KR100475417B1

KR100475417B1 - 시알산 함량이 높은 재조합 당단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR100475417B1
Application number: KR10-1998-0061586A
Authority: KR
Inventors: 백영준; 우구; 유광현; 강기신; 유대근; 박병훈; 정성목
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 1998-12-30
Filing date: 1998-12-30
Publication date: 2005-07-18
Also published as: KR20000045064A

Abstract

본 발명은 목적하는 시알산 함유 당단백질에 대한 시알리다아제의 작용을 경쟁적으로 저해하는 또다른 시알산 함유 당단백질을 함유하는 배지에서, 목적하는 시알산 함유 당단백질의 유전자로 형질전환된 포유동물세포를 배양하는 것을 특징으로 하여, 시알산 함량이 높은 재조합 당단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 높은 시알산 함량을 가짐으로써 생체내 활성이 높은 당단백질을 지속적이고도 경제적으로 제조할 수 있다.

Description

시알산 함량이 높은 재조합 당단백질의 제조방법

본 발명은 시알산(sialic acid) 함량이 높은 재조합 당단백질(recombinant glycoprotein)을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 목적하는 시알산 함유 당단백질의 유전자로 형질전환된(transformed) 포유동물세포를 배양할 때, 목적하는 시알산 함유 당단백질에 대한 포유동물 유래 시알리다아제(sialidase)의 작용을 경쟁적으로 저해하는(competitively inhibiting) 또다른 시알산 함유 당단백질을 배지에 첨가함으로써, 목적하는 당단백질로부터 시알산의 탈락을 감소시켜, 시알산 함량이 높은 재조합 당단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

시알산은 N-노이라민산(neuraminic acid)의 아민 유도체의 총칭으로서, 뮤코다당, 당단백질, 당지질, 인유의 올리고당 등의 구성성분으로 생물계에 광범위하게 분포하고 있다. 시알리다아제는 포유동물세포내에 존재하여 올리고당-시알산 결합부위를 인지하고 시알산을 탈락시키는 역할을 한다(문헌[Michael J. Gramer et al., Biotechnology Vol 13, 1995, 692-698]). 특정의 시알산 함유 당단백질을 유전공학적 방법으로 제조하고자 하는 경우, 그 당단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환시킨 포유동물세포를 배양하여 배양액으로부터 당단백질을 분리, 정제하게 되는데, 이때 포유동물세포의 세포막이 파괴되면서 시알리다아제가 배양액내로 용출되고, 용출된 시알리다아제는 배양액내 당단백질의 올리고당-시알산 결합부위를 인지하여 당단백질로부터 시알산을 탈락시킨다. 이것은 목적하는 시알산 함유 당단백질에서 시알산이 생체내 활성을 유지하는데 필수적인 경우에는 심각한 문제로 대두될 수 있다.

