CN110628616B - 一种反应器系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种反应器系统及其应用，其不仅能够高通量的开展工艺条件的研发，大大提高生物医药研发效率，而且将载体的吸附性能考虑在内，使得优化后的工艺条件能够成功放大至固定床反应器，并可缩减研发成本。一种反应器系统，其特征在于：反应器系统包括离心管架、离心管和振荡二氧化碳培养箱，离心管插装于离心管架上，离心管架安装于振荡二氧化碳培养箱内的托盘上，离心管包括管体和盖子，管体的内腔下部固定有载体，盖子开设有透气孔并内置有过滤膜，过滤膜封装透气孔。本发明的反应器系统，其采用离心管和载体构成种子细胞培养的反应器，能够通过离心管架将反应器批量设置，通过振荡二氧化碳培养箱进行动态培养。

Description

一种反应器系统及其应用
技术领域
本发明涉及动物细胞培养术与疫苗领域，尤其涉及一种反应器系统及其应用。
背景技术
细胞源疫苗的生产工艺相比于传统动物胚生产工艺，具有生产过程可控、批次均一、制品安全有效等特点，在疫苗大规模生产时，能够克服动物胚供给不足、获取时间长等问题，以及避免外源病毒污染的风险。
细胞源疫苗的工艺开发需要首先在小型反应器（缩小模型）内进行工艺条件的研究，然后将工艺逐级放大至生产规模的反应器中。细胞源疫苗根据种子细胞的类型采用不同的培养方式，主要分为贴壁培养和悬浮培养，其中，通过感染贴壁型种子、扩增、收获得到的细胞源疫苗，其在使用固定床反应器进行规模化生产过程中，我们发现采用传统方瓶静置培养筛选获得的工艺条件在固定床反应器上放大后会发生偏差，究其原因为方瓶的细胞贴附介质为瓶体内壁，而固定床反应器的细胞贴附介质为内置载体，即未将载体的吸附性能考虑在内，另外，方瓶为静态培养，与固定床反应器的动态培养存在较大差异，因此导致工艺放大后发生偏差。
若采用小型发酵罐动态培养获得工艺条件，例如专利CN201621251159.1公开的多联平行发酵罐，受小型发酵罐数量的限制，无法高通量地开展工艺开发，导致研发周期长，另外，设备成本、工艺条件研究过程耗材使用成本高。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种反应器系统及其应用，其不仅能够高通量的开展工艺条件的研发，大大提高生物医药研发效率，而且将载体的吸附性能考虑在内，使得优化后的工艺条件能够成功放大至固定床反应器，并可缩减研发成本。
一种反应器系统，其特征在于：所述反应器系统包括离心管架、离心管和振荡二氧化碳培养箱，所述离心管插装于所述离心管架上，所述离心管架安装于所述振荡二氧化碳培养箱内的托盘上，所述离心管包括管体和盖子，所述管体的内腔下部固定有载体，所述盖子开设有透气孔并内置有过滤膜，所述过滤膜封装所述透气孔。
进一步的，载体容器为圆柱形筒体并由筛网制得，所述载体容器通过支架固定于所述离心管内，所述载体填装于所述载体容器内。进一步的，所述载体容器与离心管的管壁间隔设置。
进一步的，所述支架包括一对固定环，一对所述固定环环绕设置于所述载体容器的上、下两端的外部，所述固定环的外侧壁与所述离心管的内侧壁过盈配合、固定环的内侧壁与所述载体容器的外侧壁过盈配合，所述固定环上开设有沿环形方向分布的过液孔。
进一步的，所述过滤膜的孔径为0.22μm。
进一步的，所述载体为供细胞贴壁生长载体，包括片状载体、琼脂糖球状载体等。
进一步的，所述筛网材质为不锈钢金属材质或塑料材质等其他材质。
本发明的上述反应器系统在细胞源猪伪狂犬疫苗生产的工艺条件的高通量开发中的应用，所述细胞源猪伪狂犬疫苗的种子细胞为贴壁型细胞。
进一步的，所述工艺条件包括接毒时间、接毒剂量、病毒收获方法，
接毒时间的高通量开发包括以下步骤，（1）将种子细胞分别接种于封装有细胞培养基的离心管内，进行细胞培养，（2）在预设的不同生长时间阶段，倒掉离心管中的细胞培养基，添加病毒维持培养基，进行病毒接种，（3）根据病毒滴度判断最佳的接毒时间；
接毒剂量的高通量开发包括以下步骤，（1）将种子细胞分别接种于封装有细胞培养基的离心管内，进行细胞培养，（2）在最佳的接毒时间，倒掉离心管中的细胞培养基，添加病毒维持培养基，进行不同接毒剂量的病毒接种，（3）根据病毒滴度判断最佳的接毒剂量；
病毒收获方法的高通量开发包括以下步骤，（1）将种子细胞分别接种于封装有细胞培养基的离心管内，进行细胞培养，（2）在最佳的接毒时间，倒掉离心管中的细胞培养基，添加病毒维持培养基，按最佳的接毒剂量进行接毒，（3）分别采取一次全收工艺、半收工艺、全收工艺收获离心管内的细胞维持培养基，根据收获的细胞维持培养基体积、病毒滴度计算疫苗收获剂量，根据疫苗收获剂量判断最佳的收获方式。
进一步的，所述种子细胞包括Vero细胞、CHO细胞、猪睾丸（ST）细胞、PK-15（猪肾）细胞。
进一步的，所述种子细胞为Vero细胞，所述细胞培养步骤具体为，加入20 mL、37℃预热的含10%的胎牛血清的DMEM培养基，将Vero细胞按照0.2×106个/mL的浓度接种于离心管中，旋紧盖子后置于温度为37℃，5% CO2浓度的振荡培养箱中振荡培养，转速设置为180rpm；
