DE69635076T2

DE69635076T2 - Verfahren zur kontrollierung der sialylierung von durch säugetierzellkultur hergestelltem protein

Info

Publication number: DE69635076T2
Application number: DE69635076T
Authority: DE
Inventors: Tina Etcheverry; Thomas Ryll; Werner Lesslauer; Thomas Schreitmuller; Wolfgang Richter
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Genentech Inc
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Genentech Inc
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: DK0832189T4; ATE425245T2; SA96170351B1; BR9609150A; EP1609853A1; BG63213B1; MY113496A; CA2220684C; SI0832189T2; SI0832189T1; ES2324046T3; NZ310202A; SI1609853T1; PT1609853E; BG102101A; JPH11507523A; DE69635076D1; EA199700364A1; MX9709452A; UA47428C2

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kontrolle des Sialsäuregehaltes von Glykoproteinen, die in Säugerzellkultur hergestellt werden. Die Erfindung stellt Verfahren für die Erhöhung und Verringerung des Sialsäuregehaltes von Glykoproteinen, die durch Säugerzellkultur hergestellt werden, bereit. Die Erfindung betrifft weiter Verfahren für die Herstellung von Tumornekrosefaktorrezeptor-(TNFR)-Immunglobulin-(Ig)-Chimären wie auch neuartige TNFR1-IgG₁-Präparate und ihre Verwendungen bei der Diagnose und Behandlung von verschiedenen entzündlichen und immunologischen Störungen.
Die Unterschiede in Glykosylierungsmustern von rekombinant hergestellten Glykoproteinen waren in letzter Zeit das Thema von viel Aufmerksamkeit in der wissenschaftlichen Gemeinschaft, da rekombinante Proteine, die als mögliche Prophylaktika und Therapeutika hergestellt werden, sich der Klinik nähern. Die Oligosaccharid-Seitenketten der Glykoproteine beeinflussen die Funktion des Proteins (Wittwer A. und Howard, S. C. (1990) Biochem. 29: 4175–4180) und die intramolekulare Wechselwirkung zwischen Teilen des Glykoproteins, was zu der Konformation und dargestellten dreidimensionalen Oberfläche des Glykoproteins führt (Hart, (1992) Curr. Op. Cell Biol., 4: 1017–1023; Goochee, et al., (1991) Bio/Technology, 9: 1347–1355; Parekh, R. B., (1991) Curr. Op. Struct. Biol., 1: 750–754). Oligosaccharide können auch dazu dienen, ein gegebenes Polypeptid auf bestimmte Strukturen zu richten, basierend auf spezifischen zellulären Kohlenhydratrezeptoren (Bevilacqua, M. P. und Nelson, R. M., (1993) J. Clin. Invest. 91: 379–387; Nelson, R. M., et al., (1993) J. Clin. Invest. 91: 1157–1166, Norgard, K. E. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1068–1072; Imai, Y, et al., (1993) Nature 361: 555–557). Der terminale Sialsäurebestandteil der Glykoprotein-Oligosaccharid-Seitenkette beeinflusst Absorption, Serumhalbwertszeit und die Clearance aus dem Serum, wie auch die physikalischen, chemischen und immunologischen Eigenschaften des Glykoproteins (Parekh, R. B., supra; Varki, A., (1993) Glycobiology 3: 97–100; Paulson, J. (1989), TIBS, 14: 272–276; Goochee, et al., (1991) Biotechnology 9: 1347–1355; Kobata, A, (1992) Eur. J. Biochem. 209: 483–501). Es ist daher wichtig, den Sialsäuregehalt von Glykoproteinen zu erhalten, insbesondere von denjenigen Proteinen, die für die Verwendung als Therapeutika gedacht sind.
Es wurde viel Aufmerksamkeit auf die Faktoren gerichtet, die die Glykosylierung während rekombinanter Proteinherstellung beeinflussen, wie Wachstumsmodus (adhärent oder in Suspension), fötales Rinderserum in Medienformulierung, Kulturdichte, Oxygenierung, pH, Reinigungsschemata und dergleichen (Werner, R. und Noe, W. (1993), Drug Res. 43: 1134–1249; Hayter et al., (1992) Biotech. und Bioeng. 39: 327–335; Borys et al., (1994) Biotech und Bioeng. 43: 505–514; Borys et al., (1993) Bio/technology 11: 720–724; Hearing et al., (1989) J. Cell Biol. 108: 339–353; Goochee et al., in Frontiers in Bioprocessing II, Todd et al., Hrsg. (1992) American Chemical Society, Seiten 199–240; US-Patent 5,096,816; Chotigeat, W., (1994) Cytotech. 15: 217–221). Diverse Gruppen haben die Verfahrensparameter untersucht, die die Herstellung von rekombinanten Proteinen und insbesondere den Effekt der Medienzusammensetzung bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen umgeben (Park et al., (1992) Biotech. Bioeng. 40: 686–696; Cox und McClure, (1983) In Vitro, 19: 1–6; Mizutani et al., (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 664–669; Le Gros et al., (1985) Lymph. Res. 4(3): 221–227).
Es ist bekannt, dass die Zugabe von Alkansäuren, wie Buttersäure, die transiente Expression von fremder DNA in rekombinanter Zellkultur beeinflusst (Prasad und Sinha, (1976) In Vitro, 12: 125–132; japanische Patentanmeldung Nr. 62-48935; japanische Patentanmeldung Nr. 55-150440; Klehr et al., (1992) Biochem. 31: 3222–3229; Gorman und Howard, (1983) Nucleic acid Res. 11: 7631–7648). Natriumbutyrat besitzt jedoch eine Bandbreite von Wirkungen auf die Genexpression über verschiedene Zelllinien und Medienzusammensetzungen (D'Anna et al., (1980) Biochem. 19: 2656–2671; Hagopian, H. K., (1977) Cell 12: 855–860) und Proteinherstellung (Milhaud (1980) J. Cell. Physiol. 104: 163–170; U.K.-Patentanmeldung Nr. GB 2 122 207 A ), was nahelegt, dass Butyrat die Genexpression modifizieren könnte (Yuan et al., (1985) J. Biol. Chem. 3778–3783) oder die Expression von bestimmten Genen inhibiert (Yuan et al., supra).
Das europäische Patent Nr. 0 239 292 B1 beschreibt ein Verfahren für die gesteigerte Produktion von Proteinen in der Gegenwart einer Alkansäure oder eines Salzes davon wie Buttersäure. Die Veröffentlichung stellt jedoch wenig Anleitung bei der Auswahl geeigneter Konzentrationen des Zusatzes bereit und spricht weiter nicht die Wirkung des Zusatzes auf die Proteinglykosylierung an. Andere haben beschrieben, dass die Zugabe von niedrigen Spiegeln (0 bis 1,5 mM) von Natriumbutyrat zu Zellkultur-Herstellungsmedium, um die zellspezifische Produktivität zu steigern, zu begleitenden Erhöhungen bei Säureglykoformen (korrespondierend zu gesteigertem Sial säuregehalt) des hergestellten rekombinanten Proteins führt (Chotigeat, et al., (1994) Cytotech. 15: 217–221).
Diverse Gruppen haben die Wirkungen von Osmolalität auf Zellwachstum und Polypeptidherstellung betrachtet (Ozturk und Palsson (1991) Biotech. und Bioeng. 37: 989–993; Stubblefield et al., (1960) Cancer Research, 20: 1646–1655; Garcia-Perez et al., (1989) Journal of Biological Chemistry, 264(28): 16815–16821; Miner et al., (1981) Invasion Metastasis, 1: 158–174; GB 2,251,249; EP 481,791; US-Patent 5,151,359; US-Patent 4,724,206; US-Patent 5,122,469 und WO 89/04867). Es wurden verschiedene Osmolalitätsbereiche für das Zellwachstum oder die Polypeptidproduktion vorgeschlagen. Im allgemeinen wird die Osmolalität des Zellkulturmediums über die Zugabe von NaCl oder Aminosäuren gesteigert. Umgebungsbelastungen, wie erhöhte Salzkonzentrationen, führen in einigen Fällen zu gesteigerter Zellproduktproduktion. Es wurde über die Vorstellung berichtet, dass gesteigerte Expression von Säugerproteinprodukten in Säugerzellkulturen durch Belastung mit gelöstem Stoff, z.B. durch die Zugabe von Salz, Lactatsäure, Ammonium zu den Kulturmedien erreicht werden kann (internationale Veröffentlichung Nr. WO 89/04867). Diese Belastungen sind im allgemeinen wachstumsinhibierend, aber favorisieren zellspezifische Produktivität.
Andere haben die Wirkung der Glukosekonzentration auf Zellwachstum und/oder Polypeptidproduktion in rekombinanter Zellkultur diskutiert. Siehe z.B. Park et al., (1992) Biotechnology and Bioengineering, 40: 686–696; Huang et al., (1991) Journal of Biotechnology, 18: 161–162; EP 387,840 ; Reuveny et al., (1986) Journal of Immunological Methods, 86: 53–59; Fine et al., (1976) In Vitro, 12(10): 693–701; Dircks et al., (1987) Exp. Eye Res., 44:951–958; Mizutani et al., (1992) Biochemical and Biophysical Research Communications, 187(2): 664–669; Sugiura, (1992) Biotechnology and Bioengineering, 39: 953–959; WO 88/01643; Graf et al., (1989) DECHEMA Biotechnol. Conf., 3: 615–618; japanische Patentanmeldung Nr. JP 1-101882; US-Patent 3,926,723; WO 87/00195; und Fleischaker, Jr., Ph. D. Thesis, Massachusetts Institute of Technology, Seiten 196–229 (Juni 1982). Diese vorangehenden Studien haben jedoch nicht die Wirkung verschiedener Verfahrensparameter auf den Sialsäuregehalt des reifen Proteins, einen Faktor bei der Glykoproteinproduktion, der gleichbedeutend mit klinischem Erfolg ist, untersucht.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Kontrolle des Sialsäuregehalts von Glykoproteinen, die durch Säugerzellkultur hergestellt werden, bereit.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, dass bestimmte Säugerzellkultur-Verfahrensparameter die zellspezifische Produktivität wie auch das Ausmaß und die Art der Glykosylierung der hergestellten Proteine beeinflussen. Genauer haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass bestimmte Faktoren, die die zellspezifische Produktivität steigern, einen inversen Effekt auf den Sialsäuregehalt des hergestellten Proteins besitzen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben daher verschiedene Zellkulturverfahren entworfen, um bestimmte Glykoforme von Glykoproteinen, die in Säugerzellkultur hergestellt werden, anzureichern.
Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle des Sialsäuregehaltes eines Glykoproteins, das durch eine Säugerzellkultur hergestellt wird, bereit. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung führt die Variierung der Produktionsgeschwindigkeit des Glykoproteins in der Herstellungsphase der Zellkultur zu Änderungen in dem Sialsäuregehalt des reifen Glykoproteins. Genauer führt eine Steigerung an zellspezifischer Produktivität während der Glykoprotein-Herstellungsphase zu einer Abnahme im Sialsäuregehalt des reifen Proteins. Anders herum führt eine Abnahme an zellspezifischer Produktivität zu einer Zunahme im Sialsäuregehalt bei dem reifen Protein.
Die vorliegende Erfindung stellt in einer besonderen Ausführungsart die Variation der zellspezifischen Produktivität einer Säuger-Wirtszelle während der Protein-Herstellungsphase einer Säugerzellkultur durch Kontrolle von Faktoren, die die zellspezifische Produktivität beeinflussen, bereit. Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die Konzentration von Faktoren, die die DNA-Transkription steigern, kontrolliert. Bei einer anderen Ausführungsart wird die zellspezifische Produktivität durch Erhaltung der Osmolalität der Zellkultur innerhalb bestimmter Grenzen kontrolliert. Gemäß der Erfindung wird jeder der vorangehenden Parameter allein oder in Kombination kontrolliert, um den Sialsäuregehalt des reifen Glykoproteins zu beeinflussen. Bei einer besonderen Ausführungsart der vorliegenden Erfindung ist der Faktor, der die DNA-Transkription steigert, eine Alkansäure, die Buttersäure oder ein Salz davon ist, was Natriumbutyrat in einer Konzentration von ungefähr 0,1 mM bis ungefähr 20 mM ist. Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird die Osmolalität der Zellkultur zwischen ungefähr 250 bis 600 mOsm erhalten. Bei einem weiteren Aspekt wird die Temperatur der Zellkultur zwischen ungefähr 30°C und 37°C kontrolliert.
