JPH066054B2 - 動物細胞の培養方法 - Google Patents

動物細胞の培養方法

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JPH066054B2
JPH066054B2 JP62258252A JP25825287A JPH066054B2 JP H066054 B2 JPH066054 B2 JP H066054B2 JP 62258252 A JP62258252 A JP 62258252A JP 25825287 A JP25825287 A JP 25825287A JP H066054 B2 JPH066054 B2 JP H066054B2
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Description

【発明の詳細な説明】 (a)産業上の利用分野 本発明は動物細胞の培養方法に関するものである。更に
詳しくは、有用物質を産生する動物細胞を、高密度で培
養する方法に関するものである。
(b)従来の技術 大規模による細胞大量培養は、例えばウイルス、ワクチ
ン、インターフェロンなどの抗ウイルス剤、あるいはホ
ルモンなどの生物薬品の製造に必須である。殊に近年特
定タンパク質などを標的とするモノクローナル抗体の生
産は、抗体産生細胞とミエローマによるハイブリドーマ
大量培養によるものであり、その技術の解決は工業的に
重要なテーマである。
(c)発明の目的 そこで本発明者らは、動物細胞の高密度培養方法におい
て更に効率良く培養を行う方法について鋭意研究を行っ
た結果、本発明に到達した。
(d)発明の構成 すなわち、本発明は動物細胞を生細胞密度3×106cells
/ml以上で灌流培養するにあたり、培養系におけるグリ
コース濃度を0.01mmol/l以上3mmol/l以下に維持して培
養することを特徴とする培養方法である。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の培養方法において、培養する動物細胞として
は、特に制限はなく、天然の動物細胞のみならず人為的
或いは遺伝子操作により変性された細胞例えばハイブリ
ドーマであってもよい。
また細胞としてIL−2−の如きリンホカインを産生す
るリンパ球由来の細胞であってもよく、インターフェロ
ン(IFN)の如き有用な生理活性物質を産生する2倍
体細胞であってもよい。さらに種々のモノクローナル抗
体を産生する細胞であってもよく、本発明はかかるモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養に対し
てモノクローナル抗体を高い濃度で得る目的のために特
に適している。
細胞の形態としては、特に制限はなく、浮游細胞でも培
養細胞でもよいが、本発明方法では浮游細胞であること
が好ましい。
本発明における細胞培養は浮游培養でも付着培養でもよ
い。
本発明における細胞培養は灌流培養で行われる。ここ
で、灌流培養とは、一般に新しい培養液を培養槽中へ供
給しつつ、生育阻害物質を含んだ古い培養液を培養槽外
へ排出しながら培養を行う培養方式である。
この方法を用いて培養するに当って重要なことの1つ
は、培養液中の生細胞と前記古い培養液とを効率よく分
離し、古い培養液を培養槽外へ取り出し、培養槽内の細
胞の生育環境を最適条件下に維持することである。
本発明における培養方法としては、タンク培養、細胞を
担体に付着させたものを充填剤として用いる培養および
フォローファイバー培養等がある。ここでタンク培養に
は、過法、重力沈降法、遠心沈降法等があり、それぞ
れマイクロキャリアーを用いてもよい。また、細胞を担
体に付着させたものを充填剤として培養を行う場合、該
担体としてはマイクロカプセル,セラミックス担体およ
びゲル等が用いられる。
本発明方法においては、タンク培養による灌流培養が好
ましい。
本発明方法の培養に用いられる培養液は実質的に水より
なる水性媒体である。該水性媒体は、動物細胞の培養に
通常使用される各種添加物例えば種々の無機塩.ビタミ
ン類,捕酵素,ブドウ糖,アミノ酸,抗生物質,生長促
進因子などを含有している。一般に培養液中に含まれる
糖成分としてはグルコースが用いられ、該グルコース濃
度は20mmol/lである。しかしながら本発明方法によれば
動物細胞を生細胞密度3×106cells/ml以上、好ましく
は5×106cells/ml以上で灌流培養するにあたり培養系
におけるグルコース濃度は0.01mmol/l以上、3mmol/l以
下、好ましくは0.2mmol/l以上、2mmol/l以下でよい。グ
ルコースの濃度は3mmol/lを越えると動物細胞が必要以
上のグルコースを消費し、ラクテートの生産量が増大
し、得られる目的物質の精製が困難となる。またグルコ
ースの濃度が0.01mmol/lより少ないと動物細胞の増殖が
おさえられる。また動物細胞の生細胞密度が3×106cel
ls/mlに達しない時点でグルコース濃度を0.01mmol/l以
上3mmol/l以下とすると、動物細胞の増殖はおさえら
れ、死滅していく。
更に、培養液には、血清を加えることもできるが、血清
を用いない所謂無血清培地を培養液として使用すること
もできる。無血清培地を使用するのが経済的に有利であ
り、望ましい。
以下、実験例を掲げて本発明を詳述する。
実施例1 (1)培養装置 添付図1に示す構造を有する内容積約200ml,有効培養
容積(細胞が存在する部分の容積)120mlの重力沈降型
灌流培養槽(特開昭62-265号公報参照)を用いた。
(2)細胞 マウスミエローマP3/×63−Ag8−U1株とヒトB
セルを融合して得られたマウス・ヒトハイブリドーマC
株を用いた。この株は、ヒト型抗サイトメガロウイルス
IgG1産生する。
(3)培地及びグルコース溶液 無血清培地ITES+eRDFからグルコースを除去し
たものを過滅菌して用いた。インシュリン,ヒトトラ
