також доцільним використання протеазного інгібітору, го такого, як фенілметилсульфонілфторид(ФМСФ). Для фахівця в даній області техніки очевидно, що може зажадатися модифікація способів очистки поліпептида за рахунок змін характеристик поліпептида при експресії в рекомбінантній культурі клітин.

Особливо переважними в контексті даного винаходу є способи очистки і процеси, підібрані для вуглеводів по винаходу. Необхідні глікоформи за данним винаходом можуть бути збагачені у відношенні молекул, що містять сч ов сіалову кислоту, наприклад, шляхом іонообмінної м'якої гель-хроматографії або ЖХВР з використанням катіоно - або аніонобмінних смол, при яких одержують більш кислі фракції. і)

ІМ. Аналіз глікопротеїну

Комплексну вуглеводну частину глікопротеїну, отриманого за допомогою способів за данним винаходом, при необхідності можна легко проаналізувати звичайними способами аналізу вуглеводів. Так, наприклад, такі со зо способи, як лектин-блотинг, добре відомий у даній галузі техніки, дозволяє виявити пропорції кінцевої манози або інших цукрів, таких, як галактоза. Наявність кінцевих залишків сіалових кислот у олігосахариді з однією, с двома, трьома або чотирма боковими гілками може бути підтверджена вивільненням цукрів з протеїну з «Е використанням безводного гідразину або ферментативних способів і фракціонування олігосахаридів іонообмінної хроматографією або гель-фільтрацією або за допомогою інших способів, добре відомих у даній ї- галузі техніки. Значення рі глікопротеїну також можна виміряти до та після обробки нейрамінідазою для «Е вилучення сіалових кислот. Збільшення значення рі після обробки нейрамінідазою свідчить про присутність сіалових кислот в глікопротеїні.

Вуглеводні структури за данним винаходом, що входять до складу протеїну, експресувалися у вигляді М - або

О-зв'язаних вуглеводів. М - і О-зв'язані вуглеводні фрагменти в основному відрізняються за будівлею їх ядра. « М-зв'язане глікозилювання означає приєднання вуглеводневого фрагменту до аспарагінового залишку в в с пептидному ланцюзі через СісСМАс. Усі М-зв'язані вуглеводи мають загальну структуру ядра Мап1-6Є(Мап 1 - 3)

Мапв1 - 4сІсМАсВ1 - 4сІСМАсВ - К. При цьому в означеній структурі ядра К означає аспарагіновий залишок ;» продукуємого протеїну. Послідовність пептидів виробленого протеїну повинна містити аспарагін-Х-серин, аспарагін-Х-треонін і аспарагін-Х-цистеїн, де Х означає будь-яку амінокислоту, за винятком проліну. На противагу цьому О-зв'язані вуглеводи характеризуються загальною будівлею ядра, де заіМАс приєднаний до їх гідроксильної групи треоніну або серину. З М- та О-зв'язаних вуглеводів найбільш важливими є складні М - та

О-зв'язані вуглеводи. Такі складні вуглеводи повинні містити структури, які складаються з декількох гілок.

Ш- Для додавання кінцевих сіалових кислот важливі зовнішні моно -, бі -, три- або чотирирозгалудженні структури. їх Такі зовнішні ланцюгові структури забезпечують додаткові місця для приєднання конкретних цукрів та утворення зв'язків; їх містять вуглеводи за данним винаходом. ю Вуглеводи, що утворилися, можуть бути проаналізовані будь-яким способом, який відомий у даній галузі с техніки, включаючи способи, що наведені в данному описі. Для аналізу глікозилювання відомо декілька методів, які можуть застосовуватися згідно до винаходу. Такі методи дозволяють отримати інформацію стосовно ідентичності та складу приєднаного до пептиду олігосахариду. Методи аналізу вуглеводів для застосування за ов данним винаходом включають, але не обмежені ними, лектин-хроматографію; НРАЕС-РАЮ, в якому для розподілу олігосахаридів на основі їх заряду використовується аніонобмінна хроматографія при високому

Ф) значенні рН; ЯМР; о мас-спектрометріяї, ЖХВР; гель-проникаюча хроматографія(ГПХ); аналіз складу ка моносахаридів; послідовний ферментативний розклад.

Крім того, відомі методи для вивільняння олігосахаридів. Ці методи включають: 1) ферментативне бо Вивільнення, яке звичайно проводять з використанням пептид-м-глюкозидази Г/ендо-В-галактозидази; 2)

В-елімінацію з використанням жорстких лужних умов для вивільнення головним чином О-зв'язаних структур; і З) хімічні методи, що базуються на використанні безводного гідразину для вивільнення як М -, так і О-зв'язаних олігосахаридів. Аналіз може бути здійснений з використанням наступних стадій: 1. Діаліз зразка відносно деіонізованої води для вилучення всіх буферних солей з наступною ліофілізацією. 65 2. Вивільняння інтактних ланцюгів олігосахариду за допомогою безводного гідразину.

