KR100670105B1 - 콩가수분해물의 저분자량 분획을 이용하여 시알산 함량이증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법 및 그에 의하여생산된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴 - Google Patents

콩가수분해물의 저분자량 분획을 이용하여 시알산 함량이증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법 및 그에 의하여생산된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴 Download PDF

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Abstract

본 발명은 5kDa 이하로 분획된 콩가수분해물을 포함하는 무혈청 및 무단백질 세포 배양용 배지 중에서 에리스로포이에틴을 생산하는 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법 및 그에 의하여 생산된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴을 제공한다.
시알산, 콩가수분해물, 저분자량 분획

Description

콩가수분해물의 저분자량 분획을 이용하여 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법 및 그에 의하여 생산된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴{A method of producing erythropoietin having the enhanced sialic acid content using a lower molecular weight fraction of soy hydrolysates and erythropoietin having the enhanced sialic acid content produced by the same}
도 1은 비 동물 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 세포를 배양하고, 배양 시간에 따른 세포 수를 나타낸 그래프이다.
도 2는 비 동물 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서세포를 배양하고, 배양시간에 따른 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 비 동물 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 세포를 배양하고, 배양물 중에 생산된 에리스로포이에틴의 양을 나타낸 그래프이다.
도 4는 저 분자량으로 분획한 콩 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 세포를 배양하고, 배양 시간에 따른 세포 수를 나타낸 것이다.
도 5는 저 분자량으로 분획한 콩 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 세포를 배양하고, 배양시간에 따른 생존세포율을 나타낸 것이다.
도 6은 저 분자량으로 분획한 콩 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백 질 배지 중에서 세포를 배양하고, 배양물 중에 생산된 에리스로포이에틴의 양을 나타낸 그래프이다.
도 7은 저 분자량으로 분획한 콩 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 세포를 배양하고, 배양물 중에 생산된 에리스로포이에틴의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 저 분자량으로 분획한 콩 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 세포를 배양하고, 배양물 중에 생산된 에리스로포이에틴의 등전집속 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 저 분자량으로 분획한 콩 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 세포를 배양하고, 배양물 중에 생산된 에리스로포이에틴의 시알산 함량을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 시알산 함량이 증가된 에리스포이에틴을 생산하는 방법 및 그에 의하 제조된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴에 관한 것이다.
에리스로포이에틴은 적혈구계의 세포에 특이적인 조혈호르몬으로서, 골수 중의 적아구(erythroblast)계 전구세포의 분화와 증식을 조절하여 적혈구의 생성을 자극하는 순환 당단백호르몬이다. 에리스로포이에틴은 적혈구 전구세포의 마지막 성숙과 성장을 조절하는 역할을 하는 호르몬으로서 주로 태아 간이나 성인 신장에 서 생산된다. 혈액 내의 에리스로포이에틴 양은 저 산소 혈중상태에서 증가하여 그 결과로 성숙한 산소전달 적혈구 세포의 생산을 조절한다. 인간은 정상적인 조직의 기능을 위해 적정한 수준의 적혈구 수를 유지하고 있으므로 적혈구 수가 감소하면 조직의 기능 장애가 일어나 빈혈을 일으키게 된다. 특히 말기 신부전증 환자가 신장성 빈혈을 일으키는 가장 주된 원인은 에리스로포이에틴 생성의 결핍임이 이미 입증되었다 (Eschbach 등, N. Engl. J. Med., 321, 158, 1989). 따라서, 에리스로포이에틴은 빈혈, 특히 신장성 빈혈 등의 임상적 치료에 유용하게 이용되고 있으며, 이러한 치료제로서 에리스로포이에틴을 대량으로 제조하기 위해서 유전자 재조합 기술과 세포배양 기술을 이용하는 방법은 매우 유용한 수단이 된다.