Bei einer vorzuziehenden Ausführungsart stellt die Erfindung ein Verfahren für die Steigerung des Sialsäuregehaltes des reifen Glykoproteins, das durch eine Säugerzellkultur hergestellt wird, bereit, umfassend die Erhaltung einer niedrigeren zellspezifischen Produktivität durch Kontrolle eines oder aller der oben identifizierten Verfahrensparameter, wahlweise zusammen mit anderen Parametern, die in dem Fachgebiet bekannt sind. Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung produziert die Kultivierung der Wirtszelle in einer Konzentration der Alkansäure oder des Salzes davon von ungefähr 0,1 mM bis ungefähr 6 mM und wahlweise zusammen mit der Erhaltung der Osmolalität der Zellkultur bei ungefähr 300 bis 450 mOsm ein Protein mit einem erhöhten Sialsäuregehalt.
Bei einer weiter vorzuziehenden Ausführungsart stellt die Erfindung ein Verfahren für die Verringerung des Sialsäuregehaltes des reifen Glykoproteins, das durch eine Säugerzellkultur hergestellt wird, bereit, umfassend die Erhöhung der zellspezifischen Produktivität der Zellkultur. In einer vorzuziehenden Ausführungsart wird die zellspezifische Produktivität durch die Bereitstellung eines Zellkulturverfahrens gesteigert, das irgendeines aus der Kultivierung der Wirtszelle bei einer Konzentration einer Alkansäure oder eines Salzes davon von ungefähr 6 mM bis ungefähr 12 mM und aus Aufrechterhaltung der Osmolalität der Zellkultur bei ungefähr 450 bis 600 mOsm umfasst.
Bei einer besonderen Ausführungsart stellt die Erfindung weiter ein Zellkulturverfahren mit drei Phasen der Zellkultur bereit. Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Kontrolle des Sialsäuregehaltes eines Glykoproteins, das durch eine Säugerzellkultur produziert wird, bereit, umfassend die Schritte der Kultivierung einer Wirtszelle, die das Protein in einer Wachstumsphase exprimiert, für einen Zeitraum und unter solchen Bedingungen, dass das Zellwachstum maximiert wird. Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Wachstumsphase von einer Übergangsphase gefolgt, bei der die Zellkulturparameter für den erwünschten Sialsäuregehalt des reifen Glykoproteins ausgewählt und eingestellt werden. Die Übergangsphase wird durch eine Herstellungsphase der Zellkultur gefolgt, worin die ausgewählten Parameter in der Übergangsphase aufrechterhalten werden und das Glykoproteinprodukt hergestellt und geerntet wird. Die Variierung der zellspezifischen Produktivität der Herstellungsphase der Zellkultur durch Zugabe von Buttersäure oder des Natriumsalzes davon zu der Zellkultur in einer Konzentration von ungefähr 0,1 mM bis ungefähr 20 mM und Einstellung einer Osmolalität der Zellkultur bei ungefähr zwischen 250 und 600 mOsm, wahlweise in Kombination miteinander während der Übergangsphase, produziert ein Protein mit verschiedenen Mengen an Sialsäure.
Bei einer weiter vorzuziehenden Ausführungsart stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle der Menge an Sialsäure, die in einem löslichen Typ 1-Tumornekrosefaktorrezeptor(TNFR1)-Immunglobulin G₁(IgG₁)chimären Protein vorliegt, bereit. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, dass unter bestimmten Produktionsbedingungen neuartige TNFR1-IgG₁-Glykoform-Präparate erhalten werden können, die die erwünschten Eigenschaften der verlängerten Clearance aus dem Blut aufweisen, während sie eine signifikante funktionelle Aktivität bewahren. Eine lange funktionelle Halbwertszeit erlaubt vereinfachte Bolus-Dosisverabreichung und trägt zu einer in vivo-Wirksamkeit des hergestellten Glykoproteins bei, was niedrigere Dosierungsformen des Glykoproteins erlaubt.
Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein TNFR1-IgG₁-Glykoproteinmolekül hergestellt, das vermehrt Sialsäurereste enthält. Die Zellkulturparameter für die Herstellungsphase des TNFR1-IgG₁ werden ausgewählt, um den erwünschten Sialsäuregehalt zu erhalten. Bei einer vorzuziehenden Ausführungsart liegt das Natriumbutyrat in der Herstellungsphase in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis ungefähr 6 mM vor und die Osmolalität wird bei ungefähr 300 bis 450 mOsm aufrechterhalten. Bei einem mehr vorzuziehenden Aspekt liegt die Natriumbutyrat-Konzentration bei ungefähr 1 mM und die Osmolalität wird bei ungefähr 350 bis 400 mOsm aufrechterhalten.
1A und 1B. Die 1A und 1B zeigen das Verfahren, das verwendet wird, um spezifische Produktivität eines typischen Zellkulturverfahrens in der Herstellungsphase zu berechnen. Die spezifische Produktivität kann als eine Funktion der Lebendzellzahlbestimmungen (Lebendzelltage) ausgedrückt werden, wie in 1A gezeigt wird; oder als Packed-Cell-Volumen (PCV), wie in 1B gezeigt wird. Die spezifische Produktionsgeschwindigkeit wird innerhalb des Bereiches für ein 90%iges Konfidenzintervall angegeben.
2A und 2B. Die 2A und 2B zeigen die Korrelation zwischen spezifischer Produktivität, basierend auf Lebendzelltagen (2A) und Packed-Cell-Volumen (PCV) (2B) während der Herstellungsphase und den Sialsäuregehalt (NANA) des geernteten Produktes. Die Werte für 9 verschiedene Verfahren (A–I) werden gezeigt. Die Datenpunkte stellen unabhängige Produktionsverfahren, wie in Tabelle I beschrieben, dar.
Die Kohlenhydratanteile der vorliegenden Erfindung werden mit Hinweis auf die allgemein verwendete Nomenklatur für die Beschreibung von Oligosacchariden beschrieben. Ein Überblick über die Kohlenhydratchemie, die diese Nomenklatur verwendet, wird in Hubbard and Ivatt (1981) Ann., Rev. Biochem. 50: 555–583 gefunden. Diese Nomenklatur beinhaltet z.B. Man, was Mannose darstellt: GlcNAc, was 2-N-Acetylglukosamin darstellt: Gal, was Galaktose darstellt und Glc, was Glukose darstellt. Sialsäuren werden mit Hinweis auf die Kurzbenennung NeuNAc für 5-N-Acetylneuraminsäure und NeuNGc für 5-Glykolylneuraminsäure beschrieben (J. Biol. Chem., 1982 257: 3347; J. Biol. Chem., 1982, 257: 3352).
"Osmolalität" ist ein Maß für den osmotischen Druck von aufgelösten löslichen Teilchen in einer wässrigen Lösung. Die löslichen Teilchen beinhalten sowohl Ionen wie auch nichtionisierte Moleküle. Osmolalität wird als die Konzentration von osmotisch aktiven Teilchen (spricht Osmolen), die in 1 kg einer Lösung aufgelöst sind, ausgedrückt (1 mOsm/kg H₂O bei 38°C ist äquivalent zu einem osmotischen Druck von 19 mm Hg). "Osmolarität" bezeichnet im Gegensatz dazu die Anzahl der löslichen Teilchen, die in 1 Liter Lösung aufgelöst sind. Wenn sie hier verwendet wird, bedeutet die Abkürzung "mOsm" "Milliosmol/kg Lösung".
Wie hier verwendet, bezieht sich "Glykoprotein" im allgemeinen auf Peptide und Proteine, die mehr als ungefähr zehn Aminosäuren und mindestens eine Oligosaccharidseitenkette besitzen. Die Glykoproteine können homolog zu der Wirtszelle sein oder sie sind vorzugsweise heterolog, sprich fremd zu der Wirtszelle, die verwendet wird, wie ein menschliches Protein, das von einer chinesischen Hamster-Ovarzelle produziert wird. Vorzugsweise werden Säuger-Glykoproteine (Glykoproteine, die ursprünglich von einem Säugerorganismus stammen) verwendet, mehr vorzuziehen diejenigen, die direkt in das Medium sezerniert werden. Beispiele für Säuger-Glykoproteine beinhalten Moleküle wie Zytokine und ihre Rezeptoren, wie auch chimäre Proteine, die Zytokine oder ihre Rezeptoren umfassen, einschließlich z.B. Tumor-Nekrose-Faktor alpha und beta, ihre Rezeptoren (TNFR-1; EP 417,563 veröffentlicht am 20. März 1991 und TNFR-2, EP 417,014 , veröffentlicht 20. März 1991) und ihre Derivate; Renin; ein Wachstumshormon, einschließlich menschlichem Wachstumshormon und Rinder-Wachstumshormon; Wachstumshormon Releasingfaktor; Parathormon; Thyroidea stimulierendes Hormon; Lipoproteine; alpha-1-Antitrypsin; Insulin-A-Kette; Insulin-B-Kette; Proinsulin; Follikel stimulierendes Hormon; Calcitonin; luteinisierendes Hormon; Glucagon; Gerinnungsfaktoren wie Faktor VIIIC, Faktor IX, Gewebefaktor und von Willebrand- Faktor; Antigerinnungsfaktoren wie Protein C; atrialer natriuretischer Faktor; Lungensurfactant; einen Plasminogenaktivator, wie Urokinase oder menschlicher Urin- oder Gewebe-Plasminogenaktivator(t-PA); Bombesin; Thrombin; hämapoetischer Wachstumsfaktor; Enkephalinase; RANTES (reguliert bei Aktivierung, normal T-Zell-exprimiert und sezerniert); menschliches Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP-1-alpha); ein Serumalbumin, wie ein menschliches Serumalbumin; Müllersche inhibierende Substanz; Relaxin-A-Kette; Relaxin-B-Kette; Prorelaxin; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; ein mikrobielles Protein, wie beta-Lactamase; DNase; Inhibin; Aktivin; vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF); Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin; Protein A oder D; Rheumafaktoren; ein neurotropher Faktor, wie von Hirn abstammender neurotropher Faktor (BDNF), Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6) oder ein Nerven-Wachstumsfaktor wie NGF-β; Thrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF); Fibroblasten-Wachstumsfaktor wie aFGF und bFGF; epidermaler Wachstumsfaktor (EGF); transformierender Wachstumsfaktor (TGF) wie TGF-alpha und TGF-beta, einschließlich TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 oder TGF-β5; insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I und -II (IGF-I und IGF-II); Des(1–3)-IGF-I (Gehirn-IGF-I), insulinähnlicher Wachstumsfaktor-Bindungsproteine; CD-Proteine wie CD-3, CD-4, CD-8 und CD-19; Erythropoietin; osteoinduktive Faktoren; Immunotoxine; ein Knochen-morphogenetisches Protein (BMP); ein Interferon wie Interferon-alpha, -beta und -gamma; Kolonie stimulierende Faktoren (CSFs), z.B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (ILs), z.B. IL-1 bis IL-10; Superoxiddismutase; T-Zell-Rezeptoren; Oberflächenmembranproteine; zerfallsbeschleunigender Faktor; virales Antigen wie z.B. ein Teil der AIDS-Hülle; Transportproteine; Homingrezeptoren; Addressine; Regulationsproteine; Antikörper; chimäre Proteine wie Immunadhäsine und Fragmente von irgendeinem der oben aufgelisteten Polypeptide.