З. Обробка інтактних ланцюгів олігосахариду безводним метанольним розчином НСІ для видалення індивідуальних моносахаридів у вигляді О-метильних похідних. 4. М-ацетилювання будь - яких первинних аміногруп. 5. Утворення похідних з отриманням пер - О - триметилсилілметильних глікозидів. б. Розподіл цих похідних за допомогою капілярной газо-рідинної хроматографії жЖХ) на колонці типу

СР-БІЇ 8. 7. Ідентифікація індивідуальних глікозидних похідних за часом утримання при ГЖХ і мас-спектрометрії у порівнянні з відомими стандартами. 8. Кількісна оцінка індивідуальних похідних за допомогою Ів) за внутрішнім 7/0 стандартом(13-О-метил-О-глюкозидом).

Нейтральні цукри і аміносахари можуть бути визначені за допомогою аніонообмінної хроматографії високого дозволу, об'єднаної з імпульсним амперометричним визначенням(ІНРАЕ-РАЮ Сагропуагайе Зузіет фірми ОіІопех

Согр.). Наприклад, цукри можуть бути вивільнені за допомогою гідролізу 2095-ною(за об'ємом) трифтороцтовою кислотою при 100" С Зрееа - Мас(фірма Замапі Іпзігитепів). Після цього залишки розчиняють у 195-ному розчині 7/5 тригідрату ацетату натрію та аналізують на колонці для ЖХВР типу НРІ-С-АзЗб, як описано в Апитиіа та ін (Апаї|.

Віоспет. 195: 269 - 280 (1991)).

Сіалова кислота може бути визначена окремо прямим колориметричним методом "Уао та ін (Апа!. Віоспет. 179: 332 - 335 (1989)| з використанням трьох зразків. У варіанті, якому надається перевага, застосовують тіобарбитурову кислоту(ТБЕК) у відповідності з мтодом УмМаїтеп І.., 9. ВіоІ. Спет.,238:(83(1959).

В альтернативному варіанті може бути здійснений аналіз вуглеводів за допомогою імуноблотинга. У відповідності з цим способом вуглеводи, пов'язані з протеїном, визначають з використанням комерційної системи визначення глікану(фірма Военйгіпдег), яка базуєтьсяна методі окиснювального імуноблотинга, який описано в Назеїреск і Нозеї |(НазеїресК та інш., Сіусосопідайе. 9У. 7: 63 (1990)). При цьому притримуються протоколу фарбування, який рекомендується виробником, за вийнятком того, що протеїн преносять на мембрану с ов З полівінілідендифориду, а не на нітроцелюлозну мембрану та блокуючий буфер містить 595 бичачого сироваткового альбуміну в 1О0мММ. трис-буфері з рН 7,4 з 0,995 хлориду натрію. Виявлення здійснюють з і) використанням антитіл проти дигоксигеніду, пов'язаних з коньюгантом лужного фосфату(Воепгіпдег) при розведенні 1:1000 у фізіологічному розчині, який забуферений трисом , з використанням таких субстратів для фосфатази, як хлорид 4-нітроблакитного тетразолію(0,ОЗваг/звер.95) у 100мМ трис-буфері, рН 9,5, який містить со 100мМ хлорид натрію та 50мМ хлорид магнію. Протеїнові смуги, що містять вуглевод, найчастіше проявляють пртягом приблизно 10 - 15 хвилин. с

Вуглевод звичано також може бути проаналізований розкладенням пептид-М-глюкозидазой Е. У відповідності «г з цим способом залишок суспендують у 14мкл буфері, який містить 0,1890 ДСН, 18мММ бета-меркаптоетанол, 9ОММ фосфат, З3,бмМ ЕТДК при рН 8,6, та витримують при температурі 1007"С протягом Зхвилин. Після ї-

Зв ОоХхОЛОДЖення до кімнатної температури зразок поділяють на дві рівні частини. Одну аліквоту більше не піддають «Е обробці, і вона є контролем. Іншу фракцію доводять до приблизно 195 детергентом МР-40, а потім піддають обробці 0,2 одиницями пептид-М-глюкозидази Е(фірма Воепгіпдег). Обидва зразки витримують при 377С протягом 2годин та потім аналізують за допомогою електрофореза в поліакриламідному гелі у присутності ДСН.

М Химери : рецептор фактора некроза опухолі - імуноглобулін «

У варіанті, якому надається первага, способи за данним винаходом використовують для отримування в с химери, яка складається з рецептора фактора некроза пухлини(ТМЕК) та імуноглобуліна(Ід). Особливу перевагу . з цього класу химерних протеїнів надають химері, яка складається з растворимого ТМЕК типу 1 та ІДС /4 и?» Отримані химери ТМЕКІ-ІдДсІ можуть застосовуватися при лікуванні або діагностиці багатьох опосредкованних

ТМЕ або пов'язаних з ТМЕ хвороб і розладів. Поняття "лікування" в даному контексті включає як профілактику(запобігання), приглушення(наприклад, симптомів), так і лікування існуючого патологічного стану. їх Патологічні стани, пов'язані з ТМЕ, включають, але не необмежені ними, бактеремії, зумовлені грамнегативними і грампозитивними бактеріями, ендотоксичний шок, явище відторгнення трансплантату, ревматоїдні артрити,

Ш- системну червону волчанку, хворобу Крона та інші аутоімунні та запальні захворювання, пов'язані з ТЕ. їх Препарати за данним винаходом на основі ТМЕК1-ІдО звичайно придатні для застосування при таких 5р показаннях, при яких раніше використовувались моноклональні антитіла до ТМР. Наприклад, при використанні ю тварин як моделей виявлено, що моноклональні антитіла до ТМЕ-альфа виявляють захисну дію при застосуванні с в профілактичних цілях |Тгасеу К. у. та ін., (1987) Майте, 330: 662)|| Як описано у ЕхіІеу А. К. та ін., (1990) І апсеї, 335: 1275), у фазі 1 кліничного експерименту встановлено, що мишине моноклональне антитіло до рекомбинантному ТМЕ-альфа людини безпечно для уведення пациентам з серйозним септичним шоком. Химери дво ТМЕКТ-960. придатні для лікування ревматоїдних артритів, а також септичного шока.