그 예로써, 에리스로포이에틴(erythropoietin)은 적혈구 계열 전구세포의 성장 및 분화를 촉진시켜 성숙한 적혈구의 생성을 도와주는 역할을 하여, 신장기능 장해로 인한 빈혈, 골수이식성 빈혈, 류마티스성 빈혈, 암 또는 항암제 관련 빈혈, AIDS성 빈혈 등의 치료에 광범위하게 이용되고 있는 생체내 조절인자이다. 에리스로포이에틴은 다당류 외곽이 시알산과 결합되어 있는 당단백질인데, 인 비트로에서는 시알산의 존재유무가 활성에 영향을 미치지 아니하나 인 비보에서는 시알산이 활성에 필수적이다. 그 이유는 시알산이 탈락하면 갈락토스 잔기가 노출되고 이것은 간세포의 갈락토스 수용체에 의해 인식되어 간세포에 포획되어 대사되기 때문이다. 따라서, 등전점 분획법(IEF; isoelectric focusing) 수행시 완전한 활성을 갖는 에리스로포이에틴은 pI값 4 이하에 위치하게 되는데, 이것은 시알산의 낮은 pKa값(pKa=2.6)에 기인하는 것이다(문헌[Lukowsky et al., Can. J. Biochem., 50, 1972, 909-917]). 에리스로포이에틴을 배양액으로부터 분리, 정제하는 방법에는 여러 가지 방법이 공지되어 있는데, 대표적인 예로는 미국특허 제 4,667,016 호(출원인; Por-Hsiung Lai 등, 출원일; 1985. 6. 20, 특허권자; Kirin-Amgen사)의, 배양상등액을 농축 및 투석, 여과한 후 이온 교환 크로마토그래피→역상 크로마토그래피→이온 교환 크로마토그래피→겔여과를 연속적으로 수행하는 방법을 들 수 있다. 그러나 에리스로포이에틴을 분리, 정제하는 단계에서는 시알산의 탈락 여부와 무관하게 포유동물세포에 의해 생산된 에리스로포이에틴을 배양액으로부터 분리, 정제해내게 되므로, 시알산이 탈락되어 생체내 활성을 이미 상실해버린 에리스로포이에틴도 포함되어 있으며, 시알산의 탈락이 많을수록 실질적인 생산성은 저하될 수 밖에 없다. 따라서 실질적인 생산성을 제고하기 위해서는, 배양단계에서 시알산의 탈락을 감소시킬 수 있는 방법을 강구하는 것이 필요하다. 이러한 목적을 위하여, 시알리다아제에 대해 시알산 함유 당단백질 보다 더 높은 친화성을 갖는 시알리다아제의 활성저해제, 예를 들어, 2,3-디하이드로-2-데옥시-N-노이라민산 (2,3-dehydro-2-deoxy-N-acetylneuramic acid)(문헌[Michael J. Gramer et al., Boitechnol. Prog., 1993, 365-373]) 또는 5-아세트아미도-2,6-언하이드로-3,5-디데옥시-5-글리세로-D-갈락토논-2-에논산(5-acetamido-2,6-anhydro-3,5-dideoxy-5-glycero-D-galactonon-2-enoic acid)(문헌[Thomas G. Warner et al., Glycobiology, vol 3, No. 5, 1993, 455-463])을 배지내에 첨가하여 배양함으로써 배양액내 시알리다아제의 활성을 저하시켜 시알리다아제로부터 당단백질을 보호하는 방법이 공지되어 있다. 그러나 상기 방법으로 시알리다아제의 활성을 저해하는 효과는 기대할 수 있으나, 활성저해제의 단위당 비용이 높다는 문제점이 있다. 포유동물세포를 장기배양하면 세포 노화에 따라 세포로부터 용출되어 나오는 시알리다아제의 양이 증가하여 활성저해제의 첨가량 또한 증가시켜야 하므로, 활성저해제 첨가에 소요되는 비용은 배양기간이 길어질수록 대폭 증가하게 된다. 그러므로 상기의 활성저해제를 첨가하는 방법은 포유동물세포의 배양에 의한 당단백질의 대량생산에 적용하기에는 부적합한 방법이다. 따라서, 포유동물세포의 배양을 통하여 유전공학적으로 시알산 함유 당단백질을 생산하는데 있어서, 시알리다아제로부터 시알산 함유 당단백질을 보호할 수 있는 새로운 배양방법의 개발이 절실하게 요구되는 실정이다.

