CN102002482B

CN102002482B - 猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法

Info

Publication number: CN102002482B
Application number: CN 201010577373
Authority: CN
Inventors: 徐宏军; 丁光星
Original assignee: CHENGDU TIANBANG BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Current assignee: Chengdu Shiji biopharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2010-12-08
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2030-12-08
Also published as: CN102002482A

Abstract

本发明公开了一种应用激流-灌注式生物反应器培养Marc-145细胞生产猪呼吸与繁殖障碍综合征(猪蓝耳病)病毒的生产工艺，包括如下技术步骤：1)选择Marc-145细胞作为制苗用细胞；2)Marc-145细胞的传代与培养；3)生产毒种的繁殖；4)Marc-145细胞在激流-灌注式生物反应器中纸片载体上的灌注培养；5)猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒在激流-灌注式生物反应器中的生产；6)收获病毒抗原液的处理。本发明可大幅降低生产成本，提高投入产出比10倍以上。且生产准备周期短，占用场地小，易于快速扩大生产规模，环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定。显著提高疫苗产量和质量。

Description

猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法

技术领域

本发明涉及一种应用激流-灌注式生物反应器与纸片载体细胞培养技术生产疫苗的方法，可用于工业化生产猪呼吸与繁殖综合征疫苗，替代传统的转瓶培养法生产工艺。

背景技术

目前，国内猪呼吸与繁殖障碍综合征疫苗生产主要依靠细胞转瓶培养法实现。该传统工艺劳动强度大，耗时长、效率低，生产成本高；容易被环境污染；不同生产批次间或同一生产批次不同瓶间的差异大；难以扩大生产；容易出现被细菌或其它病毒污染而致的疫苗质量隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有细胞转瓶培养法技术存在的不足之处，提供一种应用激流-灌注式生物反应器纸片载体细胞培养生产猪呼吸与繁殖障碍综合征疫苗的方法。该方法可以大量降低生产成本，而且生产周期短，占用场地小，易于快速扩大生产规模，环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定。可显著提高疫苗产量和质量。

为达到上述目的，本发明采取了如下的技术方案：

一种猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法，包括如下步骤：

(1)制苗用细胞的传代与培养

取长满单层Marc-145生产用细胞，经胰酶消化液消化传代，以细胞生长液培养，培养温度为35～38℃；形成细胞单层时，用于继续传代或接种于激流-灌注式生物反应器中进行纸片载体灌注培养。

(2)种毒的繁殖：

用细胞维持液将猪呼吸与繁殖综合征病毒种毒按体积百分比0.1～1％比例接种到步骤(1)的细胞单层继续培养，至细胞80～90％病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在Marc-145细胞上进行细胞连续传代复壮，每次传代产物进行病毒TCID₅₀检验和无菌检验，传至病毒TCID₅₀稳定且达到10^7.0TCID₅₀/mL以上时停止复壮，作为生产种毒。

(3)Marc-145细胞在激流-灌注式生物反应器中的纸片载体灌注培养

准备好激流-灌注式生物反应器，按激流-灌注式生物反应器总体积的70％加入细胞生长液，启动激流-灌注式生物反应器，打开蠕动泵，开始循环；取步骤(1)长满单层的Marc-145细胞，经胰酶液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按1×10⁶个/mL～3×10⁶个/mL的密度接种到反应器中，设定温度、pH、循环速度、摇床转速、溶氧等培养参数，进行激流-灌注式生物反应器的自动控制培养。

(4)制苗用毒液的繁殖：

间隔固定时间无菌抽取步骤(3)的细胞生长液样品，测定细胞生长液中的残糖浓度，计算细胞生长过程中的耗糖速率，根据细胞的耗糖速率来计算细胞的生长状况，计算细胞数目，当细胞数计算结果达到3×10⁶个/mL～5×10⁶个/mL时进行接毒操作，按0.1～1％比例接入步骤(2)制备好的猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒生产种毒，设定好温度、pH、循环速度、溶氧等培养参数，进行反应器自动控制培养；接毒后每隔一定时间取反应器中细胞维持液，测定残糖，计算耗糖速率，并检测样品的TCID₅₀；待计算残糖量达到或低于限定值，且耗糖速率基本稳定不变时，开始收获病毒，收获上清液和含有纸片载体的灌注袋。

(5)收获病毒液的处理：

将含纸片载体的灌注袋经2～3次冻融后与收获病毒上清混合，-20℃冷冻保存备用。

上述技术方案中，激流-灌注式生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于纸片载体灌注培养的激流-灌注式生物反应器，容积为5L～2000L。

