SK282658B6 - Spôsob kontroly obsahu kyseliny sialovej v glykoproteíne, spôsob produkcie chimérického proteínu tumor nekrotického faktora s imunoglobulínom, prípravok a terapeutická kompozícia s jeho obsahom - Google Patents

Spôsob kontroly obsahu kyseliny sialovej v glykoproteíne, spôsob produkcie chimérického proteínu tumor nekrotického faktora s imunoglobulínom, prípravok a terapeutická kompozícia s jeho obsahom Download PDF

Info

Publication number
SK282658B6
SK282658B6 SK1670-97A SK167097A SK282658B6 SK 282658 B6 SK282658 B6 SK 282658B6 SK 167097 A SK167097 A SK 167097A SK 282658 B6 SK282658 B6 SK 282658B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
cell
tnfr1
igg
glycoprotein
cell culture
Prior art date
Application number
SK1670-97A
Other languages
English (en)
Other versions
SK167097A3 (en
Inventor
Tina Etcheverry
Thomas Ryll
Werner Lesslauer
Thomas Schreitmuller
Wolfgang Richter
Original Assignee
Genentech, Inc.
F.Hoffmann-La Roche Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23863440&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK282658(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech, Inc., F.Hoffmann-La Roche Ag filed Critical Genentech, Inc.
Publication of SK167097A3 publication Critical patent/SK167097A3/sk
Publication of SK282658B6 publication Critical patent/SK282658B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Uvedený spôsob slúži na prípravu glykoproteínov cicavčími bunkovými kultúrami, kde obsah kyseliny sialovej v produkovanom glykoproteíne je kontrolovaný v širokom rozsahu hodnôt prostredníctvom úprav podmienok kultivácie buniek. Obsah kyseliny sialovej v glykoproteíne je modifikovaný zmenami parametrov kultivácie buniek, ktoré ovplyvňujú bunkovú špecifickú produktivitu, ako sú osmolalita kultivačného média, koncentrácia enhancérov transkripcie počas produkčnej fázy kultivácie a teplota kultivácie. Sú poskytované aj nové prípravky obsahujúce chimérický proteín solubilného typu 1 receptora tumor nekrotického faktora s imunoglobulínom G1 a ich použitie v liečbe zápalových a imunitne sprostredkovaných ochorení.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobu kontroly obsahu kyseliny sialovej v oligosacharidovom vedľajšom reťazci glykoproteínu produkovaného cicavčou bunkovou kultúrou, spôsobu produkcie chimérického proteínu tumor nekrotického faktora s imunoglobulínom, prípravku a terapeutickej kompozície s obsahom TNFTl-IgGj a TNFRlgGi prípravku a jeho použitia v diagnostike a pri liečbe rôznych zápalových a imunitných ochorení.
Doterajší stav techniky
Rozdiely v charaktere glykozylácie rekombinantne produkovaných glykoproteínov boli nedávno témou väčšej pozornosti vedeckej komunity, pretože rekombinantne proteíny sú produkované pre profylaktické a terapeutické prístupy v klinike.
Oligosacharidy vedľajšieho reťazca glykoproteínov ovplyvňujú funkciu proteínov (Vittver A., and Hovard S. C. (1990), Biochem. 29: 4175 - 4180) a intramolekulárne interakcie medzi časťami glykoproteínu, ktoré vedú k tvorbe a prezentujú trojrozmernú povrchovú štruktúru glykoproteínu (Hart. (1992) Curr. Op. Celí Biol., 4 : 1017 - 1023: Goochee a kol., (1991) Bio/Technology, 9: 1347 - 1355; Parekh., R. B. (1991) Curr. Op. Struct. Biol., 1: 750 - 754). Oligosacharidy môžu taktiež slúžiť na zameranie daného polypeptidu na isté štruktúry založené na špecifických bunkových receptoroch pre uhľovodíky (Belilaqua, M. P. and Nelson, R. M. (1993) J. Clin. Invest, 91: 379 - 387; Nelson, R. M. a kol., (1993), J. (Clin. Invest. 91: 1166; Norgard K. E. a kol., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1068 - 0172; Imai, Y. a kol., (1993) Náture 361: 555 -557). Terminálna zložka kyseliny sialovej oligosacharidového vedľajšieho reťazca glykoproteínu ovplyvňuje absorpciu, sérový polčas a čas odbúrania zo séra, rovnako ako fyzikálne, chemické a imunogénne vlastnosti glykoproteínu (Parekh, R. B. supra; Varki, A. (1993) Glycobiology 3: 97 -
- 100; Paulson J. (1989), TIBS. 14: 272 - 27; Goochee a kol., (1991), Biotechnology 9: 1347 - 1355; Kobata, A., (1992) Eur. J. Biochem. 209: 483 - 501). Je preto významné udržiavať obsah kyseliny sialovej v glykoproteínoch, hlavne v tých proteínoch, s ktorými sa počíta na použitie ako lieku.
Veľká pozornosť bola venovaná faktorom, ktoré ovplyvňujú glykozyláciu v priebehu produkcie rekombinantných proteínov, ako je spôsob rastu (adherentný alebo suspensný), fetálnc hovädzie sérum vo formulácii, kultivačná hustota, oxygenácia, pH, purifikačné schémy a podobne (Vemer, R. and Noe, V. (1993), Drug Res. 43: 1134 - 1249; Hayter a kol., (1992) Biotech. and Bioeng. 39: 327 - 335; Borys a kol., (1994) Biotech. and Bioeng., 43: 505 - 514, Borys a kol., (1993) Biotechnology 11: 720 -
- 724; Hearing a kol., (1989) J. Celí. Biol. 108: 339 - 353; Goochee a kol., vo Frontiers in Bioprocessing II, Todd a kol., eds. (1992) Američan Chemical Society str. 199 - 240; US patent č. 5096816; Chotigeat V., (1994) Cytotech. 15: 217 - 221). Niekoľko skupín študovalo parametre postupov, ktoré súvisia s produkciou rekombinantných proteínov a hlavne účinok zloženia média v produkcii rekombinantných proteínov (Park a kol., (1992) Biotech. Bioeng. 40: 686 -
- 696; Cox and McClure (1983) In Vitro, 19: 1 - 6; Mizutani a kol., (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 664 -
- 669; Le Gros a kol., (1985) Lymph. Res. 4 (3): 221 - 227).
O pridaní alkánových kyselín, ako je kyselina maslová, je známe, že spôsobuje nestacionárnu expresiu cudzorodej
DNA v rekombinantnej bunkovej kultúre (Prasad and Sinha (1976) In Vitro 12: 125 - 132; japonská patentová prihláška č. 62-18935; japonská patentová prihláška č. 55-150440; Klehr a kol., (1992) Biochem. 31: 3222 - 3229; Gorman a Hovard (1983) Nucleic Acids Res. 11: 7631 - 7648). Ale, butyrát sodný má rozsah účinku na génovú expresiu pri mnohých bunkových líniách na zloženie médií (D Anna a kol., (1980) Biochem. 19: 2656 - 2671; Ilogopian, H. K. (1977) Celí 12: 855 - 860) a na produkciu proteínu (Milhaud (1980) J. Celí Physiol. 104: 163 - 170; U. K. patentová prihláška č. GB 2 122 207 A) čo naznačuje, že butyrát môže modifikovať génovú expresiu (Yuan a kol., ((1985) J. Biol. Chem. 3778 - 3783) alebo inhibovať expresiu istých génov (Yuan a kol., supra).
Európsky patent č. 0239292 B1 opisuje postup na zvýšenie produkcie proteínu v prítomnosti alkánových kyselín alebo ich solí, akou je kyselina maslová. Publikácia ale poskytuje nedostatočný návod na selekciu vhodných koncentrácií aditív a ďalej sa netýka účinkov aditív na glykozyláciu proteínov. Iní opísali, že pridanie nízkych hladín (0 -1,5 mM) butyrátu sodného do produkčného média bunkovej kultúry na zvýšenie špecifickej produktivity buniek vedie ku konkomitantnému zvýšeniu kyslých glykoforiem (korešpondujúcich zvýšenému obsahu kyseliny sialovej) produkovaných rekombinantných glykoproteínov (Chotigeat a kol.,(1 994) Cytotech., 15: 217 - 221).
Niekoľko skupín študovalo účinky osmolality na rast buniek a na produkciu polypeptidov (Ozturk and Palsson (1991) Biotech. and Bioeng. 37: 989 - 993; Stubblefield a kol., (1960) Cancer Research 20: 1646 - 1655; GarciaPerez a kol., (1989) Joumal of Biological Chemistry. 264: 16815 - 16821; Miner akol., (1981) Invasion Metastasis. 1: 158 - 174; GB 2 251 249; EP 481 791; U. S. patent č. 5 151 359; U. S. patent č. 4 724 206; U. S. patent č. 5 122 469; a WO 89/04867). Boli navrhnuté rôzne rozsahy osmolality pre rast buniek alebo na produkciu polypeptidov. Všeobecne, osmolalita bunkového kultivačného média je zvýšená pridaním NaCl alebo aminokyselín. Stresy z prostredia, ako je zvýšená koncentrácia solí, vedú, v niektorých prípadoch, k zvýšenej produkcii bunkového produktu. Bolo opísané, že zvýšená expresia cicavčích proteínových produktov môže byť dosiahnutá v cicavčích bunkových kultúrach pomocou stresu vychádzajúceho z roztoku, ako je napríklad pridanie soli, kyseliny mliečnej, amoniaku do kultivačného média (Medzinárodná prihláška č. WO 89/04867). Tieto stresy všeobecne inhibujú rast, ale pomáhajú špecifickej produktivite buniek.
Iní diskutovali o účinku koncentrácie glukózy na bunkový rast a/alebo produkciu polypeptidov v rekombinantnej bunkovej kultúre. Pozri napr. Park a kol., (1992) Biotechnology and Bioengineering, 40: 686 - 696; Huang a kol., (1991) Joumal of Biotechnology, 18: 161 - 162; EP 387 840: Reuveny a kol., (1986) Joumal of Immunological Mcthods, 86: 53 - 59; Fine a kol. (1976) In Vitro, 12 (10), 693 - 701; Dircks a kol., (1987) Exp. Eye Res., 44: 951 - 958; Mizutani a kol., (1992) Biochemical and Biophysical Research Communications, 197 (2): 664 - 669; Sugiura (1992) Biotechnology and Bioengineering, 39: 953 - 959; WO 88/01643; Graf a kol., (1989) DECHEMA Biotechnol. Conf., 3: 615 - 618; japonská patentová prihláška č. JP 1-101882; U. S. patent č. 3 926 723: WO 87/00195; a Fleischaker, Jr., Ph. D. Thesis, Massachutsetts Inštitúte of Technology, str. 196 - 229 (6/1982). Predchádzajúce štúdie ale neštudovali účinok rôznych parametrov procesu na obsah kyseliny sialovej v zrelom proteíne, čo je faktor v produkcii glykoproteínov, ktorý je rozhodujúci pre klinický úspech.
Predkladaný vynález opisuje proces na kontrolu obsahu kyseliny sialovej v glykoproteínoch produkovaných cicavčou bunkovou kultúrou.
Podstata vynálezu
Vynálezcovia tohto vynálezu objavili, že isté parametre kultivácie cicavčích buniek ovplyvňujú špecifickú produktivitu buniek, rovnako ako rozsah a typ glykozylácie produkovaných proteínov: presnejšie, vynálezcovia zistili, že isté faktory, ktoré zvyšujú špecifickú produktivitu buniek, majú inverzný účinok na obsah kyseliny sialovej v produkovaných proteínoch. Vynálezcovia preto vymysleli rôzne spôsoby kultivácie buniek na obohatenie jednotlivých glykoforiem glykoproteínov produkovaných v cicavčej bunkovej kultúre.
V súlade s tým poskytuje vynález postup na kontrolu obsahu kyseliny sialovej v glykoproteínoch produkovaných cicavčou bunkovou kultúrou. Podľa tohto aspektu vynálezu vedú odlišnosti v stupni produkcie glykoproteínu v produkčnej fáze bunkovej kultúry k odlišnostiam v obsahu kyseliny sialovej v zrelom glykoproteíne. Presnejšie, zvýšenie špecifickej bunkovej produktivity v priebehu produkčnej fázy glykoproteínu vedie k zvýšeniu obsahu kyseliny sialovej v zrelom proteíne.
Predkladaný vynález v jednotlivom uskutočnení poskytuje odlišnú špecifickú bunkovú produktivitu cicavčej hostiteľskej bunky v priebehu proteínovej produkčnej fázy cicavčej bunkovej kultúry kontrolovaním faktorov, ktoré ovplyvňujú špecifickú produktivitu buniek. Podľa jedného aspektu vynálezu sú kontrolované koncentrácie faktorov, ktoré zvyšujú transkripciu DNA. V inom uskutočnení je špecifická bunková produktivita kontrolovaná udržiavaním osmolality bunkovej kultúry v istých medziach. Podľa vynálezu sú akékoľvek z uvedených faktorov kontrolované, samostatne alebo v kombinácii, na ovplyvnenie obsahu kyseliny sialovej v zrelom glykoproteíne. V jednotlivých uskutočneniach predkladaného vynálezu je faktorom, ktorý zvyšuje DNA transkripciu, alkánová kyselina alebo jej soľ, ako je butyrát sodný, v koncentrácii od asi 0,1 mM do asi 20 mM. Podľa druhého aspektu vynálezu je osmolalita bunkovej kultúry udržiavaná medzi asi 250 - 600 mOsm. V ešte ďalšom aspekte je teplota bunkovej kultúry kontrolovaná medzi asi 30 °C a 37 °C.
Vo výhodnom uskutočnení poskytuje vynález spôsob na zvýšenie obsahu kyseliny sialovej v zrelom glykoproteíne produkovanom cicavčou bunkovou kultúrou, kde tento spôsob obsahuje udržovanie nízkej špecifickej produktivity buniek kontrolovaním akéhokoľvek alebo všetkých z identifikovaných parametrov spôsobu, voliteľne spolu s inými parametrami, ktoré sú dobre známe. Podľa tohto aspektu predkladaného vynálezu poskytuje kultivovanie hostiteľskej bunky v koncentrácii alkánovej kyseliny alebo jej soli od asi 0,1 mM až asi 6 mM, a voliteľne spolu s udržovaním osmolality bunkovej kultúry okolo 300 - 450 mOsm produkuje proteín so zvýšeným obsahom kyseliny sialovej.
V ďalšom výhodnom uskutočnení poskytuje vynález spôsob na zníženie obsahu kyseliny sialovej v zrelom glykoproteíne produkovanom cicavčou bunkovou kultúrou, kde tento spôsob obsahuje zvýšenie špecifickej produktivity bunkovej kultúry. Špecifická produktivita buniek je zvýšená, vo výhodnom uskutočnení, poskytnutím procesu kultivácie buniek, ktorý obsahuje čokoľvek z: kultivovania hostiteľskej bunky v koncentrácii alkánovej kyseliny alebo jej soli okolo 6 mM až asi 12 mM a udržiavanie osmolality bunkovej kultúry okolo 450 - 600 mOsm.
