CN107723279B - 一种缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法 - Google Patents
一种缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种缺陷型腺病毒AdC68‑GP的培养方法,涉及病毒培养技术领域。其包括:将包装细胞接种至无血清培养基进行悬浮培养的细胞复苏步骤,以及根据细胞密度值即细胞密度1‑2×106cells/ml和细胞成活率即等于或大于90%进行的传代接毒培养步骤,该培养方法通过使用无血清培养基对包装细胞进行悬浮培养,一方面有利于工艺放大,另一方面,接种缺陷型腺病毒AdC68‑GP时,降低MOI值,MOI控制在0.0001~0.01的范围即可提高病毒扩增倍数,增加病毒产量。
Description
技术领域
本发明涉及病毒培养技术领域,具体而言,涉及一种缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法。
背景技术
缺陷型腺病毒AdC68-GP是以黑猩猩型腺病毒AdC68为基础经过改造后得到的能有效地诱导针对狂犬病毒的中和抗体,且对病毒感染可产生强大的抵抗力的腺病毒。
现有的培养缺陷型腺病毒AdC68-GP的方法存在的问题有工艺放大困难、培养过程中使用血清,不利于后期纯化,且血清质量不易控制,导致产品质量不易控制;接毒时MOI一般控制在0.1~10才能产生病变,接毒量大,且产毒不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,该培养方法的接毒量小,得到的缺陷型腺病毒AdC68-GP质量高,易于用于工艺放大。
本发明是这样实现的:
一种缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其包括:
细胞复苏步骤:将包装细胞接种至无血清培养基进行悬浮培养,所述包装细胞含有缺陷型腺病毒AdC68-GP缺失的E1区;
传代接毒培养步骤:当培养至细胞密度大于1×106cells/ml,且细胞活率等于或大于90%时,则进行传代培养,传代密度3~5× 105cells/ml;在传代培养的同时,接种缺陷型腺病毒AdC68-GP,控制MOI为0.0001~0.01。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,控制MOI为 0.0001~0.0095。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,控制MOI为 0.0001~0.008。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,控制MOI为 0.0008~0.004。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,控制MOI为 0.0014~0.0028。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,在传代培养步骤中,传代培养的培养条件为:温度36-38℃、7-9%CO2、转速110-150rpm。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,在传代培养步骤中,离心处理的条件为转速800-1200rpm、时间4-8min。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,在细胞复苏步骤中,悬浮培养的培养条件为:温度36-38℃、7-9%CO2、转速110-150rpm。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,在细胞复苏步骤中,所述包装细胞为人胚肾293悬浮细胞。
生产腺病毒的包装细胞主要为人胚肾293细胞(HEK293),它包含有腺病毒缺失的E1区,用于E1区缺失腺病毒生产的包装细胞, HEK293细胞属于贴壁细胞系,贴壁培养最普遍的方式是培养瓶和T 形瓶等,其结构和操作简单,投入少,但单位体积能提供细胞生长的表面积小,不能满足大规模生产。
近年来发展了中空纤维生物反应器,该装置内部管壁为半透性多孔膜,气体等小分子可以自由透过膜双向扩散,而大分子有机物不能透过,细胞贴附在中空纤维管外壁生长,可方便地获取营养物质和溶氧。生物反应器中的微载体以及固化床对于培养贴壁细胞效果也较好。这些系统适合分泌蛋白的生产,但从细胞中释放出腺病毒可能会有些困难。人们可以选择收集细胞后采用化学裂解或者等细胞完全裂解后将病毒释放到培养基中再收集,但如果没有建立起有效的下游分离纯化程序,这种方法并不适用且不能有效放大。通常情况下贴壁 293细胞接种密度在1~1.5×104cells/cm2,细胞密到105cells/cm2以后进行病毒感染,微载体提供了较大的表面积而且适合贴壁细胞培养。 Keegan等评价了293细胞用微载体培养的情况,他们得出结论 Cytodex-3优于其它微载体,但是人们认为293细胞贴附微载体的能力较低。
对于商业化生产而言,悬浮细胞系更适应大规模生产,而且悬浮培养的细胞一般可以在无血清培养体系中培养,不添加任何其它动物来源的添加剂,这样就有利于分离纯化。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,在细胞复苏步骤中,所述培养基为293无血清培养基。
本发明具有以下有益效果:
本发明提供的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其包括:将包装细胞接种至无血清培养基进行悬浮培养的细胞复苏步骤,以及根据细胞密度值即细胞密度1-2×106cells/ml和细胞成活率即等于或大于90%进行传代接毒培养步骤,该培养方法通过使用无血清培养基对包装细胞进行悬浮培养,一方面有利于工艺放大,另一方面,接种缺陷型腺病毒AdC68-GP时,降低MOI值,MOI控制在0.0001~0.01 的范围即可提高病毒扩增倍数,增加病毒产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中的人胚肾293悬浮细胞感染缺陷型腺病毒AdC68-GP后的病变结果;
图2为本发明实施例1中的人胚肾293贴壁细胞感染缺陷型腺病毒AdC68-GP后的病变结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其包括如下步骤:
1细胞复苏:
从细胞库中取出1支人胚肾293悬浮细胞(购自Thermofisher),转移至37℃恒温水浴锅中快速解冻(约2分钟),完全解冻后将293 悬浮细胞(1×107cells,1ml)转移到已加入29ml EX-CELLTM293无血清培养基(购自sigma)的125ml摇瓶中,混匀并取样计数,置于 37℃、8%CO2以及转速130rpm条件下悬浮培养。
2传代培养和接毒:
培养2~3天,悬浮培养至细胞密度等于1.1×106cells/ml,且细胞活率90%,进行传代接毒培养,传代密度3×105cells/ml;同时以MOI 值为0.0001的比例接种缺陷型腺病毒AdC68-GP(该病毒可通过申请号为201310362921.8、名称为一种新型狂犬病疫苗及其制备方法的中国专利的方法制备得到);
当培养至细胞密度低于1×106cells/ml进行传代接毒时,需要更换培养基才能获得高的病毒产率;此外,如果感染时细胞密度高于 2×106cells/ml,感染时以及感染后24小时分别需要更换培养基,操作繁琐,且病毒产率低。
本实施例中,在生长至1-2×106cells/ml的密度范围时进行传代,以及在3~5×105cells/ml密度条件下(细胞活率大于90%)接种病毒,可以使得病毒产率高。
而低MOI值接毒是让病毒和细胞能同时生长,根据细胞和病毒生长周期的时间差,在培养中,当细胞密度到达最高值时,病毒也能生长至能感染所有细胞的量,此方法充分利用了有限的营养物质,有效地提高病毒产量。
传代后,置于37℃、8%CO2以及转速130rpm条件下悬浮培养,培养72h收获病毒液,冻融3次后检测其OD260。
3结果,见图1。
如图1所示(图中:A代表正常的293悬浮细胞,B代表感染缺陷型腺病毒AdC68-GP的293悬浮细胞,病毒量为106~107vp/ml),采用293悬浮细胞和无血清培养基进行培养,只需要少量的病毒,培养后便能产生明显病变(病毒量为106~107vp/ml),收获的病毒液的量为1010~1011vp/ml。
4对照实验
细胞传代培养方法:从液氮罐中取出细胞管置37℃水浴中迅速解冻,将细胞移入装有9ml无血清培养基的离心管中,1000rpm离心 4min。用10%新生牛血清DMEM培养基重悬细胞,37℃、8%CO2 培养,当覆盖率达到80%时用胰酶消化细胞,按1∶3~1∶4传代培养。
接毒方法:一般细胞生长至汇合度80%(1∶3传代生长48h、1∶ 4传代生长72h),弃去细胞液,按MOI=0.1的量接种缺陷型腺病毒 AdC68-GP,于37℃、8%CO2条件下培养,培养48h左右收获病毒液。
培养期间,观察接种缺陷型腺病毒AdC68-GP后的细胞病变情况,以及对收获的病毒液检测其OD260,结果如图2所示(图中:blank 代表正常的293贴壁细胞;A代表感染缺陷型腺病毒AdC68-GP的 293贴壁细胞,病毒量为108vp/ml;B代表感染缺陷型腺病毒 AdC68-GP的293贴壁细胞,病毒量为1010vp/ml)。
感染24h后,在HEK293细胞中出现噬斑,病毒量为108vp/ml (图2-A);病毒量为1010vp/ml时才能全部病变(图2-B)。
在48h左右收获病毒液,量为109~1010vp/ml。
综上结果,相较于贴壁培养,本实施例提供的缺陷型腺病毒 AdC68-GP的培养方法采用293悬浮细胞和无血清培养进行培养可在减少接毒时的MOI值的情况下,能够提高病毒产量。
实施例2
本实施例提供的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其包括如下步骤:
1细胞复苏:
从细胞库中取出1支人胚肾293悬浮细胞,转移至37℃恒温水浴锅中快速解冻(约2分钟),完全解冻后将293悬浮细胞转移到已加入29ml EX-CELLTM293无血清培养基的125ml摇瓶中,混匀并取样计数,置于36℃、7%CO2、150rpm摇床培养。
2传代培养和接毒:
培养2~3天,悬浮培养至细胞密度等于1.4×106cells/ml,且细胞活率98%,进行传代接毒培养,传代密度3.5×105cells/ml;同时以 MOI值为0.0008的比例接种缺陷型腺病毒AdC68-GP;
传代后置于38℃、8%CO2、120rpm摇床培养。培养72h-96h收获病毒液。
效果同实施例1。
实施例3
本实施例提供的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其包括如下步骤:
1细胞复苏:
从细胞库中取出1支人胚肾293悬浮细胞,转移至37℃恒温水浴锅中快速解冻(约2分钟),完全解冻后将293悬浮细胞转移到已加入29ml EX-CELLTM293无血清培养基的125ml摇瓶中,混匀并取样计数,置于38℃、9%CO2、110rpm摇床培养。
2传代培养和接毒:
培养2~3天,悬浮培养至细胞密度等于1.8×106cells/ml,且细胞活率94%,进行传代接毒培养,传代密度4×105cells/ml;同时以MOI 值为0.0014的比例接种缺陷型腺病毒AdC68-GP;