본 발명의 목적은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 목적하는 시알산 함유 당단백질의 유전자로 형질전환된 포유동물세포를, 목적하는 시알산 함유 당단백질에 대한 시알리다아제의 작용을 경쟁적으로 저해하는 또다른 시알산 함유 당단백질이 첨가된 배지에서 배양함으로써, 목적하는 당단백질로부터 시알산의 탈락을 감소시켜, 시알산 함량이 높은 당단백질을 지속적이고도 경제적으로 제조할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 목적하는 시알산 함유 당단백질(제 1 당단백질)에 대한 시알리다아제의 작용을 경쟁적으로 저해하는 또다른 시알산 함유 당단백질(제 2 당단백질)을 첨가한 배지에서, 목적하는 시알산 함유 당단백질(제 1 당단백질)의 유전자로 형질전환된 포유동물세포를 배양하는 것을 특징으로 하여, 시알산 함량이 높은 재조합 당단백질(제 1 당단백질)을 제조하는 방법을 제공한다. 목적하는 시알산 함유 당단백질(제 1 당단백질)은 에리스로포이에틴일 수 있으며, 포유동물세포는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포일 수 있다. 또다른 시알산화 당단백질(제 2 당단백질)은 -글로불린(-globulin)인 것이 바람직하며, 50∼60℃에서 30분 동안 열처리되거나 단백질분해효소, 특히 0.2% 트립신으로 30∼90분 동안 전처리된 -글로불린인 것이 더욱 바람직하다. 한편 또다른 시알산화 당단백질(제 2 당단백질)은 배지에 1g/ℓ로 첨가되는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 시알산 함유 당단백질(예를 들면, 에리스로포이에틴)을 시알리다아제로부터 보호하기 위하여 상업적으로 입수가능한 또다른 시알산 함유 당단백질, 예를 들면, -글로불린(문헌[Swatowski A. et al., Wiad Lek, 47(2), 40-3, 1994])을 배지에 첨가하여 목적하는 당단백질과 상호 경쟁적으로 시알리다아제의 공격을 받게 하여 결과적으로 시알리다아제가 목적하는 당단백질에 작용하여 시알산을 탈락시키는 것을 상대적으로 감소시키는 방법이다. 목적하는 시알산 함유 당단백질과 상호 경쟁적으로 시알리다아제의 공격을 받는 당단백질은 (ⅰ) 시알산을 다량으로 함유하여야 하며, (ⅱ) 포유동물세포의 생존에 영향을 미치지 않아야 하며, (ⅲ) 구입이 용이하고, (ⅳ) 상업적으로 입수가능하여야 한다. 본 발명에서는 상기 조건을 모두 충족시키는 물질로 -글로불린을 선정하고, 목적하는 시알산 함유 당단백질 유전자로 형질전환된 포유동물세포를 배양할 때, -글로불린, 특히 열, 또는 트립신과 같은 단백질분해효소에 의한 전처리 과정을 거친 -글로불린을 배지에 첨가하여 배양함으로써, 목적하는 당단백질의 시알산을 시알리다아제의 공격으로부터 보호하여 시알산 함량이 높은 당단백질을 수득한다.

이하, 대표적 예로써, -글로불린을 첨가한 배지에서 에리스로포이에틴 유전자로 형질전환시킨 CHO 세포를 배양시켜 에리스로포이에틴을 수득하는 방법에 대해 기술한다. 유전공학적 방법에 의해 에리스로포이에틴의 유전자를 삽입한 CHO 세포를 롤러병(roller bottle) 배양장치에서 배양하면, 배양기간이 경과함에 따라 배양내로 분비된 에리스로포이에틴으로부터 시알산이 탈락되어 시알산 함량은 감소되게 된다. 이것은 에리스로포이에틴이 분비된 세포배양액을 배양일자별로 수획하여 면역크로마토그래피로 정제한 후, pH 3∼10의 IEF 겔(Novex)상에서 통상의 방법으로 전기영동한 후, pI를 분석하여 확인한 결과, 배양개시일로부터 7∼17일이 경과한 때에는 높은 생리활성을 유지하는 pI 3.5∼4.0의 에리스로포이에틴이 다량 존재하지만, 배양개시일로부터 18일이 경과한 후로부터 지속적으로 감소하는 현상으로부터 뒷받침된다(도 1). 이를 방지하기 위하여, 전처리되지 않은 -글로불린, 열 또는 단백질분해효소로 전처리된 -글로불린을 농도차이를 두어 배양배지에 첨가하여 CHO 세포를 배양시킨다. 수획된 배양액을 면역크로마토그래피로 정제하여, IEF 겔상의 pI를 확인하고, 배양일자별로 pI를 겔분석기(Viber Lourmat, Bio-1D program)로 분석하며, 단위배양액당 에리스로포이에틴의 역가를 EIA(Enzyme Immunoassay)로 측정한다. 그 결과, 전처리하지 않은 -글로불린을 첨가한 배지에서는 -글로불린 첨가로부터 7일 이후부터 에리스로포이에틴의 활성에 영향을 주어 본 발명에 따른 목적 당단백질에 대한 시알리다아제의 활성을 경쟁적으로 저해하고자 하는 당단백질로서 다소 적합성이 떨어지는 면이 있으나, 50∼60℃에서 30분 동안 열처리된 -글로불린을 1g/ℓ로 배지에 첨가하여 배양하거나, 단백질분해효소, 특히 0.2% 트립신으로 30∼90분 동안 전처리된 -글로불린을 1g/ℓ로 배지에 첨가하여 배양한 경우, 배양기간이 경과함에 따라, 시알리다아제로부터 에리스로포에틴의 시알산이 보호되어 IEF 겔상에서 활성이 높은 pI 3.5∼4.0의 에리스로포이에틴이 배양초기와 유사한 비율로 존재하고 에리스로포이에틴의 역가도 높게 유지되는 것을 확인할 수 있다(도 2, 3 및 4).