上述技术方案中，纸片载体为聚酯酰胺纸片载体，纸片载体在使用前需预处理，方法如下：1)用无菌PBS(磷酸盐缓冲液)浸泡纸片载体过夜；2)用无菌PBS(磷酸盐缓冲液)循环清洗纸片载体3遍；3)用细胞培养生长液浸泡纸片载体2小时。

上述技术方案中，所述的胰酶消化液配方为：质量份数为0.25％的胰酶溶液(规格为1∶250)；细胞生长液配方为：体积百分含量为90％～92％DMEM液、8％～10％牛血清、1％的双抗(青霉素和链霉素混合溶液)，1％的谷氨酰胺，pH为7.2～7.6。

上述技术方案中，种毒接种量为体积百分比0.1～1％，用于病毒培养的细胞维持液配方为：含体积百分含量1～4％血清的DMEM液、加1％的双抗(青霉素和链霉素混合溶液)，pH调整为7.2～7.8。培养温度为35～38℃。

上述技术方案中，激流-灌注式生物反应器设定参数为：培养温度33～38℃、pH7.0～7.8、溶氧30％～80％、循环速度为50～150rpm。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)用“激流-灌注式生物反应器纸片载体细胞培养技术”代替“转瓶细胞培养技术”制造猪呼吸与繁殖障碍综合征疫苗，可解决生产效率低、产品质量不稳定、病毒效价低的问题，通过生产技术和生产工艺的改变，全面提升疫苗质量和产量，提高疫苗的安全性。

(2)本发明可以大量降低生产成本，而且生产周期短，每个生产周期仅需5～6天，相比现有转瓶细胞培养法的6～7天以上明显缩短。

(3)应用激流-灌注式生物反应器进行疫苗生产，具有自动化程度高，用人少，生产工艺简单稳定。易操作、产量大占用场地小，易于快速扩大生产规模。质量易于实现均衡稳定。

(4)应用本方法生产疫苗，产品病毒效价比传统转瓶细胞培养法提高10～20倍，成本降低3～4倍。产品质量均一，易于规模化生产，整个生产工艺过程不涉及传统生产方法所具有的其他生物安全和公共卫生问题。

(5)该生物反应器应用新型一次性培养用耗材，减少了罐体式生物反应器的清洗、灭菌等复杂的工艺环节和工艺配套设施的安装，具有节约能耗，减少污染、占地空间小、对配套设施要求低等优点。

(6)应用本方法生产疫苗，所采用的纸片载体具有无污染，生物安全性高，细胞生长密度大，使用后处理方便，无环境污染等优势。

附图说明

图1为本发明的制备流程图

具体实施方式

以下结合说明书附图及具体实施例来对本发明作进一步的描述。

(1)选择激流-灌注式生物反应器作为培养的手段：10L激流-灌注式生物反应器。

(2)选择纸片载体作为细胞贴附生长的载体：聚酯酰胺纸片载体。

(3)纸片载体的预处理方法：1)用无菌PBS浸泡纸片载体过夜；2)用无菌PBS循环清洗纸片载体3遍；3)用细胞培养生长液浸泡纸片载体2小时以上。

(4)选择Marc-145细胞作为制苗用细胞。

(5)制苗用细胞的传代与培养。

上述细胞经胰酶消化液消化传代，以含10％牛血清、1％双抗(青霉素和链霉素混合溶液)，pH调整为7.2的细胞生长液继续培养，培养温度为37℃。形成良好单层时，用于继续传代或接种于激流-灌注式生物反应器中进行纸片载体灌注培养。

细胞生长液的组成(或配方)为：含体积百分比10％牛血清、1％双抗(青霉素和链霉素混合溶液)的DMEM，pH调整为7.2。

(6)细胞种毒的繁殖：

用细胞维持液，将猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒种毒按1％比例接种生长良好的上述细胞单层，继续培养，培养温度为37℃。至细胞80％以上病变时收获病毒液；测定病毒的TCID₅₀，待病毒效价稳定且达到10^7.0TCID₅₀/mL以上时停止复壮，将该病毒作为生产用种毒。

细胞维持液的组成(或配方)为：含体积百分比2％牛血清、1％双抗(青霉素和链霉素混合溶液)的DMEM，pH调整为7.2。

(7)Marc-145细胞在激流-灌注式生物反应器中的纸片载体灌注培养：

取转瓶上生长良好的Marc-145细胞，经胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按3×10⁶个/mL的密度接种反应器中。激流-灌注式生物反应器设定如下参数温度37℃、pH 7.2、溶氧含量50％、循环速度150rpm进行反应器自动控制培养。