Vynález ďalej opisuje spôsob kultivácie buniek s tromi fázami bunkovej kultúry. Vynález opisuje spôsob na kontrolu obsahu kyseliny sialovej v glykoproteíne produkovanom cicavčou bunkovou kultúrou, ktorý obsahuje kroky kultivovania hostiteľskej bunky, ktorá exprimuje proteín v rastovej fáze počas takého času a pri takých podmienkach, ktoré maximalizujú bunkový rast. Podľa tohto aspektu predkladaného vynálezu je rastová fáza nasledovaná prechodnou, v ktorej sú parametre kultivácie buniek pre požadovaný obsah kyseliny sialovej v zrelom glykoproteíne vybrané a zistené. Prechodná fáza je nasledovaná produkčnou fázou bunkovej kultúry, v ktorej sú udržiavané parametre vybrané v prechodnej fáze a glykoproteínový produkt je produkovaný a získaný. Odlišnosti v špecifickej produktivite buniek v produkčnej fáze spôsobené pridaním alkánovej kyseliny alebo jej soli do kult, média v koncentrácii okolo 0,1 mM až okolo 20 mM a zachovanie osmolality bunkovej kultúry okolo asi 250 a 600 mOsm, voliteľne v kombinácii jeden s druhým, v prechodnej fáze produkuje proteíny s rôznym množstvom kyseliny sialovej.
V ďalšom výhodnom uskutočnení predkladaný vynález opisuje spôsob kontroly množstva kyseliny sialovej prítomnej v solubilnom type 1 chimérického proteínu receptora tumor nekrosis faktora (TNFR-1) a imunoglobulínu G (IgGi). Vynálezcovia predkladaného vynálezu objavili, že pri určitých podmienkach produkcie, môžu byť získané prípravky TNFRl-IgGj glykoformy, ktoré majú požadované vlastnosti predĺženého času odbúrania z krvi a zachovávajú si signifikantnú funkčnú aktivitu. Dlhý funkčný polčas umožňuje zjednodušené, bolusové podávanie a udeľuje in vivo potenciál produkovanému glykoproteínu, čo umožňuje nižšie dávkové formy glykoproteínu.
Podľa tohto aspektu vynálezu je produkovaná TNFR1-IgG] glykoproteínová molekula, ktorá obsahuje viac zvyškov kyseliny sialovej. Parametre bunkovej kultúry pre produkčnú fázu TNFRl-IgG] sú vybrané tak, aby bol získaný požadovaný obsah kyseliny sialovej. Vo výhodnom uskutočnení jc butyrát sodný prítomný v produkčnej fáze v koncentrácii od asi 0,1 do asi 6 mM a osmolalita je udržiavaná asi okolo 300 - 500 mOsm. Vo viac preferovanom aspekte je koncentrácia butyrátu sodného okolo 1 mM a osmolalita je udržiavaná okolo 350 - 400 mOsm.
V ešte inom uskutočnení poskytuje predkladaný vynález prípravu TNFRl-IgG] glykoproteínu produkovaného spôsobom podľa predkladaného vynálezu. Podľa tohto aspektu vynálezu je poskytnutý prípravok, ktorý obsahuje TNFRl-IgG], kde je rozmedzie pH prípravku okolo asi 5,5 a 7,5. Ďalej je poskytnutý TNFRl-IgGi prípravok, ktorý má molámy pomer kyseliny sialovej k proteínu od asi 4 do 7 a hlavne od asi 5 do 6. V ešte inom aspekte má TNFR1-IgG| prípravok od asi 1 do 2 molov odhalených N-acetylglukozamínových zvyškov na mól proteínu. V ešte ďalšom aspekte má prípravok molámy pomer kyseliny sialovej k N-acetylglukozamínu asi od 0,25 do asi 0,5 a najmä okolo 0,4 až 0,45.
Predkladaný vynález taktiež poskytuje terapeutické kompozície obsahujúce uvedené prípravky použiteľné v liečbe TNF- sprostredkovaných patalogických stavov.
I. Definícia
Uhľovodíkové skupiny podľa predkladaného vynálezu budú opísané vzhľadom na bežne používanú nomenklatúru na opis oligosacharidov. Prehľad uhľovodíkovej chémie, ktorý používa túto nomenklatúru, je možné nájsť v Hubbard a Ivatt (1981) Ann. Rev. Biochem. 50: 555 - 583. Táto nomenklatúra zahŕňa napr. Man, čo reprezentuje mannózu, GlcNAc, čo reprezentuje 2-N-acetylglukozamín, Gal, čo reprezentuje galaktózu, a Glc, čo reprezentuje glukózu. Kyseliny sialové sú opísané s odkazom na skratky NeuNAc pre 5-N-acetylneuramínovú kyselinu a NeuNGc pre 5-glykonylneuramínovú kyselinu (J. Biol. Chem., 1982, 257: 3347, J. Biol. Chem., 1982, 257: 3352).
„Osmolalita“ je zmeraný osmotický tlak roztoku rozpustených častíc vo vodnom roztoku. Rozpustené častice zahŕňajú tak ióny, ako i ncionizovanc molekuly. Osmolalita je vyjadrená ako koncentrácia osmotický aktívnych častíc (t. j. osmólov) rozpustených v 1 kg roztoku (I mOsm/kg H2O pri teplote 38 °C je ekvivalentná osmotickému tlaku 19 mm Hg). „Osmolarita“ oproti tomu označuje počet rozpustených častíc v 1 litri roztoku. Pokiaľ je tu použité, znamená skratka „mOsm“ miliosmóly/kg roztoku“.
Ako je tu použité, označuje „glykoproteín“ všeobecné peptidy a proteíny, ktoré majú viac ako asi 10 aminokyselín a aspoň jeden vedľajší polysacharidový reťazec. Glykoproteíny môžu byť homológne pre hostiteľskú bunku, alebo preferovanými môžu byť heterológne, t. j. cudzorodé, pre hostiteľskú bunku, ktoré sú využívané, ako je napríklad ľudský proteín využívaný ovariálnymi bunkami čínskeho škrečka. Výhodne sú použité cicavčie glykoproteíny (glykoproteíny, ktoré sú pôvodne odvodené od cicavčieho organizmu), a ešte lepšie tie, ktoré sú priamo secernované do média. Príklady cicavčích glykoproteínov zahŕňajú molekuly, ako sú cytokiníny a ich receptory vrátane, napríklad tumor nekrosis faktora a ap, ich receptorov (TNF-1, EP 417 563 publikovaná 20. 3. 1991, a TNFR-2, EP 417 014 publikovaná 20. 3. 1991) a ich deriváty; renín, rastový hormón vrátane ľudského rastového hormónu a hovädzieho rastového hormónu, rastový hormón uvoľňujúci faktor, paratyreoidálny hormón, hormón stimulujúci štítnu žľazu, lipoproteíny, alfa-l-antitrypsín, A-reťazec inzulínu, B-reťazec inzulínu, proinzulín, folikulámy stimulačný hormón, kalcitonín, luteinizačný hormón, glukagón, zrážanlivé faktory, ako je faktor VIIIC, faktor IX, pletivový' faktor a von Villebrandov faktor, protizrážanlivé faktory, ako je Proteín
C., atriálny natriuretický faktor, pľúcny surfaktant,: aktivátor plasminogénu, ako je urokináza alebo ľudský močový alebo pletivový typ plasminogénového aktivátora (t-PA), bombezín, trombín, hematopoetický rastový faktor, enkefalináza, RANTES (regulovaný na aktiváciu normálnych buniek exprimovaných a secemovaných), ľudský makrofágový zápalový proteín (ΜΙΡ-1-alfa), sérový albumín, ako je ľudský sérový albumín, mulerian-inhibičná substancia, A-reťazec relaxínu, B-reťazec relaxínu, prorelaxín, myší gonadotropín asociovaný peptid, mikrobiálny proteín, ako je β-laktamáza, DNáza, inhibín, aktivín, vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF), receptory pre hormóny a rastové faktory, integrín, proteín A alebo D, reumatoidné faktory, neurotrofhé faktory, ako je od kosti odvodený neurotrofný faktor (BDNF), neurotrofiny-3,-4,-5 alebo -6 (NT-3, NT-4, NT-5, alebo NT-6), alebo nervové rastové faktory, ako je NGF-β, od doštičiek odvodený rastový faktor (PDGF), fibroblastový rastový faktor, ako je aFGF a bFGF, epidermálny rastový faktor (EGF), transformačný rastový faktor (TGF), ako jc TGF-α a TGF-β, vrátane TGF-βΙ, TGFf2. TGFp3, TGFP4 alebo TGF-P5, inzulínu podobný rastový faktor-I a II (IGF-I a IGF-II), des( 1 -3)-IGF-I (mozgový IGF-I), väzbové proteíny pre inzulínu podobného rastového faktora, CD proteíny, ako je CD-3, CD-4, CD-8 a CD-19, erytropoetín, osteoinduktívne faktory, imunotoxíny: kostný morfogenetický proteín (BMP, inerferón, ako je interferón-alfa, -beta, a -gama, kolónie stimulujúce faktory (CSFs), napr. M-CSF, GM-CSF, a G-CSF, inerleukíny (IL), napr. IL-1 až IL-10, superoxid dismutáza, receptory T buniek, povrchové membránové proteíny, hnilobu akcele rujúci faktor, vírusové antigény, ako je napríklad časť AIDS obalu, transportné proteíny, „homing“ receptory, adrezíny, regulačné proteíny, protilátky, chimerické proteíny, ako sú imunoadhezíny a fragmenty hociktorého z uvedených peptidov.
Termíny „bunkové kultivačné médium“ a „kultivačné médium“ označujú živný roztok použitý na kultiváciu cicavčích buniek, ktorý typicky poskytuje aspoň jednu zložku z jednej alebo viacerých z nasledujúcich kategórií:
1) zdroj energie, obyčajne vo forme uhľovodíka, ako je glukóza,
2) všetky esenciálne aminokyseliny, a obvykle súpravu základných kyselín s cysteínom,
3) vitamíny a/alebo iné organické zlúčeniny vyžadované v nízkych koncentráciách,
4) voľné mastné kyseliny a
5) stopové prvky, kde stopové prvky sú definované ako anorganické zlúčeniny alebo prirodzene sa vyskytujúce prvky, ktoré sú typicky vyžadované vo veľmi nízkych koncentráciách, obyčajne v rozsahu mikromólov.
Živný roztok môže byť voliteľne doplnený jednou alebo viacerými zložkami z ktorejkoľvek z nasledujúcich kategórií:
1) hormóny a rastové faktory, ako je napríklad inzulín, transferín a epidermálny rastový faktor,
2) soli a pufre, ako je napríklad vápnik, horčík a fosfor,
3) nukleozidy a bázy, ako je napríklad adenozín, tymidín a hypoxantín. a
4) proteíny a pletivové hydrolyzáty.
Termíny „cicavčia hostiteľská bunka“, „hostiteľská bunka“ „cicavčia bunka“ a podobne, označujú bunkové línie odvodené od cicavcov, ktoré sú schopné rastu a prežívania, pokiaľ sú umiestnené alebo v monovrstvovej kultúre, alebo suspenznej kultúre v médiu obsahujúcom živiny a rastové faktory. Nevyhnutné rastové faktory pre určitú bunkovú líniu je možné ľahko určiť empiricky bez zbytočného experimentovania, ako je opísané napríklad v Mammalian Celí Culture (Mather, J. P. ed. Plénum Press, N. Y. (1984), a Bames a Sato (1980) Celí., 22: 649. Typicky sú bunky schopné expresie a secernovania veľkých množstiev určitého požadovaného glykoproteínu do kultivačného média. Príklady vhodných cicavčích hostiteľských buniek v kontexte predkladaného vynálezu môžu zahŕňať ovariálne bunky čínskeho škrečka (-DHFR (CHO, Urlaub a Chasin, Proc. Natl. Sci. USA 77: 4216 (1980), dp 12.CHO bunky (EP 307 247 publikovaná 15. 3. 1989), CV1 línia opičích ľadvín transformovaná SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), ľudská embryonálna línia ľadvinových buniek (293 alebo 293 bunky subklonovanej na rast v suspenznej kultúre, Graham a kol., J. Gen Virol., 36: 59 (1977), ľadvinové bunky mláďat škrečka (BHK, ATCC CCL 10), myšie sertoliho bunky (TM4, Mather. Biol. Reprod., 23: 243 - 251 (1980), opičie ľadvinové bunky (CV1 ATCC CCL 70), ľadvinové bunky africkej zelenej opice (VERO-76, ATCC CRL 1587), ľudské cervikálne karcinómové bunky (HELA, ATCC CCL 2), psie ľadvinové bunky (MDCK, ATCC CCL 34), pečeňové bunky buffalo krysy (BRL 3A, ATCC CRL 1442), ľudské pľúcne bunky (V1328, ATCC CCL 75), ľudské pečeňové bunky (Hep G2 , HB 8065), myší tumor presných buniek (MMT 060562, ATCC CCL 51), TRI bunky (Mather a kol., Annals N. Y. Acad Sci. 383: 44 - 68 (1982), MCR 5 bunky, FS4 bunky a ľudská hepatómová línia (Hep G2).
Výhodné hostiteľské bunky zahŕňajú ovariálne bunky čínskeho škrečka (-DHFR (CHO Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)), dpl2 CHO bunky (EP 307 247 publikovaná 15. 3. 1989).
Termín „peptón“ v kontexte predkladaného vynálezu označuje doplnok média, ktorým je esenciálne hydrolyzovaný zvierací proteín. Zdrojom tohto proteínu môžu byť zvieracie produkty z bitúnkov, purifikovaná želatína, alebo to môže byť rastlinný i materiál. Proteín je typicky hydrolyzovaný s použitím kyseliny, tepla alebo rôznych enzýmových prípravkov. Výhodnými peptónovými zmesmi sú napríklad „Primatone RL“ a „Primatone HS“, ktoré sú komerčne dostupné (Sheffield, England).
„Bunková špecifická produktivita“ alebo „bunkový špecifický stupeň“ a podobne, ako sú tu použité, označujú špecifický stupeň expresie produktu meraný na bunku, alebo na bunkovú hmotu alebo objem. Bunková špecifická produktivita je meraná napríklad v gramoch proteínu produkovaných na bunku za deň. Bunková špecifická produktivita môže byť vhodne meraná podľa integrálnej metódy:
dP/dt = qpX alebo p- .
kde qpje konštanta bunkovej špecifickej produktivity, X je počet buniek alebo objem buniek, alebo ekvivalenty hmoty buniek a dP/dt je stupeň produkcie proteínu. Preto, qp môže byť získané z grafu koncentrácie produktu versus časový integrál prežívajúcich buniek (= = „prežívajúcich buniek dní“). Podľa tohto vzorca, pokiaľ je množstvo produkovaného glykoproteínového produktu vynesené proti prežívajúcim bunkám dňami, potom je sklon ekvivalentný k bunkovému špecifickému stupňu. Prežívajúce bunky môžu byť merané niekoľkými meraniami, napríklad, biomasy, stupňom vychytávania O2, laktát dehydrogenázou (LDH), celkovým objemom buniek alebo zákalom.
„Rastová fáza“ bunkovej kultúry označuje periódu exponenciálneho bunkového rastu (log fázu), v ktorej sa bunky všeobecne rýchlo delia. Počas tejto fázy sú bunky kultivované v časovej perióde, obyčajne medzi 1-4 dňami, a pri takých podmienkach, že bunkový rast je maximalizovaný. Určenie rastového cyklu pre vybranú hostiteľskú bunku môže byť určené bez zbytočného experimentovania. „Časová perióda a také podmienky, v ktorých je bunkový rast maximalizovaný“ a podobne, označujú také kultivačné podmienky, ktoré sú pre určitú bunkovú líniu určené ako optimálne na bunkový rast a delenie. Počas rastovej fázy sú bunky kultivované v živnom médiu obsahujúcom nevyhnutné aditíva všeobecne pri 30 - 40 °C, v zvlhčenej, kontrolovanej atmosfére, takže je dosiahnutý' optimálny rast pre určitú bunkovú líniu. Bunky sú udržiavané v rastovej fáze v čase okolo jedného a štyroch dní, obyčajne medzi dvoma a troma dňami.