У способі лікування захворювання або розладу, пов'язаного з ТМЕ, терапевтичне активна кількість препарату

Ф) ТМЕК1-ІдО 4 уводять суб'єкту, який необхідно таке лікування. Переважним суб'єктом є людина. ка Ефективна доза препарату на основі глікоформи ТМЕК1-Ідо. за винаходом для лікування захворювання або розладу складає 0,01 - 100мг для одного пацієнта; перевага надається 1 - 75мг, але краще від приблизно 10 до бор приблизно 5Омг.

Для уведення препарат ТМЕК1-ІдОо 1 повинен бути виготовлений у вигляді відповідної фармацевтичної або терапевтичної композиції. Така композиція звичайно містить терапевтично ефективну кількість преперата

ТМЕМ1-ідбі та фармацевтичне прийнятний наповнювач або носій, такий, як фізіологічний розчин, забуферований фізіологічний розчин, декстроза, або вода. Композиції також можуть містити певні стабілізатори, 65 такі як цукри, включаючи манозу та маніт, і місцеві анестетики для композицій, включаючи, наприклад, лідокаїн(і5) препарати ТМЕК1-Ідб3, в яких молярне відношення сіалової кислоти до М-ацетилглюкозаміну складає від приблизно 0.35 до приблизно 0.5 і найбільш переважно від приблизно 0.4 до приблизно 0.45.

Шляхи вступу індивідуальних або комбінованих терапевтичних композицій за данним винаходом включають стандартні шляхи, такі, як, наприклад, внутрішньовенна інфузія або швидкий внутрішньовенний вступ більших обсягів рідини.

Також пропонується застосування препарату ТМЕК1-Ідс 4 по винаходу при виготовленні ліків для лікування людини або тварини.

Нижче винахід більш докладно поясняется на прикладах, що уявлені тільки з ілюстративною метою і, якщо не вказаний інше, не направлені на обмеження обсягу даного винаходу. 70 Приклади

Біологічні впливи ТМЕ-альфа і ТМЕ-бета здійснюються через певні рецептори |Оетрбіс і ін., (1990)

Суокіпез, 2: 231)). Молекулярне клонування показало існування двох різноманітних типів ТМЕ-рецепторів( ТМЕК) з передбачуваними молекулярними масами 55кДа(тип 1) Г(5паї і ін., (1990) СеїІ, 61: 361) і 75кДа(тип 2) |Зт й і ін., 1990) сіепсе, 248: 1019), кожний з яких в природних умовах зв'язується як з ТМЕ-альфа, так і з

ТМЕ-бета (І оеївспег і ін., (1990) СеїЇ, 61: 351;Зснаї і ін., (1990) СеїЇ, 61: 361; Койппо і ін., (1990) Ргос.

Май. Асад. сі. ОБА 87: 8331). Встановлено, що позаклітинні частини обох рецепторів в природних умовах є розчиненими, ТМЕ-зв'язуючими протеїнами(Копго і ін., див вище). Були створені агоністи ТМЕ, що блокують шкідливий вплив. ТМЕ при різноманітних імунних і запальних захворюваннях (|Рерреї і ін., (1991) У. Ехр. Меад., 174: 1483 - 1489; Оцсп (1993) Ат. 9. Раф., 142: 1335 - 1338; Ножага 0. М. 7. (1993) Ргос. Маї). Асай. зсі.

БА 90: 2335 - 2339; Мусоіеу Р. Н., (1993) У. Іттипої., 151: 6602 - 6607). Один такий агоніст МУетег і ін., (1991) 7. Сеїї. Віоспет., Тези 20-го щорічного з'їзду, сгор. 1 15) об'єднує позаклітинний домен людського

ТМЕК типу 1 з молекулярною масою 55кДа з частиною шарнірної області і Ес-області важкого ланцюга імуноглобуліна 4 людини.

В цьому прикладі культивували клітини ссавця, трансфектовані вектором, що містить кДНК, кодуючу химеру сч

ТМЕК1-ІдО 4. з Методи (8)

А. Лінія клітин

Як лінію клітини-господаря, якою є лінія клітин ссавця, використали лінію клітини яєчника китайського хом'яка(СНО), отриману з СНО-КЦАТОСС МоССІ61 СНО-К1Т)|. Мутантну лінію клітини СНО-КІ з дефіцитом со зо дигідрофолатредуктази(ОНЕК), позначену як СНО-К! рОхХ-вВ11(ОНЕК) (отриману від Ог. Г. Свавіп з