(8)制苗毒液的繁殖：

培养后第二日取样测糖，计算耗糖速率。当耗糖速率不再增加，且糖耗速率不再变化时可行接毒操作。设定温度37℃、pH7.6、循环速度120rpm、溶氧含量50％等培养参数，进行反应器自动控制培养。接毒后每隔4小时取反应器中细胞维持液，测定糖耗，计算糖耗速率。当耗糖速率不再增加，且细胞维持液中残糖量降至1.0g/L以下时收获。分别收获上清液和纸片载体。

(9)收获病毒液的处理：

将含纸片载体的灌注袋经3次冻融后与收获病毒上清混合，-20℃冷冻保存备用。

Claims

1.一种猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法，其特征在于：

以激流-灌注式生物反应器作为培养工具；以聚酯酰胺纸片载体作为细胞贴附的生长载体；以Marc-145细胞作为制苗用细胞；

包括如下步骤：

（1）制苗用细胞的传代与培养

取长满单层Marc-145生产用细胞，经胰酶消化液消化传代，以细胞生长液培养，培养温度为35～38℃；形成细胞单层时，用于继续传代或接种于激流-灌注式生物反应器中进行纸片载体灌注培养；

（2）种毒的繁殖：

用细胞维持液将猪呼吸与繁殖综合征病毒种毒按体积百分比0.1～1%比例接种到步骤（1）的细胞单层继续培养，至细胞80～90%病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在Marc-145细胞上进行细胞连续传代复壮，每次传代产物进行病毒TCID₅₀检验和无菌检验，传至病毒TCID₅₀稳定且达到10^7.0TCID₅₀/mL以上时停止复壮，作为生产种毒；

（3）Marc-145细胞在激流-灌注式生物反应器中的纸片载体灌注培养

准备好激流-灌注式生物反应器，按激流-灌注式生物反应器总体积的70%加入细胞生长液，启动激流-灌注式生物反应器，打开蠕动泵，开始循环；取步骤（1）长满单层的Marc-145细胞，经胰酶液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按1×10⁶个/mL～3×10⁶个/mL的密度接种到反应器中，设定温度、pH、循环速度、摇床转速、溶氧培养参数，进行激流-灌注式生物反应器的自动控制培养；

（4）制苗用毒液的繁殖：

间隔固定时间无菌抽取步骤（3）的细胞生长液样品，测定细胞生长液中的残糖浓度，计算细胞生长过程中的耗糖速率，根据细胞的耗糖速率来计算细胞的生长状况，计算细胞数目，当细胞数计算结果达到3×10⁶个/mL～5×10⁶个/mL时进行接毒操作，按0.1～1%比例接入步骤（2）制备好的猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒生产种毒，设定好温度、pH、循环速度、溶氧培养参数，进行反应器自动控制培养；接毒后每隔一定时间取反应器中细胞维持液，测定残糖，计算耗糖速率，并检测样品的TCID₅₀；待计算残糖量达到或低于限定值，且耗糖速率基本稳定不变时，开始收获病毒，收获上清液和含有纸片载体的灌注袋；

（5）收获病毒液的处理：

将含纸片载体的灌注袋经2～3次冻融后与收获的病毒上清液混合，-20℃冷冻保存备用；

采用的激流-灌注式生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧参数，适用于纸片载体灌注培养的激流-灌注式生物反应器，容积为5L～2000L；

所述纸片载体为聚酯酰胺纸片载体，纸片载体在使用前需预处理，方法如下：1）用无菌PBS浸泡纸片载体过夜；2）用无菌PBS循环清洗纸片载体3遍；3）用细胞生长液浸泡纸片载体2小时；

所述的胰酶消化液配方为：质量百分数为0.25%的胰酶溶液；细胞生长液配方为：体积百分含量90%～92%的DMEM液、8%～10%的牛血清、1%的双抗，1%的谷氨酰胺，pH为7.2～7.6；

所述的生产种毒接种量为体积百分比0.1～1%，用于病毒培养的细胞维持液配方为：为含血清体积百分含量1～4%的DMEM液、加入占细胞维持液体积1%的双抗，pH调整为7.2～7.8；培养温度为35～38℃；

所述的激流-灌注式生物反应器设定参数为：培养温度33～38℃、pH7.0～7.8、溶氧30%～80%、循环速度为50～150rpm。