ES2556454T3 - Proceso para producción de proteínas - Google Patents

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ES2556454T3 ES11764561.4T ES11764561T ES2556454T3 ES 2556454 T3 ES2556454 T3 ES 2556454T3 ES 11764561 T ES11764561 T ES 11764561T ES 2556454 T3 ES2556454 T3 ES 2556454T3
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Abstract

Un proceso para la producción de una proteína de la hemostasia por cultivo en perfusión continua de un cultivo de células, en suspensión, expresando dicho cultivo de células dicha proteína de la hemostasia en dicha suspensión de cultivo, en donde el cultivo de células fluye a través de un módulo de filtro, módulo de filtro que conduce a una puerta de cosecha, teniendo el módulo de filtro un tamaño de malla de 0,1 a 2,9 μm que permite el paso a su través de la proteína de la hemostasia, en donde el flujo a través del módulo de filtro es un flujo alternativo tangencial, la proteína de hemostasia es Factor IX, y el proceso se realiza en fermentaciones en gran escala, es decir al menos 500 L.

Description

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DESCRIPCION
Proceso para produccion de protemas CAMPO TECNICO DE LA INVENClON
La presente invencion se refiere a un proceso para la produccion de una protema de la hemostasia por cultivo en perfusion continua de un cultivo de celulas en suspension, expresando dicho cultivo de celulas dicha protema de la hemostasia en dicha suspension de cultivo, en donde el cultivo de celulas fluye a traves de un modulo de filtro, modulo de filtro que conduce a una puerta de cosecha, teniendo el modulo de filtro un tamano de malla de 0,1 a 2,9 pm que permite el paso a su traves de la protema de la hemostasia y en donde el flujo a traves del modulo de filtro es un flujo alternativo tangencial. La invencion se refiere tambien a una protema producida por el proceso de la invencion.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Las protemas de la hemostasia son componentes de la cascada de coagulacion. Las deficiencias en una cualquiera de estas protemas comprenden desde complicaciones de la salud a complicaciones amenazantes para la vida. Las deficiencias de estas protemas se remediaban inicialmente por suministro de protemas de la hemostasia procedentes de fuentes animales.
Tfpicamente, las protemas recombinantes de la hemostasia se han producido por un proceso de fermentacion continua en perfusion o un proceso de fermentacion por lotes repetida. Estos procesos de fermentacion proporcionan productos de alta calidad. Sin embargo, existe una necesidad continuada de proporcionar procesos que produzcan una mayor cantidad de producto, sin disminucion de los estandares de calidad. La presente mision proporciona un proceso de este tipo.
SUMARIO DE LA INVENCION
De acuerdo con lo anterior, el primer aspecto de la invencion proporciona un proceso para la produccion de una protema de la hemostasia por cultivo en perfusion continua de un cultivo de celulas en suspension, expresando dicho cultivo de celulas dicha protema de la hemostasia en dicha suspension de cultivo, fluyendo el cultivo de celulas a traves de un modulo de filtro, modulo de filtro que conduce a una puerta de cosecha, teniendo el modulo de filtro un tamano de malla de 0,1 a 2,9 pm que permite el paso a su traves de la protema de la hemostasia y en el cual el flujo a traves del modulo de filtro es un flujo alternativo tangencial. El tamano de la malla contenida en el interior del modulo de filtro permite el paso a traves del modulo de filtro de la protema de la hemostasia, pero no de las celulas o residuos celulares.
El proceso del primer aspecto de la invencion permite la produccion de protemas de la hemostasia de alta calidad con tttulos significativamente mayores que los procesos utilizados con anterioridad.
Adicionalmente, las ventajas del mayor tttulo, sin poner en compromiso el crecimiento, la productividad y la calidad del producto se obtienen desde fermentaciones a escala de laboratorio (alrededor de 5 L) hasta fermentaciones en gran escala (al menos 500 L). La presente invencion hace posible la produccion de las protemas deseadas en cantidad hasta diez veces mayor que los procesos de la tecnica anterior, sin comprometer la calidad del producto.
