CN103773741B - 笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，其特点是将流感病毒流行株接种到Vero细胞无血清适应株，经过传代适应的毒种建立毒种库，保存于-70℃冰箱内，利用笼式通气搅拌生物反应器高密度微载体培养Vero细胞，接种流感病毒，流感病毒增殖高峰期时，连续收获病毒液，将收获的病毒液澄清、浓缩、纯化制备疫苗。本发明应用笼式通气搅拌生产反应器制备流感疫苗的方法解决了现有技术存在的问题，一旦流感大流行，可以马上投入生产，具有产量高、生产快速、起始材料易于控制、易于标准化等优点。

Description

笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种应用生物反应器高密度培养制备流感疫苗的方法，特别是涉及一种笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，属于生物技术领域。

背景技术

20世纪40年代，第一支流感病毒灭活疫苗在美国批准使用，但由于其制造工艺粗糙，接种后副反应极为严重。随后相继出现了减毒疫苗、裂解疫苗，DNA疫苗等。流感病毒属RNA病毒，分为甲、乙、丙3型。其中甲型及其亚型病毒是引起人类流感传播的主要型别，乙型病毒仅会引起局部小流行及散发，丙型主要侵犯婴幼儿造成散发病例。

目前，国内外大部分生产流感疫苗的企业主要是采用鸡胚作为流感病毒增殖基质进行流感疫苗生产，这种生产方式有很大的局限性：均存在对SPF鸡胚的依赖性，需要大量的鸡蛋，质量难于控制；方法难于标准化；存在外源病毒污染；生产用毒株需要特殊技术制备高产株；生产系统相对开放并涉及生物安全问题；原材料之间变异性大；需尽可能减少过敏性的卵清蛋白；生产规模难于扩大等。尤其是一旦大流行发生，很难在短期内选择出适应鸡胚生长的变异株，并且鸡胚的供应也是个问题。因此针对全球大流行的储备，许多国际机构都在研究新一代的细胞培养的流感疫苗。

全球最大的生物制药公司之一诺华(NYSE：NVS)在2007年6月13日宣布，欧盟已经批准其流感疫苗Optaflu上市。Optaflu是第一个由细胞培养而非鸡胚生产的疫苗，能够迅速扩大生产能力以应对大流行。Optaflu的上市标志着50年流感疫苗生产史最重大的创新之一。

诺华公司开发的Optaflu是世界上第一个由细胞培养产生的流感疫苗。该疫苗以MDCK狗肾上皮细胞产生，于2007年获得欧盟的批准。而在那时，市场上所有的流感疫苗是由鸡蛋制备而得。后者的制备工艺不但漫长而且死板，所以不能满足流感爆发的需求。为了提供更快更灵活的替代工艺，很多厂家都进行了替代工艺的研究。除了诺华以外，Baxter的Celvapan是另外一个被欧盟批准采用细胞培养制备的流感疫苗，该公司用Vero细胞非洲绿猴的肾上皮细胞模拟制备流感疫苗，获得成功。

国内流感疫苗生产企业，多是采用鸡胚生产流感疫苗。据报道有部分企业正在摸索改变流感疫苗的培养基质并能大规模生产的工艺技术。

公开号为CN1511587的中国发明专利申请给出了一种《Vero细胞流行性感冒纯化疫苗的制备方法及其应用》，在来源于非洲绿猴肾传代的Vero细胞上加入促病毒增殖因子后，分别感染流感甲₁、甲₃和乙型流感病毒，72小时后收集三型病毒，经冻融、切向流过滤去除细胞碎片澄清，超滤浓缩、β-丙内酯灭活、Sepharose4FF柱层析纯化，稀释三型病毒原液，再合并三型病毒液，加保护剂、防腐剂成半成品流感纯化疫苗，然后分装为成品以及对疫苗原液、半成品及成品的检测。这种生产方法采用了3L转瓶培养Vero细胞制备流感疫苗，虽然改变了培养基质，但操作程序繁杂，易污染，生产难以放大，成本高、批间差异大，质量难以控制等缺点。

