CN101831412A - 一种大规模生产猪蓝耳病病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大规模生产猪蓝耳病病毒的方法，利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养系统生产猪蓝耳病病毒，将制备病毒用宿主细胞接种到含有培养液与微载体的载体罐，并将上述细胞与微载体混合均匀，使细胞贴附在微载体上；在适当培养环境下，提供上述细胞足够的养分和适宜的气体环境，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的5～40倍；换用细胞维持培养液，将蓝耳病病毒制成病毒悬液，使其吸附到上述细胞上；在适当培养环境下培养病毒；连续培养2～3日后，收获病毒液；经检验合格后，将收获的病毒液于-20℃冻融两次，灭活纯化得到蓝耳病病毒液。该方法生产规模大、单批次产量高、生产成本相对较低。

Description

一种大规模生产猪蓝耳病病毒的方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及动物病毒培养技术，更具体涉及生产猪蓝耳病病毒的方法。

背景技术

猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征，是一种危害养猪业的病毒性传染病。2006年夏秋季，我国南方部分省份发生猪“高热病”疫情，农业部积极组织科研人员联合攻关，确定猪蓝耳病变异病毒为主要病原，定名为“高致病性猪蓝耳病”。直至今日，疫病形势依然严峻，同其他病毒性疾病一样，目前尚无有效的治疗性药物用于蓝耳病的治疗，免疫接种是防制该病的最有效方法，目前商品化的蓝耳病疫苗主要是由经典株制备的弱毒苗和由变异株制备的灭活苗。而这两种疫苗生产的关键点就是作为抗原的病毒的生产。病毒株生长的培养条件对于获得该株系的所希望的高产量来说具有重大意义。

为了最大化所想要的病毒的产量，系统和培养条件都必须特定地适合于提供对于产生所想要的病毒来说有利的环境。

现有的蓝耳病病毒大规模生产多采用转瓶工艺，但是生产过程中手工操作密集，病毒株受限，细胞维持时间短，密度及活性低等问题，限制了产品的产量、质量的提高和生产成本的降低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种大规模生产蓝耳病病毒的方法。该方法具有生产工艺简单稳定、易操作的特点，病毒产量高，批间差异小，质量易控制等特点，可显著提高疫苗产量和质量。

为达到上述目的，本发明利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养系统生产猪蓝耳病病毒，包括下列技术步骤：

(1)培养制备病毒用细胞：

将制备病毒用宿主细胞接种到含有培养液与微载体的载体罐，并将上述细胞与微载体混合均匀，启动贴附程序，使细胞贴附在微载体上；切换细胞培养程序，在适当培养环境下，提供上述细胞足够的养分和适宜的气体环境，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的5～40倍。

(2)毒液的接种与繁殖：

换用细胞维持培养液，将蓝耳病病毒制成病毒悬液，使其吸附到上述细胞上；在适当培养环境下培养病毒；连续培养2～3日后，收获病毒液，

(3)经检验合格后，将收获的病毒液于-20℃冻融两次，灭活纯化得到蓝耳病病毒液。

病毒液检验：按《中华人民共和国兽药典》2005年版附录15、19、20页的相关规定进行检验，完全符合，安全无副作用，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。通过接种细胞，观察致细胞病变作用，根据Reed-Muench法计算病毒含量，每1.0ml病毒含量≥10^8.5TCID₅₀；

上述技术方案中，所述的宿主细胞为可增殖蓝耳病病毒的细胞系，如猴肾细胞系(Marc-145)等。

本发明方法中所述的培养液最好是90％～99％MEM与1％～10％牛血清的混合液，PH值为6.5～8.0较好，加适量抗生素。

上述技术方案中，所述的适宜本发明的微载体可以为具有网状结构的纤维，如聚酯纤维等。

本发明方法中细胞获得气体交换的方式可以通过培养液液面升降的方式实现。

上述技术方案中，步骤(1)中，一般启动贴附程序后4h换成细胞培养程序。所述细胞贴附程序最佳参数为：up：2500mL/min hold 1min、Down：2500mL/min hold 1min、设定最大换液量17500mL；细胞培养程序最佳参数为：up：1900mL/min hold 1min、Down 1900mL/min hold 1min、设定最大换液量17500mL。

上述技术方案中，步骤(1)中所述微载体用量为每500ml培养液添加5.5g微载体较好，细胞的初始接种量为3.0～4.0×10⁷cells/g微载体较好。

上述技术方案中，步骤(2)中所述接种病毒时细胞密度一般为1.5×10⁸～2.0×10⁸cells/g微载体。

上述技术方案中，步骤(2)中所述接种病毒时按病毒感染复数(M.O.I.)为0.001～1.5的比例。

上述技术方案中，步骤(2)中，一般启动吸附程序后4h换成病毒培养程序，所述病毒吸附程序最佳参数为：up：1700mL/min hold 1min、Down：1700mL/min hold 1min、设定最大换液量17500mL；病毒培养程序最佳参数为：up：1200mL/min hold 1min、Down 1200mL/min hold 1min、设定最大换液量17500mL。