[실시예]

이하, 본 발명의 구성 및 효과를 바람직한 실시예에 의거 보다 상세하게 설명하나, 이것은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1] 열-전처리된 -글로불린을 첨가한 세포배양방법

우(牛)혈장 유래 -글로불린(EEC No. 232-706-1, Sigma)을 10g/ℓ의 농도가 되도록 우태아혈청이 결핍된 pH 7.2의 DMEM 배지에 가하여 용해시킨 후, 제균여과 하고 제균여과된 -글로불린을 수욕조에서 56℃ 및 60℃로 30분 동안 교반하며 불활화시켰다.

에리스로포이에틴을 생산하는 CHO 세포의 종균을 10% 우태아혈청 DMEM을 사용하여 F75 세포배양 플라스크에서 복원하여, 37℃, 5% CO₂, 95% 습도를 유지하는 배양기에서 3일간 배양하였다. 배양 플라스크에서 CHO 세포가 단일막을 형성하면, 0.25% 트립신을 이용하는 통상의 세포 배양방법으로 F180 플라스크로 계대배양하였다. 상기 방법으로 CHO 세포를 증식시켜 각 롤러병당 2×10⁷개의 세포를 가하고, 롤러병 배양장치에서 37℃로 배양하였다. 배양개시일로부터 2일, 4일, 6일째에 새로운 배지로 배양액을 교환하였다.

배양개시로부터 7일째에 10% 우태아혈청 함유 DMEM 배지에 열-전처리된 -글로불린과 10% 우태아혈청을 최종농도가 1.0g/ℓ가 되게 첨가한 배지로 교환하였다. 배양 8일째부터 매 24시간마다 열-전처리된 -글로불린이 첨가된 배지로 교환해주고, 에리스로포이에틴이 분비된 배양액은 매 24시간 마다 수획하여 1.0N NaOH로 pH를 8.0으로 조정하였다.

에리스로포이에틴의 정제는 면역크로마토그래피를 사용하여 수행하였다. pH 8.0으로 조정한 에리스로포이에틴이 분비된, 상기로부터 수득한 배양액을 사전에 pH 8.0의 100mM 트리스/0.02% 트윈 20으로 평형시킨 항-에리스로포이에틴 모노클로날 항체가 결합된 수지(CNBr-activated Sepharose, Pharmacia)에 부착시키고 pH 7.0의 10mM 인산나트륨/1M 염화나트륨/0.02% 트윈 20으로 세척한 후, pH 2.0의 0.1M 시트릭산으로 당단백질을 용출시켰다. 적량의 1M 트리스를 가해 pH를 8.0으로 조정하였다.