Колумбійского університету; Зітопзеп С. С. і Геміпвоп А. 0. (1983) Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА 80: 2495 - с 2499; ОпПаць б. і Спавзіп І. (1980) Ргос. Май. Асай. 5сіІ. ОБА 77:4216 - 4220), після цього використали для «г отримання лінії клітини з пониженим споживанням інсуліну шляхом трансфекції вектором, що містить кКДНК для препроінсуліну І(Зигез і ін., (1980) Зсіепсе, 208: 57 - 591). Відібраний клон, позначений як арі2. СНО, ї- потребував для зростання гліцину, гіпоксантину і тимідину, підтверджуючи цим самим свій ОНЕК-генотип. «Е

Б. Конструювання химери, що складається з розчинного ТМЕК типу 1 та ІдсС 4

Химеру розчинний ТМЕК типу 1-Ід04 конструювали шляхом генного злиття позаклітинного домену людського

ТМЕК типу 1 з шарнірною ділянкою і Сн2 - і СнЗ-доменами важкого ланцюга Ідс «(позначену далі як

ТМЕК1-Ід01). Послідовність ДНК, яка кодує людський розчинний ТМЕК типу 1 (див. І оеівснег і ін., див. вище), « одержували з плазміди рЕК-ТІМЕ-к ІЗспаї! ї ін. Сеїї, 61: 361 (1990)). Для конструювання цієї вихідної з с плазміди клон плацентарної КДНК довжиною 2.1 т.п.н. (5еспаїй! і ін., див. вище) вбудовували у вектор, який . забезпечує експресію в клітинах ссавця рКК5, конструкція якого описана в ЕР 307247, публікація 15 березня и? 1989. Ця кДНК починається з нуклеотиду в положенні 64 послідовності, описаної І оеізсНег і ін., з ініціюючим метіоніном на відстані 118 пар основ нижче(по ходу транскрипції) по відношенню до початкового нуклеотиду.

Джерелом послідовності, кодуючої Ід, служила плазміда РККСО42Рї, експресуюча СО4-Ідо |Сароп 0. У). і їх ін., Майте, 337: 525 (1989); Вугп і ін., Майте, 344: 668 (1990)), що складається з послідовності кКДНК, кодуючої гібридний поліпептид, який містить 1-180 залишків зрілого людського протеїну СО4(два М-кінцевих

Ш- варіабельних домену СО4), злитих з послідовностями людського дос 4, які розпочинаються з аспарагінової їх кислоти в 216 положенні(якщо вважати амінокислоту в 114 положенні як перший залишок константної ділянки 5р важкого ланцюга (Кабаї і ін., Зедоепсев ої Ргоїеіпз ої Іттипоіодіса! Іпіегезі, 4-е вид. (1987)), яка є першим ю залишком шарніра дб. після залишку цистеїну, що бере участь у зв'язуванні важкого і легкого ланцюга), і с закінчуються залишком в 441 положенні для приєднання Снаео- і СнЗ-доменів Ес-ділянки Ідс 4.

ТМЕК1-Ід03 конструювали, одержуючи рестрикційні фрагменти плазмід рЕК-ТМЕ-К і рАКСО4»ов 1 і лігуючи їх з використанням делеційного мутагенезу таким чином, щоб залишок треоніну в положенні 171 зрілих ТМЕК ов бпівпадав з залишком аспарагінової кислоти в положенні 216 важкого ланцюга Ідс. |Кабраї і ін., див. вище|. Утворена плазміда РККТМЕК-ІдО містила повнорозмірну послідовність, кодуючу ТМЕК1-Ідся.

Ф) В. Культура клітин ка Ген, що кодуює розчинний ТМЕК типу 1-ІдО3, вводили в клітини лінії арі2-СНО шляхом трансфекції. Це уведення здійснювали за допомогою методу на основі фосфату кальцію для інтродукції ДНК в клітини ссавця. бо Через два дні опісля трансфекції клітини обробляли трипсином і опересівали в селективне середовище(середовище НАМ Р-12 без гліцину-гіпоксантину і тимідину/ОМЕМ, 1:1 за об'ємом 295 підданої діалізу сироватки). Отримані ізоляти піддавали скринінгу на здатність секретувати ТМЕК 4-Ідб4. Клони, експресуючі

ТМЕКІ1-Ідо1, ампліфікували в метотрексаті одержуючи клони, що мають високу експресію, і їх послідовно адаптували до безсироваткового середовища. Ці клітини перебували під безперервним селективним тиском до 65 перенесення у невибірне середовище для зростання і експансії(розмноження) інокуляту.

Для отримання культур клітин, продукуючих ТМЕК1-Ідсо 3, описану вище популяцію клітин з середовища, що містить метотрексат, розмножували шляхом серійних пересівів в судини більшого об'єму в середовище для зростання, що не містить метотрексату. На цих стадіях процесу неселективне середовище для зростання являло собою композицію на основі ОМЕМ/НАМ РЕ-12 |див., наприклад, патент США 5122469) зі зміненими концентраціями деяких компонентів, таких як глюкоза, амінокислоти, солі, цукор, вітаміни, гліцин, гіпоксантин і тимідин; рекомбінантний людський інсулін; гідролізований пептон(РгІтайпе НЗ або Ргітайюпе КІ); захищаючий клітину агент, такий, як Рішгопіс Ебв(плуронієвий поліол) або його еквівалент; гентаміцин; ліпіди і мікроелементи.