La presente invencion hace posible un control cuidadoso de los parametros de proceso, haciendo factible la realizacion del proceso con una determinada densidad de celulas a fin de proporcionar un producto de alta calidad con altas concentraciones dentro de las caractensticas ffsicas del biorreactor.
descripciOn de los dibujos
Figura 1: Concentracion de celulas vivas y viabilidad para Factor IX a escala de laboratorio y escala de planta piloto (>500 L) utilizando ATF realizado con extraccion.
Figura 2: Comparacion de rendimientos en gran escala (>500 L) entre procesos previos ("proceso semicontinuo") con el proceso ATF para Factor IX (en una escala relativa).
Figura 3: Concentracion de celulas vivas y viabilidad para linajes de celulas de Factor IX en escala de laboratorio utilizando ATF realizado sin extraccion.
Figura 4: Concentracion de celulas vivas y viabilidad para Factor VIII a escala de laboratorio utilizando ATF. Figura 5: Concentracion de celulas vivas y viabilidad para Factor VII a escala de laboratorio utilizando ATF.
descripciOn detallada de la invenciOn
En el proceso de la invencion, la protema de la hemostasia es preferiblemente una de Factor VII (FVII), Factor VIII FVIII) o Factor IX (FIX). Existen en la tecnica numerosos documentos que describen la produccion de las protemas
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de la hemostasia, tales como FVII, FVIII y FIX. Los linajes de celulas, el cultivo de celulas y las tecnologfas de produccion de protemas son bien conocidos y se describen en documentos tales como US 2006/0166.915 y WO 2004/000366 para FVII, US 2009/0130060 y WO 2006/018.204 para FVII y FIX, WO 2009/130198 y US 4.770.999 para FIX y US 20100120094, WO 97/43436, WO 88/08035, WO 87/04187, WO 90/02175, US 20050227913 y EP 1707634 para FVIII. Todos estos documentos describen los principios bien conocidos de la produccion de protemas de la hemostasia, cuyos pasos de proceso pueden utilizarse conforme a la presente invencion. Para producir las protemas recombinantemente conforme a la invencion, se utiliza un linaje de celulas que expresa la protema (en condiciones apropiadas) mientras se encuentra en cultivo. Tales linajes de celulas (con acido nucleico recombinante que codifica una protema de la hemostasia tal como FVII, FVIII o XIX) son conocidos la tecnica, tales como celulas de Rinon de Cna de Hamster (BHK), celulas humanas, con inclusion de celulas humanas inmortalizadas (v.g. celulas PER.C6), y celulas de rata y raton. Conforme a la presente invencion, el cultivo de celulas es preferiblemente un cultivo de un linaje de celulas de ovario de hamster chino (CHO), que expresa la protema de la hemostasia de interes en cultivo. Mas preferiblemente, el cultivo es el linaje de celulas CHO-KI.
El cultivo de celulas esta presente en suspension. Ejemplos de medio util para dicho cultivo y para la produccion recombinante de la protema de interes son bien conocidos. Ejemplos adecuados pueden encontrarse en la tecnica anterior, con inclusion de los archivos de patente descritos anteriormente y en la seccion de ejemplos de este documento.
La presente invencion es un proceso continuo en perfusion para cultivar celulas. El termino proceso en perfusion para cultivar celulas tiene el significado convencional en la tecnica, lo que significa que, durante el cultivo, las celulas estan retenidas por un dispositivo de separacion; existe un flujo de salida de lfquido (del cultivo) que tiene una densidad de celulas menor que antes de la separacion, existiendo tambien un flujo de entrada (en el cultivo) del medio de cultivo de celulas. La presente invencion se refiere a la produccion de una protema deseada. El lfquido clarificado recogido del proceso tiene una concentracion de la protema deseada comprendida en el mismo intervalo que lo hace el cultivo de celulas. En la presente invencion es preferible que al menos un componente del medio de cultivo de celulas se anada continuamente. Otros componentes del medio pueden anadirse de manera continua, semicontinua o de otro modo.