传代后置于37℃、8%CO2、130rpm摇床培养。培养72h-96h收获病毒液。
效果同实施例1。
实施例4
本实施例提供的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其包括如下步骤:
1细胞复苏:
从细胞库中取出1支人胚肾293悬浮细胞,转移至37℃恒温水浴锅中快速解冻(约2分钟),完全解冻后将293悬浮细胞转移到已加入29ml EX-CELLTM293无血清培养基的125ml摇瓶中,混匀并取样计数,置于37℃、8%CO2、150rpm摇床培养。
2传代培养和接毒:
培养2~3天,悬浮培养至细胞密度等于1.6×106cells/ml,且细胞活率等于91%,进行传代接毒培养,传代密度4.8×105cells/ml;同时以MOI值为0.0028的比例接种缺陷型腺病毒AdC68-GP;
传代后置于36℃、8%CO2、150rpm摇床培养。培养72h-96h收获病毒液。
效果同实施例1。
实施例5
本实施例提供的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其包括如下步骤:
1细胞复苏:
从细胞库中取出1支人胚肾293悬浮细胞,转移至37℃恒温水浴锅中快速解冻(约2分钟),完全解冻后将293悬浮细胞转移到已加入29ml EX-CELLTM293无血清培养基的125ml摇瓶中,混匀并取样计数,置于37℃、8%CO2、120rpm摇床培养。
2传代培养和接毒:
培养2~3天,悬浮培养至细胞密度等于1×106cells/ml,且细胞活率95%,进行传代接毒培养,传代密度3.2×105cells/ml;同时以 MOI值为0.008的比例接种缺陷型腺病毒AdC68-GP;
传代后置于37℃、8%CO2、120rpm摇床培养。培养72h-96h收获病毒液。
效果同实施例1。
实施例6
本实施例提供的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其包括如下步骤:
1细胞复苏:
从细胞库中取出1支人胚肾293悬浮细胞,转移至37℃恒温水浴锅中快速解冻(约2分钟),完全解冻后将293悬浮细胞转移到已加入29ml EX-CELLTM293无血清培养基的125ml摇瓶中,混匀并取样计数,置于37℃、8%CO2、120rpm摇床培养。
2传代培养和接毒:
培养2~3天,悬浮培养至细胞密度等于1.3×106cells/ml,且细胞活率92%,进行传代接毒培养,传代密度5×105cells/ml;同时以MOI 值为0.01的比例接种缺陷型腺病毒AdC68-GP;
传代后置于37℃、8%CO2、120rpm摇床培养。培养72h-96h收获病毒液。
效果同实施例1。
综上,该本发明实施例提供的培养方法通过使用无血清培养基对包装细胞即人胚肾293悬浮细胞进行悬浮培养,一方面有利于工艺放大,另一方面,接种缺陷型腺病毒AdC68-GP时,降低MOI值,MOI 控制在0.0001~0.01的范围即可提高病毒扩增倍数,增加病毒产量。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其特征在于,其包括:
细胞复苏步骤:将包装细胞接种至无血清培养基进行悬浮培养,所述包装细胞含有缺陷型腺病毒AdC68-GP缺失的E1区;
传代接毒培养步骤:当培养至细胞密度为1-2×106cells/ml,且细胞活率等于或大于90%时,则进行传代培养,传代密度3~5×105cells/ml;
在传代培养的同时,接种缺陷型腺病毒AdC68-GP,控制MOI为0.0001~0.01;
在细胞复苏步骤中,所述包装细胞为人胚肾293悬浮细胞。
2.根据权利要求1所述的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其特征在于,控制MOI为0.0001~0.0095。
3.根据权利要求2所述的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其特征在于,控制MOI为0.0001~0.008。
4.根据权利要求3所述的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其特征在于,控制MOI为0.0008~0.004。
5.根据权利要求4所述的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其特征在于,控制MOI为0.0014~0.0028。
6.根据权利要求1-5任一项所述的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其特征在于,在传代培养步骤中,传代培养的培养条件为:温度36-38℃、7-9%CO2、转速110-150rpm。
7.根据权利要求1-5任一项所述的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其特征在于,在传代培养步骤中,离心处理的条件为转速800-1200 rpm、时间4-8min。
8.根据权利要求1-5任一项所述的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其特征在于,在细胞复苏步骤中,悬浮培养的培养条件为:温度36-38℃、7-9%CO2、转速110-150rpm。
9.根据权利要求1所述的缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法,其特征在于,在细胞复苏步骤中,所述培养基为293无血清培养基。
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