Die Begriffe "Zellkulturmedium" und "Kulturmedium" beziehen sich auf eine Nährlösung, die für das Züchten von Säugerzellen verwendet wird, die typischerweise mindestens einen Bestandteil aus einer oder mehreren der folgenden Kategorien bereitstellt:

1) eine Energiequelle, gewöhnlich in der Form eines Kohlenhydrats wie Glukose;
2) alle essenziellen Aminosäuren und gewöhnlich den Basissatz an zwanzig Aminosäuren plus Cystein;
3) Vitamine und/oder andere organische Verbindungen, die in niedrigen Konzentrationen nötig sind;
4) freie Fettsäuren; und
5) Spurenelemente, wobei Spurenelemente als anorganische Verbindungen oder natürlich vorkommende Elemente definiert sind, die typischerweise in sehr niedrigen Konzentrationen erforderlich sind, gewöhnlich im mikromolaren Bereich.

Die Nährlösung kann wahlweise mit einem oder mehreren Bestandteilen aus jeder der folgenden Kategorien ergänzt werden:

1) Hormone und andere Wachstumsfaktoren wie z.B. Insulin, Transferrin und epidermaler Wachstumsfaktor;
2) Salze und Puffer wie z.B. Calcium, Magnesium und Phosphat;
3) Nukleoside und Basen wie z.B. Adenosin, Thymidin und Hypoxanthin; und
4) Protein und Gewebehydrolysate.

Der Begriff "Säugerwirtszelle", "Wirtszelle", "Säugerzelle" und dergleichen, bezieht sich auf von Säugern abstammende Zelllinien, die in der Lage sind, zu wachsen und zu überleben, wenn sie entweder in eine Monolayerkultur oder in eine Suspensionskultur in einem Medium, das die geeigneten Nährstoffe und Wachstumsfaktoren enthält, platziert werden. Die notwendigen Wachstumsfaktoren für eine bestimmte Zelllinie werden ohne weiteres empirisch ohne unnötiges Experimentieren bestimmt, wie z.B. in Mammalian Cell Culture (Mather, J. P. Hrsg., Plenum Press, N.Y. [1984]) und Barnes and Sato, (1980) Cell, 22: 649 beschrieben wird. Typischerweise sind die Zellen in der Lage, große Mengen eines bestimmten Glykoproteins von Interesse in das Kulturmedium zu exprimieren und sezernieren. Beispiele für geeignete Säuger-Wirtszellen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können chinesische Hamster-Ovarzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]); dp12.CHO-Zellen ( EP 307,247 , veröffentlicht am 15. März 1989); Affen-Nieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, subkloniert für Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 [1977]); Babyhamster-Nierenzellen (BHK. ATCC CCL 10); Maus-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243–251 [1980]); Affen-Nieren-Zellen (CV1 ATCC CCL 70); afrikanische grüne Affen-Nieren-Zellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche zervikale Karzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hunde-Nieren-Zellen (MDCK. ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A. ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44–68 [1982]); MRC 5-Zellen; FS4-Zellen und eine menschliche Hepatomlinie (Hep G2) beinhalten.
Bevorzugte Wirtszellen beinhalten chinesische Hamster-Ovarzellen/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]); dp12.CHO-Zellen ( EP 307,247 , veröffentlicht am 15. März 1989).
Der Begriff "Pepton" im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung soll sich auf eine Medienergänzung beziehen, die im wesentlichen hydrolysiertes Tierprotein ist. Die Quelle für dieses Protein können Tierabfallprodukte aus Schlachthäusern, gereinigte Gelatine oder Pflanzenmaterial sein. Das Protein wird typischerweise unter Verwendung von Säure, Hitze oder verschiedenen Enzympräparaten hydrolysiert. Bevorzugte Peptonmischungen sind z.B. "Primatone RL" und "Primatone HS", die beide kommerziell erhältlich sind (Sheffield, England).
"Zellspezifische Produktivität", "zellspezifische Geschwindigkeit" und dergleichen werden hier verwendet, um sich auf eine spezifische, sprich pro Zelle oder pro Messung von Zellmasse oder Volumen, Produkt-Expressionsgeschwindigkeit, zu beziehen. Die zellspezifische Produktivität wird z.B. in Gramm Protein, die pro Zelle pro Tag produziert werden, gemessen. Die zellspezifische Produktivität kann bequem gemäß dem integralen Verfahren gemessen werden: dP/dt = qpXoder P = qp∫::Xdtwobei q_p die zellspezifische Produktivitätskonstante, X die Anzahl von Zellen oder Zellvolumen oder Zellmassenäquivalente und dP/dt die Geschwindigkeit der Proteinproduktion ist. Daher kann q_p aus einem Diagramm der Produktkonzentration gegen das Zeitintegral von lebensfähigen Zellen erhalten werden (∫:^:Xdt "Lebend-Zell-Tage"). Wenn die Menge des Glykoproteinproduktes, das produziert wird, gegen die Lebend-Zell-Tage aufgetragen wird, ist gemäß dieser Formel die Kurve äquivalent zu der zellspezifischen Geschwindigkeit. Lebensfähige Zellen können durch verschiedene Messungen, z.B. Biomasse, O₂-Aufnahmegeschwindigkeit, Lactasedehydrogenase (LDH), Packed-Cell-Volumen oder Trübung bestimmt werden.
"Wachstumsphase" der Zellkultur bezieht sich auf den Zeitraum exponentiellen Zellwachstums (die log-Phase), wo sich Zellen im allgemeinen schnell teilen. Während dieser Phase werden die Zellen für einen Zeitraum, gewöhnlich zwischen 1 bis 4 Tagen, und unter solchen Bedingungen kultiviert, dass das Zellwachstum maximiert wird. Die Bestimmung des Wachstumszyklus für die Wirtszelle kann für die bestimmte vorgestellte Wirtszelle ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden. "Zeitraum und unter solchen Bedingungen, dass Zellwachstum maximiert wird" und dergleichen bezieht sich auf diejenigen Kulturbedingungen, für die für eine bestimmte Zelllinie bestimmt wird, dass sie für Zellwachstum und Teilung optimal sind. Während der Wachstumsphase werden die Zellen in einem Nährmedium, das die notwendigen Zusätze enthält, bei allgemein ungefähr 30 bis 40°C, in einer befeuchteten kontrollierten Atmosphäre kultiviert, dass optimales Wachstum für die besondere Zelllinie erreicht wird. Die Zellen werden in der Wachstumsphase für einen Zeitraum von ungefähr zwischen einem und vier Tagen erhalten, gewöhnlich zwischen zwei bis drei Tagen.
"Übergangsphase" der Zellkultur bezieht sich auf den Zeitraum, während dem die Kulturbedingungen für die Herstellungsphase eingestellt werden. Während der Übergangsphase werden Umgebungsfaktoren wie die Temperatur der Zellkultur, Mediumosmolalität und dergleichen von Wachstumsbedingungen zu Produktionsbedingungen verschoben.
"Herstellungsphase" der Zellkultur bezieht sich auf den Zeitraum, während dem sich das Zellwachstum eingependelt hat. Während der Herstellungsphase hat das logarithmische Zellwachstum aufgehört und die Proteinproduktion ist vorherrschend. Während dieses Zeitraumes wird das Medium im allgemeinen ergänzt, um fortgesetzte Proteinproduktion zu unterstützen und um das erwünschte Glykoproteinprodukt zu erhalten.
Der Begriff "Expression" oder "exprimiert" wird hier verwendet, um sich auf Transkription und Translation, die in einer Wirtszelle auftritt, zu beziehen. Der Spiegel der Expression eines Produktgens in einer Wirtszelle kann auf der Basis von entweder der Menge an korrespondierender mRNA, die in der Zelle vorliegt, oder der Menge an Protein, das durch das Produktgen, das durch die Zelle produziert wird, kodiert wird, bestimmt werden. Zum Beispiel wird mRNA, die von einem Produktgen transkribiert wird, wünschenswert durch Northern-Hybridisierung quantifiziert. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Seiten 7.3–7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Ein Protein, das durch ein Produktgen kodiert wird, kann entweder durch Untersuchung auf die biologische Aktivität des Proteins oder durch Anwendung von Assays, die von solcher Aktivität unabhängig sind, wie Western-Blotting oder Radioimmunassay, unter Verwendung von Antikörpern, die in der Lage sind, mit dem Protein zu reagieren, quan tifiziert werden. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Seiten 18.1–18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Mit Alkansäure oder Salz davon ist Buttersäure gemeint und das korrespondierende Salz ist Natriumbutyrat.
II. Zellkulturverfahren
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, dass Faktoren, die die zellspezifische Produktivität während der Produktion eines Glykoproteins, das durch eine Säugerzellkultur produziert wird, steigern, einen umgekehrten Effekt auf den Sialsäuregehalt des produzierten Glykoproteins haben. Da Proteine, die einen oder mehrere Sialsäurereste pro komplexer Oligosaccharidstruktur exprimieren, in vivo längere Clearancegeschwindigkeiten aufweisen, kann die Clearancegeschwindigkeit des hergestellten Glykoproteins innerhalb weiter Grenzen durch den allgemeinen Sialylierungsgrad der Zubereitung manipuliert werden. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Kontrolle des Ausmaßes an Sialylierung eines Glykoproteins, das durch eine Säugerzellkultur hergestellt wird, bereit. Der Methodologie folgend, die hier dargestellt wird, ist man in der Lage, die präzisen Verfahrensparameter zu bestimmen, die den erwünschten Sialsäuregehalt eines Glykoproteins, das durch eine Säugerzellkultur hergestellt wird, bereitstellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Säugerwirtszelle kultiviert, um ein gewinnbares Glykoproteinprodukt herzustellen. Der allgemeine Sialsäuregehalt in dem Glykoprotein wird durch Kontrolle von Zellkulturparametern, die die zellspezifische Produktivität beeinflussen, kontrolliert. Faktoren, die die zellspezifische Produktivität beeinflussen, sind in dem Fachgebiet gut bekannt und beinhalten, aber sind nicht begrenzt auf Faktoren, die die Anzahl der DNA/RNA-Kopien beeinflussen, Faktoren, die RNA beeinflussen, wie Faktoren, die RNA stabilisieren, Mediennährstoffe und andere Ergänzungen, die Konzentration von Transkriptionsverstärkern, die Osmolalität der Kulturumgebung, die Temperatur und der pH der Zellkultur und dergleichen. Gemäß der vorliegenden Erfindung bildet die Einstellung dieser Faktoren, allein oder in Kombination, um die zellspezifische Produktivität zu erhöhen, ein Protein mit einem verringerten Sialsäuregehalt. Die Einstellung dieser Faktoren, allein oder in Kombination, um die zellspezifische Produktivität zu verringern, bildet ein reifes Glykoprotein mit einem gesteigerten Sialsäuregehalt.
Die Erfindung wird nun mit Hinweis auf verschiedene, einschließlich gut bekannter, Zellkulturtechniken und Prinzipien beschrieben werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Säugerzellen kultiviert, um ein gewünschtes Glykoproteinprodukt herzustellen. Bei der Auswahl einer Wirtszelle für die Herstellung des Glykoproteins im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist es wichtig zu erkennen, dass verschiedene Wirtszellen charakteristische und spezifische Mechanismen für die Translations- und Posttranslationsverarbeitung und Modifizierung (z.B. Glykosylierung, Spaltung) der exprimierten Proteine aufweisen. Es sollten geeignete Zelllinien gewählt werden, um sicherzustellen, dass die gewünschten Posttranslationsmodifizierungen möglich sind. Alternativ können Wirtszellen modifiziert werden, um ein gewünschtes Genprodukt, das für die spezifische Posttranslationsmodifizierung erforderlich ist, zu exprimieren.