El dispositivo de separacion conforme la presente invencion es un modulo de filtro. El modulo de filtro es preferiblemente un filtro de fibra hueca en forma de una membrana tubular. Filtros/membranas de este tipo son conocidos comunmente en la tecnica, y pueden obtenerse, por ejemplo, de General Electric (anteriormente Amersham). El filtro se selecciona de tal manera que el tamano de malla es de 0,1 a 2,9 pm. Esta es una caractenstica importante de la invencion, dado que dicho tamano de malla se selecciona para evitar, en la mayor medida posible, que los restos celulares pasen a traves del filtro. Filtros preferidos para uso conforme a la invencion incluyen los fabricados a partir de mezclas PS (polisulfona) o PES (polietersulfona).
El flujo alternativo tangencial (ATF) se ha descrito desde hace tanto tiempo como el ano 2000. Un sistema ATF esta compuesto generalmente por un diafragma ademas del filtro (como se ha descrito arriba), filtro que puede estar conectado con cualquier tipo de biorreactor (acero inoxidable, vidrio, un biorreactor de un solo uso, etc.). Por cambio del tamano de poro del filtro, el producto obtenido puede, o bien someterse a aumento de concentracion en el biorreactor o retirarse continuamente. ATF significa que se esta produciendo flujo alternativo tangencial en el modulo de filtro, es decir, que existe un solo flujo en la misma direccion (es decir, tangencial), en cuanto a las superficies de membrana del modulo de filtro y que existe otro flujo en una direccion sustancialmente perpendicular a dicha superficie del filtro. El flujo tangencial puede obtenerse por metodos conocidos en la tecnica, tal como se describen en la patente US numero 6.544.424.
El biorreactor preferido es un biorreactor agitado clasico provisto de una puerta de extraccion, una puerta ATF (puerta de cosecha), una puerta intermedia, una puerta de base, puertas de gas y puertas adicionales para otras adiciones.
Con anterioridad no se ha crefdo que pueda util utilizarse ATF en un proceso para producir protemas de la hemostasia que tengan cualidades similares a las producidas en otros procesos (cualidades tales como, por ejemplo, perfil GLA o forma activada o perfil de glicol o cadena pesada), como material producido utilizando otros procesos que tengan un rendimiento significativamente menor, por ejemplo niveles de produccion diaria o volumetrica o concentracion de producto a granel.
Los parametros del sistema son generalmente los descritos en la tecnica. En principio, el pH, la temperatura, la concentracion de oxfgeno disuelto y la osmolaridad del medio de cultivo de las no son cnticos y dependen de la celula seleccionada y del producto a producir. Los parametros pueden modificarse para maximizar la calidad y cantidad de producto. Usualmente se requiere una compensacion. Conforme a la presente invencion, la velocidad en perfusion es preferiblemente de 0,7 a 10 volumenes por dfa, mas preferiblemente de 0,9 a 4 volumenes por dfa.
El proceso puede "sangrarse" para eliminar la suspension de cultivo de celulas sin filtrar a fin de compensar el volumen de lfquido recogido y el volumen de lfquido anadido al cultivo. Esta velocidad de extraccion puede modificarse. El lfquido sin filtrar se retira preferiblemente del proceso a una velocidad de 0 a 0,2 volumenes por dfa (volumen total del proceso). La suspension de cultivo de celulas sin filtrar puede retirarse continuamente del proceso
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(extraccion continua). Alternativamente, la suspension de cultivo de celulas sin filtrar puede retirarse del proceso discontinuamente (extraccion pulsada). Con respecto al Factor IX, una velocidad de extraccion preferida es 0,01 a 0,2) volumenes por d^a (volumen total del proceso). Esta extraccion se aplica durante la fase de produccion a fin de mantener una viabilidad celular alta como por ejemplo, superior a 80 %".