公开号为CN101062411的中国发明专利申请给出了一种《应用生物反应器大规模生产流感疫苗的方法》，其特征在于：将流感当年流行毒株在Vero细胞上进行适应传代，经传代适应的病毒毒种保存于-70℃以下待用；在生物反应器中加入微载体，接种Vero细胞，待Vero细胞生长至一定密度时接种上述流感毒种，使病毒在合适的条件下大量增殖，将收获的病毒液经灭活、浓缩、纯化及裂解，根据纯化的单价原液的血凝素含量，配制成三价流感疫苗半成品。这种生产方法解决了采用鸡胚生产流感疫苗所存在的外源病毒污染难以控制、副反应大、成本高、生产规模不易扩大的缺点，但所采用的生物反应器为固定床篮式搅拌反应器，载体是片状载体，这种培养工艺在技术上存在一定的缺点。在培养面积上过于局限，每克片状微载体的面积可达1200cm²，不能很好的进行大规模的高密度培养。吊篮式片状微载体培养可放大到40L左右。不利于工业化大规模生产。

公开号为CN101979517A的中国发明专利申请给出了一种《利用生物反应器进行大规模生产流感病毒的方法》，包括如下步骤：1)细胞的接种和吸附培养：将哺乳动物细胞接种到潮汐式生物反应器载体罐(8)内的载体(9)上，进行细胞的吸附培养；2)在细胞的吸附培养结束后进行细胞的扩增培养；3)将流感病毒接种到扩增培养的细胞上，进行病毒的吸附培养；4)在病毒的吸附培养结束后进行病毒的增殖培养；和5)在病毒含量达峰值后，收获含有流感病毒的培养液，其中步骤1)至4)中的培养在潮汐培养条件下进行，所述潮汐培养条件是通过泵出或泵入载体罐(8)内的培养液以间歇性淹没与暴露载体实现的。这种培养工艺在技术上具有污染率低、操作简单、稳定性好等的优点，但接种不均匀，氧气供应不充分、营养物质传递不均匀，不利于细胞高密度培养。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的上述不足，公开了一种适合大规模生产的，能够产业化的利用生物反应器制备流感疫苗的方法-笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法。

本发明给出的技术方案是：这种笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，其特点是将流感病毒流行株接种到Vero细胞无血清适应株，经过传代适应的毒种建立毒种库，保存于-70℃冰箱内；利用笼式通气搅拌生物反应器高密度微载体培养Vero细胞，接种流感病毒，流感病毒增殖高峰期时，连续收获病毒液。将收获的病毒液澄清、浓缩、纯化制备疫苗。

为更好地实现本发明的目的，Vero细胞无血清适应传代有如下步骤：将低代次的Vero细胞用胰酶消化传代，加入无血清培养基，适应传代，用无血清培养基传5～8代，细胞形态及密度达到要求，建立无血清Vero细胞库。

为更好地实现本发明的目的，流感病毒流行株接种Vero细胞无血清适应株，适应传代有如下步骤：将流感病毒流行株接种至9～11日龄鸡胚传代，传至1～2代，接种Vero细胞无血清适应株。

为更好地实现本发明的目的，Vero细胞适应的流感毒种接种笼式通气搅拌生物反应器感染复数MOI为0.01～0.0000001。

为更好地完成本发明的目的，所述笼式通气搅拌生物反应器微载体高密度培养Vero细胞的步骤如下：

(1)取工作种子库Vero细胞，进行扩增传代达到生物反应器所需的细胞数量；

(2)细胞悬液与20g/L微载体混合，并通过连接装置，导入已处理完毕的生物反应器，调整Celligen参数，pH＝7.4、温度＝37℃、DO＝50、搅拌浆转数＝80转/分钟；

(3)反应器在上述条件下进行细胞培养，培养液为M199培养基和无血清培养基，培养5～6日，细胞密度达到1.0～1.5×10⁷/ml以上时感染病毒。

为更好地实现本发明的目的，Vero细胞接种笼式通气搅拌生物反应器接种、灌流有如下步骤：

将已丰满单层的Vero细胞15瓶，用胰酶消化后接种反应罐，培养基为M199培养基；

接种第2天2个体积进行灌流，培养基为M199培养基；

接种第3天4个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；

接种第4天4个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；

接种第5天4个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；

接种第6天3个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；

接种第7天感染病毒。

笼式通气搅拌生物反应器流感病毒培养，采取如下措施：

取流感工作种子批毒种，迅速融化；

根据反应器中的总细胞数，决定病毒接种量，感染复数MOI为0.01～0.0000001；

将确定量的病毒与适量的无血清培养基混匀，并按终浓度20ug/ml加入胰蛋白酶；

降低反应器温度至33℃，pH调至7.4；

接种细胞后的第7天感染病毒(胰酶终浓度为20ug/ml)，接种后吸附3小时后，灌流24小时开始连续收获，每天按一个罐体积收获，72小时停止收获。(灌流培养基中胰酶终浓度为5ug/ml)。