„Prechodná fáza“ bunkovej kultúry označuje časovú periódu, počas ktorej sú zadané kultivačné podmienky pre produkčnú fázu. Počas prechodnej fázy sú faktory prostredia, ako je teplota bunkovej kultúry, osmolalita média a podobne posunuté z rastových podmienok na produkčné podmienky.
„Produkčná fáza“ bunkovej kultúry označuje časovú periódu, počas ktorej je bunkový rast vo fáze plató. Počas produkčnej fázy je logaritmický bunkový rast ukončený a primárna je produkcia proteínu. Počas tejto časovej periódy je médium doplňované na podporu trvalej produkcie proteínu a na dosiahnutie požadovaného glykoproteínového produktu.
Termín „expresia“, ako je tu použitý, označuje traskripciu a trasláciu vyskytujúcu sa v hostiteľskej bunke. Hladina expresie génového produktu v hostiteľských bunkách môže byť určená buď na základe korešpondujúcej mRNA, klorá je prítomná v bunke, alebo na základe množstva proteínu kódovaného génovým produktom, ktorý je produkovaný bunkou. Napríklad, mRNA mRNA transkribovaná z génu pre produkt je vhodne kvalifikovaná northem hybridizáciou. Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Menual, str. 7.3 - 7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Proteín kódovaný génom pre produkt môže byť vhodne kvantifikovaný buď testovaním na biologickú aktivitu proteínu, alebo použitím testov, ktoré sú nezávislé od takejto aktivity, ako je vestem blotting alebo rádioimunotest s použitím protilátok, ktoré sú schopné reagovať s proteinom. Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, str. 18.1 - 18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Alkánovou kyselinou alebo jej soľou je mienený priamy alebo vetvený reťazec, saturovaný alebo nesaturovaný. Alkánová kyselina má všeobecne jeden do až desať atómov uhlíka, výhodne tri až šesť atómov uhlíka. Príkladom alkánovej kyseliny je kyselina maslová a jej korešpondujúcou soľou je butyrát sodný.
II. Postupy kultivácie buniek
Vynálezcovia tohto vynálezu zistili, že faktory, ktoré zvyšujú bunkovú špecifickú produktivitu v priebehu produkcie glykoproteínu produkovaného kultúrou cicavčích buniek, majú opačný účinok na obsah kyseliny sialovej v produkovanom glykoproteíne. Pretože proteíny exprimujúce jeden alebo viac rezíduí kyseliny sialovej na komplex oligosacharidovej štruktúry majú dlhší čas odbúrania stupeň in vivo, môže byť čas odbúrania produkovaného glykoproteínu manipulovaný v širších limitoch prostredníctvom celkového stupňa sialyzácie prípravku. Predkladaný vynález poskytuje spôsoby na kontrolu rozsahu sialyzácie glykoproteínu produkovaného kultúrou cicavčích buniek. Podľa metodológie, ktorá je tu daná, je možné určiť presné parametre spôsobu, ktoré poskytujú požadovaný obsah kyseliny sialovej v glykoproteíne produkovanom kultúrou cicavčích buniek.
Podľa predkladaného vynálezu je cicavčia hostiteľská bunka kultivovaná na produkciu získateľného glykoproteínového produktu. Celkový obsah kyseliny sialovej v glykoproteíne je kontrolovaný kontrolou parametrov bunkovej kultúry, ktoré ovplyvňujú bunkovú špecifickú produktivitu. Faktory, ktoré ovplyvňujú bunkovú špecifickú produktivitu, sú v odbore dobre známe a zahrnujú, ale nie sú obmedzené na faktory, ktoré ovplyvňujú DNA'RNA počet kópií, faktory, ktoré ovplyvňujú RNA, ako sú faktory, ktoré stabilizujú RNA, živné médiá a iné doplnkové látky, koncentrácia enhancérov transkripcie, osmolalita kultivačného prostredia, teplota pH bunkovej kultúry a podobne. Podľa predkladaného vynálezu úprava týchto faktorov, spolu alebo v kombinácii, na zvýšenie bunkovej špecifickej produktivity generuje proteín so zníženým obsahom kyseliny sialovej. Úprava týchto faktorov, spolu alebo v kombinácii, na zníženie bunkovej špecifickej produktivity, generuje proteín so zvýšeným obsahom kyseliny sialovej.
Vynález bude teraz opísaný vzhľadom na rôzne, vrátane dobre známych, techniky a princípy kultivácie buniek.
Podľa predkladaného vynálezu sú cicavčie bunky kultivované na produkciu požadovaného glykoproteínového produktu. Pri výbere hostiteľskej bunky na produkciu glykoproteínu v kontexte predkladaného vynálezu je dôležité rozpoznať tie hostiteľské bunky, ktoré majú charakteristické a špecifické mechanizmy na transláciu a post-translačné spracovanie a modifikáciu (napr. glykozyláciu, štiepenie)
SK 282658 Β6 exprimovaného proteínu. Vhodné bunkové línie by mali byť vybrané tak, aby bolo zaistené, že požadované post-translačné modifikácie sú možné. Alternatívne môže byť hostiteľská bunka modifikovaná tak, aby exprimovala požadovaný génový produkt nutný na špecifické post-translačné modifikácie.
Cicavčia bunka, ktorá exprimuje požadovaný proteín, by mala exprimovať, alebo by mala byť manipulovaná tak, aby exprimovala, určité enzýmy, takže pri vhodných podmienkach, ktoré sú tu opísané, sa vhodné post-translačné modifikácie vyskytujú in vivo. Enzýmy zahrnujú tie enzýmy, ktoré sú nevyhnutné pre adíciu a kompletáciu N- a O-viazaných uhľovodíkov, akými sú tie, ktoré sú opísané v Hubbard a Ivan supra pre N-viazané oligosacharidy. Tieto enzýmy voliteľne zahrnujú oligosacharyltransferázu, alfa-glukozidázu 1, alfa-glukozidázu II, ÉR alfa (1,2) manozidázu, Golgiho alfa-manodázu I, N-acytelglukozaminyltransferázu I, Golgiho alfa-manodázu II, N-acytelglukozaminyltransferázu II, alfa(l,6)fukozyltransferázu a β(1,4)-galaktozyltransferázu. Okrem toho, hostiteľská buka exprimuje vhodnú sialyl trasferázu, od ktorej sa očakáva, že pripojuje terminálnu sialovú kyselinu vo vhodnej pozícii a je viazaná ako časť genómu hostiteľa. Voliteľne môže byť hostiteľ upravený tak, aby exprimoval vhodné sialyl transferázy, napríklad, transfekciou hostiteľskej bunky DNA kódujúcu sialyl transferázu.
Pri opísaných sialyl transferázach sa očakáva, že pridávajú terminálne rezíduum kyseliny sialovej na vhodný oligosacharid jadrovej štruktúr}', ako je Ga l β l - 4GlcNAc. Vhodné sialyl transferázy v kontexte predkladaného vynálezu zahrnujú, ale nie sú obmedzené na tie sialyl transferázy, ktoré katalyzujú komplexnú sialyzáciu a vetvenie N- a O-viazaných oligosacharidov.
Na kultivovanie cicavčích buniek exprimujúcich požadovaný proteín a schopných predania požadovaných uhľovodíkov v špecifickej pozícii a väzbe môže byť použitých mnoho kultivačných podmienok vzhľadom na kultivovanú hostiteľskú bunku. Vhodné kultivačné podmienky sú dobre známe v odbore (J. Immunol. Methods (1983) 56: 221 - 234) alebo môžu byť odborníkom ľahko určené (pozri napríklad Animal Celí Culture: A Practical Approach 2. vydanie, Rickwood, D. a Hames, B. D. vyd. Oxford University Press, New York, (1992), a odlišujú sa podľa jednotlivej vybranej hostiteľskej bunky.
Cicavčia bunková kultúra podľa predkladaného vynálezu je pripravená v médiu, ktoré je vhodné pre jednotlivú kultivovanú bunku. Komerčne dostupné média, ako je Ham F10 (Sigma), Minimálne Esenciálne médium ((MEM)Sigma), RPMI-1640 (Sigma) a Dulbecovo modifikované Eaglovo médium ((DMEM) Sigma) sú príkladmi živných roztokov. Okrem toho, akékoľvek médium opísané v Ham and Valiace, (1979), Meth. Enz. 58: 44, Bames and Sato, (1980) Anál. Biochem., 102: 255, US patenty č. 4 767 704, 4 657 866,4 927 762, 5 122 469 alebo 4 560 655, medzinárodné prihlášky WO 90/03430 a WO 87/00195, ktorých objavy sú tu uvedené ako odkazy, môžu byť použité ako kultivačné média. Hociktoré z týchto médií môže byť doplnené podľa potreby hormónmi a/alebo inými rastovými faktormi (ako je inzulín, transferín alebo epidermálny rastový faktor), soľami (ako je chlorid sodný, vápnik, horčík a fosfor), puframi (ako je HEPES), nukleozidmi (ako je adenozín a tymidín), antibiotikami (ako je Gentamycin™), stopovými prvkami (definovanými ako anorganické zlúčeniny obyčajne prítomné v konečných koncentráciách v rade mikromólov), lipidy (ako je kyselina linoleová alebo iné mastné kyseliny) a ich vhodnými nosičmi, a glukózou alebo ekvivalentným zdrojom energie. Akékoľvek iné nevy hnutné doplnky môžu byť taktiež zahrnuté vo vhodných koncentráciách, ktoré sú odborníkom známe.
V jednotlivom uskutočnení je cicavčou hostiteľskou bunkou CHO bunka, výhodne dpl2.CHO bunka a vhodné médium obsahuje základnú zložku média, ako je DMEM/HAM F-12 založená formulácia (pre zloženie DMEM a HAM F12 média pozri formuláciu kultivačných médií v Američan Type Culture Collcction Catalogue of CELL Lines and Hybridomas, 6. vydanie, 1988, str. 346 - 349) (formulácie médií opísané v US. patente 5 122 469 sú hlavne vhodné) s modifikovanými koncentráciami určitých zložiek, ako sú aminokyseliny, soli, cukry a vitamíny a voliteľne obsahujúci glycín, hypoxantín a tymidín, rekombinantný ľudský inzulín, hydrolyzovaný peptón, ako je Primatone HS alebo Primatone RL (Sheffield, England), alebo jeho ekvivalent, bunkové ochranné činidlá, ako je Pluronic F68 alebo ekvivalentný pluronický polyol, a stopové prvky.
Glykoproteíny podľa predkladaného vynálezu môžu byť produkované kultivovaním buniek, ktoré exprimujú požadovaný proteín pri rôznych kultivačných podmienkach. Napríklad, postupy kultivácie buniek pre veľké alebo malé rozsahy produkcie proteínov sú potenciálne užitočné v kontexte predkladaného vynálezu. Postupy zahrnujú, ale nie sú obmedzené na, bioreaktor s fluidným lôžkom, bioreaktor s dierovanými vláknami, kultúru v otáčajúcej sa nádobe alebo miešacie tankové bioreaktorové systémy, a môžu byť použité, v posledných dvoch systémoch, s alebo bez mikronosičov, a môžu operovať alternatívne vo vsádkovom, napájanom-vsádkovom alebo kontinuálnom spôsobe.
Vo výhodnom uskutočnení je bunková kultúra podľa predkladaného vynálezu pripravená v miešacom tankovom bioreaktorovom systéme a je využitá napájaná vsádková kultivačná procedúra. Vo výhodnej napájanej vsádkovej kultúre sú cicavčie hostiteľské bunky a kultivačné médium doplňované do kultivačnej nádoby na začiatku a ďalšie kultivačné živiny sú pridávané, kontinuálne alebo v oddelených intervaloch, do kultúry počas kultivovania, s alebo bez periodického zberu buniek a/alebo produktu pred ukončením kultúry. Napájaná vsádková kultúra môže obsahovať napríklad semikontinuálne napájanú vsádkovú kultúru, kde je periodicky celá kultúra (vrátane buniek a média) odstránená a nahradená čerstvým médiom. Napájaná vsádková kultúra sa líši od jednoduchej vsádkovej kultúry, v ktorej sú všetky zložky na kultiváciu buniek (vrátane buniek a kultivačných živín) doplnené do kultivačnej nádoby na začiatku procesu kultivácie. Napájaná vsádková kultúra môže byť ďalej odlíšená od perfuznej kultúry v tom, že supernatant nie je odstránený z kultivačnej nádoby počas procesu (v perfuznej kultúre zostávajú bunky v kultúre, napr. filtráciou, enkapsuláciou, zakotvením na mikročastice atď. a kultivačné médium je kontinuálne alebo prerušovane zavedené a odvádzané z kultivačnej nádoby).
Bunky kultúry môžu byť ďalej propagované podľa akejkoľvek schémy alebo zvyklosti, ktoré sú vhodné pre určitú hostiteľskú bunku a predpokladaný plán určitej produkcie. Preto predpokladá predkladaný vynález jednokrokovú alebo mnohokrokovú kultivačnú procedúru. V jednokrokovej procedúre sú hostiteľské bunky inokulované do kultivačného prostredia a postupy podľa predkladaného vynálezu sú využité počas jednej produkčnej fázy bunkovej kultúry. Alternatívne je uvažované o mnohoštádiovej kultivácii. V mnohoštádiovej kultúre môžu byť bunky kultivované v mnohých krokoch alebo fázach. Napríklad, bunky môžu byť kultivované v prvom kroku alebo rastovej fáze kultúry, kde sú bunky' pravdepodobne odohrané zo zásobníka, inokulované na médium vhodné na navodenie rastu a vysokej životaschopnosti. Bunky môžu byť udržované v rastovej fáze vhodnú časovú periódu pridaním čerstvého média do kultúry hostiteľských buniek.
Podľa výhodného uskutočnenia vynálezu sú vymyslené podmienky napájanej vsádkovej alebo kontinuálnej kultúry na posilnenie rastu cicavčích buniek v rastovej fáze bunkovej kultúry. V rastovej fáze sú bunky kultivované pri takých podmienkach a počas takého času, aby bol maximalizovaný rast. Kultivačné podmienky, ako je teplota, pH, rozpustený kyslík (dO2) a podobne sú tie, ktoré sú použité pre určitého hostiteľa a budú jasné odborníkom v odbore. Všeobecne, pH je upravené na hodnotu asi 6,5 a 7,5 použitím kyseliny (napr. CO2) alebo bázy (napr. Na2COj alebo NaOH). Vhodné rozpätie teplôt na kultiváciu cicavčích buniek, ako sú CHO bunky je medzi asi 30 až 38 °C a vhodný dO2 je asi 5 až 90 % saturácie vo vzduchu.
V určitom štádiu môžu byť bunky použité na inokuláciu produkčnej fázy alebo kroku kultúry'. Alternatívne, ako je opísané, produkčná fáza alebo krok môže pokračovať z inokulačnej alebo rastovej fázy alebo kroku.
Podľa predkladaného vynálezu je prostredie bunkovej kultúry počas produkčnej fázy bunkovej kultúry kontrolované. Podľa postupu podľa predkladaného vynálezu sú ovplyvňované faktory ovplyvňujúce špecifickú produktivitu buniek cicavčích hostiteľských buniek, takže je dosiahnutý požadovaný obsah kyseliny sialovej vo výslednom glykoproteíne. Faktory, ktoré zvyšujú bunkovú špecifickú produktivitu, sú kontrolované počas produkčnej fázy procesu kultivácie buniek, takže vzniknutý glykoproteínový produkt obsahuje požadované množstvo kyseliny sialovej.