에리스로포이에틴은 구조적으로 165개의 아미노산으로 구성되어 있으며 3개의 N-결합 당쇄와 1개의 O-결합 당쇄를 포함하고 있고, 전체 당쇄는 전체 분자량의 40%에 해당한다. 당쇄부분은 에리스로포이에틴의 생체 내 활성에 필수적인 역할을 하므로, 에리스로포이에틴의 당 함량이 감소되면 생물학적 반감기가 급속히 감소되어 생체 내 생물학적 활성이 소실된다 (Goto 등, Biotechnology, 6, 67, 1988). 예를 들어, 시알산 (sialic acid)은 아시알로 당단백질 (asialoglycoprotein) 수용체의 두 번째 갈락토오스기를 보호함으로써 EPO의 생체 내 활성도에 영향을 미친다 (Goldwaser등, J. Biol. Chem., 249, 4202, 1974). 에리스로포이에틴의 당쇄에 존재하는 시알산은 에리스로포이에틴의 생체 내 반감기 연장에 중요한 역할을 하며, 궁극적으로는 효능에 영향을 주는 것으로 알려져 있다 (Lowy 등, 185, 102, 1960). 또한, 시알산 분해효소 (sialidase)가 작용하여 에리스로포이에틴의 생체 내 생물 학적 활성을 불활성화시킨다는 사실이 발견된 이후, 에리스로포이에틴의 생물학적 활성에서 시알산의 기능에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 대부분의 경우에 치료제로 사용되는 당은 당단백질 고유의 효능을 나타내는데 필수불가결한 역할을 하며, 특히 인간 유래 에리스로포이에틴의 경우에 있어서는 당의 역할이 절대적이다. 즉, 당이 없는 경우에는 에리스로포이에틴의 활성이 전혀 나타나지 않을 뿐만 아니라 당의 조성이나 말단의 시알산 함량 등에 따라 EPO의 생체내 활성이 크게 영향을 받는다.
종래 동물세포 배양에는 생체 조건과 유사한 환견을 제공하기 위하여 약 5-10%의 우태아 혈청이 포함된 배지가 사용되었다. 그러나, 혈청을 사용하는 것은 높은 가격과 제한된 공급, 각 생산분마다 조성의 균일성 부재, 바이러스, 마이코플라즈마에 의한 감염성 위험 및 성분이 완벽하게 밝혀져 있지 않다는 것에 기인한 여러 문제점들이 있다. 따라서, 1980년대부터 의약품을 생산하는데 있어서 혈청의 첨가에 따른 문제점이 부각되면서 혈청의 사용을 줄이거나 대체하기 위한 연구들이 꾸준히 진행되어 오고 있다.
혈청의 대체물로서 예를 들면, 콩가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지가 사용된 바 있다. 예를 들면, 미국특허 공개 제2003/0203448호에는 콩가수분해물의 40%이상이 분자량 500 Da이하인 콩가수분해물을 포함하는 세포 배양용 무혈청 무단백질 배지가 개시되어 있으며, 콩가수분해물을 사용함으로써 재조합 표적 단백질의 수율을 유의하게 증가시킬 수 있다는 내용이 개시되어 있다.
그러나, 상기 종래 기술에 의하더라도 에리스로포이에틴의 시알산 함량을 증 가시키는 방법에 대하여는 전혀 개시되어 있지 않다. 또한, 상기한 종래 기술에는콩가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지를 이용하여 vWF 및 FVIII을 재조합 CHO 세포로부터 생산하는 방법이 개시되어 있고 상기 방법에 의하여 생산 수율을 증가시킬 수 있다고만 하고 있을 뿐, 상기 단백질의 시알산 함량의 변화에 대하여는 전혀 언급되어 있지 않다. 따라서, 당업자라면 상기한 종래 기술을 읽는다 하더라도, 생산되는 재조합 단백질 중의 시알산 함량을 증가시키는 방안에 대하여 암시를 받거나 동기부여가 되는 것은 아니다.
본 발명자들은 놀랍게도, 콩가수분해물의 저분자량 분획을 포함하는 무혈청 무단백질 배지를 이용하여 에리스로포이에틴을 생산하는 세포를 배양함으로써, 에리스로포이에틴 중의 시알산 함량을 증가시킬 수 있다는 예기치 않는 결과를 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 에리스로포이에틴 중의 시알산 함량을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의하여 제조된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴을 제공하는 것이다.