Культури містили при контрольованому значенні рН 7.2...0,4, використовуючи газоподібний СОз(кислота) і/або Ма»СОз(основа). Температуру під час періоду зростання підтримували біля 37"С. Вміст розчиненого кисню 7/0 підтримували на рівні вище 59о від насичення повітрям за допомогою прямого продування повітрям і/або газоподібним киснем.

Осмоляльність протягом фази розмноження інокуляту підтримували в діапазоні приблизно від 250 до

ЗБОмосмолей.

Для кожної культури за фазою зростання йшла друга фаза або перехідна фаза, в якій умови культивування 7/5 Змінювали від умов, оптимальних для зростання, до умов, відповідних фазі продукування. Під час цієї перехідної фази температуру системи для культивування знижували звичайно приблизно до 30-35"С. Додавали бутират і осмоляльність підтримували в певному діапазоні. Продукт, що накопичувався під час цієї фази продукування, аналізували на вміст сіалової кислоти.

За звичайної схеми продукування приблизно 1.2х105 клітин, отриманих в результаті розмноження інокуляту після стадії селекції, вирощували в фазі зростання з вихідною осмоляльністю ЗОбмосмолей. Середовище для зростання доповнювали мікроелементами, рекомбінантним людським інсуліном і гідролізованим пептоном. В цих умовах клітини вирощували протягом 2днів. На початку третього дня культивування клітин температуру знижували. Водночас або після зміни температури в культуру клітин додавали бутират натрію і підтримували необхідну для продукування осмоляльність, додаючи різноманітні компоненти середовища. Клітини вирощували Га

В цих умовах з підживленням впродовж 9-1Однів. При необхідності клітини підживлювали різноманітними компонентами середовища. і)

В таблиці 1 подані умови для різних способів здійснення процесу продукування. со зо ПОП

Екс ШИХ процесу |(ммоль/л) продукування (мосмоль/кг) між 5-10 днями(пг/день) на 10 день (моль/моль) «т в яю 11111111 воваімезі т з в ю011110148111111000 як щ п ОС Есе НН УТ УС я 11810011 зюаю00010101010000014293, вався ч у з с ПИ ЕЕ ПОЕТ ПНО ННЯ У :з» Г. Виділення ТМЕВ-ІДО

Химеру ТМЕК1-дб1 очищували до гомогенності більше 9595 за допомогою афінної хроматографії на 415 імобілізованому протеїні А Зіарпуіососсиз ацйгецв, як описано у Сароп і ін., див. вище. їз Д. Аналіз вуглеводу

Вміст сіалової кислоти аналізували способом УМаїтеп І.., (1959) 3. ВісоІ. Спет., 234: 1971 - 1975. -і Результати їз Будували графік залежності питомої клітинної продуктивності для кожної з продукуючих культур, наведених в таблиці 1, від вмісту сіалової кислоти отриманого продукту. Результати наведені на фіг. 1. Найбільш високий іме) вміст сіалової кислоти спостерігали, коли параметри процесу в фазі продукування підтримували на наступному «со рівні: осмоляльність приблизно 360 - 420 мосмолей, а концентрація бутирату приблизно 1мММ. Вміст сіалової кислоти може контролюватися в широкому діапазоні значень шляхом регулювання параметрів процесу.

Приклад ІІ

Визначали в плазмі фармакокінетичні параметри, такі, як час напівжиття і/або швидкість кліренсу для різноманітних препаратів. Препарати, що мають більш високий вміст сіалової кислоти, звичайно мали більший (Ф) період напіввиведення з плазми і/або меншу загальну швидкість кліренсу у порівнянні з препаратами, що мають г більш низький вміст сіалової кислоти.

Методи во Сімнадцять самців щурів лінії Зргадое-Оаулеу вагою 272 - 315г випадковим чином розподіляли за трьома групами(М - 5 або б особин в групі), які піддавали обробці злитим протеїном ТМЕК1-ІдО 4. Тваринам внутрішньовенно через канюлю в стегновій вені вводили номінальну дозу 5мг/кг тестованого матеріалу. Відібрані тестовані матеріали містили два препарати ТМЕК1-ІдО., отримані в результаті процесу, в якому концентрація бутирату під час фази продукування складала бмМ і осмоляльність під час фази продукування підтримували на ве рівні приблизно 40О0мосмолей(процес 1), а третій препарат ТМЕК1-Ідо. був отриманий в результаті процесу, в якому концентрація бутирату складала 12мМ і осмоляльність під час фази продукування складала приблизно

Б5ООмосмолей(процес ІІ). Зразки крові об'ємом 2мл перед обробкою і через 5хв., 2, 6, 10, 24, 34, 48, 56, 72, 96 і 120годин після обробки вносили в 8.596-ну ЕДТК. Зразки крові центрифугували, збирали плазму і зразки аналізували на вміст злитого протеїну ТМЕК1 -Ідо4.

Для кількісної оцінки вмісту ТМЕМК1-О 3 у плазмі щура застосовували імуноферментний аналіз з використанням біологічного зв'язування(Е! ІВА). Цей аналіз заснований на спроможності ТМЕ-альфа, з'єднаного з пероксидазою з хрону(ТМЕ-альфа-НКР), який зв'язувався з рецепторною ділянкою злитого протеїну

ТМЕК1-до1і. В цьому аналізі покриття лунок планшетів для мікротитрування Раб-фрагментами козиного антилюдинного ІДОЕ використовували для імобілізації ТМЕК1-Ідо. шляхом взаємодії з Ес--астиною молекули. В 7/0 лунки додавали ТМЕР-альфа-НКР і давали зв'язуватися з рецепторною ділянкою імобілізованого ТМЕК1-ІДО 4.