Vo výhodnom uskutočnení produkčnej fáze spôsobu kultivácie buniek predchádza prechodná fáza bunkovej kultúry, v ktorej sú stanovené parametre pre produkčnú fázu bunkovej kultúry.
Podľa jedného aspektu predkladaného vynálezu je manipulované s koncentráciou enhancérov transkripcie, ako je alkánová kyselina, na ovplyvnenie bunkovej špecifickej produktivity, teda na ovplyvnenie výsledného obsahu kyseliny sialovej v glykoproteínovom produkte cicavčích buniek. Alkánová kyselina môže byť akákoľvek z mnoho jednoduchých alebo rozvetvených alkánových kyselín, ktoré zvyšujú transkripciu cicavčích proteínov.
Výhodne je alkánovou kyselinou kyselina maslová a hlavne jej soľ, butyrát sodný.
Podľa predkladaného vynálezu je koncentrácia butyrátu sodného kontrolovaná na kontrolu bunkovej špecifickej produktivity. Koncentrácie butyrátu sodného medzi 0,1 a 20 mM sú použité a modifikované podľa určitého hostiteľa, ktorý je kultivovaný a podľa požadovaného obsahu kyseliny sialovej v produkovanom glykoproteíne. Na generovanie proteínu s požadovaným obsahom kyseliny sialovej je vybraná koncentrácia butyrátu sodného, ktorá poskytuje najvyššiu bunkovú špecifickú produktivitu s najviac akceptovateľným profilom kyseliny sialovej. Preto je podľa predkladaného vynálezu vybraná koncentrácia enhancéra transkripcie, ako je butyrát sodný tak, aby bol získaný požadovaný obsah kyseliny sialovej.
Na zvýšenie obsahu kyseliny sialovej v zrelom glykoproteine sú vybrané nižšie koncentrácie enhancéra transkripcie. Nižšie koncentrácie umožňujú posilnenie transkripcie, ale uchovávajú nižšiu bunkovú špecifickú produktivitu pri zachovaní životaschopnosti kultúry hostiteľských buniek. Všeobecne sú použité koncentrácie enhancérov transkripcie, ako je butyrát sodný, medzi 0,1 a 8 mM. Výhodne sú použité koncentrácie okolo asi 1,0 a 6,0 mM. V jednotlivom uskutočnení je použité okolo 6mM butyrátu sodného. V inom uskutočnení je použité okolo 1 mM butyrátu sodného.
V inom uskutočnení je produkovaný glykoproteín so zníženou hladinou kyseliny sialovej. Podľa tohto aspektu predkladaného vynálezu sú cicavčie bunky kultivované pri takých podmienkach, že bunková špecifická produktivita je zvýšená. Podľa tohto aspektu prekladaného vynálezu je koncentrácia alkánovej kyseliny alebo iného vhodného enhancéra transkripcie vybraná tak, že zvýšená špecifická bunková produktivita generuje proteín s požadovaným profilom kyseliny sialovej. Vo výhodnom uskutočnení je koncentrácia alkánovej kyseliny alebo jej soli asi okolo 5 až 20 mM, výhodne medzi asi 6 mM a 12 mM. V určitom uskutočnení je koncentrácia butyrátu sodného okolo 12 mM.
Určenie koncentrácie enhancéra transkripcie, ako je alkánová kyselina alebo jej soľ, vyplýva z obrázku 2, rovnako ako z tabuľky 1 a ďalej v príklade 1. Podľa predkladaného vynálezu vedú všeobecne nižšie koncentrácie butyrátu sodného k nižšej špecifickej produktivite. Podľa predkladaného vynálezu sú koncentrácie butyrátu sodného vybrané vzhľadom na iné parametre procesu, ako je osmolalita produkčnej fázy. Ako je diskutované ďalej, osmolalita môže ovplyvňovať bunkovú špecifickú produktivitu. Koncentrácie butyrátu sú vybrané vzhľadom na určitú osmolalitu, ktorá je udržovaná počas produkčnej fázy.
Alternatívne, pre iné cicavčie hostiteľské bunky a pre iné glykoproteíny, môžu byť pripravené malé testovacie kultúry a stupeň produkcie glykoproteínového produktu, t. j. bunková špecifická produktivita, môže byť určená a výsledný obsah kyseliny sialovej môže byť použitý na prípravu podobnej tabuľky a obrázku pre určitého hostiteľa, ktorý je kultivovaný, vzhľadom na to, že zníženie bunkovej špecifickej produktivity vedie k zvýšeniu obsahu kyseliny sialovej v produkovanom glykoproteíne. Alkánová kyselina alebo jej soli, ako je butyrát sodný alebo iný vhodný enhancér transkripcie, je pridaný do kultúry hostiteľských buniek asi v čase, keď je iniciovaná produkčná fáza bunkovej kultúry. Vhodne je využitá prechodná fáza počas procesu kultivácie buniek, ktorá predchádza produkčnej fáze, v ktorej sú zaistené kultivačné podmienky uvedené pre požadovanú bunkovú špecifickú produktivitu a teda pre požadovaný profil glykoforiem.
Alkánová kyselina alebo jej soľ je pridaná akýmikoľvek prostriedkami, ktoré sú v odbore známe. Výhodne je butyrát sodný pridaný vo vsádke do napájaného vsádkového kultivačného systému s alebo bez vhodných živín, ako sú tu opísané alebo ako sú známe v odbore cicavčích bunkových kultúr.
Podľa predkladaného vynálezu je ďalej, okrem uvedených faktorov, kontrolovaná osmolalita prostredia kultivácie buniek na reguláciu rozsahu sialyzácie zrelého glykoproteínu. V jednom príklade je osmolalita kontrolovaná pre kontrolu obsahu kyseliny sialovej v zrelom proteíne nezávisle od iných faktorov, ktoré ovplyvňujú bunkovú špecifickú produktivitu. V inom príklade je osmolalita kontrolovaná spolu s kontrolovaním iných faktorov, ktoré ovplyvňujú bunkovú špecifickú produktivitu. Výhodne je kontrolovaná jednak osmalalita, tak aj koncentrácia alkánovej kyseliny.
Osmolalita prostredia kultivácie buniek je kontrolovaná na vytvorenie na produkciu požadovanej rovnováhy medzi bunkovou špecifickou produktivitou a profilom kyseliny sialovej vo výslednom glykoproteíne. Všeobecne, bunková špecifická produktivita je zvýšená, pokiaľ je osmolalita zvýšená. Osmolalita, ktorá produkuje proteín s požadovanou kyselinou sialovou je vybraná vzhľadom na to, že zvý7 šenie osmolality všeobecne vedie k zvýšeniu stupňa produkcie určitého proteínu. Na zníženie stupňa produkcie a na zvýšenie obsahu kyseliny sialovej v zrelom glykoproteíne je osmolalita všeobecne udržiavaná na nízkych hladinách pre určitý typ buniek, ktorý je kultivovaný.
Pre cicavčie bunkové kultúry je osmolalita kultivačného média udržovaná okolo 290 - 330 mOsm. Viacmenej, zvýšenie osmolality vedie k zvýšeniu stupňa produkcie proteínu. Osmolalita je vybraná tak, aby stupeň produkcie korešpondoval s požadovaným profilom produktu. Na zvýšenie obsahu kyseliny sialovej je stupeň produkcie znížený a osmalilata je udržovaná v nižších medziach vzhľadom na určitú kultivovanú hostiteľskú bunku. Osmolalita v medziach od asi 250 mOsm do asi 450 mOsm je vhodná pre zvýšený obsah kyseliny sialovej. Výhodne, osmolalita je udržiavaná asi medzi 300 - 450 mOsm, v súlade s týmto aspektom predkladaného vynálezu, výhodnejšie medzi 350 - 400 mOsm a najvýhodnejšie okolo 400 mOsm.
Pre nižší obsah kyseliny sialovej je vybraná osmolalita, ktorá poskytuje zvýšený stupeň produkcie. Podľa tohto aspektu predkladaného vynálezu je osmolalita udržiavaná asi okolo 350 až 600 mOsm, výhodne okolo 450 - 550 mOsm.
Skúsení odborníci vedia, že osmolalita média je závislá od koncentrácie osmoticky aktívnych častíc v kultivačnej tekutine a že mnoho premenných, ktoré vytvárajú kultivačné médium cicavčích buniek, ovplyvňuje osmolalitu. Počiatočná osmolalita kultivačného média je určená zložením kultivačného média. Osmolalita môže byť meraná použitím osmometra, ako je ten, ktorý je dostupný od Fisher Scientefic, Pittsburgh, Pennsylvania, pod názvom OSMETTE (alebo Osmette model 2007, dostupný od Precision Systems, Inc., Natick, MA). Na dosiahnutie osmolality v požadovanom rozsahu musí byť koncentrácia rôznych konštituentov v kultivačnom médiu upravená.
Roztoky, ktoré môže byť pridané do kultivačného média tak, aby sa zvýšila jeho osmolalita, zahrnujú proteíny, ako sú peptidy, aminokyseliny, hydrolyzované zvieracie proteíny, ako sú peptóny, nemetabolizovateľné polyméry, vitamíny, ióny, soli, cukry, metabolity, organické kyseliny, lipidy a podobne. V jednom príklade je osmolalita kontrolovaná pridaním peptónu do bunkovej kultúr)' spolu s inými zložkami kultivačného média počas napájanej vsádkovej kultivačnej procedúry.
Podľa predkladaného vynálezu je osmolalita udržovaná alebo upravená na požadovaný rozsah pridaním napríklad formulácie základného média obsahujúceho aminokyseliny, rôzne soli (napr. NaCl) spolu s peptónom. Výhodne je médium doplnené, napríklad základným kultivačným médiom obsahujúcim nadbytok aminokyselín (pozri napr. „Super“ médium podľa US patentu č. 5 122 469), glukózy a peptónu.
Bude však ocenené, že koncentrácie iných zložiek kultivačného média, môžu byť modifikované na dosiahnutie rozmedzia osmolality, ako je to opísané. Prerušovaným alebo kontinuálnym kontrolovaním koncentrácie glukózy (primárneho zdroja energie), napríklad v kultivačnom médiu počas kultivácie, môže byť osmolalita média udržovaná okolo požadovaného určeného rozmedzia. Kontrolovanie koncentrácie glukózy slúži na poskytnutie adekvátneho zdroja uhlíka pre bunky a simultánne kontroluje produkciu kyseliny mliečnej hostiteľskými bunkami. To je výhodné preto, že sa limituje pokles pH v kultivačnom médiu, ktorý vyžaduje pridanie neutralizačnej látky (napr. bázy, ako je Na2CO3 alebo NaOH), čo spôsobuje zvýšenie osmolality.
Médium môže byť doplnené na udržovanie osmolality v istých medziach podľa akejkoľvek schémy pre udržovanie bunkovej kultúry. Výhodne je kultivačným systémom napájaný vsádkový kultivačný systém a médium je doplnené vo vsádke živín počas produkčnej fázy bunkovej kultúry. Ďalej môže byť médium doplnené počas produkčnej fázy, ako j c opísané ďalej.
Alternatívne môže byť uskutočnené off-line vzorkovanie kultivačného média. Osmolalita kultivačného média môže potom byť modifikovaná modulovaním živného roztoku podľa potreby.
Odborníci pochopia, že postupy kultivácie buniek podľa predkladaného vynálezu sú vybrané tak, aby bola dosiahnutá požadovaná hladina sialyzácie produkovaného proteínu. Ďalšie parametre procesu okrem tých, ktoré sú tu opísané a ktoré ovplyvňujú stupeň sialyzácie, zahŕňajú hladinu kyslíka a hladinu glukózy. Kultivačná hustota, čas a skladovacie podmienky, ako je teplota, taktiež ovplyvňujú sialyzáciu. Predkladaný vynález je zamýšľaný tak, aby obsahoval tie parametre procesu, ktoré sú ďalej najviac vhodné na zvýšenie sialyzácie.
III. Získanie glykoproteínu
Po produkčnej fáze polypeptidu je požadovaný polypeptid odobraný z kultivačného média pomocou techník, ktoré sú v odbore dobre známe.
Požadovaný polypyeptid je výhodne získaný z kultivačného média ako sekretovaný polypeptid, hoci môže taktiež byť získaný z lyzátu hostiteľských buniek.
Ako prvý’ krok je kultivačné médium alebo lyzát centrifugovaný s cieľom odstrániť drviny. Polypeptid je potom purifikovaný od kontaminujúcich solubilných proteínov a polypeptidov, kde nasledujúce postupy môžu byť príkladmi vhodných purifikačných postupov: fiakcionácia na imunoafinitných alebo iónových výmenných kolónach, precipitácia etanolom, reverzná fáza HPLC chromatografie na silikagéli alebo katexovej živici, ako je DEAE, chromatofokusovanie, SDS-PAGE, precipitácia síranom amónnym, gélová filtrácia s použitím napríklad Sephadex G-75, a proteín A Sepharosovej kolóny na odstránenie kontaminantov, ako je IgG. Inhibítory proteáz, ako je fenyl-metyl-sulfonyl fluorid (PMSF), môžu byť taktiež užitočné na inhibíciu proteolytickej degradácie počas purifikácie. Odborník v odbore ocení, že metódy purifikácie pre požadovaný polypeptid môžu vyžadovať modifikácie podľa zmien v charaktere polypeptidov počas expresie v rekombinantnej bunkovej kultúre.
V kontexte predkladaného vynálezu sú najmä preferované purifikačné techniky a procesy, ktoré selektujú uhľovodíky podľa vynálezu. Požadované glykoformy podľa predkladaného vynálezu môžu byť obohatené o kyselinu sialovú obsahujúcu molekuly napríklad iónovou výmennou chromatografiou na mäkkom géli alebo HPLC s použitím katiónových alebo aniónových výmenných živíc, kde je zhromždených viac acidických frakcií.
IV. Analýzy glykoproteínu
Komplexná uhľovodíková časť glykoproteínu produkovaného procesmi podľa predkladaného vynálezu môže byť ľahko analyzovaná, pokiaľ je to požadované, konvenčnými technikami analýzy uhľovodíkov. Tak napríklad technika, akou je lectin-blotting, ktorá je v odbore dobre známa, ukazuje proporcie tenninálnej manózy alebo iných cukrov ako je galaktóza. Ukončenie mono-, bi-, tri-, alebo tetra-antenárnych oligosacharidov sialovými kyselinami môže byť potvrdené uvoľnením cukrov z proteínov použitím anhydrického hydrazínu alebo enzymatických metód a frakcionáciou oligosacharidov iónovou výmennou chromatografiou alebo chromatografiou s vylučovaním podlá veľkosti, alebo inými v odbore dobre známymi metódami.
Taktiež môže byť meraný pi glykoproteínu, pred ošetrením a po ošetrení nueraminidázou na odstránenie sialových kyselín. Zvýšenie v pi po ošetrení neuraminidázou ukazuje na prítomnosť sialových kyselín v glykoproteíne.