본 발명은 5kDa 이하로 분획된 콩가수분해물을 포함하는 무혈청 및 무단백질 세포 배양용 배지 중에서 에리스로포이에틴을 생산하는 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법을 제공한 다.
본 발명은 무혈청 및 무단백질의 기본 배지에 상기 콩가수분해물의 저분자량 분획을 포함시킨 배지를 이용하여 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 콩가수분해물의 저분자량 분획은 10kDa이하, 바람직하게는 5kDa이하, 가장 바람직하게는 3kDa이하의 분자량을 갖는 것이다. 또한, 저분자량 분획물은 배지의 총 건조 중량에 대하여 5∼50% (w/w), 바람직하게는 10∼40% (w/w), 가장 바람직하게는 20∼30% (w/w)의 건조 중량으로 배지에 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 선택되는 콩가수분해물은 특별히 한정되지 않는다. 상업적으로 구입가능한 많은 콩가수분해물이 본 발명의 저분자량 분획을 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, pH 6.5 내지 7.5이고 총질소 함량이 9 % 내지 9.7 %이고 회분 함량이 8 내지 15%인 콩분말으로부터 유래된 펩톤, 효소적으로 분해된 펩톤 (예, 파파인)이 포함된다. 이들은 당업자에 의하여 세포 배양에 일반적으로 사용된 형태의 대두 유래 펩톤이다. 본 발명에 있어서, 펩톤과 가수분해물은 서로 동일한 의미로서 사용된다.
본 발명에 사용되는 저분자량 분획은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 콩가수분해물로부터 제조될 수 있다. 저분자량 분획은 예를 들면, 콩가수분해물을 한외여과 (ultrafiltraton) 단계를 거쳐 정제함으로써 얻어질 수 있다,
한외여과는 선행기술에 널리 알려진 방법에 따라, 즉, 정의된 컷-오프-한계를 갖는 막 여과기 (filter)를 사용하여 수행될 수 있다.
한외여과된 콩펩톤의 정제는 예를 들면, Sephadex G25 또는 Sephadex G10 또는 등가물질을 갖는 겔 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피 또는 "역상 (reversed-phase)" 크로마토그래피에 의하여 수행될 수 있다. 이들 방법은 당업계에 잘 알려져 있는 방법이다. 이들 방법에 의하여 10 KDa 이하, 5 KDa이하, 1kDa이하의 분자량을 갖는 콩가수분해물을 포함하는 분획이 선택될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 배지는 상기 콩가수분해물 저분자량 분획을 포함할 뿐만 아니라, DMEM/HAM's F12, RPMI 및 HyQCDM4CHO (HyClone, USA)와 같은 종래 알려져 있는 합성 배지를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 배지에는 또한 아미노산을 포함하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 L-아스파라긴, L-시스틴, L-시스타인 (cystine), L-프롤린, L-트립토판, L-글루타민, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 아미노산은 개별적으로 또는 조합되어 배지에 첨가될 수 있다. 상기한 아미노산을 모두 포함하는 아미노산 혼합물의 조합물을 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 알려진 합성 배지가 콩가수분해물 저분자량 분획과 함께 조합되어 사용될 수 있다. 통상적인 합성 배지는 무기 염, 아미노산, 비타민, 탄수화물 원료 및 물을 포함할 수 있다. 예를 들면, HyQCDM4CHO (HyClone, USA) 및 DMEM/HAM's F12 배지가 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 배지에는 버퍼 물질, 산화 안정화제, 기계적 스 트레스에 대한 안정화제, 또는 프로테아제 저해제와 같은 보조 물질을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 에리스로포이에틴을 생산하는 동물 세포는 에리스로포이에틴을 생산하는 천연 세포 또는 재조합 클로닝된 세포일 수 있다. 이들 세포는 무혈청 및 무단백질 배지에 적응된 후에 사용될 수 있다. 상기 세포는 에리스로포이에틴을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 CHO 세포 또는 BHK일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 특히, 바람직하게는, 상기 에리스로포이에틴을 생산하는 동물 세포는 에리스로포이에틴을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 CHO, 더욱 바람직하게는 DG-44 세포이다.