Insbesondere sollten Säugerzellen, die das erwünschte Protein exprimieren, die besonderen Enzyme exprimieren oder manipuliert werden, um sie zu exprimieren, so dass unter geeigneten Bedingungen, die hier beschrieben werden, die passende Posttranslationsmodifizierung in vivo auftritt. Die Enzyme beinhalten diejenigen Enzyme, die für die Addition und Vervollständigung der N- und O-gekoppelten Kohlenhydrate notwendig sind, wie diejenigen, die in Hubbard und Ivan, siehe oben, für N-gekoppelte Oligosaccharide beschrieben werden. Die Enzyme beinhalten wahlweise Oligosaccharyltransferase, alpha-Glukosidase I, alpha-Glukosidase II, ER-alpha(1,2)mannosidase, Golgi-alpha-mannodase I, N-Acetylyglukosaminyltransferase I, Golgi-alpha-mannodase II, N-Acetylyglukosaminyltransferase II, alpha-(1,6)-Fukosyltransferase und β(1,4)Galaktosyltranferase. Zusätzlich exprimiert die Wirtszelle die geeignete Sialyltransferase, von der angenommen werden kann, dass sie die terminale Sialsäure in spezifischer Position und Bindung als Teil des Wirtszellengenoms anhängt. Wahlweise kann die Wirtszelle dazu gebracht werden, die geeigneten Sialyltransferasen z.B. durch Transfizierung der Wirtszelle mit der DNA, die die Sialyltransferase kodiert, zu exprimieren.
Von den oben beschriebenen Sialyltransferasen würde erwartet werden, dass sie den terminalen Sialsäurerest an die passende Oligosaccharid-Kernstruktur anfügen, wie Galβ1-4GlcNAc. Geeignete Sialyltransferasen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf diejenigen Sialyltransferasen, die die komplexe Sialylierung und Verzweigung der N- und O-gekoppelten Oligosaccharide katalysieren.
Für die Kultivierung der Säugerzellen, die das erwünschte Protein exprimieren und in der Lage sind, die gewünschten Kohlenhydrate in spezifischer Position und Bindung zuzufügen, können zahlreiche Kultivierungsbedin gungen verwendet werden, wobei besondere Aufmerksamkeit auf die Wirtszelle, die kultiviert wird, gerichtet wird. Geeignete Kultivierungsbedingungen für Säugerzellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (J. Immunol. Methods (1983) 56: 221–234) oder können durch den geübten Fachmann leicht bestimmt werden (siehe z.B. Animal Cell Culture: A Practical Approach 2. Ausgabe, Rickwood, D. und Hames, B. D., Hrsg. Oxford University Press, New York (1992)) und variieren entsprechend der besonderen ausgewählten Wirtszelle.
Die Säugerzellkultur der vorliegenden Erfindung wird in einem Medium vorbereitet, das für die besondere Zelle, die kultiviert wird, geeignet ist. Kommerziell erhältliche Medien wie Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium ([DMEM], Sigma) sind beispielhafte Nährlösungen. Zusätzlich kann jedes der Medien, das in Ham und Wallace, (1979) Meth. Enz., 58: 44; Barnes und Sato, (1980) Anal. Biochem., 102: 255; US-Patenten 4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 5,122,469 oder 4,560,655; internationale Patentveröffentlichungen Nrn. WO 90/03430 und WO 87/00195, die Offenbarungen von allen sind hier durch Hinweis eingeschlossen, beschrieben werden, als Kulturmedium verwendet werden. Jedes dieser Medien kann wenn notwendig mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie Insulin, Transferrin oder epidermaler Wachstumsfaktor), Salzen (wie Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nukleosiden (wie Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie Gentamycin^TM Medikament), Spurenelementen (die als anorganische Verbindungen, die normalerweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorliegen, definiert sind), Lipiden (so wie Linolsäure oder andere Fettsäuren) und ihren geeigneten Trägern und Glukose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Alle anderen notwendigen Ergänzungen können auch in geeigneten Konzentrationen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sein werden, eingeschlossen werden.
Bei einer besonderen Ausführungsart ist die Säuger-Wirtszelle eine CHO-Zelle, vorzugsweise eine dp12.CHO-Zelle, und ein geeignetes Medium enthält einen Basismediumbestandteil wie eine auf DMEM/HAM F-12 basierende Formulierung (für die Zusammenstellung von DMEM und HAM F12-Medien, siehe Kulturmedienformulierungen in American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 6. Ausgabe, 1988, Seiten 346–349) (die Formulierung von Medium, wie beschrieben in US-Patent 5,122,469 ist besonders geeignet) mit modifizierten Konzentrationen von einigen Bestandteilen wie Aminosäuren, Salzen, Zucker und Vitaminen und wahlweise Beinhaltung von Glycin, Hypoxanthin und Thymidin; rekombinantem menschlichem Insulin, hydrolysiertem Pepton, wie Primatone HS oder Primatone RL (Sheffield, England) oder das Äquivalent; einen zellschützenden Wirkstoff wie Pluronic F68 oder das äquivalente Pluronic-Polyol; Gentamycin und Spurenelemente.
Die Glykoproteine der vorliegenden Erfindung können durch Züchtung von Zellen, die das gewünschte Protein unter einer Vielzahl von Zellkulturbedingungen exprimieren, hergestellt werden. Zum Beispiel sind Zellkulturverfahren für die groß oder klein angelegte Herstellung von Proteinen potenziell brauchbar im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung. Es können Verfahren einschließlich, aber nicht begrenzt auf, einen Flüssigbett-Bioreaktor, Hohlfaser-Bioreaktor, Rollflaschenkultur oder Rühr-Bioreaktorsystem verwendet werden, bei den letzteren zwei Systemen mit oder ohne Mikroträger und alternativ in einem Batch, Fed-batch oder kontinuierlichen Modus betrieben werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsart wird die Zellkultur der vorliegenden Erfindung in einem Rühr-Bioreaktorsystem durchgeführt und es wird ein Fed-batch-Kulturverfahren verwendet. Bei der bevorzugten Fed-batch-Kultur werden die Säuger-Wirtszellen und das Kulturmedium einem Kultivierungsgefäß initial zugeführt und zusätzliche Kulturnährstoffe werden kontinuierlich oder in einzelnen Inkrementen zu der Kultur während der Kultivierung zugegeben, mit oder ohne periodische Zell- und/oder Produkternte vor der Beendigung der Kultur. Die Fed-batch-Kultur kann z.B. eine semikontinuierliche Fed-batch-Kultur beinhalten, wobei periodisch die gesamte Kultur (einschließlich Zellen und Medium) entfernt und durch frisches Medium ersetzt wird. Fed-batch-Kultur wird von einfacher Batch-Kultur unterschieden, bei der alle Bestandteile für die Zellkultivierung (einschließlich der Zellen und aller Kulturnährstoffe) zu dem Kulturgefäß am Beginn des Kultivierungsprozesses zugegeben werden. Fed-batch-Kultivierung kann weiter von Perfusionskultivierung insofern unterschieden werden, als dass der Überstand von dem Kulturgefäß nicht während des Prozesses entfernt wird (bei Perfusionskultivierung werden die Zellen in der Kultur zurückgehalten, z.B. durch Filtration, Einkapselung, Verankerung an Mikrocarrier etc. und das Kulturmedium wird kontinuierlich oder in Abständen in das Kulturgefäß eingeführt und entfernt).
Weiter können die Zellen der Kultur gemäß jedem Schema oder jedem Routineverfahren, das für die bestimmte Wirtszelle und den bestimmten überlegten Produktionsplan geeignet ist, vermehrt werden. Daher überlegt die vorliegende Erfindung ein Einschritt- oder Mehrschritt-Kulturverfahren. Bei einer Einschrittkultur werden die Wirtszellen in eine Kulturumgebung ge impft und die Verfahren der momentanen Erfindung werden während einer einzelnen Herstellungsphase der Zellkultur angewendet. Alternativ stellt man sich eine Kultur mit vielen Stadien vor. Bei der Kultur mit vielen Stadien können die Zellen in einer Anzahl von Schritten oder Phasen kultiviert werden. Zum Beispiel kann man Zellen in einem ersten Schritt oder einer Wachstumsphasenkultur wachsen lassen, wobei Zellen, möglicherweise aus einer Lagerung entfernt, in ein Medium, das für die Förderung von Wachstum und hoher Lebensfähigkeit geeignet ist, geimpft werden. Die Zellen können in der Wachstumsphase für einen geeigneten Zeitraum durch die Zugabe von frischem Medium zu der Wirtszellenkultur erhalten werden.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung werden Fed-batch oder kontinuierliche Zellkulturbedingungen angewendet, um das Wachstum der Säugerzellen in der Wachstumsphase der Zellkultur zu verstärken. In der Wachstumsphase lässt man Zellen unter Bedingungen und für einen Zeitraum wachsen, die für Wachstum maximiert sind. Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH, gelöster Sauerstoff (dO₂) und dergleichen sind diejenigen, die von dem bestimmten Wirt verwendet werden und sie werden dem normal bewanderten Fachmann offensichtlich sein. Im allgemeinen wird der pH auf ein Niveau zwischen ungefähr 6,5 und 7,5 unter Verwendung von entweder einer Säure (z.B. CO₂) oder einer Base (z.B. Na₂CO₃ oder NaOH) eingestellt werden. Ein geeigneter Temperaturbereich für die Kultivierung von Säugerzellen wie CHO-Zellen liegt zwischen ungefähr 30 bis 38°C und ein geeigneter dO₂ liegt zwischen 5 bis 90% Luftsättigung.
In einem bestimmten Stadium können die Zellen verwendet werden, um eine Herstellungsphase oder einen Schritt der Zellkultur zu beimpfen. Alternativ kann, wie oben beschrieben, die Herstellungsphase oder der Schritt kontinuierlich mit der Beimpfungs- oder Wachstumsphase oder dem Schritt verlaufen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Zellkulturumgebung während der Herstellungsphase der Zellkultur kontrolliert. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden Faktoren, die die zellspezifische Produktivität der Säuger-Wirtszelle beeinflussen, so manipuliert, dass der gewünschte Sialsäuregehalt bei dem resultierenden Glykoprotein erhalten wird. Insbesondere Faktoren, die die zellspezifische Produktivität steigern, werden während der Herstellungsphase des Zellkulturverfahrens so kontrolliert, dass das resultierende Glykoproteinprodukt den erwünschten Sialsäuregehalt enthält.
Bei einem bevorzugten Aspekt geht der Herstellungsphase des Zellkulturverfahrens eine Übergangsphase der Zellkultur voran, bei der Parameter für die Herstellungsphase der Zellkultur eingestellt werden.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Konzentration eines Transkriptionsverstärkers wie einer Alkansäure manipuliert, um die zellspezifische Produktivität und dadurch den resultierenden Sialsäuregehalt des Säugerzell-Glykoproteinproduktes zu beeinflussen. Die Alkansäure ist Buttersäure und das Salz davon ist Natriumbutyrat.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Konzentration von Natriumbutyrat kontrolliert, um die zellspezifische Produktivität zu kontrollieren. Es werden Konzentrationen von Natriumbutyrat zwischen 0,1 und 20 mM verwendet und gemäß der bestimmten Wirtszelle, die kultiviert wird, und dem erwünschten Sialsäuregehalt des Glykoproteinproduktes modifiziert. Um ein Protein mit dem gewünschten Sialsäuregehalt herzustellen, wird eine Konzentration von Natriumbutyrat gewählt, die die höchste zellspezifische Produktivität mit dem am besten annehmbaren Sialsäureprofil bereitstellt. Des halb werden gemäß der vorliegenden Erfindung Konzentrationen eines Transkriptionsverstärkers wie Natriumbutyrat ausgewählt, um den erwünschten Sialsäuregehalt zu erhalten.
Um den Sialsäuregehalt des reifen Glykoproteins zu steigern, werden im allgemeinen niedrigere Konzentrationen des Transkriptionsverstärkers verwendet. Die niedrigere Konzentration sorgt für verstärkte Transkription, aber erhält eine niedrigere zellspezifische Produktivität aufrecht, während sie die Lebensfähigkeit der Wirtszellenkultur erhält. Im allgemeinen werden Konzentrationen des Transkriptionsverstärkers wie Natriumbutyrat zwischen ungefähr 0,1 mM und ungefähr 8 mM verwendet. Mehr vorzuziehen werden Konzentrationen zwischen ungefähr 1,0 und 6,0 mM verwendet. Bei einer besonderen Ausführungsart werden ungefähr 6 mM Natriumbutyrat verwendet. Bei einer anderen Ausführungsart wird ungefähr 1 mM Natriumbutyrat verwendet.