为更好地实现本发明的目的，生物反应器为美国NBS公司生产的笼式通气搅拌生物反应器，微载体为美国GE生产的Cytodex球状微载体，不限于Cytodex1微载体和Cytodex3微载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用笼式通气搅拌式生物反应器制备流感疫苗，通过笼式通气装置避免了通气时产生的气泡直接损伤细胞的问题。同时，在采用微载体系统培养微载体时，不会被通气所产生的泡沫裹挟在气液界面。采用400目的不锈钢丝网制成的笼式结构，微载体不会贴附在丝网的表面。由一个多孔的笼式通气装置可以满足培养时溶解氧的需要。本发明还采用了球状微载体，每克球状微载体面积可达4400cm²，在大规模细胞培养中，能达到较高的细胞密度，工艺可放大1000L的生物反应器。具有产量高、生产快速、起始材料易于控制、易于标准化等优点。不仅在技术提高了，而且克服了现有技术的缺点。一旦流感大流行，可以马上投入生产，并保证产量。

具体实施方式：

实施例1

Vero细胞无血清适应株建库方法如下：

从液氮罐中取出取Vero细胞后立即放入37℃水浴中，待冻存细胞融化后弃掉上清液，加2ml无血清细胞培养基制成细胞悬液。将细胞悬液全部加至F-150细胞培养瓶中，补加50ml无血清细胞培养基放入37℃细胞培养箱中培养。24小时后换液，继续培养5～7天。将细胞在倒置显微镜下观察。待细胞长至丰满单层时进行传代。将细胞培养液废弃，加入0.25％胰酶消化液消化，消化3～5分钟后将胰酶消化液废弃，加入细胞培养基制成细胞悬液。按1∶7比例分装至F-150细胞培养瓶中。置37℃细胞培养箱中培养。按上述方法传5～8代，细胞形态及密度达到要求，建立无血清Vero细胞库。

实施例2

流感病毒株适应Vero细胞的方法如下：

将流感病毒流行株按10倍系列稀释至10^-5，取稀释度10^-2～10-⁴接种至9～11日龄鸡胚进行传代，传1～2代。收获病毒液，做血凝滴度检测，血凝滴度≥1∶128以上，分装于冻存管内，置-70℃冻存，备用。将血凝滴度≥1∶128的毒种按10倍系列稀释，取稀释度为10^-4～10^-7接种Vero细胞无血清适应株。同时加入胰酶，胰酶终浓度为6ug/ml，病毒培养基为无血清培养基。置33℃二氧化碳培养箱内培养。分别于24、48小时后，补加胰酶，胰酶终浓度为5ug/ml，72小时分别按不同稀释度进行抽样，做血凝滴度检测，选择血凝滴度≥1∶128以上的稀释度，收获病毒液。按上述方法进行传代，传10～30代，血凝滴度≥1∶512以上，建立毒种库。

实施例3

微载体制备方法如下：

按20g/L浓度称量微载体，将微载体用PBS浸泡2～3小时，高压灭菌，用PBS液清洗微载体2～3次备用。

实施例4

生物反应器微载体高密度培养Vero细胞的方法如下：

从液氮罐中取Vero细胞后，立即放入37℃水浴中，待冻存细胞融化后弃掉上清液，加2mlM199-10％FBS细胞培养基制成细胞悬液。将细胞悬液全部加至F-150细胞培养瓶中，补加50mlM199-10％FBS细胞培养基。放入37℃细胞培养箱中培养，24小时后换液。培养6～7天，挑选镜下观察丰满单层细胞进行传代。传至转瓶。将细胞培养液废弃，加入0.25％胰酶消化液消化，消化3～5分钟后将胰酶消化液废弃，加入细胞培养基制成细胞悬液。将细胞悬液分装至转瓶中，置37℃培养。按上述方法传代2～3代，传代比例为1∶10。取12～15瓶丰满单层的细胞制备细胞悬液，加入已处理好的微载体，通过连接装置，导入已处理完毕的生物反应器。向生物反应器内补加细胞培养基至转子上方2cm处。培养基为M199-10％FBS，调整Celligen参数，pH＝7.4、温度＝37℃、DO＝50、搅拌浆转数＝80转/分钟。细胞接种后对生物反应器进行连续监控，24小时不流加培养基。24小时后(接种第2天)，开始流加细胞培养基，调整流加培养基的速度。接种第2天2个体积进行灌流，培养基为M199培养基；接种第3天4个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；接种第4天4个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；接种第5天4个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；接种第6天3个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；接种第7天感染病毒。培养基为M199培养基和无血清培养基，培养5～6日，细胞密度达到1.0～1.5×10⁷/ml以上时感染病毒。