본 발명에 있어서, 상기 세포의 배양은 당업계에 알려진 통상적인 배양 조건에서 배양될 수 있다. 또한, 세포 배양에 의하여 생산된 에리스로포이에틴은 종래 알려진 방법에 따라 정제될 수 있다. 예를 들면, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환크로마토그래피 및 염석 등의 방법에 의하여 정제될 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 생산된 에리스로포이에틴은 종래 알려진 방법에 의하여 제조되는 에리스로포이에틴에 비하여 시알산이 함량이 높은 특성을 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 의하여 생산된 에리스로포이에틴은 종래 알려진 방법에 의하여 제조되는 에리스로포이에틴에 비하여 약 10 % 이상, 더욱 바람직하게는 20 % 이상의 증가된 시알산 함량을 가질 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의하여 생산된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴을 제공한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예1 : 비 동물 유래 가수분해물이 세포성장과 에리스로포이에틴 생산에 미치는 영향
실험에 사용된 비 동물유래 가수분해물은 재료에 따라 세포성장과 에리스로포이에틴 생산에 다른 효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단되어 콩, 밀, 쌀, 효모 유래 가수분해물을 사용하여 그 효과를 조사하였다.
1. CHO 세포 배양
본 발명의 실시예에 사용된 에리스로포이에틴을 생산하는 세포는 아래와 같은 방법으로 제조되었다. 먼저, 서열번호 1에 기재된 염기서열을 갖는 pMSG (KCCM 10203) 벡터를 제한효소 NheI과 BglII에 에리스로포이에틴을 코딩하는 유전자 (서열번호 2)를 삽입하여 에리스로포이에틴 발현용 벡터를 제조하였다. pMSG (KCCM 10203) 벡터는 프로모터의 5' 말단에 베타글로빈 MAR 서열을 포함하고 있어, 동물 세포에서 재조합 단백질의 발현을 증진시킬 수 있는 벡터로서, 종래 알려져 있는 벡터이다. 상기 pMSG (KCCM 10203) 벡터에 대하여는, 참조에 의하여 그 전체로 본 명세서에 포함되어지는 한국특허 공개 제10-2002-0010327호에 개시되어 있다.
얻어진 에리스로포이에틴 발현용 벡터를 Dosper liposomal transfection reagent (Roche 사)를 이용하여 부착성 CHO-DG44 세포 (Chasin, L. A., et al., Somatic Cell. Mol. Genet., vol. 12, p.555-566, 1986)에 형질도입하였다.
얻어진 형질도입세포 (transformant)를 MTX의 농도를 순차적으로 증가하켜, 세포 중의 에리스로포이에틴 유전자를 증폭시켜 에리스로포이에틴을 고농도로 발현하는 CHO 세포를 분리하였다. 분리된 부착성 세포를 무혈청 무단백질 배지인 HyQCDM4CHO (HyClone, USA) 배지에서 부유배양에 적응된 세포를 선별하였다. 이 무혈청 무단백질 배지에 부유배양으로 적응된 세포를 초기 세포농도 3x105 cells/mL로 하여 3일 마다 계대배양하였다. 계대배양 용기로는 250 mL spinner flask (Bellco, USA)를 사용하였으며, 3L spinner flask (Bellco, USA)에서 대량배양하여 에리스로포이에틴의 생산량을 측정하였다. 세포 배양은 5% CO2, 37℃ 배양기에서 60 RPM으로 배양하였다.
2. 가수분해물 제조 방법
본 실시예에 사용한 가수분해물은 콩 (RR10131.01, HyClone), 밀 (H8037-5, Simga), 쌀 (H8037-1, Sigma), 효모 (RR10133.01, HyClone) 유래 가수분해물을 증류수에 녹여 사용하였으며 각각은 20% (w/v) 용액으로 제조하였다. 제조된 가수분해물은 0.22 μm 필터를 이용하여 제균 후 4℃에서 냉장 보관하였다.