Uhľovodíkové štruktúry podľa predkladaného vynálezu sa vyskytujú na proteínc ako N-viazané alebo O-viazané uhľovodíky. N-viazané a O-viazané uhľovodíky sa líšia primáme vo svojej jadrovej štruktúre. N-viazaná glykozylácia označuje pripojenie uhľovodíkovej skupiny prostredníctvom GlcNac na asparagínový zvyšok v peptidovom reťazci. N-viazané uhľovodíky všetky obsahujú spoločnú Manl-6 (Manl-3)Manpi-4GlcNac[5l-4GlcNacp-R jadrovú štruktúru. Preto v opísanej jadrovej štruktúre je R asparagínový zvyšok produkovaného proteínu. Peptidová sekvencia produkovaného proteínu bude obsahovať asparagín-X-serín, asparagín-X-treonín a asparagín-cysteín, kde X je akákoľvek aminokyselina okrem prolínu. O-viazané uhľovodíky, oproti tomu, sú charakterizované spoločnou jadrovou štruktúrou, s GalNAc pripojeným na hydroxylovú skupinu treonínu alebo serínu. Z N-viazaných a O-viazaných uhľovodíkov sú najdôležitejšie komplexy N- a 0-viazaných uhľovodíkov. Takéto komplexy uhľovodíkov budú obsahovať niekoľko alternatívnych štruktúr. Mono-, bi-, tri-, a tetra- vonkajšie štruktúry sú dôležité pre pridanie terminálnych sialových kyselín. Takéto štruktúry vonkajšieho reťazca poskytujú ďalšie miesta pre špecifické cukry a väzby, ktoré obsahujú uhľovodíky podľa predkladaného vynálezu.
Vzniknuté uhľovodíky môžu byť analyzované akoukoľvek metódou v odbore známou vrátane tých, ktoré sú tu opísané. V odbore existuje niekoľko metód na glykozylačné analýzy, ktoré sú použiteľné v kontexte predkladaného vynálezu. Takéto metódy poskytujú informácie týkajúce sa identity a zloženia oligosacharidov pripojených na peptid. Metódy na analýzu uhľovodíkov použiteľné v predkladanom vynáleze zahrnujú, ale nie sú obmedzené na lektínovú chromatografiu, HPAEC-PAD, ktorá využíva aniónovú výmennú chromatografiu s vyšším pH na separovanie oligosacharidov na základe náboja, NMR, hmotovú spektrometriu, HPLC, GPC, monsacharidové kompozičné analýzy, sekvenčné enzymatické štiepenie.
Ďalej sú známe metódy na uvoľnenie oligosacharidov. Tieto metódy zahŕňajú: 1) enzymatickú, ktorá je obvykle robená s použitím pepti-N-glykozidázy F/endo-[l-galaktozidázy, 2) β eliminácie s použitím tvrdého alkalického prostredia na uvoľnenie najmä O-viazaných štruktúr, a 3) chemickej metódy s použitím bezvodého hydrazínu na uvoľnenie tak 0-, ako i N-viazaných oligosacharidov.
Analýzy môžu byť robené použitím nasledujúcich krokov:
1. Dialýzou vzorky oproti deionizovanej vode, na odstránenie všetkých pufŕovacích solí, a potom lyofilizáciou.
2. Uvoľnením intaktných oligosacharidových reťazcov bezvodým hydrazínom.
3. Ošetrením intaktných oligosacharidových reťazcov bezvodou metanolickou HC1 na uvoľnenie jednotlivých monosacharidov ako O-metyl derivátov.
4. N-acetyláciou akýchkoľvek primárnych aminoskupín.
5. Derivatizáciou na získanie per-O-trimetylsilyl metyl glykozidov.
6. Separáciou týchto derivátov kapilárnou GLC (plynovo-kvapalinovou chromatografiou) na CP-SIL8 kolóne.
7. Identifikáciou jednotlivých derivátov FID s vnútorným štandardom (13-0-metyl-D-glukóza).
8. Neutrálne a aminocukry môžu byť identifikované aniónovou výmennou chromatografiou s vysokou rozlišo vacou schopnosťou kombinovanou s pulznou ampérometrickou detekciou (HPAE-PAD Carbohydrate Systém, Dionex Corp.). Napríklad, cukry môžu byť uvoľnené hydrolýzou v 20 % (objem/objem) kyseline trifluóroctovej pri 100 °C počas 6 hodín. Hydrolyzáty sú potom sušené lyofilizáciou alebo na Spccd-Vac (Savant Instruments). Zvyšky sú potom rozpustené v 1 % roztoku trihydrátu octanu sodného a sú analyzované na HPLC-AS6 kolóne, ako je opísané Anumulom a koľ, (Anál. Biochem. 195: 269 - 280 (1991).
Kyselina sialová môže byť určená separátne podľa priamej kolorimetrickej metódy podľa Yao a kol., (Anál. Biochem. 179: 332 - 335 (1989) v troch vzorkách. Výhodne je použitá kyselina tiobarbiturová (TBA) podľa Vareena, L., J. Biol. Chem. 238: (8) (1959).
Alternatívne môže byť urobená imunoblotová analýza uhľovodíkov. Podľa tohto postupu sú na proteíny naviazané uhľovodíky detegované použitím komerčného glykánového detekčného systému (Boehringer), ktorý je založený na oxidatívnom imunoblotovom postupe, ktoiý opísal Haselbeck and Hosel (Haselbeck et al., Glycoconjugate J., 7: 63 (1990). Je postupované podľa protokolu farbenia odporúčaného výrobcom s výnimkou toho, že proteín je prenesený do polyvinyldifluoridovcj membrány namiesto do nitrocelulózovej membrán}' a že blokujúci pufer obsahuje 5 % hovädzieho sérového albumínu v 10 mM tris pufn, pH 7,4 s 0,9 % chloridom sodným. Detekcia je vykonaná konjugátom anti-digoxigeninových protilátok naviazaných na alkalickú fosfatázu (Boehringer), 1 : 1000 riedenie v tris pufrovanom salinickom roztoku s použitím fosfatázových substrátov. 4-nitroblue tetrazolium chlorid, 0,03 % (hmotnosť/objem) a 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-fosfát 0,03 % (hmotnosť/objem) v 100 mM tris pufŕi, pH 9,5, obsahujúci 100 mM chloridu sodného a 50 mM chloridu horečnatého. Proteínové prúžky obsahujúce uhľovodík sú obyčajne vizualizované asi 10 až 15 minút.
Uhľovodíky môžu byť taktiež analyzované štiepením peptid-N-glykozidázou F. Podľa tohto postupu je zvyšok suspendovaný v 14 μΐ pufra obsahujúceho 0,18 % SDS., 18 mM (3-merkaptoetanolu, 90 mM fosfátu, 3,6 mM EDTA pri pH 8,6 a zahriaty na 100 °C počas 3 minút. Po ochladení na izbovú teplotu je vzorka rozdelená do dvoch rovnakých častí. Jedna alikvotná časť nie je ďalej ošetrená a slúži ako kontrola. Druhá frakcia je upravená na asi 1 % NP-40 detergentom a potom nasleduje ošetrenie 0,2 jednotkami peptid-N-glykozidázy F (Boehringer). Obidve vzorky sú zohriate na 37 °C počas 2 hodín a potom sú analyzované SDS-polyakrylamidovou gélovou elektroforézou.
V. Chiméry receptora tumor nekrosis faktora s imunoglobulínom
Vo výhodnom uskutočnení sú postupy podľa predkladaného vynálezu použité na produkciu chimér receptora tumor nekrosis faktora (TNFR) s Imunoglobulínom (Ig). V tejto triede chimerických proteínov je najmä preferovaný solubilný typ 1 TNFR IgG,. Produkované TNFRl-IgGi chiméry sú užitočné v liečbe alebo v diagnostike TNF-sprostredkovaných alebo s TNF súvisiacich ochorení a porúch. Termín „liečba“ v tomto kontexte zahŕňa profylaxiu (prevenciu), supresiu (napr. symptómov) i liečbu existujúcich stavov. Patalogické stavy asociované s TNF zahŕňajú, ale nie sú obmedzené, na gramnegatívne a grampozitívne baktérie, endotoxický šok, fenomén rejekcie štepov, reumatoidnú artritídu, systémový lupus, Crohnovu chorobu a iné autoimunitné a zápalové choroby asociované s TNF.
TNFRl-IgG] prípravky podľa predkladaného vynálezu sú užitočné v tých indikáciách, kde bol zistený úžitok mo noklonálnych protilátok proti TNF. Napríklad, bolo zistené, že monoklonálne protilátky proti TNF-alfa majú ochranný účinok, pokiaľ sú podané profylaktický (Tracey, K. J. a kol., (1987), Náture 330; 662) . Vo fáze I klinickej štúdie opísal Exly, A. R. a kol., (1990) Lancet 335: 1275 myšiu monoklonálnu protilátku k ľudskému TNF-alfa ako bezpečnú, pokiaľ je podaná pacientom so závažným septickým šokom. TNFRl-IgG] je vhodne používaný v liečbe reumatoidnej artritídy, rovnako ako septického šoku.
Pri liečbe ochorení alebo porúch asociovaných s TNF je terapeuticky aktívne množstvo TNFR-IgG, prípravku podané subjektu, ktorý potrebuje takúto liečbu. Výhodným subjektom je človek.
Účinné množstvo TNFR-IgG] glykoformového prípravku podľa predkladaného vynálezu na liečbu chorôb alebo porúch je v dávkovom rozsahu 0,01 - 100 mg/pacienta, výhodne 1 mg - 75 mg/pacienta a najvýhodnejšie okolo 10 a okolo 50 mg/pacienta.
Na podanie by TNFRl-IgG] prípravok mal byť formulovaný do vhodnej farmaceutickej alebo terapeutickej kompozície. Takéto kompozície typicky obsahujú terapeuticky aktívne množstvo TNFRl-IgG] prípravku a farmaceutický akceptovateľný excipient alebo nosič, ako je salinický roztok, pufrovaný salinický roztok, dextróza alebo voda. Kompozície môžu obsahovať špecifické stabilizačné činidlá, ako sú cukry vrátane manózy a manitolu, a lokálne anestetiká pre injekovateľné kompozície vrátane napríklad Iidokaínu.
Predkladaný vynález poskytuje kompozície, ktoré ďalej obsahujú terapeuticky aktívne množstvo ďalších aktívnych prísad, ako sú monoklonálne protilátky (napr. anti-TNF protilátky, protilátky k Mac 1 alebo LFA 1) alebo iné receptory asociované s produkciou TNF, napr. IL-1 alebo IL-2 receptory, atď.
Výhodná terapeutická kompozícia na mono- alebo na kombinovanú terapiu, ako je uvedené, obsahuje nový TNFRl-IgG] prípravok podľa predkladaného vynálezu, ktorý má predĺžený čas odbúrania z krvi a zachováva si signifikantnú funkčnú aktivitu. Takýto predĺžený funkčný polčas umožňuje zjednodušené, bolusové podávanie a poskytuje potenciál in vivo. Preferované TNFRl-IgG] chiméry v terapeutických kompozíciách obsahujú TNFRl-IgG] a prípravky tu opísané, napríklad:
1) TNFRl-IgG] prípravky obsahujúce komplex oligosacharidov ukončený jedným alebo viacerými zvyškami kyseliny sialovej,
2) TNRFl-IgG] prípravky, kde rozmedzie izoelektrického bodu pi prípravku je medzi 5,5 a 7,5 ako je určené chromatofokusovaním, v ktorom je pi senzitívne na ošetrenie neuraminidázou,
3) TNFRl-IgG] prípravky s okolo 1 - 2 molov exponovaných N-acetylglukozamínových zvyškov na mól proteínu,
4) TNRFl-IgG] prípravky s molárnym pomerom kyseliny sialovej k proteínu okolo 4-7, najmä okolo 5 - 6,
5) TNRFl-IgG] prípravky s molárnym pomerom kyseliny sialovej k proteínu okolo 0,35 - 0,5, najmä okolo 0,4 - 0,45.
Spôsoby podania pre jednotlivé alebo pre kombinované terapeutické kompozície podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú štandardné spôsoby, ako je napríklad intravenózna infúzia alebo bolusová injekcia.
Je tiež poskytnuté použitie TNRFl-IgG] prípravku podľa predkladaného vynálezu vo výrobe liečiv a na liečbu zvierat a ľudí.
Po všeobecnom opise vynálezu bude tento lepšie pochopiteľný pomocou nasledujúcich príkladov, ktoré sú pos kytnuté na ilustráciu a neobmedzujú predkladaný vynález, pokiaľ nie je inak uvedené.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1A a obrázok 1B: Obrázky 1A a 1B ukazujú metódu použitú na počítanie špecifickej produktivity typického spôsobu kultivácie buniek v produkčnej fáze. Špecifická produktivita môže byť vyjadrená ako funkcia počtu živých buniek (dní živých buniek), ako je to ukázané na obrázku 1A, alebo ako súhrnný objem buniek (PCV), ako je ukázané na obrázku 1B. Stupeň špecifickej produkcie je daný v rozsahu pre 90 % interval spoľahlivosti.
Obrázok 2A a obrázok 2B: Obrázky 2A a 2B ukazujú koreláciu medzi špecifickou produktivitou na základe dní živých buniek (obrázok 2A) súhrnným objemom buniek (PCV) (obrázok 2B) počas produkčnej fázy a obsahom kyseliny sialovej (NANA) získaného produktu. Sú ukázané hodnoty pre 9 rôznych spôsobov (A-I). Údaje reprezentujú nezávislé procesy produkcie, ako sú opísané v tabuľke 1.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Biologické účinky TNF-alfa a TNF-beta sú sprostredkované cez špecifické receptory (Dembic a kol., (1990), Cytokines, 2, 231). Molekulárne klonovanie ukázalo existenciu dvoch rôznych typov TNF receptorov (TNFR) so zreteľnou molekulovou hmotnosťou 55 kDa (typ I) (Schall a kol., (1990) Celí 61: 361) a 75 kDa (typ II) (Smith a kol., (1990), Science, 248: 1019), kde sa každý prirodzene viaže ako na TNF-alfa, tak na TNF-beta (Loetscher a kól., (1990) Celí, 61: 351, Shall a kol., (1990) Celí, 61: 361, Kohno a kol., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8331). Extracelulárne časti oboch receptorov sú prirodzene nachádzané ako solubilné TNF väzbové proteíny (Kohno a kol., vyššie). Boli vytvorené TNF agonisty, ktoré blokujú škodlivé účinky TNF v rôznych imunitných a zápalových procesoch (Peppel a kol., (1991) J. Exp. Med., 174: 1483 - 1489, Ulich (1993) Am. J. Path., 142: 1335 - 1338, Hovard, O. M. Z. (1993) Proc. Natl. Sci. USA 90: 2335 - 2339, Voley, P. H. (1993), J. Immunol. 151: 6602 - 6607). Jeden takýto agonista (Vemer a kol., (1991) J. Celí Biochem., Abstracts, 20 th annual meeting, str. 115) kombinuje extracelulárnu doménu ľudského 55 kDa typu 1 TNFR s časťou spojovacieho a Fc regiónov ťažkého reťazca ľudského imunoglobulínu Gl.
V tomto príklade boli kultivované cicavčie bunky transfektované vektorom obsahujúcim cDNA kódujúcu TNFRl-IgG] chiméru.