上述技术方案中，细胞与病毒培养温度36.5℃～37.5℃，培养环境中含有2.5％～5％的CO₂。

本发明方法中，潮汐式微载体悬浮培养技术采用的生物反应器主要由载体罐、储液罐、pH控制器、DO监测器、输入和输出系统组成。工作过程如下：细胞贴附在载体罐中的载体上生长，当储液罐的培养液被泵入载体罐时，培养液液面上升向细胞供给养分并促进细胞新陈代谢产物的去除；当载体罐的培养液泵入储液罐时，培养液面随之下降，使细胞进行通风，促进呼吸，减小细胞切向压力，无O₂供应限制，无泡沫烦恼。这个重复的运动使载体上的细胞能够得到足够的营养和O₂，同时产生的代谢废物如CO₂能够有效的被排出去，从而能够大量的扩增细胞并增值病毒，此种技术称之为潮汐式微载体悬浮培养技术。

本发明所提供的一种以潮汐式细胞微载体悬浮培养系统生产动物用狂犬病毒抗原的方法，与传统转瓶传代细胞培养技术相比，更具有以下优点：

1.采用本发明方法，解决了传统转瓶生产时单批产量不高、批间差异大、产品质量不稳定、劳动强度大、生产成本高等问题。

2.本发明方法中采用的载体为网状的聚酯纤维，具有亲水性和生物无害性，1g载体约占15ml的空间，可提供2400cm²的贴壁面积，在同样的空间内极大的增大了细胞的贴壁面积，增加了细胞生长的密度，细胞数可达到1.0×10⁹以上，其效能为传统转瓶培养系统的数十倍，可以节省许多成本及人力。

3.本发明方法制备的细胞接种量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度的抗原可以大大提高疫苗的免疫能力。

4.制备的病毒毒价高：传统的转瓶工艺生产的蓝耳病病毒效价仅为10^6.5TCID₅₀/ml，而本发明采用新的技术参数，运用潮汐式微载体悬浮培养技术高密度培养生产的病毒效价可以达到10^8.5TCID₅₀/ml，其毒价要高出100倍。

具体实施方式

实施例中所使用的生物反应器为美国CESCO公司的TideCell-020型，所使用的载体为美国CESCO公司的BioNoc II聚酯纤维，宽5mm，长10mm，1g载体约占15ml的空间，提供2400cm²的贴壁面积，可提供1.0×10⁹以上数量的细胞生长。

实施例1

1.病毒与细胞株

用于制备蓝耳病病毒抗原的病毒株为NVDC-JXA1毒株，经过致病性测试，该毒株病毒不具有致病性。以对该病毒株具有良好敏感性的细胞系猴肾细胞(Marc-145)，作为制苗用细胞系，藉以感染并大量繁殖蓝耳病病毒。

2.制备方法

(1)将制备抗原用细胞系猴肾细胞(Marc-145)接种到加有MEM液体培养基(包括10％牛血清、0.01mol/LNaHCO₃、0.1mg/ml硫酸卡那霉素(kanamycinsulfate)、100,000IU青霉素G钠盐(Penicillin G Sodium)、pH值为7.2)与BioNoc II聚酯纤维的载体罐内；微载体用量为每500ml培养液添加5.5g微载体，细胞初始接种量为8.0×10⁹cells/g微载体。

(2)于37℃、5％CO₂培养环境下，细胞贴附4h，使上述制备抗原用细胞与微载体混合均匀，并使细胞贴附在微载体上。贴附程序参数为：up：2500mL/min hold 1min、Down：2500mL/min hold 30s、设定最大换液量17500mL；4h后切换为细胞培养程序，细胞培养程序参数为：up：1900mL/minhold 1min、Down：1900mL/min hold 1min、设定最大换液量17500mL。

(3)于37℃、5％CO₂培养环境下，使细胞在上述微载体上生长，待细胞达到4.0×10¹⁰cell时，换用添加1％牛血清的MEM细胞维持培养液，按病毒感染复数(M.O.I.)为0.001的比例接种蓝耳病病毒NVDC-JXA1毒株，并使之感染细胞，使病毒增值，病毒吸附程序为：up：1700mL/min hold 1min、Down：1700mL/min hold 1min、设定最大换液量17500mL；病毒培养程序：up：1200mL/min hold 1min、Down 1200mL/min hold 1min、设定最大换液量17500mL；

(4)于37℃、5％CO₂培养环境下继续培养；培养2日后收获病毒液，于-20℃冻融两次并进行以下检验；

(a)纯净性检验：按《中华人民共和国兽药典》2005版附录15、19、20页相关规定进行检验，结果无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染；