3. 효소 면역측정법에 의한 에리스로포이에틴 정량방법
에리스로포이에틴의 정량 분석을 위하여 상품화된 사람 유래 에리스로포이에틴 정량 측정 키트 (R&D Systems, USA)를 사용하였다. 항원흡착 플레이트 각 웰에 희석액을 각각 100 μL 씩 가하고 표준액과 희석액으로 적절히 희석한 국제표준액 및 검액들을 100 μL 씩 가하여 잘 섞은 후 실온에서 2시간 반응시켰다. 각 웰의 잔여 반응액을 제거하고 200 μL의 효소항체 접합체액을 가한 후 다시 2시간 반응 시켰다. 반응 후 반응액을 제거하고 세척용액으로 4회 세척한 후 잔여액을 모두 제거하였다. 기질 발색용액을 200 μL 씩 가한 후 실온에서 20분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 각 웰에 반응 정지액을 100 μL 씩 가하여 반응을 정지시키고 잘 섞은 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준액의 역가를 횡축, 흡광도를 종축으로 하여 표준곡선을 작성하고 작성된 표준 곡선으로부터 국제표준액과 검액 각각의 흡광도에 따른 에리스로포이에틴의 역가를 수치로 구하였다. 여기에 각각의 희석비를 곱하여 검액을 정량하였다.
4. 비 동물유래 가수분해물이 세포성장에 미치는 영향
본 발명자들은 3 L Spinner flask (Bellco, USA)를 사용하였으며, 무혈청 무단백질 배지인 인 HyQCDM4CHO (HyClone, USA) 배지를 기본배지로 하여 초기 세포농도를 3x105 cells/mL로 접종하였다. 배양 3일 후 제조된 가수분해물을 배지의 건조중량에 대하여 20% (w/w)를 첨가하였으며, 매일 세포수를 측정하였다.
그 결과를 도 1 내지 3에 나타내었다. 도 1 내지 3에 나타낸 바와 같이, 비동물 유래 가수분해물을 첨가된 배지를 사용하는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 최대 세포농도가 증가하였고 60% 이상 세포생존율이 연장되었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 식물펩톤 (phytone peptone), 티씨 이스톨레이트, 박토소이톤 및 콩 가수분해물의 효과가 가장 좋았다. 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 60% 이상 세포생존율은 무혈청 무단백질 배지만을 사용하여 배양된 세포는 5일, 효모추출물, 밀 부질, 쌀, 밀쌀 및 밀가수분해물을 사용하는 경우 6일, 식물 펩톤, 티씨 이스톨레이트, 박토소이톤, 및 콩 가수분해물을 사용하는 경우에는 7일로 연장되었다. 이중 콩 가수분해물은 7일 이후에도 생존세포 농도와 생존세포율이 가장 높았다.
도 3은 비 동물 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 세포를 배양하고, 배양물 중에 생산된 에리스로포이에틴의 양을 나타낸 그래프이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 효모추출물, 밀 부질, 쌀, 밀쌀 및 밀 가수분해물, 식물펩톤을 사용한 경우, 생산성 증가가 크지 않았으나, 티씨 이스톨레이트, 박토 소이톤 및 콩 가수분해물을 사용한 경우, 생산성이 크게 증가되었다. 특히 콩 가수분해물을 사용한 경우 생산성이 약 2 배 증가되었다. 도 1 내지 도 3에서, NC: 무혈청 무단백질 배지, WGH: 밀 부질 가수분해물, YE: 효모추출물, RH: 쌀 가수분해물, WRH: 밀쌀 가수분해물, WH: 밀 가수분해물, PP: 식물 펩톤, TCY: 티씨 이스톨레이트, BS: 박토소이톤, SH: 콩 가수분해물을 나타낸다.
이상과 같이, 콩 가수분해물은 다른 가수분해물에 비하여 세포농도, 생존세포율 및 에리스로포이에틴의 생산성을 향상시키는데 현저한 효과가 있다.
실시예 2: 저 분자량의 콩 유래 가수분해물이 생존세포율, 에리스로포이에틴의 생산 및 그의 시알산 함량에 미치는 영향
1. 콩가수분해물의 분획의 제조
콩가수분해물의 저 분자량의 분획을 얻기 위해 가루 형태의 콩 유래 가수분해물 (H8036, Sigma)을 20% (w/v) 용액으로 제조하였다. 제조된 가수분해물은 각각 10kDa 이하, 5 kDa 이하 및 3 kDa 이하로 분획하는 원심분리 유니트 (Millipore, USA)를 이용하여 분획하였다. 분획은 상기 가수분해물 용액을 원심분리 유니트에 첨가한 후 4℃, 3000 RPM 에서 2시간 동안 원심분리하여 수행하였다. 분획된 가수분해물은 0.22 μm 필터로 제균하여 4℃ 냉장고에 보관하였다.