Кількісну оцінку здійснювали шляхом виміру забарвлення, отриманого в результаті реакції пероксидази з перекисом і ортофенілендіаміновим(ООР) субстратом. Діапазон аналізованих значень складав від 0.003 до 0.02мг/мл. Встановлено, що присутність ЕДТК в зразках плазми не чинить вплив на якість аналізу.

Дози усереднювали таким чином, щоб врахувати відмінності в концентраціях розчинів, що застосовуються /5 для обробки. Всі обчислення були зроблені на основі графіків залежності концентрації від часу аж до кінцевої точки відрахунку 120год. Усічену площину під кривою(АШсСо - 120/МУ) обчислювали з використанням правила трапеції, а усереднене по вазі значення усіченого кліренсу(Сі о - 420//М) обчислювали за формулою: доза/"АОсСо - 120.

Результати

Швидкості кліренсу варіювали в залежності від використаного варіанта процесу(пор. процес 1 з процесом ІЇ) і від кількості сіалової кислоти, присутньої в продукті. Швидкості кліренсу, отримані для окремих тварин, і відповідне середнє значення і стандартні відхилення, отримані в цьому дослідженні, наведені нижче в таблиці

ІІ. При використанні процесу 1 отримано більш низьку і більш прийнятну швидкість кліренсу. п ни ПИ со з см - в зв « ввіз» « середнє значення 1.91 з с станд. відхилення 0.02

Приклад ІІ з Склад моносахаридів ТМЕК1-ІДдС 1

Визначення складу олігосахаридів вуглеводю і побудови химери ТМЕК1-ІдО 4, отриманої згідно з прикладом 1, показало, що вміст сіалової кислоти при різноманітних варіантах процесу змінюється. Швидкий кліренс з їх плазми пов'язаний з високим рівнем незахищеного (зІСсСМАс, пониженим рівнем сіалової кислоти в ланцюгах олігосахариду (припустимо) доступністю протеїну для рецепторів манози або галактози. Повільний кліренс з

Ш- плазми пов'язаний з більшою кількістю кінцевих залишків сіалової кислоти. А. Джерела тестованого матеріалу їх ТМЕК1-до1 одержували відповідно до методів, викладених вище в прикладі 1. Матеріал для процесу 1 5о одержували з культури клітин, використовуючи під час фази продукування бмМ бутират і осмоляльність ю приблизно 40О0мосмолей. Матеріал для процесу ІЇ одержували з культури клітин, використовуючи під час фази с продукування 12мМ бутират і осмоляльність приблизно 50Омосмолей.

Б. Методи

Вивільняння інтактних нейтральних цукрів і аміноцукрів визначали за допомогою аніонообмінної ов хроматографії з високим значенням рн, об'єднаної з імпульсним амперометричним визначенням. Аналіз проводили відповідно до наступних стадій:

Ф) 1 Проводили заміну буферу в препаратах з ТМЕК1-ІдО3(приблизно Б5Омкг/мл) і у відповідних контрольних ка зразках таким чином, щоб кінцевий зразок перебував в 195-ной оцтовій кислоті. 2. Заморожували приблизно ЗОмкг ТМЕК1-Ідо., а також зразки з контрольними матеріалами в бані з сухим бо льодом і спиртом, а заморожений зразок ліофілізували протягом ночі. 3. Відновлювали висушені замороженням зразки в 50О0мкл трифтороцтової кислоти і інкубували при 1207 протягом 1 год. 4. Після кислотного гідролізу ТМЕК1-Ідо 4 і контрольні зразки охолоджували і випарювали їх досуха. 5. Відновлювали зразки водою до кінцевої концентрації приблизно 0.бмг/мл. 65 б. Проводили розподіл моносахаридів при температурі навколишнього середовища за допомогою аніонообменної хроматографії з високим значенням рн, об'єднаної з імпульсним амперометричним визначенням,

використовуючи колонку типу біопех СагроРас РА(4х25Омм) (фірма Оіопех Согр., З,ппу маїе, СА). 7. Проводили кількісну оцінку індивідуальних моносахаридів шляхом порівняння з моносахаридами в контрольних зразках.

В. Результати

Відносний молярний вміст кожного моносахариду в двох препаратах наведений в таблиці ІІЇ нижче. нн й нн ів нний

Наведені вище результати показують, що параметри процесу, вибрані для фази продукування глікопротеїну, чинять вплив на склад вуглеводнів зрілого глікопротеїну. Препарати з більш високим вмістом сіалової кислоти звичайно мають пролонгований період напіввиведення з сироватки. с

В наведених нижче таблицях ІМ і М показаний вуглеводний склад бокових ланцюгів олігосахариду в препаратах на основі химери ТМЕК1-94О., отриманих в умовах, відповідних процесу | і процесу ІІ. В таблиці о