Bei einer anderen Ausführungsart wird ein Glykoprotein mit einem verringerten Spiegel von Sialsäure hergestellt. Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Säugerzellen unter solchen Bedingungen kultiviert, dass die zellspezifische Produktivität gesteigert wird. Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Konzentration von Buttersäure so ausgewählt, dass die gesteigerte zellspezifische Produktivität ein Protein mit dem gewünschten Sialsäureprofil bildet. Bei einer bevorzugten Ausführungsart liegt deshalb die Konzentration der Buttersäure oder des Natriumsalzes davon zwischen ungefähr 5 und 20 mM und mehr vorzuziehen zwischen ungefähr 6 mM und 12 mM. Bei einer besonderen Ausführungsart liegt die Konzentration von Natriumbutyrat bei ungefähr 12 mM.
Bei der Bestimmung der geeigneten Konzentration der Buttersäure oder des Natriumsalzes davon kann auf die 2 wie auch auf die Tabelle I unten bei Beispiel I Bezug genommen werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung führen niedrigere Natriumbutyrat-Konzentrationen im allgemeinen zu niedrigerer zellspezifischer Produktivität. Gemäß der Erfindung werden Konzentrationen von Natriumbutyrat ausgewählt, wobei andere Verfahrensparameter, wie die Osmolalität der Herstellungsphase, im Kopf behalten werden. Wie unten diskutiert, kann die Osmolalität die zellspezifische Produktivität beeinflussen. Es werden Konzentrationen von Natriumbutyrat ausgewählt, wobei die bestimmte Osmolalität, die während der Herstellungsphase erhalten werden soll, im Kopf behalten wird.
Alternativ können für andere Säuger-Wirtszellen und andere Glykoproteine kleine Testkulturen hergestellt werden und die Geschwindigkeit der Glykoproteinprodukt-Produktion, sprich der zellspezifischen Produktivität, kann bestimmt und der resultierende Sialsäuregehalt verwendet werden, um eine ähnliche Tabelle und Figur, die für die bestimmte Wirtszelle, die kultiviert wird, geeignet ist, herzustellen, wobei im Kopf behalten wird, dass Abnahmen bei der zellspezifischen Produktivität zu Zunahmen bei dem Sialsäuregehalt des produzierten Glykoproteins führen. Die Buttersäure oder das Natriumbutyrat wird zu der Wirtszellkultur an oder ungefähr zu dem Zeitpunkt zugegeben, an dem die Herstellungsphase der Zellkultur begonnen wird. Bequemerweise wird eine Übergangsphase während des Zellkulturprozesses verwendet, die der Herstellungsphase, bei der die Zellkulturbedingungen, die hier diskutiert werden, für die gewünschte zellspezifische Produktivität und daher das gewünschte Glykoformprofil eingestellt werden, vorangeht.
Die Buttersäure oder das Natriumsalz davon wird auf irgendeine Weise, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, zugegeben. Bei einer bevorzugten Ausführungsart wird das Natriumbutyrat in einer Charge zu dem Fed-batch-Kultursystem mit oder ohne andere geeignete Nährstoffe, wie hier beschrieben wird oder wie denjenigen, die auf dem Fachgebiet der Säugerzellkultur bewandert sind, bekannt ist, zugegeben.
Gemäß der momentanen Erfindung wird die Osmolalität der Zellkulturumgebung zusätzlich zu den Faktoren, die oben angeführt sind, kontrolliert, um das Ausmaß der Sialylierung des reifen Glykoproteins zu regulieren. Bei einer Ausführungsart wird die Osmolalität kontrolliert, um den Sialsäuregehalt des reifen Proteins unabhängig von anderen Faktoren, die die zellspe zifische Produktivität beeinflussen, zu kontrollieren. Bei einer anderen Ausführungsart wird die Osmolalität zusätzlich zu der Kontrolle anderer Faktoren, die die zellspezifische Produktivität beeinflussen, kontrolliert. Bei einer bevorzugten Ausführungsart werden sowohl Osmolalität wie auch die Konzentration von Buttersäure kontrolliert.
Die Osmolalität der Zellkulturumgebung wird kontrolliert, um die erwünschte Balance zwischen der zellspezifischen Produktivität und dem Sialsäureprofil des resultierenden Glykoproteins herzustellen. Im allgemeinen wird die zellspezifische Produktivität gesteigert, wenn die Osmolalität gesteigert wird. Eine Osmolalität, die ein Protein mit der gewünschten Sialsäure ergibt, wird ausgewählt, wobei im Kopf behalten wird, dass Zunahmen in der Osmolalität im allgemeinen zu einer Steigerung bei der Produktionsgeschwindigkeit des bestimmten Proteins führt. Um die Produktionsgeschwindigkeit zu verringern und den Sialsäuregehalt des reifen Glykoproteins zu steigern, wird die Osmolalität im allgemeinen auf einem niedrigeren Niveau für den bestimmten Zelltyp, der kultiviert wird, erhalten.
Für Säugerzellkultivierung liegt die Osmolalität des Kulturmediums im allgemeinen bei ungefähr 290 bis 330 mOsm. Zunahmen in der Osmolalität führen jedoch im allgemeinen zu einer Steigerung der Produktionsgeschwindigkeit von Proteinen. Eine Osmolalität wird so ausgewählt, dass die Produktionsgeschwindigkeit mit dem erwünschten Produktprofil korrespondiert. Um den Sialsäuregehalt zu steigern, wird die Produktionsgeschwindigkeit gesenkt und die Osmolalität wird im allgemeinen in einem niedrigeren Bereich erhalten, wobei die bestimmte Wirtszelle, die kultiviert wird, im Kopf behalten wird. Osmolalität in dem Bereich von ungefähr 250 mOsm bis ungefähr 450 mOsm ist für einen gesteigerten Sialsäuregehalt geeignet. Mehr vorzuziehen wird die Osmolalität zwischen ungefähr 300 und 450 mOsm gemäß diesem Aspekt der Erfindung und mehr vorzuziehen zwischen ungefähr 350 und 400 mOsm und am besten bei ungefähr 400 mOsm erhalten.
Für einen niedrigeren Sialsäuregehalt wird eine Osmolalität, die eine gesteigerte Produktionsgeschwindigkeit bereitstellt, ausgewählt. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird die Osmolalität zwischen ungefähr 350 und 600 mOsm erhalten und liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 450 bis 550 mOsm gemäß diesem Aspekt der Erfindung.
Der geübte Fachmann wird erkennen, dass die Medien-Osmolalität von der Konzentration von osmotisch aktiven Teilchen in der Kulturflüssigkeit abhängt und dass eine Anzahl von Variablen, die ein komplexes Säugerzell-Kulturmedium ausmachen, die Osmolalität beeinflusst. Die initiale Osmolali tät des Kulturmediums wird durch die Zusammensetzung des Kulturmediums bestimmt. Die Osmolalität kann unter Verwendung eines Osmometers, wie z.B. das, das von Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa., unter dem Markennamen OSMETTE verkauft wird (oder des Osmette-Modells 2007, erhältlich von Precision Systems, Inc. Natick MA), gemessen werden. Um eine Osmolalität in dem gewünschten Bereich zu erhalten, kann die Konzentration von verschiedenen Bestandteilen in dem Kulturmedium eingestellt werden.
Gelöste Stoffe, die zu dem Kulturmedium zugegeben werden können, um die Osmolalität zu steigern, beinhalten daher Proteine, Peptide, Aminosäuren, hydrolysierte Tierproteine wie Peptone, nicht-metabolisierte Polymere, Vitamine, Ionen, Salze, Zucker, Metabolite, organische Säuren, Lipide und dergleichen. Bei einer Ausführungsart wird die Osmolalität durch die Zugabe eines Peptons zu der Zellkultur zusammen mit anderen Bestandteilen des Kulturmediums während eines Fed-batch-Kulturverfahrens kontrolliert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Osmolalität über die Zugabe von z.B. einer Grundmediumformulierung einschließlich Aminosäuren, verschiedenen Salzen (z.B. NaCl) zusätzlich zu einem Pepton erhalten oder auf den gewünschten Bereich eingestellt. Bei einer bevorzugten Ausführungsart wird das Kulturmedium durch z.B. ein Grundkulturmedium, das einen Überschuss an Aminosäuren (siehe z.B. das "Super"-Medium von US-Patent Nr. 5,122,469), Glukose und ein Pepton enthält, ergänzt.
Es wird jedoch verstanden werden, dass die Konzentration (die Konzentrationen) der anderen Bestandteile in den Kulturmedien modifiziert werden kann (können), um einen oben angegebenen Osmolalitätsbereich zu erhalten. Zum Beispiel kann durch Kontrolle der Konzentration von Glukose (der primären Energiequelle), entweder in Abständen oder kontinuierlich, in dem Kulturmedium während der Kultivierung, die Osmolalität des Mediums bei ungefähr dem spezifizierten erwünschten Bereich erhalten werden. Die Kontrolle der Glukosekonzentration dient dazu, eine adäquate Kohlenstoffquelle für die Zellen bereitzustellen und simultan die Produktion von Laktatsäure durch die Wirtszellen zu kontrollieren. Dies ist insofern vorteilhaft, da es die pH-Abnahme in dem Kulturmedium, die die Zugabe eines Neutralisationsstoffes erforderlich macht, (z.B. einer Base wie Na₂CO₃ oder NaOH), was bewirkt, dass die Osmolalität ansteigt, limitiert.
Das Medium kann innerhalb der passenden Grenzen ergänzt werden, um die Osmolalität zu erhalten, gemäß welchem Schema auch immer, das verwendet wird, um die Zellkultur zu erhalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsart ist das Kultursystem ein Fed-batch-Kultursystem und das Medium wird in einer Charge bei einer Zugabe während der Herstellungsphase der Zellkultur ergänzt. Zusätzlich kann das Medium während der Herstellungsphase, wie unten beschrieben wird, ergänzt werden.
Alternativ kann in Abständen Offline-Probennahme des Kulturmediums durchgeführt werden. Die Osmolalität des Kulturmediums kann dann durch die Modulierung einer Nährlösung, wie erforderlich, modifiziert werden.
Es wird von dem geübten Fachmann verstanden werden, dass die Zellkulturverfahren der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden, um den erwünschten Grad an Sialylierung des hergestellten Proteins zu erreichen. Verfahrensparameter zusätzlich zu denjenigen, die hier beschrieben werden, die den Grad der Sialylierung beeinflussen, beinhalten Sauerstoffspiegel und Glukosespiegel. Kulturdichte, Zeit und Lagerungsbedingungen wie Temperatur, beeinflussen auch die Sialylierung. Die vorliegende Erfindung soll diejenigen Verfahrensparameter einschließen, die zusätzlich am besten geeignet für gesteigerte Sialylierung sind.
Im Anschluss an die Polypeptid-Herstellungsphase wird das Polypeptid von Interesse aus dem Kulturmedium unter Verwendung von Techniken, die auf dem Fachgebiet gut eingeführt sind, gewonnen.
Das Polypeptid von Interesse wird vorzugsweise aus dem Kulturmedium als ein sezerniertes Polypeptid gewonnen, obwohl es auch aus Wirtszelllysaten gewonnen werden kann.
Als ein erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um teilchenförmigen Zellabfall zu entfernen. Das Polypeptid wird danach von kontaminierenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, wobei die folgenden Verfahren beispielhaft für geeignete Reinigungsverfahren sind: durch Fraktionierung auf Immunaffinitäts- oder Ionenaustauschsäulen; Ethanol-Präzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Silikagel oder auf einem Kationenaustauschharz wie DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfat-Präzipitation; Gelfiltration unter Verwendung von z.B. Sephadex G-75 und Protein A-Sepharosesäulen, um Kontaminanten wie IgG zu entfernen. Ein Proteaseinhibitor wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) kann auch nützlich dafür sein, den proteolytischen Abbau während der Reinigung zu verhindern. Ein Fachmann wird erkennen, dass Reinigungsverfahren, die für das Polypeptid von Interesse geeignet sind, Modifikationen erforderlich machen können, um Änderungen im Charakter des Polypeptids bei der Expression in einer rekombinanten Zellkultur zu berücksichtigen.
In dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung werden Reinigungstechniken und Verfahren besonders bevorzugt, die die Kohlenhydrate der Erfin dung selektieren. Die erwünschten Glykoforme der vorliegenden Erfindung können für Sialsäure enthaltende Moleküle z.B. durch Ionenaustausch-Softgel-Chromatographie oder HPLC unter Verwendung von Kation- oder Anion-Austauschharzen, wobei die saurere Fraktion gesammelt wird, angereichert werden.
Der komplexe Kohlenhydratanteil des Glykoproteins, das durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, kann einfach durch konventionelle Techniken der Kohlenhydratanalyse analysiert werden, wenn erwünscht. So enthüllen z.B. Techniken wie Lectinblotting, gut bekannt auf dem Fachgebiet, Proportionen der terminalen Mannose oder anderer Zucker wie Galaktose. Der Abschluss von mono-, bi-, tri- oder tetra-antennären ("antennary") Oligosacchariden durch Sialsäuren kann durch Freisetzung von Zuckern aus dem Protein unter Verwendung von wasserfreiem Hydrazin oder enzymatischen Verfahren und Fraktionierung von Oligosacchariden durch Ionenaustausch- oder Größenausschlusschromatographie oder andere Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, bestätigt werden. Der pI des Glykoproteins kann auch vor und nach Behandlung mit Neuraminidase, um die Sialsäuren zu entfernen, gemessen werden. Eine Zunahme des pI nach Neuraminidasebehandlung weist auf die Gegenwart von Sialsäuren auf dem Glykoprotein hin.
Die Kohlenhydratstrukturen der vorliegenden Erfindung treten auf dem Protein als N-gekoppelte oder O-gekoppelte Kohlenhydrate exprimiert auf. Die N-gekoppelten und O-gekoppelten Kohlenhydrate unterscheiden sich in erster Linie in ihren Kernstrukturen. N-gekoppelte Glykosylierung bezieht sich auf die Anheftung des Kohlenhydratbestandteiles über GlcNAc an einen Asparaginrest in der Peptidkette. Die N-gekoppelten Kohlenhydrate enthalten alle eine gemeinsame Man1–6(Man1–3)Manβ1–4GlcNAcR1–4GlcNAcβ-R-Kernstruktur. Deshalb stellt das in der Kernstruktur beschriebene R einen Asparaginrest des hergestellten Proteins dar. Die Peptidsequenz des hergestellten Proteins wird ein Asparagin-X-Serin, Asparagin-X-Threonin und Asparagin-X-Cystein enthalten, worin X eine Aminosäure außer Prolin ist. O-gekoppelte Kohlenhydrate werden im Gegensatz dazu durch eine gemeinsame Kernstruktur charakterisiert, die GalNAc, angeheftet an die Hydroxylgruppe eines Threonins oder Serins ist. Von den N-gekoppelten und O-gekoppelten Kohlenhydraten sind die wichtigsten die komplexen N- und O-gekoppelten Kohlenhydrate. Solche komplexen Kohlenhydrate werden verschiedene antennäre Strukturen enthalten. Die äußeren Mono-, Bi-, Tri- und Tetra-Strukturen sind wichtig für die Zugabe der terminalen Sialsäuren. Solche äußeren Ket tenstrukturen bieten zusätzliche Orte für die spezifischen Zucker und Bindungen, die die Kohlenhydrate der vorliegenden Erfindung umfassen.
Die resultierenden Kohlenhydrate können durch jedes Verfahren, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, einschließlich denjenigen Methoden, die hier beschrieben werden, analysiert werden. Es sind verschiedene Verfahren auf dem Fachgebiet für Glykosylierungsanalyse bekannt und in dem Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich. Solche Verfahren stellen Information hinsichtlich der Identität und der Zusammensetzung des Oligosaccharids, das an das Peptid angeheftet ist, bereit. Verfahren für die Kohlenhydratanalyse, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten, aber sind nicht limitiert auf Lektin-Chromatographie; HPAEC-PAD, das Anionenaustauschchromatographie bei hohem pH verwendet, um Oligosaccharide, basierend auf der Ladung zu trennen; NMR; Massenspektrometrie; HPLC; GPC; qualitative Monosaccharid-Analyse; sequenzielle Enzymverdauung.
Zusätzliche Verfahren für die Freisetzung von Oligosacchariden sind bekannt. Diese Verfahren beinhalten 1) enzymatische, die im allgemeinen unter Verwendung von Peptid-N-glykosidase-F/endo-β-galaktosidase durchgeführt werden; 2) β-Eliminierung unter Verwendung einer unwirtlichen alkalischen Umgebung, um hauptsächlich O-gekoppelte Strukturen freizusetzen und 3) chemische Verfahren unter Verwendung von wasserfreiem Hydrazin, um sowohl N- wie auch O-gekoppelte Oligosaccharide freizusetzen.
Analyse kann unter Verwendung der folgenden Schritte durchgeführt werden:

1. Dialyse der Probe gegen deionisiertes Wasser, um alle Puffersalze zu entfernen, gefolgt von Lyophilisierung.
2. Freisetzung von intakten Oligosaccharidketten mit wasserfreiem Hydrazin.
3. Behandlung der intakten Oligosaccharidketten mit wasserfreiem methanolischem HCl, um einzelne Monosaccharide als O-Methylderivate freizusetzen.
4. N-Acetylierung von primären Aminogruppen.
5. Derivatbildung, um Per-O-trimethylsilylmethylglykoside zu ergeben.
6. Trennung dieser Derivate durch kapilläre GLC (Gas-Flüssig-Chromatographie) auf einer CP-SIL8-Säule.
7. Identifizierung von einzelnen Glykosidderivaten durch die Retentionszeit aus der GLC und Massenspektroskopie, verglichen mit bekannten Standards.
8. Quantifizierung von einzelnen Derivaten durch FID mit einem inneren Standard (13-O-Methyl-D-Glukose).

Neutrale und Aminozucker können durch Hochleistungs-Anionen-Austauschchromatographie in Kombination mit gepulstem amperometrischem Nachweis (HPAE-PAD-Kohlenhydratsystem, Dionex Corp.) bestimmt werden. Zum Beispiel können Zucker durch Hydrolyse in 20% (V/V) Trifluoressigsäure bei 100°C für 6 Stunden freigesetzt werden. Die Hydrolysate werden dann durch Lyophilisierung oder mit einem Speed-Vac (Savant Instruments) getrocknet. Die Reste werden dann in 1%iger Natriumacetattrihydratlösung aufgelöst und auf einer HPLC-AS6-Säule, wie durch Anumula et al. (Anal. Biochem. 195: 269–280 (1991) beschrieben, analysiert.
Die Sialsäure kann getrennt durch das direkte kalorimetrische Verfahren von Yao et al. (Anal Biochem. 179: 332–335 (1989)) in dreifachen Proben bestimmt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsart wird die Thiobarbitursäure (TBA) von Warren, L. J. Biol. Chem. 238: (8) (1959) verwendet.
Alternativ kann Immunoblot-Kohlenhydratanalyse durchgeführt werden. Gemäß diesem Verfahren werden proteingebundene Kohlenhydrate unter Verwendung eines kommerziellen Glukan-Nachweissystems (Boehringer), das auf dem oxidativen Immunoblotverfahren, das durch Haselbeck und Hosel [Haselbeck et al. Glycoconjugate J., 7: 63 (1990)] beschrieben wird, basiert, nachgewiesen. Es wird dem Färbungsprotokoll, das durch den Hersteller empfohlen wird, gefolgt, außer dass das Protein auf eine Polyvinylidendifluoridmembran anstatt auf eine Nitrocellulosemembran übertragen wird und dass die Blockierungspuffer 5%iges Rinderserumalbumin in 10 mM Tris-Puffer, pH 7,4 mit 0,9% Natriumchlorid enthielten. Der Nachweis wird durchgeführt mit anti-Digoxigenin-Antikörpern, gekoppelt mit einem alkalischen Phosphatkonjugat (Boehringer), 1:1000-Verdünnung in Tris-gepufferter Kochsalzlösung unter Verwendung der Phosphatasesubstrate 4-Nitroblau-Tetrazoliumchlorid, 0,03% (G/V) und 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-phosphat 0,03% (G/V) in 100 mM Tris-Puffer, pH 9,5, enthaltend 100 mM Natriumchlorid und 50 mM Magnesiumchlorid. Die Proteinbanden, die Kohlenhydrat enthalten, werden in ungefähr 10 bis 15 Minuten sichtbar gemacht.
Das Kohlenhydrat kann auch durch Verdauung mit Peptid-N-glykosidase F analysiert werden. Gemäß diesem Verfahren wird der Rest in 14 μl eines Puffers, der 0,18% SDS, 18 mM beta-Mercaptoethanol, 90 mM Phosphat, 3,6 mM EDTA bei pH 8,6 enthält, suspendiert und bei 100°C für 3 Minuten erhitzt. Nach der Abkühlung auf Raumtemperatur wird die Probe in zwei gleiche Teile getrennt. Ein Aliquot wird nicht weiter behandelt und dient als Kontrolle.
Die zweite Fraktion wird auf ungefähr 1% NP-40-Tensid, gefolgt von 0,2 Einheiten Peptid-N-glykosidase F (Boehringer) eingestellt. Beide Proben werden bei 37°C für 2 Stunden erwärmt und dann durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsart werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, um Tumornekrosefaktorrezeptor-(TNFR)-Immunoglobulin(Ig)-Chimären zu produzieren. Besonders bevorzugt innerhalb dieser Klasse von chimären Proteinen ist das lösliche Typ-1-TNFR IgG₁. Die hergestellten TNFR1-IgG₁-Chimären sind nützlich bei der Behandlung oder Diagnose von vielen TNF-vermittelten oder TNF-verwandten Erkrankungen und Störungen. Die Bezeichnung "Behandlung" in diesem Zusammenhang beinhaltet sowohl prophylaktische (Prävention), Suppressions- (z.B. eines Symptoms) und Behandlung eines existierenden Zustandes. Die pathologischen Zustände, die mit TNF vergesellschaftet sind, beinhalten, aber sind nicht begrenzt auf gramnegative und grampositive Bakteriämie, endotoxischen Schock, Abstoßungsphänomene, rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus, Morbus Crohn und andere autoimmune und entzündliche Erkrankungen, die mit TNF vergesellschaftet sind.
Beispiele
Die biologischen Effekte von TNF-alpha und TNF-beta werden durch spezifische Rezeptoren vermittelt (Dembic et al., (1990) Cytokines, 2: 231). Molekulares Klonen hat die Existenz von zwei verschiedenen Typen von TNF-Rezeptoren (TNFR) mit offensichtlichen Molekülmassen von 55 kD (Typ 1) (Schall et al., (1990) Cell 61: 361) und 75 kD (Typ 2) (Smith et al., (1990) Science 248: 1019) gezeigt, wovon jeder natürlich an sowohl TNF-alpha wie auch TNF-beta bindet (Loetscher et al., (1990) Cell, 61: 351; Shall et al. (1990) Cell, 61: 361; Kohno et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8331). Die extrazellulären Anteile von beiden Rezeptoren werden natürlich als lösliche TNF-Bindungsproteine gefunden (Kohno et al., siehe oben). Es wurden TNF-Agonisten geschaffen, die den schädlichen Effekt von TNF bei verschiedenen immunen und entzündlichen Ereignissen blockieren (Peppel et al., (1991) J. Exp. Med., 174: 1483–1489; Ulich (1993) Am. J. Path., 142: 1335–1338; Howard, O. M. Z., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2335–2339; Wooley, P. H., (1993) J. Immunol. 151: 6602–6607). Ein solcher Agonist (Werner et al., (1991) J. Cell. Biochem. Abstracts, 20. jährliches Treffen, Seite 115) kombiniert die extrazelluläre Domäne von menschlichem 55 kD Typ 1 TNFR mit einem Teil der Gelenk- und Fc-Regionen der menschlichen schweren Immunglobulin-G1-Kette.