2. 콩 가수분해물의 분획이 세포성장에 미치는 영향
본 발명자들은 HyQCDM4CHO (HyClone, USA)를 기본배지로 하여 초기 세포농도를 3x105 cells/mL로 접종하여, 3 L Spinner flask (Bellco, USA)에서 배양하였다. 배양 3일 후 각 상기 분획을 배지의 건조중량에 대하여 20% (w/w)로 첨가하였으며, 매일 생존세포의 수와 세포 생존율을 측정하였다. 에리스로포이에틴 분석에 사용할 시료는 세포 생존율이 80% 이상인 배양 6일째 시료로 준비하였다.
도 4는 저 분자량으로 분획한 콩 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 CHO 세포를 배양하고, 배양 시간에 따른 세포 수를 나타낸 것이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 최대 세포 농도는 6x106 cells/mL로 분자량에 따른 차이는 크지 않았다.
도 5는 저 분자량으로 분획한 콩 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 CHO 세포를 배양하고, 배양시간에 따른 생존세포율을 나타낸 것이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 각 분획에 따른 생존 세포율의 차이는 크지 않았다.
도 6은 저 분자량으로 분획한 콩 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 CHO 세포를 배양하고, 배양물 중에 생산된 에리스로포이에틴의 양을 나타낸 그래프이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 에리스로포이에틴의 생산량은 분획되지 않은 가수분해물을 사용한 경우에 비하여 약간 증가하였으나, 분자량에 따른 차이는 거의 없었다.
3. 에리스로포이에틴 정제 및 농축
빈 PD-10 컬럼에 블루 세파로오스 (Amersham biosciences, Sweden)를 충진시킨 후 적어도 5 컬럼부피의 평형화 버퍼 (PBS, pH 7.4)로 평형시켰다. 이어서 배양상층액을 흡수시켰으며 세정 버퍼 (PBS, pH7.4)로 5 컬럼 부피로 세정 후 용출버퍼 (PBS+ 0.6M NaCl, pH7.4)로 2 컬럼 부피로 용출시켰다. 용출된 시료는 10kDa 이하를 배제시키는 원심분리 유니트 (Millipore, USA)에 넣은 후 2000 RPM, 4℃에서 30 분간 원심분리하여 농축된 에리스로포이에틴을 얻었다. 각각의 시료는 적당한 부피로 나누어 -70℃에서 보관하였다. 정제된 에리스로포이에틴은 ELISA 분석을 통하여 수율을 계산 하였다. 분획된 콩 유래 가수분해물 또는 분획되지 않은 콩 유래 가수분해물을 첨가한 무혈청배지에서 생산된 에리스로포이에틴은 모두 표준배지와 유사한 50∼60%의 수율을 보였다 (표 1).
표 1. 분획된 콩가수분해물이 첨가된 배지에서 생산된 에리스로포이에틴의 블루-세파로즈 정제 결과
정제전 시료 (μg) 정제후 시료 (μg) 수율 (%)
대조군 3696 2374 64.2±7.2
원액 4393 2502 56.9±5.1
10kDa 이하 분획 3626 2277 62.8±8.6
5kDa 이하 분획 3611 1890 58.3±9.3
3kDa 이하 분획 3959 1946 59.2±4.5
4. 정제된 에리스로포이에틴의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동
3에서 준비한 시료를 브레드포드 (Bradford) 방법을 사용하여 단백질을 정량분석하였다. 단백질의 농도를 계산하여 동량으로 취한 후 4배 시료 버퍼와 10배 환원액으로 잘 희석한 다음 70℃에서 10분간 반응시켰다. 프리-캐스트겔 (4-12% Bis-Tris, Novex, USA)을 전기영동장치 (InVitrogen, USA)에 설치하고 전기영동장치에 이동완충액을 채웠다. 준비된 시료를 겔의 웰에 넣은 후 200V 전압에서 35분 동안 전기영동하였다. 겔을 분리한 후 염색완충액 (0.25% 쿠마시 블루, 40% 메탄올, 10% 아세트산, 50% 증류수)에서 30분간 염색하였고 탈염색완충액 (40% 메탄올, 10% 아세트산, 50% 증류수)에서 탈염색하였다.