ンスフェリン,エタノールアミン,および亜セレン酸ナ
トリウムの添加量はそれぞれ9mg/l,10mg/l,0.62
mg/l,0.43×10-3mg/lである。培地には5mM HE
PES,1g/l水酸化ナトリウム,105IU/lペニ
シリン0.1g/lストレプトマイシンを添加した。
グルコース溶液としては、eRDF培地に10%のグルコ
ースを溶解したものを過滅菌して用いた。
(4)培養方法及び結果 37℃の恒温水槽中に設置された培養槽に過滅菌した培
地150mlおよびグルコース溶液5mlを入れC23株を5×1
05個播種した。培養槽においては、炭酸ガス5%含有空
気が空間部に、純酸素ガスが培養液中に逆入しうるよう
になっており、溶存酸素量が3〜4ppmの範囲で一定に
なるように制御された。攪拌速度は20r.p.m.であった。
培養開始2日目よりノズル3から培地を240ml/dayで送
入し灌流を開始した。グルコース溶液は2日目から4日
目まではノズル4から8.6ml/day送入し、5日目以降は
8時間に1回 図1のノズル10よりサンプリングを行っ
てグルコースの濃度を測定しその濃度が2〜3mmol/lと
なるようにポンプの流量を調節して培養を継続した。
かくして18日間培養を行った結果は表1の通りであっ
た。
実施例2 (1)培養装置 添付図2に示す培養システムを用いた。培養槽(AP−
1)は実施例1に同じである。図2のAP−2はプレー
トアンドフレーム型限外過装置である。限外過膜は
シリポア社製ペリコンラボカセット用限外過膜を使用
した。膜の分画分子量は10000である。
(2)細胞:実施例1と同じものを用いた。
(3)培地及びグルコース溶液 培地はインシュリン,トランスフェリンの添加量はそれ
ぞれ1.8mg/l,2mg/lとしそれ以外の組成は実施例1
に同じものを用いた。グルコース溶液は実施例1に同じ
ものを用いた。
(4)培養方法および結果 おらかじめオートクレーブ滅菌した前記培養槽に正味培
養容積が約200mlになるように培養液は送入して、グル
コース溶液6.7mlををさらに追加して細胞を播種した。
培養槽の温度,溶存酸素コントロール,攪拌速度は実施
例1に同じである。
播種後2日間は回分培養を行った。3日目から灌流を開
始し表2に示すように培養開始後4日目に細胞密度は1.
1×106個/mlに達し、培地とグルコース溶液の送入比は
24:1とした。灌流の尺度として正味培養容積の1日当
り置換率として表わし実験結果を併記する。すなわちポ
ンプP−I,P−II,P−IIIを駆動しバルブXを開,
パルブYを閉として、培養槽内で細胞と分離された培養
液をラインDから抜きとり、その量と同じ量の新培地を
ラインAから連続的に送入した。限外過装置AP−2
には分子量分画10000の限外過膜がセットされてお
り、ラインFからは膜を通過した液を、またラインEか
らは膜を通過しなかった液を系外に取出した。時間の経
過とともに細胞密度が上昇し、7日には2.9×106個/ml
に達した。この時点で図2においてバルブXを閉じバル
ブYを開き限外過膜を通過しなかった液はラインGを
通して培養槽に循環した。またこの時点から8時間に1
回培養槽からサンプリングを行ってグルコース濃度を測
定し、その濃度が1.5mmol/l以下になることを目標に送
入量を調節して培養を継続した。
かくして40日間培養を行った結果は表2の通りあっ
た。
比較例1 培養開始5日目以降の培養系中グルコース濃度が10〜
15mmol/lとなるようにする以外は実施例1と同
様にして培養を行った結果を表3に示す。
比較例2 播種した細胞数を1×106個とし培養開始時より培養系
中グルコース濃度を1〜3mmol/lとし、培養開始直後か
ら培地送入速度240ml/dayで灌流する以外は、実施例1
と同様にして培養した結果を表4に示す。
(e)発明の効果 従って、本発明方法によれば動物細胞の高密度培養方法
において培地コストの低減が可能となり、得られた目的
物質の分離,精製が行いやすくなり、より効率的に培養
を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図1および図2はそれぞれ本発明の培養方法を実施する
工程の概略図を示したものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:91)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】動物細胞を生細胞密度3×106cells/ml以
    上で灌流培養するにあたり、培養系におけるグリコース
    濃度を0.01mmol/l以上3mmol/l以下に維持して培養する
    ことを特徴とする培養方法。
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US5705364A (en) 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
DE10255508A1 (de) 2002-11-27 2004-06-17 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Kultivierung von Zellen zur Produktion von Substanzen
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CA2913687C (en) 2013-07-04 2022-12-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Interference-suppressed immunoassay to detect anti-drug antibodies in serum samples
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