Metódy
A. Bunková línia
Ovariálna bunková línia čínskeho škrečka (CHO) použitá ako cicavčia hostiteľská bunková línia bola odvodená od CHO-K1 (ATCC č. CCL6 CHO Kl). Mutantná CHO-K1 dihydrofolát reduktäza (DHFR) deficientná bunková línia označená CHO-K1 DUX-B11 (DHFR-) (získaná od Dr. L. Chasina z Columbia University, Simonsen, C. C. and Levinson, A. D. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495 - 2499, Urlaub G., and Chasin, L. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 - 4220) bola potom použitá na získanie bunkovej línie s redukovanou požiadavkou na inzulín transfekciou vektorom obsahujúcim cDNA pre preproinzulín (Sures a kol., (1980) Science, 208: 57 - 59). Se lektovaný kloň označený dpl2.CHO vyžaduje glycín, hypoxantín a tymidín pre rast, čo potvrdzuje jeho DHFR - genotyp.
B. Konštrukcia solubilný typ TNFR-IgG] chiméry
Solubilný typ TNFR-IgG] chiméra bola konštruovaná génovou fuziou extracelulámej domény ľudského typu 1 TNFR so spojovacím regiónom CH2 a CH3 doménami ťažkého reťazca IgG1 je ďalej označovaná TNFRl-IgG]).
DNA sekvencie kódujúce ľudský typ 1 TNFR (pozri Loetscher a kol., vyššie) bola získaná z plazmidu pRK-TNF-R (Schall a kol., Celí 61: 361 (1990). Na konštrukciu tohto začiatočného plazmidu bol 2,1 kb placentálny cDNA kloň (Schall a kol., vyššie) inzertovaný do cicavčieho expresného vektora pRK5, ktorého konštrukcia je opísaná v EP prihláške č. 307 247 publikovanej 15. 3. 1989. Táto cDNA začína v nukloetidovej pozícii 64 sekvencie opísanej Loetscherom a kol., s iniciálnym metionínom 118 bp downstream.
Zdrojom IgGi kódujúcej sekvencie bol CD4-IgG expresný plazmid pRKCD42Fcl (Capon, D. J. a kol., Náture 337: 525 (1989), Bym a kol., Náture 344: 667 (1990)) obsahujúci cDNA sekvenciu kódujúcu hybridný polypeptid skladajúci sa zo zostatkov 1 - 180 zrelého ľudského CD4 proteínu (dve N-terminálne CD4 variabilné domény) fúzovaných na ľudské IgG] sekvencie začínajúce kyselinou aspartátovou 216 (kde aminokyselina 114 je prvým zostatkom konštantného regiónu ťažkého reťazca (Kabat a koll., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. vydanie, (1987)), ktorá je prvým zostatkom IgGi pántu po cysteínovom zostatku obsiahnutom v spojení ťažkého a ľahkého reťazca), a končiaci zostatkom 441 na získanie CH2 a Ch3 Fc domén IgG].
TNFRl-IgG] bol konštruovaný generovaním reštrikčných fragmentov plazmidov pRK-TNF-R a pRKCD42Fc, a ich ligácií, s použitím delečnej mutagenézy, takže treonínový zostatok 171 zrelého TNFR je juxtaponovaný aspartátovému zostatku 216 IgG] ťažkého reťazca (Kabat a koll., vyššie). Vzniknutý plazmid pRKTNFR-IgG obsahoval kompletnú kódujúcu sekvenciu pre TNFR]IgG].
C. Bunková kultúra
Gén kódujúci solubilný typ 1 TNFR-IgG] bol zavedený do dpl2.CHO buniek transfekciou. Toto bolo urobené s použitím techniky fosforečnanu vápenatého na zavedenie DNA do cicavčích buniek. Dva dni po transfekcii boli bunky trypsinizované a umiestnené na selektívne médium (glycín - hypoxantín a tymidín bez Hamovo F-12 DMEN, 1 : 1 objem/objem s 2 % dialyzovaným sérom). Vzniknuté izoláty boli vyšetrované na sekréciu TNFRl-TgG]. Klony exprimujúce TNFRl-IgG] boli amplifikované v metotrexáte, čo dávalo vysoký výnos exprimujúcich klonov a následne boli adaptované na séra bez médií. Tieto bunky boli pod trvalým selekčným tlakom, pokiaľ neboli prenesené do neselektívneho média na rast a expanziu inokula.
Na poskytnutie TNFRl-IgG] produkčných kultúr bola bunková populácia už opísaná, expandovaná z média obsahujúceho metotrexát sériovými subkultiváciami v nádobách so zvyšujúcim sa objemom do kultivačného média neobsahujúceho metotrexát. Pre tieto kroky kultivácie bolo neselektívne rastové médium na DMEM/HAM F-12 založená formulácia (pozri napríklad U. S. patent č. 5 122 469) s modifikovanými koncetráciami niektorých zložiek, ako je glukóza, aminokyseliny, soli, cukry, vitamíny, glycín, hypoxantín a tymidín, rekombinantný ľudský inzulín, hydrolyzovaný peptón (Primaton HS alebo Primaton RL), bunková protektívne činidlo, ako je Pluronic F68 (plurónový polyol) alebo ekvivalent, Gentamycin, lipidy a stopové prvky.
Kultúry boli kontrolované pri pH 7,2 +/- 0,4 použitím CO2 (kyselina) a/alebo Na2CO3 (báza). Teplota bola kontrolovaná okolo 37 °C počas rastovej periódy. Rozpustený kyslík bol udržovaný okolo 5 % saturácie vzduchu priamym prístupom vzduchom a/alebo kyslíkom.
Osmolalita bola počas expanznej fázy inokula udržovaná okolo 250 mOsm a 350 mOsm.
Po rastovej fáze každej kultúry nasledovala druhá fáza alebo prechodná fáza, keď boli kultivačné parametre zmenené z optimálneho rastu na produkčné podmienky. Počas tejto prechodnej fázy bola teplota kultivačného systému znížená, asi medzi 30 a 35 °C. Bol pridaný butyrát a bol udržovaný istý stupeň osmolality. Produkt akumulovaný počas tejto produkčnej fázy bol analyzovaný na obsah kyseliny sialovej.
V typickom produkčnom vzorci bolo asi 1,2 x 106 buniek odvodených od expanzie inokula zo selektívneho štádia, kde boli kultivované v rastovej fáze s počiatočnou osmolalitou 300 mOsm. Rastové médium bolo doplňované stopovými prvkami, rekombinantným ľudským inzulínom a hydrolyzovaným peptónom. Bunky boli kultivované pri týchto podmienkach 2 dni. Na začiatku tretieho dňa bola teplota bunkovej kultúry znížená. Simultánne alebo po posune teploty bol pridaný k bunkovej kultúre butyrát sodný a bola zaistená požadovaná produkčná osmolalita pridaním rôznych zložiek média. Bunky boli kultivované pri týchto podmienkach s pridávaním živín počas 9 - 10 dní. Bunky boli vyživované, pokiaľ to bolo nevyhnutné, rôznymi zložkami média.
Tabuľka I opisuje produkčné podmienky pre rôzne produkčné procesy.
Tabuľka 1
Verzia procesu koncentrácia butyrátu (sniól(l) osmolalita v produkčnej fáze (mOsmol/kg) bunková špecifická produktivita medzi 5 10 (pg/d) obsah kys. sialovej v TNFRl-IgG! na 10 deň (mól/mól)
A 1 360-420 0,6 - 1,5 6,4 - 7,2 N-4
B 1 480-510 1.7 - 2,2 6,0 - 6.3 N=3
C 6 460 4,8 4.7 N=1
D 6 370-420 2.4 - 2,8 5,5 - 5,6 N=3
E 6 350-370 1.4 - 2,3 5.4 - 6.3 N«3
F 12 390 4,0 5.3 N=1
G 12 490-510 2.9 - 5,2 4.0 - 5.2 N*4
H 12 400-430 2,0 - 2,8 5,8 - 6,0 N=3
I 12 370-380 2,0 - 2,2 5,5 - 5,9 N-3
D. Získanie TNFR - IgG]
TNFRl-IgG] chiméra bola purifikovaná do viacej ako 95 % homogenity afinitnou chromatografiou na imobilozovanom Staphylococcus aureus Proteínu A, ako opísal Capon a kol., vyššie.
E. Analýza uhľovodíkov
Obsah kyseliny sialovej bol analyzovaný metódou podľa Varrena, L. (1959) J. Biol. Chem. 234: 1971 - 1975.
Výsledky
Bunková špecifická produktivita pre každú produkčnú kultúru opísanú v tabuľke I bola zakreslená proti obsahu kyseliny sialovej v získanom produkte. Výsledky sú prezentované na obrázku 1. Najvyšší obsah kyseliny sialovej bol pozorovaný, pokiaľ boli parametre procesu udržované pri produkčnej osmolalite medzi asi 360 a 420 mOsm a
SK 282658 Β6 koncentrácii butyrátu okolo 1 mM. Obsah kyseliny sialovej mohol byť kontrolovaný v širokom rozsahu úpravou týchto parametrov.
Príklad 2
Boli určené plazmatické farmakokinetické polčasy a/alebo stupne odbúrania v krvi rôznych prípravkov. Prípravky obsahujúce vyšší obsah kyseliny sialovej všeobecne mali vyšší plazmatický polčas a/alebo nižšie celkové odbúravanie v krvi v porovnaní s prípravkami obsahujúcimi nižší obsah kyseliny sialovej.
Metódy
Sedemnásť od Sprague-Davley odvodených samcov krýs vážiacich 272 - 315 g bolo náhodne rozdelených do jednej z troch skupín ošetrených TNFRl-IgG! fuznym proteínom (N = 5 alebo 6 na skupinu). Zvieratám bola injekovaná intravenózne nominálna dávka 5 mg/kg testovaného materiálu cestou femorálnej venóznej kanyly. Vybraný testovaný materiál zahŕňal dva TNFRl-IgG] prípravky z procesu, v ktorom bola koncentrácia butyrátu počas produkčnej fázy 6 mM a osmolalita počas produkčnej fázy bola udržovaná okolo 400 mOsm, proces I a tretí TNFR1-IgGj prípravok z procesu, v ktorom bola koncentrácia butyrátu počas produkčnej fázy 12 mM a osmolalita počas produkčnej fázy bola udržovaná okolo 500 mOsm, proces
2. Dva ml krvných vzoriek boli odobrané do EDTA (8,5 %) pred dávkou, a v 5 minúte, a 2, 6, 10,24, 34, 48, 56, 72, 96 a 120 hodín po dávke. Krvné vzorky boli centrifugované, plazma bola odobraná a vzorky boli analyzované na koncentráciu TNFRl-IgGi fúzneho proteínu.
Enzýmovo viazaný imunologický a biologický väzbový test (ELIBA) bol použitý na kvantifikáciu TNFRl-IgG! v plazme krýs. Tento test je založený na schopnosti TNF-alfa naviazaného na peroxidázu (TNF-alfa-HRP) viazať sa na receptorovú časť TNFRl-IgG! lužného proteínu. V tomto teste boli Fab fragmenty kozieho antiľudského IgGFc potiahnuté na jamky mikrotitračnej platne použité na zachytenie TNFRl-IgG] interkaciou s Fc časťou molekuly. TNF-alfa-HRP bol pridaný do jamiek a bola umožnená väzba na receptorovú časť zachyteného TNFRl-IgG]. Kvantifikácia bola určená meraním farby produkovanej reakciou peroxidázy s orto-fenyléndiamínovým (OPD) substrátom. Rozsah testu je 0,003 až 0,02 mg/ml. Prítomnosť EDTA vo vzorkách plazmy nemala žiadny účinok na vykonanie testu.
Dávka bola normalizovaná vzhľadom na rozdiely v koncentrácii na dávkovanie roztoku. Všetky výpočty boli založené na údajoch koncentrácie proti času v priebehu 120 hodín. Ohraničená plocha pod krivkou (AUC0.120) bola počítaná s použitím lichobežníkového pravidla a na hmotnosť normalizované skrátené odbúravanie z krvi (CL0.120) bolo počítané ako dávka/AUCo.120·
Výsledky
Odbúravanie v krvi sa líšilo v závislosti od využitej verzie procesu (proces 1 v porovnaní s procesom 2) a množstva kyseliny sialovej prítomnej v produkte. Odbúravanie v krvi pre jednotlivé zvieratá a výsledný priemer a štandardné odchýlky z tejto štúdie sú prezentované v tabuľke II. Proces 1 má nižšie a vhodnejšie ukazovatele odbúravania z krvi.
Tabuľka II
Odbúravanie v krvi 0-120 ml/h/kg
Proces 1 Proces 1 Proces 2
2,12 2,08 2,144
2,03 2,31 2,99
1,63 2,20 2,61
1,89 2,22 3,27
1,85 1,99 2,82
1,66 3,42
priemer 1,91 2,08 2,88
STDEV 0,02 0,23 0.45
Príklad 3
Momosacharidová kompozícia TNFRl-IgGi
Určenie oligosacharidovej uhľovodíkovej štruktúry pripraveného, ako jc opísané v príklade 1 ukázalo, že obsah kyseliny sialovej sa v rôznych verziách procesu líši. Rýchle plazmatické odbúravanie bolo asociované s vysokou expozíciou GlcNAc, menším množstvom kyseliny sialovej v oligosacharidových reťazcoch a (interferenčné) dostupnosťou proteínu pre manózové alebo galaktózové receptory. Pomalé plazmatické odbúravanie bolo asociované s viacerými terminálnymi rezíduami kyseliny sialovej.
A. Zdroje testovaného materiálu
TNFRl-IgG] bol produkovaný podľa metódy opísanej v príklade 1. Materiál z procesu 1 bol získaný z bunkovej kultúry s použitím 6 mM butyrátu a osmolality 400 mOsm v priebehu produkčnej fázy. Materiál z procesu 2 bol získaný z bunkovej kultúry s použitím 12 mM butyrátu a osmolality' 500 mOsm v priebehu produkčnej fázy.
Metódy
Uvoľnenie intaktných neutrálnych aminocukrov bolo určené aniónovou výmennou chromatografiou pri vysokom pH kombinovanou s pulznou ampérometrickou detekciou. Analýza bola robená v nasledujúcich krokoch:
1. Výmena pufra bola robená s TNFRl-IgG] (približne 50 Lig/ml) a vhodnými referenčnými vzorkami tak, že konečná vzorka bola obsiahnutá v 1 % kyseline octovej.
2. Približne 90 pg TNFRl-IgG], rovnako ako vzorky referenčného materiálu, bolo zmrazené v kúpeli suchého ľadu a alkoholu a zmrazená vzorka bola lyofilizovaná cez noci.
3. Mrazom vysušené vzorky boli rekonštituované v 500 pl kyseliny trifluóroctovej a inkubované pri 120 °C počas jednej hodiny.
4. Po kyslej hydrolýze boli TNFRl-IgG] a referenčné vzorky ochladené a odparené do sucha.
5. Vzorky boli rekonštituované vodou do konečnej koncentrácie asi 0,6 mg/ml.
6. Separácia monosacharidov bola robená pri teplote prostredia aniónovou chromatografiou pri vysokom pH s pulznou ampérometrickou detekciou s použitím Díonex CarboPac PA1 (4 x 250 mm) kolóny (Dionex Corp., Sunnyavale, CA).
Ί. Kvantifikácia jednotlivých monosacharidov bola urobená porovnaním s referenčnými monosacharidmi.
C. Výsledky
Relatívne moláme obsahy každého monosacharidu ukazuje tabuľka III uvedená ďalej.