М наведені дані для вуглеводів в рецепторній ділянці химерної молекули за винятком сайта глікозування Ес. со 7 --- лють сч - в зв « « нини 4 нин нн З нин - нн У Со СЯ » Кітсть молей незахищеною ЗоМАє ча моль 318 32,11 132 / мист» молей незакищеного Зі ча моль, 09700812 026 1 1 плкива ат атвмї в їх С кількість сівлової кислоти на моль! | 35 48500 | 65 - Дані, наведені в таблицях ІМ і М, показують, що склад ТМЕК1-ІО і характерний для комплексних ї» олігосахаридів з однією, двома і трьома гілками, що закінчуються сіаловою кислотою. Можна зробити висновок 5о про те, що ТМЕК1-Ід0, отриманий відповідно до процесу І, має істотно більший вміст сіалової кислоти і де істотно менший вміст незахищеного СіІсМАс. Кількість сіалової кислоти на моль протеїну свідчить про те, що цей со матеріал має більш низьку ізоелектричну точку у порівнянні з матеріалом, отриманим відповідно до процесу ЇЇ.

При співставленні з результатами, наведеними в таблиці ІІ, ці дані також показують, що більш повільний кліренс з плазми матеріалу, отриманого відповідно до процесу 1, корелює з більш низьким вмістом незахищеного СісМАс і звичайно з більш високим вмістом сіалової кислоти.

В таблицях ІМ і М наведені дані про препарати ТМЕК1-Ідо у, що містять комплексний олігосахарид, який іФ) закінчується одним або декількома залишками сіалової кислоти. Більш прийнятні препарати ТМЕК1-ІДО 4 ко містять молекули ТМЕК1-Ідо 3, що мають приблизно 1 - 2 моля незахищених залишків М-ацетилглюкозаміну на моль протеїну. Молярне відношення сіалової кислоти до протеїну складає приблизно 4 - 7. Препарати бо 0 ТМЕК1-дбі мають молярне відношення сіалової кислоти до М-ацетилглюкозаміну приблизно від 0.4 до приблизно 0.45.

Приклад ЇМ

Значення рі дуже сіалілованого препарату нижче, ніж значення рі слабко сіалілованого препарату.

Методи 65 Для різноманітних препаратів, описаних в прикладі Ії, проводили ізоелектричне фокусування. Ізоелектрично фокусуючі гелі поділяють глікопротеїни препарату відповідно з їх ізоелектричною точкою(рі) при використанні градієнту рН, створюваного за допомогою амфолітів з різним значенням рН. В цьому дослідженні аналіз препаратів проводили, використовуючи градієнт рН від 10 до 4.

Результати

Препарати ТМЕК1-Ід0 мають ізоелектричні точки в діапазоні від приблизно 5.5 до приблизно 7.5, як встановлено методом хроматофокусування, в якому рі чутлива до обробки нейрамінідазою.

Усі зазначені вище документи внесені в даний опис як незалежно від того, використані вони конкретно чи ні.

Хоча даний винахід описаний на прикладах його конкретних варіантів здійснення, очевидно, що можливі й інші модифікації. Передбачається, що даний опис містить будь-які варіації, застосування або модифікації 7/0 Винаходу, що випливають в цілому з основної ідеї винаходу, і такі відхилення від опису даного опису, які можуть бути зроблені на основі відомої або звичайної практики в даній галузі техніки, до якої відноситься винахід і які можуть бути застосовані до істотних ознак викладеного вище винаходу, описаних в пунктах формули винаходу, що додаються.

Claims (23)

19 Формула винаходу

1. Спосіб контролю кількості сіалової кислоти, що присутня в олігосахаридному бічному ланцюзі глікопротеїну, продукованого культурою клітин ссавця, шляхом зміни питомої продуктивності зазначеної Культури, який здійснюють наступним чином: під час перехідної фази додають до культури клітин алканову кислоту з 3-6 атомами вуглецю або її сіль в інтервалі концентрацій, що складає приблизно від 0,1 мМ до 20 мМ, встановлюють осмоляльність клітинної культури в інтервалі значень, що складає приблизно від 250 мОсмолей до 600 мОсмолей, встановлюють температуру культивування, що складає приблизно від 30 до 35"С, і підтримують зазначені параметри на стадії сч ов продукування глікопротеїну.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що для збільшення кількості сіалової кислоти в олігосахаридному (о) бічному ланцюзі глікопротеїну, продукованого культурою клітин ссавців, зменшують питому продуктивність культури клітин наступним чином: під час перехідної фази додають до культури клітин алканову кислоту з 3-6 атомами вуглецю або її сіль в со зо інтервалі концентрацій, що складає приблизно від 0,1 мМ до 6 мМ, встановлюють осмоляльність клітинної культури в інтервалі значень, що складає приблизно від 300 мОсмолей до 450 мОсмолей, встановлюють СМ температуру культивування, що складає приблизно від 30 до 35"С, і підтримують зазначені параметри на стадії «т продукування глікопротеїну.

З. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що культура клітин ссавців являє собою культуру клітин яєчника в. китайського хом'ячка (СНО). «т

4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що сіль алканової кислоти являє собою бутират натрію.

5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що продукований культурою клітин глікопротеїн являє собою глікопротеїн ссавця.