La protema de hemostasia deseada se recoge del sistema por la puerta de cosecha. Muy preferiblemente, la misma se purifica en procesamiento aguas abajo. Pueden combinarse varios pasos de procesamiento aguas abajo. El procesamiento aguas abajo tfpico de las protemas de la invencion se describe en la tecnica, tal como en los registros de patente de la tecnica anterior a que se ha hecho referencia anteriormente. En el proceso de la invencion, el lfquido que pasa a traves del modulo de filtro contiene la protema deseada que se separa de las celulas y residuos celulares en cultivo de suspension por el paso a traves del filtro. El lfquido es una suspension filtrada y clarificada que contiene la protema de la hemostasia producida. La suspension filtrada se recoge preferiblemente a una velocidad de 0,7 a 10 volumenes por dfa (volumen total del proceso), con preferencia 0,7 a 1,0, o 0,8 a 1,4, o 1,0 a 1,2 volumenes por dfa.
La productividad del proceso depende en cierto grado de los parametros del proceso, dependiendo por otra parte de la exposicion de la protema de la hemostasia a los clones de celulas. El beneficio de la presente invencion es la mayor produccion comparada con la produccion en un proceso distinto de ATF que utilice el mismo clon de celulas.
La viabilidad celular al comienzo y durante el proceso debena ser mayor que 80 %, preferiblemente mayor que 90 %. La viabilidad celular debena medirse durante el proceso y ajustarse a las condiciones como en todos los cultivos si la viabilidad celular desciende por debajo del nivel deseado.
La densidad celular variara. Un inoculo adecuado esta comprendido en el intervalo de 3-6 * 105 celulas/ml.
La densidad de las celulas diana en el cultivo es inferior a 80 * 106 celulas/ml. Una densidad mayor de celulas produce una cantidad y/o calidad menor de producto. En una realizacion preferida para FIX, la densidad de celulas en el cultivo es inferior a 8 * 106 celulas/ml.
La temperatura de la suspension se mantiene preferiblemente alrededor de 35,5 a 37,5 °C, muy preferiblemente alrededor de 36,5 °C. El pH de la suspension se mantiene preferiblemente alrededor de 6,95 ± 0,45.
La concentracion de oxfgeno disuelto en la suspension es importante. Preferiblemente, la misma es alrededor de 20 a 120%, con preferencia alrededor de 30 a 70%, con mas preferencia alrededor de 45 a 55%, y con mas preferencia alrededor de 50%. La aireacion puede realizarse por cualquier medio. Medios tfpicos y preferidos incluyen aireacion utilizando una mixtura de aire y oxfgeno, preferiblemente 100% de oxfgeno a traves de un borboteador, en condiciones de entrada de aire constante en el espacio de cabezas.
En particular, la presente invencion se refiere a un proceso como se indica en la reivindicacion 1, para la produccion de protema Factor VII o Factor VIII o Factor IX.
Un segundo aspecto de la invencion proporciona una protema FVII, FVIII o FIX producida por un proceso conforme al primer aspecto de la invencion. Todas las caractensticas preferidas del primer aspecto son aplicables tambien al segundo aspecto.
La calidad de la protema puede medirse conforme a criterios para dicha protema, dado que las protemas de la hemostasia son conocidas en la tecnica. La medida de la calidad de FVII y FIX se refiere usualmente al perfil GLA (Gla 10 a 12). La medida de la calidad de FVIII se refiere usualmente a las reivindicaciones pesada y ligera combinadas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
El Ejemplo 1 describe el cultivo de la protema Factor IX, realizado utilizando el proceso de la invencion en un dispositivo en perfusion ATF en un biorreactor de 5 L (escala de laboratorio). El cultivo se realizo utilizando un dispositivo en perfusion ATF. El cultivo dio como resultado densidad de celulas, viabilidad y rendimiento de producto estables. El intervalo de extraccion variaba desde cero a 20 %.
Por lo que respecta a la calidad del producto, el FIX activado ("FIXa") se mantiene estable y bajo en el proceso. El perfil de GLA (dominio de acido gamma-carboxiglutamico de FIX rico en acido glutamico) con relacion a GLA 11 & 12 disminma ligeramente desde 90-95 % a 80-85% a medida que aumenta la concentracion de FIX. El rendimiento de FIX alcanzado es alrededor de 10 veces mayor que en el proceso corriente de la tecnica anterior (no ATF) utilizado sin poner en compromiso la calidad del producto.
Detalles de la cepa
El tipo de celula es una cepa CHO-K1 que expresa FIX.