Bei diesem Beispiel wurden Säugerzellen, die mit einem Vektor, der die cDNA enthielt, die die TNFR1-IgG₁-Chimäre kodiert, transfiziert wurden, kultiviert.
Verfahren
A. Zelllinie
Die chinesische Hamster Ovar (CHO)-Zelllinie, die als die Säuger-Wirtszelllinie verwendet wurde, wurde von CHO-K1 (ATCC Nr. CCL61 CHO-K1) abgeleitet. Eine mutierte, Dihydrofolatreduktase (DHFR^–) defiziente CHO-K1-Zelllinie, genannt CHO-K1 DUX-B11 (DHFR^–), (erhalten von Dr. L. Chasin der Columbia Universität; Simonsen, C. C. und Levinson, A. D., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495–2499; Urlaub G. und Chasin, L., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci USA 77: 4216–4220) wurde dann verwendet, um eine Zelllinie mit verringertem Bedarf an Insulin durch Transfektion mit dem Vektor, der die cDNA für das Präproinsulin enthält, zu erhalten (Sures et al., (1980) Science, 208: 57–59). Das als dp12.CHO bezeichnete selektierte Klon benötigt Glycin, Hypoxanthin und Thymidin zum Wachsen, wodurch ihr DHFR^–-Genotyp verifiziert wird.
B. Konstruktion einer löslichen Typ 1 TNFR-IgG₁-Chimäre
Es wurde eine lösliche Typ 1 TNFR-IgG₁-Chimäre durch Genfusion der extrazellulären Domäne von menschlichem Typ 1 TNFR mit der Gelenkregion und C_H2- und C_H3-Domänen von schwerer IgG₁-Kette konstruiert (weiter bezeichnet als TNFR1-IgG₁).
Die menschliche Typ 1 TNFR kodierende DNA-Sequenz (siehe Loetscher et al., siehe oben) wurde von dem Plasmid pRK-TNF-R [Schall et al., Cell 61, 361 (1990)] erhalten. Um dieses Startplasmid zu konstruieren, wurde ein 2,1 kb cDNA-Plazenta-Klon (Schall et al., siehe oben) in den Säuger-Expressionsvektor pRK5 inseriert, wovon die Konstruktion in EP Nr. 307,247, veröffentlicht am 15. März 1989, beschrieben wird. Diese cDNA beginnt an Nukleotidposition 64 der Sequenz, die von Loetscher et al. berichtet wird, mit dem Start-Methionin 118 bp stromabwärts.
Die Quelle der IgG₁ kodierenden Sequenz war das CD4-IgG-Expressionsplasmid pRKCD⁴ ₂F_c1 [Capon, D. J. et al., Nature 337, 525 (1989); Byrn et al., Nature 344, 667 (1990)], das eine cDNA-Sequenz enthält, die ein Hybrid-Polypeptid kodiert, bestehend aus den Resten 1 bis 180 des reifen menschlichen CD4-Proteins (zwei N-terminale CD4-variable Domänen), fusioniert an menschliche IgG₁-Sequenzen, beginnend bei Asparaginsäure 216 (die Aminosäure 114 als den ersten Rest der konstanten schweren Kettenregion nehmend [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 4.
Ausgabe (1987)], die der erste Rest des IgG₁-Gelenkes nach dem Cysteinrest ist, der in die Bindung zwischen schwerer und leichter Kette involviert ist) und endend mit Rest 441, um die C_H2- und C_H3-Fc-Domänen von IgG₁ mit einzuschließen.
TNFR1-IgG₁ wurde durch Erzeugung von Restriktionsfragmenten der Plasmide pRK-TNF-R und pRKCD4₂F_c1 und Legierung von ihnen unter Verwendung von Deletionsmutagenese konstruiert, so dass Threoninrest 171 von reifen TNFRs dem Asparaginsäurerest 216 der IgG₁ schweren Kette [Kabat et al., siehe oben] gegenübersteht. Das resultierende Plasmid pRKTNFR-IgG enthielt die Kodierungssequenz für TNFR1-IgG₁ in voller Länge.
C. Zellkultur
Das Gen, das das lösliche Typ 1 TNFR-IgG₁ kodiert, wurde in dp12.CHO-Zellen durch Transfektion eingeführt. Dies wurde unter Verwendung der Calciumphosphattechnik für die Einführung von DNA in Säugerzellen erreicht. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen trypsiniert und in selektives Medium (Glycin-Hypoxanthin- und Thymidin-freies Ham's F-12 DMEM, 1,1 V/V mit 2% dialysiertem Serum) replattiert. Darauffolgende Isolate wurden auf die Sekretion von TNFR1-IgG₁ gescreent. Klone, die TNFR1-IgG₁ exprimierten, wurden in Methotrexat amplifiziert, was hoch exprimierende Klone ergab, und darauffolgend an serumfreies Medium adaptiert. Diese Zellen befanden sich unter einem kontinuierlichen selektiven Druck, bis sie auf nicht-selektives Medium für Wachstum und Expansion des Impfmaterials übertragen wurden.
Um Zellen für die TNFR1-IgG₁-Produktionskulturen bereitzustellen, wurde die oben beschriebene Zellpopulation aus dem Medium, das Methotrexat enthielt, durch serielle Unterkultivierungen in Gefäßen mit ansteigendem Volumen auf Wachstumsmedium, das kein Methotrexat enthielt, expandiert. Für diese Schritte des Verfahrens war das nicht-selektive Wachstumsmedium eine auf DMEM/HAM F-12 basierende Formulierung (siehe z.B. US-Patent 5,122,469) mit modifizierten Konzentrationen von einigen Bestandteilen wie Glukose, Aminosäuren, Salzen, Zucker, Vitaminen, Glycin, Hypoxanthin und Thymidin; rekombinantem menschlichem Insulin, hydrolysiertem Pepton (Primatone HS oder Primatone RL), einem zellschützenden Wirkstoff wie Pluronic F68 (Pluronic-Polyol) oder das Äquivalent; Gentamycin; Lipid und Spurenelementen.
Die Kulturen wurden bei pH 7,2 ± 0,4 durch die Verwendung von CO₂-Gas (Säure) und/oder Na₂CO₃ (Base) kontrolliert. Die Temperatur wurde nahe 37°C während der Wachstumsperiode kontrolliert. Gelöster Sauerstoff wurde über 5% Luftsättigung durch direktes Hindurchperlen von Luft und/oder Sauerstoffgas erhalten.
Die Osmolalität während der Impfgut-Expansionsphase wurde zwischen ungefähr 250 mOsm und 350 mOsm erhalten.
Die Wachstumsphase für jede Kultur wurde von einer zweiten Phase oder Übergangsphase gefolgt, worin die Kulturparameter von optimalen Wachstumsauf Produktionsbedingungen geändert wurden. Während dieser Übergangsphase wurde die Temperatur des Kultursystems erniedrigt, im allgemeinen auf ungefähr zwischen 30° und 35°C. Es wurde Butyrat zugegeben und ein bestimmter Osmolalitätsbereich wurde eingestellt. Während dieser Herstellungsphase akkumuliertes Produkt wurde auf Sialsäuregehalt analysiert.
Bei einem typischen Produktionsplan wurden ungefähr 1,2 × 10⁶ Zellen, stammend von der Impfmaterial-Expansion aus dem selektiven Stadium, in einer Wachstumsphase mit einer Start-Osmolalität von 300 mOsm gezüchtet. Das Wachstumsmedium wurde mit Spurenelementen, rekombinantem menschlichem Insulin und hydrolysiertem Pepton ergänzt. Die Zellen wurden unter dieser Bedingung für 2 Tage gezüchtet. Zu Beginn des dritten Tages wurde die Temperatur der Zellkultur gesenkt. Simultan zu oder nach der Temperaturänderung wurde Natriumbutyrat zu der Zellkultur zugegeben und die gewünschte Produktions-Osmolalität wurde durch Zugabe von verschiedenen Medienbestandteilen eingestellt. Die Zellen wurden unter diesen Bedingungen mit Fütterung für 9 bis 10 Tage gezüchtet. Die Zellen wurden wenn nötig mit verschiedenen Medienbestandteilen gefüttert.
Tabelle I beschreibt die Produktionsbedingungen für verschiedene Produktionsverfahren.
Tabelle I
D. Gewinnung des TNFR-IgG
Die TNFR1-IgG₁-Chimäre wurde auf mehr als 95%ige Homogenität durch Affinitätschromatographie auf immobilisierten Staphylococcus aureus Protein A gereinigt, wie durch Capon et al., siehe oben, beschrieben.
E. Kohlenhydratanalyse
Der Sialsäuregehalt wurde durch das Verfahren von Warren, L. (1959) J. Biol. Chem. 234: 1971–1975 analysiert.
Ergebnisse
Die zellspezifische Produktivität für jede der Produktionskulturen, beschrieben in Tabelle I, wurden gegen den Sialsäuregehalt des geernteten Produkts aufgetragen. Die Ergebnisse werden in 1 dargestellt. Der höchste Sialsäuregehalt wurde beobachtet, wenn die Verfahrensparameter bei einer Produktions-Osmolalität zwischen ungefähr 360 und 420 mOsm und einer Butyrat-Konzentration von ungefähr 1 mM aufrechterhalten wurden. Der Sialsäuregehalt konnte über einen breiten Bereich von Werten durch Einstellung der Verfahrensparameter kontrolliert werden.
Beispiel II
Es wurden die pharmakokinetischen Plasma-Halbwertszeiten und/oder Clearancegeschwindigkeiten von verschiedenen Präparaten bestimmt. Die Präparate, die einen höheren Sialsäuregehalt enthielten, zeigten im allgemeinen eine verlängerte Plasma-Halbwertszeit und/oder niedrigere gesamte Clearancegeschwindigkeiten im Vergleich zu Präparaten, die einen verringerten Sialsäuregehalt enthielten.
Verfahren
Siebzehn männliche Sprague-Dawley-Ratten, die 272 bis 315 g wogen, wurden zufällig zu einer der drei TNFR1-IgG₁-Fusionsprotein-Behandlungsgruppen zugeordnet (N = 5 oder 6 pro Gruppe). Den Tieren wurde eine nominale Dosis von 5 mg/kg Testmaterial über eine Femoralvenenkanüle intravenös injiziert. Die ausgewählten Testmaterialien beinhalteten zwei TNFR1-IgG₁-Präparate aus einem Verfahren, bei dem die Butyratkonzentration während der Herstellungsphase 6 mM betrug und die Osmolalität während der Herstellungsphase bei ungefähr 400 mOsm erhalten wurde, Verfahren I, und ein drittes TNFR1-IgG₁-Präparat aus einem Verfahren, bei dem die Butyratkonzentration 12 mM betrug und die Osmolalität während der Herstellungsphase bei ungefähr 500 mOsm lag. Verfahren II. Es wurden 2 ml Blutproben in EDTA (8,5%) vor Verabreichung der Dosis und bei 5 Minuten und 2, 6, 10, 24, 34, 48, 56, 72, 96 und 120 Stunden nach Verabreichung der Dosis abgenommen. Die Blutproben wurden zentrifugiert, das Plasma geerntet und die Proben auf Konzentrationen von TNFR1-IgG₁-Fusionsprotein analysiert.