(b)病毒含量测定：将病毒用含1％牛血清细胞维持液作10倍梯度系列稀释，从10^-1到10^-9。每个稀释度接种8个孔，同时设立阴性不接毒对照，放入5％CO₂温箱中37℃培养。在倒置显微镜下逐孔观察致细胞病变作用(CPE)，每天观察一次，并将观察结果记入专用登记表内。观察天数为直至出现CPE终点，即看到能够引起病毒增殖的病毒最高稀释度。对照细胞应始终保持良好形态和特征。并根据Reed-Muench法计算病毒含量，每1.0ml病毒含量≥10^8.5LD₅₀；

(c)特异性：用间接免疫荧光抗体(IFA)方法测定。将病毒接种于96孔细胞板Marc-145细胞，每个样品4孔，每孔200μL，同时设立阴性对照，放入5％CO₂温箱中37℃培养60～68h；弃去培养液，用0.01mol/L的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤细胞4次，然后加入100μL预冷的80％丙酮水溶液，4℃固定30min；然后用PBS洗涤4次，每次3min，然后每孔加入100μL工作浓度的猪抗蓝耳病病毒血清，置于37℃恒温箱中感作45min；用PBS洗涤4次，每次3min后；加入工作浓度的兔抗猪FITC结合物100μL，37℃作用45min；用PBS洗涤4次，每次3min，在荧光显微镜下观察。细胞对照孔无特异性黄绿色荧光出现，而病毒接种细胞孔有大量特异性黄绿色荧光出现。

对比例  悬浮培养工艺与传统转瓶培养技术比较

通过对大规模潮汐式细胞微载体悬浮培养系统与常用转瓶培养系统相关生产性能指标进行对比，结果如表1所示。

表1  不同培养系统增殖蓝耳病病毒的相关比较

备注：BioNOC II载体贴壁面积1g＝2400cm²，1个TideCell-020微载体悬浮培养系统需要加入BioNOC II载体220g。

结论

上列详细说明系针对本发明之一可行实施例之具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明之专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为之等效实施或变更，均应包含于本案之专利范围中。

Claims (9)

1.一种大规模生产猪蓝耳病病毒的方法，利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养系统生产猪蓝耳病病毒，包括下列技术步骤：

(1)培养制备病毒用细胞

将可增殖蓝耳病病毒的细胞系接种到含有培养液与微载体的载体罐，并将上述细胞与微载体混合均匀，启动贴附程序，使细胞贴附在微载体上；切换细胞培养程序，在适当培养环境下，提供上述细胞足够的养分和适宜的气体环境，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的5～40倍；

(2)毒液的接种与繁殖

待细胞达到一定密度时，换用细胞维持培养液，将蓝耳病病毒制成病毒悬液，使其吸附到上述细胞上；在适当培养环境下培养病毒；连续培养2～3日后，收获病毒液；

(3)经检验合格后，将收获的病毒液于-20℃冻融两次，灭活纯化得到蓝耳病病毒液。

2.根据权利要求1所述的大规模生产猪蓝耳病病毒的方法，其特征在于，所述细胞微载体悬浮培养系统为潮汐式。

3.根据权利要求2所述的大规模生产猪蓝耳病病毒的方法，其特征在于步骤(1)中启动贴附程序4h后切换培养程序；所述的细胞贴附程序参数为：up：2300～2700mL/min hold 40～120s、Down：2300～2700mL/min hold 40～90s、设定最大换液量17500mL；细胞培养程序参数为：up：1700～2100mL/min hold40～120s、Down 1700～2100mL/min hold 40～120s、设定最大换液量17500mL。

4.根据权利要求2所述的大规模生产猪蓝耳病病毒的方法，其特征在于步骤(2)中启动吸附程序后4h换成病毒培养程序，所述病毒吸附程序参数为：up：1500～1900mL/min hold 40～120s、Down：1500～1900mL/min hold 40～90s、设定最大换液量17500mL；病毒培养程序参数为：up：1000～1400mL/min hold40～120s、Down 1000～1400mL/min hold 40～120s、设定最大换液量17500mL。

5.根据权利要求2所述的大规模生产猪蓝耳病病毒的方法，其特征在于所述可增殖蓝耳病病毒的细胞系为猴肾细胞系；培养液为90％～99％MEM，加1％～10％牛血清，加适量抗菌素，pH值为6.5～8.0；所述微载体为聚酯纤维。

6.根据权利要求2所述的大规模生产猪蓝耳病病毒的方法，其特征在于细胞培养温度36.5～37.5℃，培养环境中含有2.5％～5％二氧化碳。

7.根据权利要求2所述的大规模生产猪蓝耳病病毒的方法，其特征在于微载体用量为每500ml培养液添加5.5g微载体，细胞初始接种量为3.0～4.0×10⁷cells/g微载体。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的接种蓝耳病病毒时的细胞密度为1.5×10⁸～2.0×10⁸cells/g微载体。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)按病毒感染复数(M.O.I.)为0.001～1.5的比例接种病毒。