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Medio:
El medio utilizado era un medio comercial que soportaba el crecimiento y la produccion de las celulas y el producto. Dicho medio esta reforzado usualmente con insulina, vitamina K1, glutamina y glucosa.
Resumen del proceso
Se siguio un proceso para cultivo de FIX a fin de ajustar el proceso ATF conforme a la invencion. El proceso implicaba descongelacion de un vial de banco de celulas y transferencia de las celulas a matraces en forma de T o matraces de sacudidas con baja agitacion (<30 revoluciones por minuto). La expansion de las celulas se realizo en matraces de sacudidas hasta que se produjeron celulas suficientes a fin de inocular un biorreactor de 5 L. En todos los pasos del proceso las celulas se cultivan en suspension en medio exento de suero. En el biorreactor, el cultivo se realizo en modalidad de lotes durante los 2 o 3 primeros dfas. Cuando se cumplieron los criterios para inicio de la perfusion, pulso y recogida, se suministro el medio continuamente. Se anadieron glutamina y glucosa por bolus o continuamente (en caso necesario). La recogida se clarifico de GMO por centrifugacion y/o filtracion y se transfirio a la recuperacion primaria.
Parametros del biorreactor - Preparacion y test de 5 L Biostat B plus
El electrodo de pH se calibro con tampones 4,0 y 7,4 y se comprobo con tampon 7,0 antes de ensamblar el tanque. El tanque se esterilizo con PBS (9,6 g/l, que se intercambio mas tarde con medio. El electrodo de oxfgeno se calibro con nitrogeno (0%) y aire (100%) en la solucion de PBS.
El electrodo de pH se recalibro eventualmente para medidas de pH externas. El tanque, las tubenas y los filtros se testaron respecto a fugas.
Condiciones operativas del proceso
Los puntos de ajuste de los parametros del proceso se ajustaron como se especifica en la Tabla 1 a continuacion. Tabla 1: Condiciones operativas del proceso para 5 L Biostat B plus
Parametro
Unidades Punto de ajuste
Temperatura
°C 34-38)
pH
6,7-7,5
DOT (tension de oxfgeno disuelto)
% de saturacion del aire 10-90
Velocidad de agitacion
rpm 100-150
Volumen de operacion
L 4
Base (carbonato de sodio para control del pH)
M 1-3
CO2 (espacio de cabezas)
NA A demanda
O2 o aire o mixture (borboteo)
% 0-100%
Inoculacion
La concentracion de celulas de siembra se direcciono en el intervalo de 3-6 x 105 celulas/ml). La base se conecto hasta 2 dfas despues de la inoculacion.
Fase de crecimiento
La perfusion y la extraccion se iniciaron cuando la concentracion de celulas alcanzo la fase de crecimiento experimental. La ratio de velocidades extraccion/recogida era 10/90 (%). La botella de recogida se cambio cada dfa durante el cultivo.
Se aplico una estrategia de extraccion por pulsos tan pronto como la concentracion de celulas era mayor que la concentracion de celulas diana (6 * 106 celulas/ml). Dependiendo de la concentracion de celulas, el tamano de la
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extraccion por pulsos se modifico desde cero a 20% del volumen de operacion del biorreactor.
La velocidad de recogida se mantuvo constante y se comprobo diariamente.
Recogida
El cultivo de celulas se recogio desde el tanque a un matraz con tapon azul. El cultivo se filtro en condiciones esteriles utilizando un filtro de 0,22 pm. Se transfirio aproximadamente 1 L de recogida a una bolsa esteril y se congelo.
Resultados
La concentracion de celulas se mantuvo estable a alrededor de 7-8 * 106 celulas/ml.
La viabilidad se mantuvo alrededor de 85% y 90% durante el cultivo. Ello dio como resultado un contenido de FIXa de aproximadamente 0,07%.
Por lo que respecta al perfil de GLA, GLA-11 y GLA-12 se mantuvieron por encima de 80%.
Se obtuvieron tambien alta productividad y producto estable con extraccion continua.