Tabuľka III
Relatívny molámy obsah monosacharidov v dvoch TNFR1-IgGi prípravkoch
Monosacharíd Proces I Proces I
Fukóza 4,3 + - 0,2 4,4
Gulaktóza 6,5 -i- - 0,0 4,7
Maimózu 12,2 í- - 0,6 12,5
N-aoetylglukózamín 14,1 +· - 14,3
Kyselina sialová 4,9 + - 0,3 3,7+-0,3
N-acetylgalaktózamin 0,5 í- - 0,1 0,3
Pomer
k.sialová/GlcNAc 0,35 0.26
Uvedené výsledky ukazujú, že parametre procesu vybrané pre produkčnú fázu glykoproteínu ovplyvňujú zloženie uhľovodíkov zrelého glykoproteínu. Prípravky s vyšším obsahom kyseliny sialovej všeobecne majú predĺžený sérový polčas.
Tabuľky IV a V uvedené v ďalšej časti demonštrujú zloženie uhľovodíkov oligosacharidových vedľajších reťazcov TNFRl-IgG] chimérických prípravkov produkovaných v podmienkach procesu I a procesu II. Tabuľka V uvádza údaje pre uhľovodík}' na receptorovej časti chimérickej molekuly, odpočítajúce Fc glykozylačné miesto.
Tabuľka IV
PI PI PI PI Pil Pil
Kyselina sialová 5,8 5,8 5,7 5,8 3,7 3,5
Fukóza 4,0 4,0 3,6 4,1 4,4 4,3
GalNAc 0,3 0,2 0,2 0,4 0,3 0,4
GINAu 12,9 15,0 14,8 14,3 14,3 14,4
Gal 7,4 7.6 7,1 7,0 4,7 4,1
Man 12,0 12,0 10,0 12,0 12,5 11,9
Pomer 0,45 0.39 0.39 0,41 0,26 0,24
SA/GlcNAc
Tabuľka V
Pil Pil PI PI
móly exponované GlcNAc na mól 3,18 3,2 1,11 1,32
toóly exponované Gal na raól 0,97 -0.G8 1,45 -0,26
Gal anténa 4,47 4,72 6,45 6,24
K. sialová 3,5 4,8 5,00 6,5
na mól
Výsledky prezentované v tabuľkách IV a V demonštrujú, že kompozície TNFRl-IgG] sú typické sialové kyseliny ukončené mono-, bi-, a triantenárnymi komplexmi oligosacharidov. Predpokladá sa, že TNFRl-IgG] pripravený procesom I obsahuje signifíkantne vyššiu časť kyseliny sialovej a signifíkantne nižšiu časť exponovanej GlcNAc. Kyselina sialová na mól proteínu ukazuje, že tento materiál bude mať nižší izoelektrický bod ako materiál produkovaný v procese II. Pri porovnaní s výsledkami v tabuľke II tieto výsledky taktiež ukazujú, že nižšie plazmatické odbúravanie materiálu z procesu I koleruje s nižším exponovaným GlcNAc a všeobecne s vyšším obsahom kyseliny sialovej.
Tabuľky IV a V ukazujú TNFRl-IgG] prípravky obsahujúce komplex oligosacharidov zakončených jedným alebo viacerými zostatkami kyseliny sialovej. Preferované
TNFRl-IgG] prípravky obsahujú TNFRl-IgG] molekuly majúce okolo 1 - 2 molov exponovaných N-acetylglukózamínových zostatkov na mól proteínu. Molámy pomer kyseliny sialovej k proteínu je okolo 4 - 7. TNFRl-IgG] prípravky majú molámy pomer kyseliny sialovej k proteínu od asi 0,4 do asi 0,45.
Príklad 4 pi silne sialyzovaných prípravkov je nižší ako pi slabo sialyzovaných prípravkov
Metódy
Izoelektrické fokusovanie bolo robené pre rôzne prípravky opísané v príklade 2. Izoelektrický fokusačný gél separuje glykoproteíny podľa ich izoelektrického bodu, pi, s použitím pH gradientu vytvoreného amfolytmi s rôznym pH. V tejto štúdii bola analýza prípravkov robená s použitím pH gradientu od 10 do 4.
Výsledky
TNFRl-IgG] prípravky majú rozmedzie izoelektrického bodu od asi 5,5 do asi 7,5, ako je stanovené chromatofokusovaním, kde pi je senzitívne na ošetrenie neuraminidázou.
Tu citované odkazy sú tu uvedené ako odkazy, či sú špecificky uvedené alebo nie.
Hoci bol vynález opísaný v súvislosti s jeho špecifickými uskutočneniami, je zrejmé, že sú možné jeho ďalšie modifikácie. Táto prihláška sa chápe tak, aby pokryla akékoľvek variácie, použitie alebo adaptácie vynálezu, ktoré všeobecne nasledujú princípy vynálezu a obsahujú také odchýlky od predklaného vynálezu, ktoré sú v odbore, ktorého sa vynález týka, známe, a ktoré môžu byť aplikované na základné rysy, ktoré sú tu dané v rozsahu pripojených patentových nárokov.

Claims (23)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob kontroly obsahu kyseliny sialovej v oligosacharidovom vedľajšom reťazci glykoproteínu produkovaného cicavčou bunkovou kultúrou, ktorý zahŕňa kultivovanie cicavčej hostiteľskej bunky v produkčnej fáze kultivácie, vyznačujúci sa tým, že sa
    i) pridá kyselina alkánová alebo jej soľ v koncentrácii od 0,1 mM do 20 mM, ii) udržuje sa osmolalita bunkovej kultúry od 250 do 600 mOsm a iii) teplota od 30 do 35 °C.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, kde obsah kyseliny sialovej v oligosacharidovom vedľajšom reťazci glykoproteínu je zvýšený, vyznačujúci sa tým, že bunková špecifická produktivita bunkovej kultúry je znížená kultivovaním hostiteľskej bunky pri koncentrácii alkánovej kyseliny alebo jej soli od 0,1 do 6 mM a udržovaním osmolality od 300 do 450 mOsm.
  3. 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že hostiteľskou bunkou je CHO bunka.
  4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že alkánová kyselina alebo jej soľ je butyrát sodný.
  5. 5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že produkovaným glykoproteínom je cicavčí glykoproteín.
  6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že glykoproteínom je chiméra receptora tumor nekrotického faktora a imunoglobulínu.
  7. 7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že hostiteľská bunka je dpl2.CH0 bunková línia transfektovaná vektorom nesúcim cDNA kódujúcu solubilný typ 1 chiméry receptora tumor nekrotického faktora s imunoglobulínom Gj.
  8. 8. Spôsob podľa nároku 1, kde obsah kyseliny sialovej v oligosacharidovom vedľajšom reťazci glykoproteínu je znížený, vyznačujúci sa tým, že bunková špecifická produktivita bunkovej kultúry je zvýšená kultivovaním hostiteľskej bunky pri koncentrácii alkánovej kyseliny alebo jej soli od 6 mM do 12 mM a udržovaním osmolality od 450 do 600 mOsm.
  9. 9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že hostiteľskou bunkou je CHO bunka.
  10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že alkánová kyselina alebo jej soľ je butyrát sodný.
  11. 11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa t ý m , že produkovaným glykoproteínom je cicavčí glykoproteín.
  12. 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že glykoproteínom je chiméra receptora tumor nekrotického faktora a imunoglobulínu.
  13. 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že hostiteľská bunka je dp 12. CHO bunková línia transfektovaná vektorom nesúcim cDNA kódujúcu solubilný typ 1 chiméry receptora tumor nekrotického faktora s imunoglobulínom G|; TNFRl-IgG].
  14. 14. Spôsob produkcie TNFRl-IgG] chimérického proteínu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje
    a) kultiváciu cicavčej hostiteľskej bunky, ktorá exprimuje TNFR1-1G chiméru v rastovej fáze pri takých podmienkach a počas takého času, že je dosiahnutý maximálny bunkový rast,
    b) kultiváciu hostiteľskej bunky v produkčnej fáze v prítomnosti butyrátu sodného v koncentrácii od 6 mM do 12 mM,
    c) udržanie osmolality produkčnej fázy od 450 do 600 mOsm, a teploty od 30 °C do 35 °C.
  15. 15. Spôsob produkcie TNFRl-IgG! chimérického proteínu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje
    a) kultiváciu cicavčej hostiteľskej bunky, ktorá exprimuje TNFR1-1G chiméru v rastovej fáze pri takých podmienkach a počas takého času, že je dosiahnutý maximálny bunkový rast,
    b) kultiváciu hostiteľskej bunky v produkčnej fáze v prítomnosti butyrátu sodného v koncentrácii od 1 mM do 6 mM,
    c) udržanie osmolality produkčnej fázy od 300 do 450 mOsm, a teploty od 30 °C do 35 °C.
  16. 16. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa t ý m , že hostiteľskou bunkou je CHO bunka.
  17. 17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že hostiteľská bunka je dp 12. CHO bunková línia.
  18. 18. Prípravok, obsahujúci TNFRl-IgGi, produkovaný spôsobom podľa nároku 17.
  19. 19. Terapeutická kompozícia obsahujúca TNFRl-IgGi produkovaný spôsobom podľa nároku 15 a farmaceutický prijateľný nosič.
  20. 20. TNFRl-IgG] prípravok obsahujúci INFRl-IgG! molekuly, kde TNFRl-IgGi molekuly majú molámy pomer kyseliny sialovej k proteínu 4 až 7.
  21. 21. TNFRl-IgG] prípravok obsahujúci TNFRl-IgG] molekuly, kde TNFRl-IgG] molekuly majú 1 až 2 moly exponovaných N-acetylglukózamínových zostatkov na mól TNFRl-IgG] proteínu.
  22. 22. TNFRl-IgG] prípravok obsahujúci TNFRl-IgG] molekuly, kde TNFRl-IgG] molekuly majú molámy pomer kyseliny sialovej k N-acetylglukózamínu od 0,35 do 0,5.
  23. 23. TNFRl-IgG] prípravok podľa nároku 22, kde molárny pomer kyseliny sialovej kN-acetylglukózamínu je od 0,38 do 0,45.
SK1670-97A 1995-06-06 1996-06-06 Spôsob kontroly obsahu kyseliny sialovej v glykoproteíne, spôsob produkcie chimérického proteínu tumor nekrotického faktora s imunoglobulínom, prípravok a terapeutická kompozícia s jeho obsahom SK282658B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/469,348 US5705364A (en) 1995-06-06 1995-06-06 Mammalian cell culture process
PCT/US1996/009284 WO1996039488A1 (en) 1995-06-06 1996-06-06 Process for controlling sialylation of proteins produced by mammalian cell culture

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK167097A3 SK167097A3 (en) 1998-07-08
SK282658B6 true SK282658B6 (sk) 2002-11-06

Family

ID=23863440

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1670-97A SK282658B6 (sk) 1995-06-06 1996-06-06 Spôsob kontroly obsahu kyseliny sialovej v glykoproteíne, spôsob produkcie chimérického proteínu tumor nekrotického faktora s imunoglobulínom, prípravok a terapeutická kompozícia s jeho obsahom

Country Status (36)

Country Link
US (1) US5705364A (sk)
EP (2) EP1609853B2 (sk)
JP (2) JPH11507523A (sk)
KR (1) KR100496356B1 (sk)
CN (1) CN1166772C (sk)
AR (2) AR004940A1 (sk)
AT (2) ATE425245T2 (sk)
AU (1) AU717847B2 (sk)
BG (1) BG63213B1 (sk)
BR (1) BR9609150A (sk)
CA (1) CA2220684C (sk)
CZ (1) CZ293719B6 (sk)
DE (2) DE69635076T3 (sk)
DK (2) DK0832189T4 (sk)
EA (1) EA001215B1 (sk)
ES (2) ES2324046T5 (sk)
GE (1) GEP20012519B (sk)
HK (2) HK1017903A1 (sk)
HU (1) HU226420B1 (sk)
IL (1) IL122398A (sk)
IS (1) IS2614B (sk)
MY (1) MY113496A (sk)
NO (1) NO322276B1 (sk)
NZ (1) NZ310202A (sk)
OA (1) OA10753A (sk)
PL (1) PL185484B1 (sk)
PT (1) PT1609853E (sk)
RO (1) RO120267B1 (sk)
SA (1) SA96170351B1 (sk)
SI (2) SI1609853T2 (sk)
SK (1) SK282658B6 (sk)
TR (1) TR199701543T1 (sk)
TW (2) TW426734B (sk)
UA (1) UA47428C2 (sk)
WO (1) WO1996039488A1 (sk)
ZA (1) ZA964776B (sk)

Families Citing this family (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1132471A3 (de) 1989-09-12 2001-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US6656466B1 (en) * 1995-06-06 2003-12-02 Genetech, Inc. Human tumor necrosis factor—immunoglobulin(TNFR1-IgG1) chimera composition
US5705364A (en) † 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
JP4306813B2 (ja) 1995-09-19 2009-08-05 アスビオファーマ株式会社 動物細胞の新規培養方法
AU725408B2 (en) * 1996-05-08 2000-10-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of asthma with TNFR-Ig
US6673575B1 (en) * 1997-12-03 2004-01-06 Roche Diagnostics Gmbh Method for preparing polypeptides with appropriate glycosilation
US6140445A (en) * 1998-04-17 2000-10-31 Crompton Corporation Silane functional oligomer
US6528286B1 (en) * 1998-05-29 2003-03-04 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing glycoproteins
ES2255765T3 (es) * 1998-05-29 2006-07-01 Genentech, Inc. Procedimiento de cultivo de celulas para la produccion de glicoproteinas.
TR200504220T2 (tr) 1998-12-17 2007-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Aktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimeAktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimerik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştrik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştırılması için bir yöntem.ırılması için bir yöntem.