Es wurde ein enzymgekoppeltes immunologisches und biologisches Bindungsassay (ELIBA) verwendet, um TNFR1-IgG₁ im Rattenplasma zu quantifizieren. Dieses Assay basiert auf der Fähigkeit von TNF-alpha, gekoppelt an Meerrettichperoxidase (TNF-alpha-HRP), an den Rezeptoranteil des TNFR1-IgG₁-Fusionsproteins zu binden. Bei diesem Assay wurden Fab-Fragmente von anti-menschlichem Ziegen-IgGFc, beschichtet auf Vertiefungen von Mikrotiterplatten, verwendet, um TNFR1-IgG₁ durch Wechselwirkung mit dem Fc-Anteil des Moleküls einzufangen. Es wurde TNF-alpha-HRP zu den Vertiefungen zugegeben und man ließ es an den Rezeptoranteil des gefangenen TNFR1-IgG₁ binden. Die Quantifizierung wurde durch Messung einer Färbung, die durch die Reaktion von Peroxidase mit Peroxid und einem ortho-Phenylendiamin(OPD)-Substrat hervorgerufen wurde, bestimmt. Der Bereich des Assays liegt bei 0,003 bis 0,02 mg/ml. Es wurde gezeigt, dass die Gegenwart von EDTA in den Plasmaproben keine Wirkung auf die Leistung des Assays hatte.
Die Dosis wurde normalisiert, um Unterschieden bei der Konzentration der Dosierungslösung Rechnung zu tragen. Alle Berechnungen basierten auf der Konzentration gegen Zeitdaten bis zum 120-Stunden-Zeitpunkt. Der verkürzte Bereich unter der Kurve (AUC_0–120) wurde unter Verwendung der Trapezoidregel berechnet und die gewichtsnormalisierte verkürzte Clearance (CL_0–120/Gewicht) wurde als Dosis/AUC_0–120 berechnet.
Ergebnisse
Die Clearancegeschwindigkeiten variierten in Abhängigkeit von der Verfahrensversion, die verwendet wurde (Verfahren I im Vergleich zu Verfahren II) und der Menge der Sialsäure, die in dem Produkt vorlag. Die Clearancegeschwindigkeiten für einzelne Tiere und die resultierenden mittleren und Standardabweichungen von dieser Studie werden in Tabelle II unten dargestellt. Verfahren I weist eine langsamere und günstigere Clearancegeschwindigkeit auf.
Tabelle II Clearance 0 bis 120 (ml/h/kg)
Beispiel III
Monosaccharid-Zusammensetzung von TNFR1-IgG₁
Bestimmung der Oligosaccharid-Kohlenhydrat-Zusammensetzung und Struktur von TNFR1-IgG₁, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, zeigte, dass der Sialsäuregehalt der verschiedenen Verfahrensversionen variierte. Schnelle Plasmaclearance war mit stark exponiertem GlcNAc, geringerer Sialsäure auf den Oligosaccharidketten und (daraus abgeleitet) Zugängigkeit des Proteins zu Mannose- oder Galaktoserezeptoren vergesellschaftet. Eine langsame Plasmaclearance war mit mehr terminalen Sialsäureresten vergesellschaftet.
A. Quellen für Testmaterial
TNFR1-IgG₁ wurde gemäß den umrissenen Verfahren hergestellt, wie in Beispiel 1 oben beschrieben. Das Material für Verfahren I erhielt man aus einer Zellkultur unter Verwendung von 6 mM Butyrat und eine Osmolalität von ungefähr 400 mOsm während der Herstellungsphase. Verfahrensmaterial II erhielt man aus einer Zellkultur unter Verwendung von 12 mM Butyrat und einer Osmolalität von ungefähr 500 mOsm während der Herstellungsphase.
B. Verfahren
Die Freisetzung von intakten neutralen und Aminozuckern wurde durch Anionenaustausch-Chromatographie bei hohem pH in Kombination mit gepulster amperometrischer Detektion bestimmt. Die Analyse wurde unter Verwendung der folgenden Schritte durchgeführt:

1. Pufferaustausch wurde mit TNFR1-IgG₁ (ungefähr 50 μg/ml) und den geeigneten Referenzproben durchgeführt, so dass die endgültige Probe in 1%iger Essigsäure enthalten war.
2. Es wurden ungefähr 90 μg TNFR1-IgG₁ wie auch Proben des Referenzmaterials in Trockeneis und Alkoholbad gefroren und die gefrorene Probe über Nacht lyophilisiert.
3. Die gefriergetrockneten Proben wurden in 500 μl Trifluoressigsäure wieder aufgelöst und bei 120°C für 1 Stunde inkubiert.
4. Nach Säurehydrolyse wurden das TNFR1-IgG₁ und die Referenzproben gekühlt und bis zur Trockene verdampft.
5. Die Proben wurden mit Wasser auf eine endgültige Konzentration von ungefähr 0,6 mg/ml wieder hergestellt.
6. Die Trennung der Monosaccharide wurde bei Umgebungstemperatur durch Anionenaustausch-Chromatographie bei hohem pH mit gepulster amperometrischer Detektion unter Verwendung einer Dionex CarboPac PA1 (4 × 250 mm)-Säule (Dionex Corp., Sunnyvale, CA) durchgeführt.
7. Die Quantifizierung der einzelnen Monosaccharide wurde durch Vergleich mit Referenzmonosacchariden durchgeführt.

C. Ergebnisse
Der relative molare Gehalt von jedem Monosaccharid in den zwei Präparaten wird in Tabelle III unten gezeigt.
Tabelle III Relativer molarer Gehalt von Monosacchariden in zwei TNFR1-IgG₁-Präparaten
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die für die Herstellungsphase des Glykoproteins ausgewählten Verfahrensparameter die Kohlenhydratzusammensetzung des reifen Glykoproteins beeinflussen. Präparate mit einem höheren Sialsäuregehalt weisen im allgemeinen eine verlängerte Serumhalbwertszeit auf.
Die unten dargestellten Tabellen IV und V zeigen die Kohlenhydratzusammensetzung der Oligosaccharidseitenketten der TNFR1-IgG₁-Chimärpräparate, die unter den Bedingungen des Verfahren I- und Verfahren II-Typs hergestellt wurden. Tabelle V stellt Daten für Kohlenhydrate an dem Rezeptoranteil des chimären Moleküls abzüglich der F_c-Glykosylierungsstelle dar.
Tabelle IV
Tabelle V
Die Ergebnisse, die in Tabelle IV und V dargestellt werden, zeigen, dass die Zusammensetzung des TNFR1-IgG₁ typisch für Sialsäure-terminierte mono- bi- und tri-antennäre komplexe Oligosaccharide ist. Es kann daraus geschlossen werden, dass das TNFR1-IgG₁, das durch Verfahren I hergestellt wird, einen signifikant höheren Anteil von Sialsäure und einen signifikant geringeren Anteil von exponiertem GlcNAc enthält. Sialsäure pro Mol Protein zeigt an, dass dieses Material einen niedrigeren isoelektrischen Punkt aufweisen würde als das Material, das durch Verfahren II hergestellt wird. Durch Vergleich mit den Ergebnissen in Tabelle II zeigen diese Ergebnisse auch an, dass die langsamere Plasmaclearance des Verfahren I-Materials mit geringerem exponiertem GlcNAc und im allgemeinen mit einem höheren Sialsäuregehalt korreliert.
Tabelle IV und V zeigen TNFR1-IgG₁-Präparate, die ein komplexes Oligosaccharid umfassen, die durch einen oder mehrere Reste einer Sialsäure terminiert werden. Die bevorzugten TNFR1-IgG₁-Präparate umfassen TNFR1-IgG₁-Moleküle mit ungefähr 1 bis 2 mol exponierten N-Acetylglukosaminresten pro Mol Protein. Das molare Verhältnis von Sialsäure zu Protein liegt bei ungefähr 4 bis 7. Die TNFR1-IgG₁-Präparate weisen ein molares Verhältnis von Sialsäure zu N-Acetylglukosamin von ungefähr 0,4 bis ungefähr 0,45 auf.
Beispiel IV
Der pI des stark sialylierten Präparates ist niedriger als der pI des wenig sialylierten Präparates.
Verfahren
Es wurde isoelektrische Fokussierung für die verschiedenen Präparate, die in Beispiel II beschrieben werden, durchgeführt. Die isoelektrischen Fokussierungsgele trennen die Glykoproteine des Präparates gemäß ihrer isoelektrischen Punkte, pI, unter Verwendung eines pH-Gradienten, der mit Ampholyten verschiedenen pHs geschaffen wird. Bei dieser Studie wurde die Analyse der Präparate unter Verwendung eines pH-Gradienten von 10 bis 4 durchgeführt.
Ergebnisse
Die TNFR1-IgG₁-Präparate zeigen einen isoelektrischen Punktbereich von ungefähr 5,5 bis ungefähr 7,5, wie durch Chromatofokussierung bestimmt wurde, bei der der pI gegenüber Neuraminidasebehandlung sensibel ist.
Die oben zitierten Quellenangaben sind hier alle durch Verweis eingeschlossen, egal ob sie ausdrücklich eingeschlossen sind oder nicht.

Claims

Verfahren zur Kontrolle der Menge an Sialsäure, die an einer Oligosaccharidseitenkette eines Säureglykoproteins vorliegt, welches durch Kultivierung in einer Säugerwirtszelle hergestellt wird, umfassend: Kultivieren der Säugerwirtszelle in einer Herstellungsphase der Kultur, gekennzeichnet durch: i) Zugeben von Natriumbutyrat zu der Zellkultur bei einer Konzentration von 0,1 mM bis 20 mM; und ii) Aufrechterhalten der Osmolalität der Zellkultur bei 250 bis 600 mOsm; und iii) Aufrechterhalten der Temperatur der Kultur bei einer Temperatur zwischen 30°C und 35°C.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge an Sialsäure, die an der Oligosaccharidseitenkette des Glykoproteins vorliegt, erhöht wird und wobei: die zellspezifische Produktivität der Zellkultur durch Kultivieren der Wirtszelle bei einer Konzentration des Butyrats von 1 mM bis 6 mM und Aufrechterhalten der Osmolalität bei 300 bis 450 mOsm verringert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Wirtszelle eine CHO-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Glykoprotein eine Tumornekrosefaktorrezeptor-Immunoglobulinchimäre ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Wirtszelle eine Zelle ist, transfiziert mit einem Vektor, der die cDNA trägt, welche eine lösliche Typ-1-Tumornekrosefaktorrezeptor-Immunglobulin TNFR1-IgG₁-Chimäre kodiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge an Sialsäure, die an der Oligosaccharidseitenkette des Glykoproteins vorliegt, verringert wird und wobei: die zellspezifische Produktivität der Zellkultur durch Kultivieren der Wirtszelle bei einer Konzentration des Butyrats von 6 mM bis 12 mM und Aufrechterhalten der Osmolalität bei 450 bis 600 mOsm erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Wirtszelle eine CHO-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Glykoprotein eine Tumornekrosefaktorrezeptor-Immunoglobulinchimäre ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Wirtszelle eine Zelle ist, transfiziert mit einem Vektor, der die cDNA für eine lösliche Typ-1-Tumornekrosefaktorrezeptor-Immunglobulin TNFR1-IgG₁-Chimäre trägt.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung eines humanen, löslichen Typ-1-Tumornekrosefaktorrezeptor-Immunglobulin TNFR1-IgG₁-Chimärenproteins, umfassend: das Kultivieren der Wirtszelle in einer Herstellungsphase: (i) in der Gegenwart von Natriumbutyrat bei einer Konzentration von 6 mM bis 12 mM; (ii) während des Aufrechterhaltens der Osmolalität bei 450 bis 600 mOsm.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung eines humanen, löslichen Typ-1-Tumornekrosefaktorrezeptor-Immunoglobulin TNFR1-IgG₁-Chimärenproteins, umfassend: das Kultivieren der Wirtszelle in einer Herstellungsphase: (i) in der Gegenwart von Natriumbutyrat bei einer Konzentration von 0,1 mM bis 6 mM; (ii) während des Aufrechterhaltens der Osmolalität bei 300 bis 450 mOsm.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle eine CHO-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Wirtszelle eine dhfr-CHO-Zelle ist.