Ejemplo 2
El ejemplo 2 describe el cultivo de la protema Factor IX, realizado utilizando el proceso de invencion en un dispositivo en perfusion ATF en gran escala (> 500 L). El proceso en gran escala (Ejemplo 2) se realizo utilizando los mismos cepa, medio y pasos generales de proceso descritos anteriormente en el Ejemplo 1. Con respecto a los parametros de proceso (es decir parametros del biorreactor, condiciones operativas, etc.) estos fueron tambien similares a los descritos anteriormente en el Ejemplo 1.
Tabla 2: Datos de calidad del producto para Factor IX en escala de laboratorio y gran escala para el proceso anterior (“proceso semicontinuo”) y el proceso ATF
Biorreactor
Proceso GLA11+12 (%) FIXa (%)
Escala de laboratorio
Proceso semi-continuo 90 -0,03
Gran escala (>500L)
Proceso semi-continuo 90-93 0,02-0,06
Escala de laboratorio
ATF 80-90 0,06-0,13
Gran escala (>500L)
ATF 87-96 0,02-0,15
Resultados
La tabla 2 muestra que la calidad del Factor IX producido se mantiene utilizando el proceso ATF comparada con el proceso anterior (“proceso semicontinuo”). Sin embargo, el proceso ATF produce cantidad/rendimiento mucho mayores (como se muestra en la Figura 2).

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un proceso para la produccion de una protema de la hemostasia por cultivo en perfusion continua de un cultivo de celulas, en suspension, expresando dicho cultivo de celulas dicha protema de la hemostasia en dicha suspension de cultivo,
    5 en donde el cultivo de celulas fluye a traves de un modulo de filtro, modulo de filtro que conduce a una puerta de cosecha, teniendo el modulo de filtro un tamano de malla de 0,1 a 2,9 pm que permite el paso a su traves de la protema de la hemostasia,
    en donde el flujo a traves del modulo de filtro es un flujo alternativo tangencial, la protema de hemostasia es Factor IX, y el proceso se realiza en fermentaciones en gran escala, es decir al menos 500 L.
    10 2. El proceso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la velocidad en perfusion
    es 0,7 a 10 volumenes por dfa.
  2. 3. El proceso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el que la suspension de cultivo de celulas sin filtrar se retira del proceso a una velocidad de 0 a 0, 5 volumenes por dfa.
  3. 4. El proceso conforme a la reivindicacion 1, en el que la suspension de cultivo de celulas sin filtrar se retira de 15 proceso a una velocidad de 0,01 a 0,2 volumenes por dfa.
  4. 5. El proceso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la suspension de cultivo de celulas sin filtrar se retira continua o discontinuamente del proceso.
  5. 6. El proceso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la concentracion de celulas se mantiene por debajo de 80 * 106 celulas/ml, preferente por debajo de 50 x 106 celulas/ml.
    20
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110172405A (zh) * 2012-08-20 2019-08-27 泰尔茂比司特公司 浓缩穿过细胞生长腔室循环的流体的组分
EA201690684A1 (ru) 2013-09-30 2016-09-30 Круселл Холланд Б.В. Способ осветления выросшей клеточной массы неочищенной культуры клеток с высокой плотностью клеток
JP6530171B2 (ja) * 2014-09-09 2019-06-12 旭化成メディカル株式会社 培養産生物の回収方法
WO2018022661A1 (en) * 2016-07-25 2018-02-01 Repligen Corporation Alternating tangential flow rapid harvesting
JP7057423B2 (ja) * 2017-10-26 2022-04-19 レプリゲン・コーポレイション 微小交互接線流灌流フィルタ、処理容器およびその使用方法
AU2019262624A1 (en) * 2018-05-04 2021-01-07 Genzyme Corporation Perfusion bioreactor with filtration systems
CN108504562A (zh) * 2018-06-21 2018-09-07 江苏澳创生物科技有限公司 一种发酵生产l-苏氨酸的系统及其应用
JP2022540920A (ja) * 2019-07-16 2022-09-20 イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド 高密度連続接種の細胞培養方法及びその応用

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0218713B1 (en) 1985-04-22 1992-03-25 Genetics Institute, Inc. High yield production of active factor ix
DE3785102T2 (de) 1986-01-03 1993-07-22 Genetics Inst Verfahren zur herstellung von faktor-viii:c-typ-proteinen.