CHO 세포에서 생산된 시료는 모두 에리스로포이에틴 표준품과 같은 분자량을 갖는 것으로 확인 되었으며 순도는 대략 70∼80% 이상인 것으로 추정되었다. 무혈청 무단백질 배지에서 생산된 에리스로포이에틴은 가수분해물을 처리한 무혈청 배지에서 생산된 에리스로포이에틴에 비해 순도가 약간 떨어지는 것을 알 수 있었다. 이는 CHO 세포의 생존세포율이 낮아 다른 단백질의 함량이 상대적으로 높기 때문에 나타난 것으로 판단된다. 또한 분획된 콩 유래 가수분해물을 첨가한 경우는 무혈청 무단백질 배지만 사용한 경우에 비해 상대적으로 많은 양의 에리스로포이에틴을 얻을 수 있었다.
저분자량 분획의 종류 즉, 10 kDa, 5kDa 및 3kDa이하의 각 분획 사이의 에리스로포이에틴 생산량 차이는 크지 않았다 (도 7). 도 7은 저 분자량으로 분획한 콩 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 세포를 배양하고, 배양물 중에 생산된 에리스로포이에틴의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 결과를 나타낸 도면이다. 도 7에서 레인 1: 크기 마커, 2: 무혈청 무단백질 배지, 3: 무혈청 무단백질 배지 + 원액 콩 가수분해물, 4: 무혈청 무단백질 배지 + 10kDa 이하 분획 콩 가수분해물, 5: 무혈청 무단백질 배지 + 5kDa 이하 분획 콩 가수분해물, 6: 무혈청 무단백질 배지 + 3kDa 이하 분획 콩 가수분해물, 7: 에리스로포이에틴 표준품을 나타낸다.
5. 정제된 에리스로포이에틴의 등전집속 (IEF) 분석
3에서 준비한 시료에서 동량의 단백질을 취한 후 같은 양의 시료 완충액을 첨가하여 잘 혼합하였다. 전기영동장치에 IEF-겔 (pH 3-7, Novex, USA)을 설치한 후 양극 완충액과 음극 완충액을 섞이지 않도록 주의하여 전기영동 장치에 채운 후 준비된 시료를 웰에 넣었다. 전기영동은 100 V전압에서 18분, 200 V 전압에서 18분, 그리고 500 V 전압에서 24분 동안 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 겔을 분리하여 염색 완충액에서 30분간 염색하였고, 탈염색 완충액에서 탈염색을 실시하였다.
도 8은 저 분자량으로 분획한 콩 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 CHO 세포를 배양하고, 배양물 중에 생산된 에리스로포이에틴의 등전집속 분석 결과를 나타낸 도면이다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 에리스로포이에틴 의 pI는 콩가수분해물을 첨가하지 않은 경우에 비하여 더 낮았다. 저 분자량의 가수분해물일수록 생산된 에리스로포이에틴의 pI 값은 더 낮았다. 도 8에서 레인 1: 에리스로포이에틴 표준품, 2: 무혈청 무단백질 배지, 3: 무혈청 무단백질 배지 + 원액 콩 가수분해물, 4: 무혈청 무단백질 배지 + 10kDa 이하 분획 콩 가수분해물, 5:무혈청 무단백질 배지 + 5kDa 이하 분획 콩 가수분해물, 6: 무혈청 무단백질 배지 + 3kDa 이하 분획 콩 가수분해물을 나타낸다.
상기한 바와 같이, 콩가수분해물의 저분자량 분획을 사용함으로써 pI가 낮은 에리스로포이에틴이 얻어졌다. 이는 에리스로포이에틴 중의 시알산의 함량이 증가하였기 때문인 것으로 여겨진다. 이는 콩가수분해물의 저분자량 분획을 사용함으로써 체내 활성 및 안정성이 우수한 에리스로포이에틴을 생산할 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 따라서, 본 발명자들은 상기와 같이 얻어진 낮은 pI 값을 갖는 에리스로포이에틴에 대하여 실제로 증가된 시알산 함량을 가지고 있는지를 분석하였다.