实施例5

流感病毒适应株接种生物反应器方法如下：

当生物反应器中细胞培养7天，应用L-15培养基更换无血清培养基。并调整反应器温度为33℃。温度稳定3小时以上时，按MOI为0.01～0.0000001接种病毒。将确定量的病毒与适量的无血清培养基混匀，并按终浓度20ug/ml加入胰蛋白酶，接种反应器。接种后吸附3小时，灌流，24小时开始连续收获，每天按一个罐体积收获，72小时停止收获。(灌流培养基中胰酶终浓度为5ug/ml)。pH＝7.4、DO＝50、搅拌浆转数＝80转/分钟。将收获病毒液进行检测，备用。

将检测合格的病毒液按1∶4000的终浓度加入β-丙内酯，2～8℃搅拌灭活24小时，37℃水解2～3小时。经无菌操作合并，然后澄清，澄清后原液加入Benzonase消化DNA。消化后进行超滤浓缩。澄清系统采用0.65μm中空纤维滤柱及蠕动泵或离心，超滤膜采用750kDa的中空纤维进行浓缩，浓缩20倍左右。将浓缩后的液体经分子筛层析纯化，采用柱色谱的方法纯化。分子筛层析介质为Sepharose-4FF，经0.5MNaOH溶液清洗消毒系统，用pH7.4的无盐PBS平衡，层析上样量不超过柱体积的10％，层析首峰为特异性蛋白峰，即病毒峰。收集取样，即为原液。根据纯化后的单价原液的血凝素含量，按最终45ug/剂，配制半成品。

Claims (2)

1.一种笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，其特征在于：将低代次的Vero细胞用胰酶消化传代，加入无血清培养基，适应传代，用无血清培养基传5～8代，细胞形态及密度达到要求，建立无血清Vero细胞库；将流感病毒流行株接种到Vero细胞无血清适应株，经过适应传代的毒种建立毒种库，保存于－70℃冰箱内；利用笼式通气搅拌生物反应器高密度微载体培养Vero细胞，接种流感病毒，对流感病毒培养，流感病毒增殖高峰期时，连续收获病毒液；将收获的病毒液澄清、浓缩、纯化制备疫苗；其中：

流感病毒流行株接种Vero细胞无血清适应株及适应传代有如下步骤：将流感病毒流行株接种至9～11日龄鸡胚传代，传至1～2代，接种Vero细胞无血清适应株；

利用笼式通气搅拌生物反应器高密度微载体培养Vero细胞，其步骤如下：

（1）取工作种子库Vero细胞，进行扩增传代达到笼式通气搅拌生物反应器所需的细胞数量；

（2）细胞悬液与20g/L微载体混合，并通过连接装置，导入已处理完毕的笼式通气搅拌生物反应器，调整Celligen参数，pH＝7.4、温度＝37℃、DO＝50、搅拌浆转数＝80转/分钟；

（3）笼式通气搅拌生物反应器在上述条件下进行细胞培养，培养液为M199培养基和无血清培养基，培养5～6日，细胞密度达到1.0～1.5×10⁷个/ml以上时感染病毒；

在笼式通气搅拌生物反应器高密度微载体培养的Vero细胞上接种流感病毒，其步骤如下：

将已丰满单层的Vero细胞15瓶，用胰酶消化后接种笼式通气搅拌生物反应器，培养基为M199培养基；

接种第2天2个体积进行灌流，培养基为M199培养基；

接种第3天4个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；

接种第4天4个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；

接种第5天4个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；

接种第6天3个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；

接种第7天感染病毒；

在笼式通气搅拌生物反应器中对流感病毒培养，其步骤如下：

取流感工作种子批毒种，迅速融化；

根据笼式通气搅拌生物反应器中的总细胞数，决定病毒接种量，感染复数MOI为0.01～0.0000001；

将确定量的病毒与适量的无血清培养基混匀，并按终浓度20μg/ml加入胰蛋白酶；

降低反应器温度至33℃，pH调至7.4；

接种细胞后的第7天感染病毒，胰酶终浓度为20μg/ml，接种后吸附3小时后，灌流24小时开始连续收获，每天按一个罐体积收获，72小时停止收获，灌流培养基中胰酶终浓度为5μg/ml。

2.根据权利要求1所述的笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，其特征在于：笼式通气搅拌生物反应器为美国NBS公司生产的笼式通气搅拌生物反应器，微载体为美国GE生产的Cytodex球状微载体。