[실시예 2] 단백질분해효소-전처리된 -글로불린을 첨가한 세포배양방법

우혈장 유래 -글로불린(EEC No. 232-706-1, Sigma)을 20g/ℓ의 농도가 되게 우태아혈청이 결핍된 pH 7.2의 DMEM 배지에 가하여 용해시킨 후, 제균여과하고 세포배양용으로 검증된, 마이코플라스마(Mycoplasma)와 같은 미생물에 의해 오염되지 않도록 무균처리된 트립신을 최종농도 0.2%가 되게 가하고, 조제된 -글로불린/0.2% 트립신 용액을 수욕조에서 37℃로 30분, 60분 및 90분 동안 교반하며 반응시키고, 각 반응시간 경과후 우태아혈청을 10% 되도록 첨가하여 37℃에서 10분 동안 교반하고, 60℃에서 30분 동안 트립신 활성을 불활화시켰다.

그 다음부터는, 상기 실시예 1에서, 열-전처리된 -글로불린 대신에 트립신-전처리된 -글로불린을 사용한 것을 제외하고는 실질적으로 동일하게 실시하였다.

[비교예 1] -글로불린을 첨가하지 않은 세포배양방법

상기 실시예 1의 세포배양방법에서, -글로불린을 첨가하지 않은 배지를 사용한 것을 제외하고는 실질적으로 동일하게 실시하였다.

[실험예 1] 정제 에리스로포이에틴의 분석-IEF 분석

정제된 에리스로포이에틴의 pI값을 확인하기 위하여, 정제 에리스로포이에틴을 농축기를 사용하여 10㎕에 100㎍이 되게 한 후, pH 3∼10의 IEF 겔 키트(Novex)내의 검체 완충액으로 2배 희석하였다. IEF 전기영동장치(Novex)를 설치하여, (-) 전극부에 희석된 상층완충액을 최대로 붓고, (+) 전극부에 하층완충액 200㎖을 부었다. 키트내에 있는 pI 마커 및 농축된 정제 에리스로포이에틴을 각 공에 20㎕씩 가하여, 100V에서 1시간, 200V에서 1시간, 500V에서 30분간 전기영동하였다. 전기영동이 완료된 겔을 통상의 방법으로 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색 및 탈색하였다. 탈색이 완료된 겔을 겔분석기(Viber Lourmat)로 사진 촬영하고, BIO-1D 프로그램으로 에리스로포이에틴의 pI 값을 겔상에서 동시 전기영동된 pI 마커와 비교하여 결정하고, 각 공내에서 에리스로에틴 밴드별 농도를 비율로 결정하였다.

그 결과를 도 1 내지 도 3에 나타내었다. 도 1에는 -글로불린 첨가전, 도 2에는 56℃에서 30분 동안 전처리된 -글로불린 첨가후, 도 3에는 0.2% 트립신으로 60분 동안 전처리된 -글로불린 첨가후, CHO 세포의 배양일자에 따른 정제 에리스로포이에틴의 등전점 분획법 결과를 나타내었다. 도 2 및 도 3으로부터 -글로불린을 첨가하여 배양한 경우, 시알리다아제로부터 에리스로포에틴의 시알산이 보호되어 IEF 겔상에서 활성이 높은 pI 3.5∼4.0의 에리스로포이에틴이 배양초기와 유사한 비율로 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 2] 정제 에리스로포이에틴의 분석-EIA 분석

또한, 실시예 및 비교예로부터 수득한 에리스로포이에틴이 분비된 배양액내의 에리스로포이에틴의 함량을 EIA 방법으로 측정하였다. pH7.6의 0.05M NaHCO₃에 0.02mg/㎖의 마우스 항-에리스로포이에틴 모노클로날항체 용액을 96공 마이크로플레이트의 각 공에 100㎕씩 가한 후 37℃에서 2시간 동안 방치하였다. 인산염완충액에 0.05% 트윈 20, 1% 우태아혈청을 가한 pH 7.2의 희석용액으로 표준용액의 희석액열을 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 0.75, 1단위/㎖로 제조하고 배양액을 0.05∼0.5단위/㎖가 되도록 희석액열을 제조하였다. 각 공으로부터 모노클로날 항체 용액을 제거하고 인산염완충액에 0.05% 트윈 20을 가한 pH 7.2의 세척액으로 4회 세척한 후 표준용액과 검액을 각 공에 100㎕씩 가하고 37℃에서 2시간 방치시킨 후 세척액으로 4회 세척하였다. 그런 후 희석용액을 사용하여 래빗 항-에리스로포이에틴 폴리클로날 항체를 40ng/㎖로 희석한 다음 각 공에 100㎕씩 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 반응액을 제거하고 세척액으로 4회 세척하였다.