6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що глікопротеїн являє собою химерний глікопротеїн, що складається « 70 З рецептора фактора некрозу пухлини людини і імуноглобуліну 04. з с

7. Спосіб за п. 6, який відрізняється тим, що культура клітин являє собою лінію др12.СНО, трансфектовану вектором, що включає кКДНК, кодуючу химерний глікопротеїн, що складається з розчинної форми рецептора :з» фактора некрозу пухлини людини типу 1 і імуноглобуліну 54 (ТМЕК1-ІДО 4).

8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що для зменшення кількості сіалової кислоти в олігосахаридному бічному ланцюзі глікопротеїну, продукованого культурою клітин ссавців, збільшують питому продуктивність їз культури клітин наступним чином: під час перехідної фази додають до культури клітин алканову кислоту з 3-6 атомами вуглецю або її сіль в - інтервалі концентрацій, що складає приблизно від б мМ до 12 мМ, встановлюють осмоляльність клітинної їз культури в інтервалі значень від приблизно 450 мОсмолей до 600 мОсмолей, встановлюють температуру Культивування, що складає приблизно від 30 до 35"С, і підтримують зазначені параметри на стадії продукування їмо) глікопротеїну. со

9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що культура клітин ссавців являє собою культуру клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО).

10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що сіль алканової кислоти являє собою бутират натрію.

11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що продукований культурою клітин глікопротеїн являє собою глікопротеїн ссавця. (Ф)

12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що глікопротеїн являє собою химерний глікопротеїн, що ГІ складається з рецептора фактора некрозу пухлини людини і імуноглобуліну 03.

13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що культура клітин являє собою лінію др12.СНО, трансфектовану бо Вектором, що включає КДНК, кодуючу химерний протеїн, що складається з розчинної форми рецептора фактора некрозу пухлини людини типу 1 і імуноглобуліну 54(ТМЕК1-Ідо 1).

14. Спосіб одержання химерного глікопротеїну, що складається з розчинної форми рецептора фактора некрозу пухлини людини типу 1 і імуноглобуліну 54(ТМЕК1-ІдО 4) і що має знижену кількість сіалової кислоти в олігосахаридному бічному ланцюзі, який полягає у тому, що здійснюють наступні стадії: 65 а) культивують клітини СНО, що експресують химерний глікопротеїн ТМЕК1-Ід01 при температурі біля 377С в умовах, що забезпечують максимальне зростання клітин;

б) під час перехідної фази додають до культури клітин бутират натрію в інтервалі концентрацій приблизно від 6 мМ до 12 мМ, встановлюють осмоляльність клітинної культури в інтервалі значень приблизно від 450 мОсмолей до 600 мОсмолей, встановлюють температуру культивування приблизно від 30 до 35"С, підтримують зазначені параметри на стадії продукування глікопротеїну і виділяють глікопротеїн з культурального середовища та очищають.

15. Спосіб одержання химерного глікопротеїну, що складається з розчинної форми рецептора фактора некрозу пухлини людини типу 1 і імуноглобуліну 54(ТМЕК1-ІдО 4) і що має підвищену кількість сіалової кислоти в олігосахаридному бічному ланцюзі, який полягає у тому, що здійснюють наступні стадії: 70 а) культивують клітини ссавців, що експресують химерний глікопротеїн ТМЕК1-Ідо при температурі біля 37"7С в умовах, що забезпечують максимальне зростання клітин; б) під час перехідної фази додають до культури клітин бутират натрію в інтервалі концентрацій, що складає приблизно від 1 мм до 6 мМ, встановлюють осмоляльність клітинної культури в інтервалі значень, що складає приблизно від ЗО0 мОсмолей до 450 мОсмолей, встановлюють температуру культивування, що складає приблизно від 30 до 35"С, підтримують зазначені параметри на стадії продукування глікопротеїну і виділяють глікопротеїн з культурального середовища та очищають.

16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що клітини ссавців являють собою клітини СНО.

17. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що клітини СНО являють собою лінію ар12.СНО.

18. Препарат, що містить химерний глікопротеїн ТМЕК1-Ідо., одержаний відповідно до способу за п. 17.

19. Терапевтична композиція, що містить химерний глікопротеїн ТМЕКІ-І9О!, одержаний відповідно до способу за п. 15, і фармацевтично прийнятний наповнювач.

20. Препарат, що містить химерний глікопротеїн ТМЕК1-Ідо., одержаний відповідно до способу за п. 14 або 15, причому в молекулі ТМЕК1-ІдО1 молярне відношення сіалової кислоти до білка складає приблизно 4-7.

21. Препарат, що містить химерний глікопротеїн ТМЕК1-ІдОї, одержаний відповідно до способу за п. 15, сч ов причому в молекулі ТМЕК1-І9до 4 міститься приблизно 1-2 моля незахищених залишків М-ацетилглюкозаміну на моль білка. і)

22. Препарат, що містить химерний глікопротеїн ТМЕК1-Ідос., одержаний відповідно до способу за п. 15, причому в молекулі ТМЕК1-Ідо.4 молярне відношення сіалової кислоти і М-ацетилглюкозаміну складає приблизно від 0,935 до 0,5. со зо

23. Препарат за п. 22, який відрізняється тим, що молярне відношення сіалової кислоти і М-ацетилглюкозаміну складає приблизно від 0,39 до 0,45. с « ча « -

с . и? щ» -І щ» з 50 ІЧ е) Ф) іме) 60 б5