GB9828624D0 (en) * 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Production of proteins
KR100475417B1 (ko) * 1998-12-30 2005-07-18 씨제이 주식회사 시알산 함량이 높은 재조합 당단백질의 제조방법
US7294481B1 (en) * 1999-01-05 2007-11-13 Immunex Corporation Method for producing recombinant proteins
WO2000065070A2 (en) 1999-04-26 2000-11-02 Genentech, Inc. Cell culture process for glycoproteins
US6261805B1 (en) * 1999-07-15 2001-07-17 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Sialyiation of N-linked glycoproteins in the baculovirus expression vector system
KR100394474B1 (ko) * 1999-12-18 2003-08-09 동아제약 주식회사 동물세포에서 재조합 당단백질의 연속식 대량생산 방법
EP1335931B1 (en) * 2000-05-16 2005-12-21 Lipoxen Technologies Limited Derivatisation of proteins in aqueous solution
WO2002002793A1 (fr) * 2000-07-05 2002-01-10 Japan As Represented By Secretary Of Osaka University Processus de production de glycoproteine
US20030040095A1 (en) * 2001-03-16 2003-02-27 Achille Arini Method for the production of pharmaceutically active recombinant proteins
CA2447791A1 (en) * 2001-06-13 2002-12-19 Neslihan Delacruz Methods of culturing animal cells and polypeptide production in animal cells
AU2003220529B2 (en) * 2002-03-27 2006-09-07 Immunex Corporation Methods for increasing polypeptide production
US20030190710A1 (en) * 2002-03-28 2003-10-09 Devries Ruth L. Control of glycoforms in IgG
US6924124B1 (en) * 2002-08-23 2005-08-02 Immunex Corporation Feeding strategies for cell culture
US6974681B1 (en) 2002-08-23 2005-12-13 Immunex Corporation Cell culture performance with vanadate
US7067279B1 (en) 2002-08-23 2006-06-27 Immunex Corporation Cell culture performance with betaine
ATE472556T1 (de) * 2002-12-02 2010-07-15 Amgen Fremont Inc Gegen den tumor nekrose faktor gerichtete antikörper und deren verwendungen
US7332303B2 (en) * 2002-12-23 2008-02-19 Bristol-Myers Squibb Company Product quality enhancement in mammalian cell culture processes for protein production
BR0317723A (pt) * 2002-12-23 2005-11-22 Bristol Myers Squibb Co Processo de cultura de células de mamìfero para a produção de proteìna
AU2004234377A1 (en) * 2003-04-25 2004-11-11 Immunex Corporation Inducers of recombinant protein expression
IN2014DN02484A (sk) 2003-10-24 2015-05-15 Selexis Sa
AU2004309114A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-14 Laboratoires Serono Sa Process for the production of tumor necrosis factor-binding proteins
WO2005064002A1 (en) * 2003-12-31 2005-07-14 Samyang Genex Corporation Method for mass production of secondary metabolites in plant cell culture by treatment of an alkanoic acid or salt thereof
AU2005215889B9 (en) * 2004-02-13 2011-11-17 Glycotope Gmbh Highly active glycoproteins-process conditions and an efficient method for their production
TWI374935B (en) * 2004-08-27 2012-10-21 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Production of α-abeta
US7294484B2 (en) * 2004-08-27 2007-11-13 Wyeth Research Ireland Limited Production of polypeptides
US7300773B2 (en) * 2004-08-27 2007-11-27 Wyeth Research Ireland Limited Production of TNFR-Ig
CA2607663C (en) * 2005-05-19 2014-08-12 Amgen Inc. Compositions and methods for increasing the stability of antibodies
WO2006128764A2 (en) * 2005-06-03 2006-12-07 Biovitrum Ab (Publ) Process for cultivating animal cells comprising the feeding of plant-derived peptones
KR100670105B1 (ko) 2005-06-29 2007-01-17 주식회사 셀트리온 콩가수분해물의 저분자량 분획을 이용하여 시알산 함량이증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법 및 그에 의하여생산된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴
WO2008057634A2 (en) * 2006-10-26 2008-05-15 The Rockefeller University Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
US8470318B2 (en) 2005-11-07 2013-06-25 The Rockefeller University Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
KR101398713B1 (ko) * 2005-12-20 2014-06-12 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 조성물 및 조성물의 제조 방법
AR058568A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
US20070190057A1 (en) 2006-01-23 2007-08-16 Jian Wu Methods for modulating mannose content of recombinant proteins
AU2007251256B2 (en) * 2006-01-26 2013-03-07 Recopharma Ab Compositions and methods for inhibiting viral adhesion
MX2008012843A (es) * 2006-04-05 2009-01-19 Univ Rockefeller Polipeptidos con propiedades antiinflamatorias aumentadas y citotoxicas reducidas y metodos relacionados.
JP5401310B2 (ja) * 2006-07-13 2014-01-29 ワイス・エルエルシー 糖タンパク質の生産
SG174804A1 (sk) 2006-09-13 2011-10-28 Abbott Lab
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
US20080145893A1 (en) * 2006-09-17 2008-06-19 Excellegene Sa Method for producing a recombinant protein at high specific productivity, high batch yield and high volumetric yield by means of transient transfection
WO2008069244A1 (ja) * 2006-12-05 2008-06-12 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 糖蛋白質組成物の製造方法
WO2008128228A1 (en) * 2007-04-16 2008-10-23 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to cell surface glycosylation
TW200902708A (en) 2007-04-23 2009-01-16 Wyeth Corp Methods of protein production using anti-senescence compounds
US20090023186A1 (en) * 2007-07-22 2009-01-22 Excellgene Sa Use of valproic acid for enhancing production of recombinant proteins in mammalian cells
US20090042253A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Wyeth Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors
CA2717383C (en) 2008-03-06 2017-01-03 Halozyme, Inc. Large-scale production of soluble hyaluronidase
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
EP2283043B1 (en) * 2008-04-07 2014-08-13 Bayer HealthCare, LLC Methods of recombinant production of glycoproteins
US7846744B2 (en) 2008-04-22 2010-12-07 Ravetch Jeffrey V Methods of identifying anti-inflammatory compounds
CA2734922C (en) 2008-09-15 2020-01-14 Laetitia Malphettes Compositions comprising polynucleotides comprising hybrid osmo-responsive transcriptional regulatory elements and methods for producing a protein under conditions of hyperosmolarity
TW201028433A (en) 2008-10-20 2010-08-01 Abbott Lab Viral inactivation during purification of antibodies
ES2535734T3 (es) 2008-10-20 2015-05-14 Abbvie Inc. Aislamiento y purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad con la proteína A
CA2915783C (en) * 2008-12-09 2020-07-21 Halozyme, Inc. Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof
WO2010102262A1 (en) * 2009-03-06 2010-09-10 Halozyme, Inc. Temperature sensitive mutants of matrix metalloprotease 1 und uses thereof
US9540426B2 (en) 2009-10-06 2017-01-10 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
KR101985153B1 (ko) 2009-10-26 2019-05-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법
US8765415B2 (en) 2009-11-17 2014-07-01 Medarex, L.L.C. Methods for enhanced protein production
BR112012013330A2 (pt) * 2009-12-02 2017-03-28 Acceleron Pharma Inc composições e métodos para aumentar meia vida do soro de proteínas de fusão fc
PT2538968T (pt) * 2010-02-24 2018-01-23 Chiesi Farm Spa Processo para produção e purificação de alfa-manosidase lisossómica recombinante
EP2610338A4 (en) 2010-08-02 2015-03-25 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCTION OF SUBSTANCE
CA2829774C (en) 2011-03-14 2019-09-24 National Research Council Of Canada Method of viral production in cells
US9062106B2 (en) 2011-04-27 2015-06-23 Abbvie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
WO2012147053A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Biocon Research Limited A method for reducing heterogeneity of antibodies and a process of producing the antibodies thereof
EP2718328A4 (en) 2011-06-08 2014-12-24 Acceleron Pharma Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING THE HALF TIME OF SERUM
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9249182B2 (en) 2012-05-24 2016-02-02 Abbvie, Inc. Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
CN102839157A (zh) * 2012-07-12 2012-12-26 扬州大学 稳定共表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系及构建方法和应用
WO2014035475A1 (en) 2012-09-02 2014-03-06 Abbvie Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
NO2760138T3 (sk) 2012-10-01 2018-08-04
CN104822826B (zh) 2012-10-15 2019-04-30 百时美施贵宝公司 用于蛋白产生的哺乳动物细胞培养过程
US20140106405A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-17 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
CA2905010A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US8921526B2 (en) 2013-03-14 2014-12-30 Abbvie, Inc. Mutated anti-TNFα antibodies and methods of their use
US9217168B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
RU2674996C2 (ru) 2013-07-04 2018-12-14 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Иммуноферментный анализ с подавлением интерференции для определения антител к лекарствам в образцах сыворотки
US20160215319A1 (en) 2013-07-06 2016-07-28 Cadila Helthcare Limited Improved process for production of monoclonal antibodies
WO2015051293A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Abbvie, Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
SG11201606856SA (en) * 2014-02-27 2016-09-29 Hoffmann La Roche Modulation of cell growth and glycosylation in recombinant glycoprotein production
JP6652334B2 (ja) 2014-05-31 2020-02-19 Ｊｃｒファーマ株式会社 ウリジンとｎ−アセチル−ｄ−マンノサミンとを含有する培地
EP3152318A1 (en) * 2014-06-03 2017-04-12 Lupin Limited Cell culture process for producing a protein
US20160130324A1 (en) 2014-10-31 2016-05-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. C1 Inhibitor Fusion Proteins and Uses Thereof
KR102007930B1 (ko) 2014-12-31 2019-08-06 주식회사 엘지화학 재조합 당단백질의 글리코실화 조절 방법
TW202330904A (zh) 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
MA43270A (fr) 2015-11-19 2021-06-02 Takeda Pharmaceuticals Co Inhibiteur de la c1 estérase humaine recombinante et ses utilisations
EP3397076A1 (en) * 2015-12-29 2018-11-07 N.V. Nutricia Fermented formula with non-digestible oligosaccharides
US20200385673A1 (en) * 2017-11-30 2020-12-10 Hoffmann-La Roche Inc. Process for culturing mammalian cells
AU2019379858B2 (en) 2018-11-13 2024-01-04 Janssen Biotech, Inc. Control of trace metals during production of anti-CD38 antibodies
TW202128743A (zh) 2019-12-06 2021-08-01 美商再生元醫藥公司 抗ｖｅｇｆ蛋白組合物及其製備方法
MX2023002417A (es) 2020-08-31 2023-03-22 Regeneron Pharma Estrategias de suministro de asparagina para mejorar el rendimiento del cultivo celular y mitigar las variantes de secuencia de asparagina.
US20220228107A1 (en) 2021-01-20 2022-07-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of improving protein titer in cell culture
US20230116199A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods of ph modeling and control
TW202331252A (zh) 2021-10-07 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 Ｐｈ計校準與校正
US20240010737A1 (en) 2022-03-02 2024-01-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing process for high titer antibody

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3926723A (en) 1974-08-08 1975-12-16 Massachusetts Inst Technology Method of controllably releasing glucose to a cell culture medium
JPS5938488B2 (ja) 1979-05-07 1984-09-17 株式会社東芝 空気調和機
DK283683A (da) * 1982-06-21 1983-12-22 Wellcome Found Fremgangsmaade til fremstilling af interferon
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4724206A (en) * 1984-02-13 1988-02-09 Damon Biotech, Inc. Protein production using hypertonic media
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
JPH0639919B2 (ja) 1985-08-29 1994-05-25 トヨタ自動車株式会社 過給機付き内燃機関の異常判別装置
GB8606386D0 (en) * 1986-03-14 1986-04-23 Celltech Ltd Production of protein
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
WO1988001643A1 (en) 1986-08-29 1988-03-10 Endotronics, Inc. Method of culturing cells
JPH01257492A (ja) * 1987-03-05 1989-10-13 Green Cross Corp:The 異種蛋白質の生産増強方法
IL87737A (en) * 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
JPH066054B2 (ja) 1987-10-15 1994-01-26 帝人株式会社 動物細胞の培養方法
CA1312030C (en) * 1987-11-18 1992-12-29 Brian Maiorella Method to increase antibody titer
US5151359A (en) * 1988-05-19 1992-09-29 Mitsui Toatsu Chemicals Incorporated Method for producing of human tissue type plasminogen activator
WO1990003430A1 (en) 1988-09-23 1990-04-05 Cetus Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
KR0132666B1 (en) * 1989-03-14 1998-04-14 Hitachi Kk Method for controlling cultivation conditions for animal cells
JPH0396383A (ja) 1989-09-08 1991-04-22 Riso Kagaku Corp 画像形成装置
EP1132471A3 (de) 1989-09-12 2001-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US5096816A (en) * 1990-06-05 1992-03-17 Cetus Corporation In vitro management of ammonia's effect on glycosylation of cell products through pH control
US5122469A (en) * 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022545D0 (en) * 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
GB2251249B (en) * 1990-12-28 1995-06-21 Mogam Biotech Res Inst High-density medium for animal cell culture
AU3144193A (en) * 1991-11-21 1993-06-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
WO1994006476A1 (en) * 1992-09-15 1994-03-31 Immunex Corporation Method of treating tnf-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists
JP3523293B2 (ja) † 1993-07-19 2004-04-26 住友製薬株式会社 インターフェロンの産生増強法
US5705364A (en) † 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
JP5515221B2 (ja) † 2008-01-28 2014-06-11 日油株式会社 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
SI1609853T1 (sl) 2009-08-31
CA2220684C (en) 2002-11-12
DE69635076T3 (de) 2009-01-15
KR19990022473A (ko) 1999-03-25
BR9609150A (pt) 1999-02-23
HK1087151A1 (en) 2006-10-06
US5705364A (en) 1998-01-06
AR004940A1 (es) 1999-04-07
CN1166772C (zh) 2004-09-15
AR011439A2 (es) 2000-08-16
ZA964776B (en) 1997-12-08
EP0832189B1 (en) 2005-08-17
AU717847B2 (en) 2000-04-06
EA001215B1 (ru) 2000-12-25
OA10753A (en) 2002-12-11
HUP9900920A2 (hu) 1999-07-28
RO120267B1 (ro) 2005-11-30
IS2614B (is) 2010-04-15
SI0832189T1 (sl) 2006-02-28
EP1609853A1 (en) 2005-12-28
JP4348376B2 (ja) 2009-10-21
HU226420B1 (en) 2008-12-29
DE69635076T2 (de) 2006-06-01
JP2007190024A (ja) 2007-08-02
NO975674D0 (no) 1997-12-05
TW426734B (en) 2001-03-21
NZ310202A (en) 1999-10-28
ES2248812T5 (es) 2008-12-16
GEP20012519B (en) 2001-08-27
PT1609853E (pt) 2009-06-09
DK0832189T3 (da) 2005-11-21
HK1017903A1 (en) 1999-12-03
TR199701543T1 (xx) 1998-05-21
CN1186514A (zh) 1998-07-01
ATE302266T1 (de) 2005-09-15
NO322276B1 (no) 2006-09-04
IL122398A0 (en) 1998-06-15
EA199700364A1 (ru) 1998-04-30
TW516962B (en) 2003-01-11
JPH11507523A (ja) 1999-07-06
EP0832189A1 (en) 1998-04-01
IS4626A (is) 1997-12-03
MY113496A (en) 2002-03-30
SI1609853T2 (sl) 2020-07-31
ES2248812T3 (es) 2006-03-16
EP1609853B2 (en) 2020-01-22
BG102101A (en) 1998-07-31
ES2324046T5 (es) 2020-09-14
AU6095296A (en) 1996-12-24
SK167097A3 (en) 1998-07-08
ES2324046T3 (es) 2009-07-29
HUP9900920A3 (en) 2001-06-28
DE69635076D1 (de) 2005-09-22
CZ390997A3 (cs) 1998-06-17
EP1609853B1 (en) 2009-03-11
PL185484B1 (pl) 2003-05-30
SI0832189T2 (sl) 2008-12-31
DK1609853T4 (da) 2020-04-06
WO1996039488A1 (en) 1996-12-12
MX9709452A (es) 1998-06-30
EP0832189B2 (en) 2008-07-09
IL122398A (en) 2001-12-23
BG63213B1 (bg) 2001-06-29
KR100496356B1 (ko) 2005-11-25
UA47428C2 (uk) 2002-07-15
CA2220684A1 (en) 1996-12-12
PL323737A1 (en) 1998-04-14
NO975674L (no) 1998-02-06
DK1609853T3 (da) 2009-06-02
ATE425245T2 (de) 2009-03-15
CZ293719B6 (cs) 2004-07-14
SA96170351B1 (ar) 2006-07-04
DK0832189T4 (da) 2008-10-27
DE69637867D1 (de) 2009-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK282658B6 (sk) Spôsob kontroly obsahu kyseliny sialovej v glykoproteíne, spôsob produkcie chimérického proteínu tumor nekrotického faktora s imunoglobulínom, prípravok a terapeutická kompozícia s jeho obsahom
US6656466B1 (en) Human tumor necrosis factor—immunoglobulin(TNFR1-IgG1) chimera composition
US5721121A (en) Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein
CA2637156C (en) Methods for modulating mannose content of recombinant proteins
EP2139986B1 (en) Use of low temperature and/or low ph in cell culture
RU2670889C1 (ru) Способ контроля гликозилирования рекомбинантного гликопротеина
MXPA97009452A (en) Process to control the sialilation of proteins produced by cultivation of mamife cells

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Expiry date: 20160606