CA1331157C (en) 1987-04-06 1994-08-02 Randal J. Kaufman Method for producing factor viii:c-type proteins
US4956080A (en) * 1987-08-03 1990-09-11 Microlift Systems, Incorporated High pressure oxygen-saturated water treatment apparatus
JPH066054B2 (ja) 1987-10-15 1994-01-26 帝人株式会社 動物細胞の培養方法
JPH084495B2 (ja) 1988-08-19 1996-01-24 帝人株式会社 接着性動物細胞の培養方法
WO1990002175A1 (en) 1988-08-16 1990-03-08 Novo Nordisk A/S A method of producing polypeptides by culturing eukaryotic cells in the presence of protease inhibitors
US6268487B1 (en) * 1996-05-13 2001-07-31 Genzyme Transgenics Corporation Purification of biologically active peptides from milk
US5851800A (en) 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
AT409379B (de) * 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
US6544424B1 (en) 1999-12-03 2003-04-08 Refined Technology Company Fluid filtration system
DK1356073T3 (da) 2000-10-20 2010-04-06 Bioneer As Fermenteringsfremgangsmåde til fremstilling af heterologe genprodukter i mælkesyrebakterier
US6960657B2 (en) 2001-11-02 2005-11-01 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
ES2490590T3 (es) * 2001-11-02 2014-09-04 Novo Nordisk Health Care Ag Polipéptidos de factor VII de coagulación humana
EP1517710B1 (en) 2002-06-21 2011-03-30 Novo Nordisk Health Care AG Pegylated factor vii glycoforms
US7351688B2 (en) 2003-02-05 2008-04-01 The Research Foundation Of State University Of New York Compositions and methods for less immunogenic protein formulations
US20070065907A1 (en) 2003-05-01 2007-03-22 Dms Ip Assets B.V. Process for the production of biological substances by perfusion culturing of suspended animal cells
WO2004099396A1 (en) 2003-05-09 2004-11-18 Crucell Holland B.V. Cultures of e1-immortalized cells and processes for culturing the same to increase product yields therefrom
JP4740138B2 (ja) 2003-10-10 2011-08-03 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 真核生物細胞におけるポリペプチドの大規模生産方法及びそれに適した培養容器
AU2005229359C1 (en) * 2004-03-05 2011-07-28 Patheon Holdings I B.V. Process for cell culturing by continuous perfusion and alternating tangential flow
CN101006175A (zh) 2004-08-17 2007-07-25 Csl百灵有限公司 经修饰的维生素k依赖性多肽
EP1707634A1 (en) 2005-03-29 2006-10-04 Octapharma AG Method for isolation of recombinantly produced proteins
KR20090021339A (ko) 2006-04-21 2009-03-03 바이엘 헬스케어 엘엘씨 관류 배양을 위한 포유류 세포에서의 항-세포소멸성 유전자의 적용
ES2650042T3 (es) * 2006-07-14 2018-01-16 Patheon Holdings I B.V. Proceso mejorado para el cultivo de células
CN101490239A (zh) * 2006-07-14 2009-07-22 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 改进的细胞培养方法
EP1988101A1 (en) 2007-05-04 2008-11-05 Novo Nordisk A/S Improvement of factor VIII polypeptide titers in cell cultures
EP2014760A1 (en) 2007-06-13 2009-01-14 CMC Biopharmaceuticals A/S A method for producing a biopolymer (e.g. polypeptide) in a continuous fermentation process
JP2009045019A (ja) 2007-08-21 2009-03-05 Toray Ind Inc タンパク質の製造方法
EP2444491B1 (en) 2008-04-21 2016-11-16 Novo Nordisk Healthcare Ag Hyperglycosylated human coagulation factor IX
WO2010003759A2 (en) 2008-06-17 2010-01-14 Dsm Ip Assets B.V. Cell culturing method

Also Published As

Publication number Publication date
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