퍼옥시다아제(peroxidase)가 결합된 항-래빗 항체를 희석용액을 사용하여 적정농도로 희석한 다음 항원-항체 반응이 완료된 96공 마이크로플레이트의 각 공에 100㎕씩 가하였다. 37℃에서 2시간 방치시킨 후 퍼옥시다아제가 결합된 항-래빗 항체를 제거하고 세척액으로 4회 세척하였다. 0.25M 구연산염/0.25M 구연산을 가한 pH 5.0의 용액에 발색시약, O-페닐렌디아민(O-phenylenediamine)과 과산화수소를 각각 0.06%와 0.025%가 되도록 용해시켜 각 공에 100㎕씩 가한 후, 발색을 관찰하였으며 일정시간 경과후 50㎕의 1N H₂SO₄로 반응을 정지시키고 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준액의 흡광도와 농도를 이용하여 회귀곡선식을 구하고 Y축 절편과 기울기를 결정하였다. 이 회귀곡선식을 사용하여 검액의 측정농도를 계산하고 희석배수를 곱하여 배양액내 에리스로포이에틴의 함량을 계산하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에는 -글로불린 첨가전(비교예 1), 열처리된 -글로불린 첨가후(실시예 1: 56℃ 30분처리 / 60℃ 30분처리) 및 트립신 처리된 -글로불린 첨가후(실시예 2: 0.2% 트립신 30분처리 / 0.2% 트립신 60분처리 / 0.2% 트립신 90분처리)의, CHO 세포의 배양일자에 따른 에리스로포이에틴의 배양액내 함량을 나타내었다. 그 결과, 열 또는 트립신으로 전처리된 -글로불린을 배지에 첨가하여 배양한 경우, 시알리다아제로부터 에리스로포에틴의 시알산이 보호되어 에리스로포이에틴의 역가가 지속적으로 높게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따르면, 높은 시알산 함량을 가짐으로써 생체내 활성이 높은 당단백질을 지속적이고 경제적으로 제조할 수 있다.

도 1은 -글로불린 첨가전, CHO 세포의 배양일자에 따른 정제 에리스로포이에틴의 등전점 분획법 결과를 나타내는 도면;

도 2는 열처리된 -글로불린 첨가후, CHO 세포의 배양일자에 따른 정제 에리스로포이에틴의 등전점 분획법 결과를 나타내는 도면;

도 3은 트립신 처리된 -글로불린 첨가후, CHO 세포의 배양일자에 따른 정제 에리스로포이에틴의 등전점 분획법 결과를 나타내는 도면; 및

도 4는 -글로불린 첨가전, 열처리된 -글로불린 첨가후 및 트립신 처리된 -글로불린 첨가후, CHO 세포의 배양일자에 따른 에리스로포이에틴의 배양액내 함량을 나타내는 그래프.

Claims

목적하는 시알산 함유 당단백질에 대한 시알리다아제의 작용을 경쟁적으로 저해하는 또다른 시알산 함유 당단백질이 첨가된 배지에서, 목적하는 시알산 함유 당단백질의 유전자로 형질전환된 포유동물세포를 배양하는 것을 특징으로 하여, 시알산 함량이 높은 재조합 당단백질을 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 목적하는 시알산 함유 당단백질이 에리스로포이에틴인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 포유동물세포가 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 또다른 시알산 함유 당단백질이 -글로불린인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 또다른 시알산 함유 당단백질이 50∼60℃에서 30분 동안 열처리된 -글로불린인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 또다른 시알산 함유 당단백질이 단백질분해효소로 30∼ 90분 동안 전처리된 -글로불린인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 단백질분해효소가 0.2% 트립신인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 또다른 시알산 함유 당단백질이 배지에 1g/ℓ로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.