6. 정제된 에리스로포이에틴의 시알산 함량 분석
시알산 표준액과 검액을 각각 뚜껑이 있는 유리 튜브에 1 mL씩 넣고 제조된 리소시놀 용액 (0.25 mM 쿠프릭 설페이트, 80% (v/v) HCl, 0.2% (w/v) 리소시놀)을 1 mL씩 첨가시킨 후 잘 섞어주었다. 뚜껑을 닫은 다음 30분 동안 끓는 물에 반응시킨 후 10분 동안 얼음물에 식힌 다음 얼음물에서 꺼내어 2 ml의 추출액 (부틸 아세이트: 부탄올=48:12)을 첨가시킨 후 강하게 교반시켰다. 교반이 끝나면 4℃, 2500 rpm에서 5분간 원심분리하여 층을 분리하였다. 분리된 두개의 층에서 상층액만을 취하여 580 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시알산 표준품을 횡축으로 흡광도 측정값 을 종축으로 하여 시료의 시알산 함량을 계산하였다. 계산된 시알산의 함량을 기준으로 희석배수를 곱하여 시료내에 존재하는 시알산의 함량을 구하였다. 다음은 에리스로포이에틴 농도 당 시알산 농도를 구한 식이다.
에리스로포이에틴의 농도 (mole) 당 시알산 농도 (mole)
= [시알산농도(μmg/mL)/309](μmole)/[에리스로포이에틴 농도 (μg/mL)/30,600] (μmole)
시알산의 분자량: 309
에리스로포이에틴의 분자량: 30,600
도 9는 저 분자량으로 분획한 콩 유래 가수분해물을 포함하는 무혈청 무단백질 배지 중에서 CHO 세포를 배양하고, 배양물 중에 생산된 에리스로포이에틴의 시알산 함량을 나타낸 그래프이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 콩가수분해물의 분획의 분자량이 작으면 작을 수록 에리스로포이에틴 중의 시알산 함량은 더 높았다. 특히, 콩가수분해물을 첨가하지 않은 경우에 비하여, 3kDa 이하의 분획을 사용한 경우 에리스로포이에틴 중의 시알산 함량은 20% 이상 증가하였다. 또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 3kDa 이하 분획을 사용하는 경우는 5kDa이하 분획을 사용하는 경우에 비하여 약 10 %이상 더 높은 시알산 함량을 보였다. 이는 당업자가 선행기술로부터 예측하기 곤란한 현저한 효과인 것이다.
이상과 같이, 5kDa 이하, 더욱 바람직하게는 3kDa이하로 분획된 콩가수분해물을 포함하는 배지 중에서 에리스로포이에틴를 생산하는 세포를 배양함으로써, 생체 내 활성과 안정성이 우수한 에리스로포이에틴을 얻을 수 있었다.
본 발명의 방법에 따르면, 콩가수분해물의 저분자량 분획을 이용하여 에리스로포이에틴의 시알산 함량을 증가시킬 수 있다.
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Claims (5)

  1. 5kDa 이하로 분획된 콩가수분해물을 포함하는 무혈청 및 무단백질 세포 배양용 배지 중에서 에리스로포이에틴을 생산하는 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 에리스로포이에틴을 생산하는 동물 세포는 중국햄스터 난소 세포 (CHO)인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 무혈청 및 무단백질 세포 배양용 배지는 하이클론 화학적으로 정의된 배지 4 중국햄스터 난소 (HyClone Chemically defined medium 4 Chinese Hamster Ovary: HyQCDM4CHO) 배지, 디엠이 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's medium: DMEM), 알피엠아이 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640: RPMI 1640) 또는 햄스 에프 12 (HAM's F12)인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 콩가수분해물의 5kDa이하의 분획은 배지 총 건조 중량에 대하여 5∼50% (w/w)의 범위로 포함되는 것인 방법.
  5. 삭제
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