所述离心管为50ml，0.4克Fibra-Cel1片状载体装填于载体容器中，载体容器与管体内壁的间隙为3~5mm。
本发明的反应器系统，其采用离心管和载体构成种子细胞培养的反应器，体积小，能够通过离心管架将反应器批量设置于振荡二氧化碳培养箱进行细胞动态培养，二氧化碳、氧气可通过透气性盖子进行气体交换，进而实现高通量的开展工艺条件的研发，大大提高生物医药研发效率；同时，种子细胞贴附于载体上进行生长，载体在载体容器和支架的作用下相对离心管保持静止，而培养基通过振荡进行混合，从而将载体的吸附性能考虑在内，模仿实验室规模的固定床反应器的培养条件，并且经实验证明基于该反应器系统的工艺条件的可放大性；此外，本发明的反应器相较于现有的小型发酵罐，一方面，体积小，细胞、培养基用量少，进而能够大幅缩减研发成本，另一方面，结构简单，制造成本低，并且本发明载体填充于载体容器内，载体容器是通过一对固定环过赢固定于离心管内，无需复杂的安装工艺，能够进一步降低制造成本。
附图说明
图1为本发明的反应器系统的结构示意图。
图2为本发明的离心管与离心管架配合的结构示意图。
图3为本发明的管体、固定环和载体容器配合的结构示意图。
图4为本发明的盖子和过滤膜的结构示意图。
图5为本发明的最佳接毒时间的确定。
图6为本发明的最佳接毒剂量的确定。
图7为本发明的最佳收毒方式的确定。
图8为本发明的疫苗工艺方法放大验证。
具体实施方式
如图1~图4所示，一种反应器系统，反应器系统包括离心管架2、离心管1和振荡二氧化碳培养箱3，离心管1插装于离心管架2上，离心管架2安装于振荡二氧化碳培养箱3内的托盘上，离心管1包括管体11和盖子12，管体11的内腔下部固定有载体，盖子12开设有透气孔121并内置有过滤膜15，过滤膜封装透气孔，过滤膜的孔径为0.22μm，以保证通气并隔绝微生物污染。
载体容器13为圆柱形筒体并由不锈钢的筛网制得，载体容器13通过支架固定于离心管1内，载体填装于载体容器13内。通过载体容器、固定环将载体固定于离心管内，从而换液操作简单，在换液时可直接倾倒去除旧培养基，且不会造成细胞损失。
载体容器13与离心管1的管壁间隔设置，具体的，离心管为50ml，0.4克Fibra-Cel（Eppendorf，德国艾本德公司）片状载体装填于载体容器中，载体容器与管体内壁的间隙为3mm，支架包括一对固定环14，一对固定环14环绕设置于载体容器13的上、下两端的外部，固定环14的外侧壁与离心管1的内侧壁过盈配合、固定环14的内侧壁与载体容器13的外侧壁过盈配合，固定环14上开设有沿环形方向分布的过液孔141。其中，载体容器与管体内壁的间隙以及固定环的过液孔的设置，能够在振荡培养过程中实现培养基从载体容器的各个方位混入内部，充分与载体或者说与载体上的细胞进行接触，提高细胞生长密度。
本发明的上述反应器系统在细胞源猪伪狂犬疫苗生产的工艺条件的高通量开发中的应用，具体如下：
1、细胞复苏：
将冻存管放入37℃温水中，并轻轻摇动令其内容物尽快融化。从37℃水浴中取出冻存管，用75%酒精消毒后在生物安全柜中开启，用吸管将细胞悬液转移至15 mL离心管中并加入10 mL细胞生长培养基，混匀后1000 rpm离心5 min，除去上清液。用1 mL DMEM培养基重悬。接种于T75培养瓶，放入CO2培养箱静置培养。
2、细胞消化：
待Vero细胞在T-175方瓶表面长成致密单层细胞后，弃去旧培养基。用移液管加入30 mL经37℃预热的PBS，轻轻晃动数次从而冲洗细胞表面残余的培养基，弃去PBS后再加入5 mL经37℃预热胰酶，将方瓶平置并缓慢摇晃方瓶使得胰酶与细胞充分接触。约半分钟后倾倒大部分胰酶溶液，剩余少量胰酶继续消化细胞。数分钟后轻轻拍打方瓶促进细胞从方瓶表面脱落。用移液管加入50 mL含10% FBS的DMEM培养基终止消化，并吸吹数次将细胞吹散形成细胞悬液。
3、细胞培养：
将0.4克片状载体装填于载体模块中，经辐照灭菌后，在生物安全柜中加入20 mL预热的培养基（DMEM培养基并添加10%的胎牛血清）。将Vero细胞按照0.2×106个/mL的浓度接种于微型固定床生物反应器中，旋紧盖子后置于温度为37℃，5% CO2浓度的振荡培养箱中振荡培养，转速设置为180 rpm。
4、疫苗工艺开发：
待细胞生长至3天、5天、7天时，即TOI（time of infection，接毒时间）为3 d、5 d、7 d时，弃去反应器中的旧培养基，更换为病毒维持培养基，并按照接毒剂量MOI为0.01进行接毒。从而获得最佳接毒时间的工艺条件。进一步的在最佳接毒时间条件下，分别以接毒剂量MOI（Multiplicity of infection，接毒剂量）为0.0001、0.001、0.01、0.05、0.1进行接毒，从而获得最佳接毒剂量的工艺条件。此外，对病毒收获方式进行研究，“半收”即接毒后每天收获一半体积的培养基，并补充一半体积新鲜的病毒维持培养基。“全收”即接毒后每天收获全部的培养基，并替换为新鲜的病毒维持培养基。“一次收获”即仅在产毒工艺结束时收获全部的培养基。从而获得最佳的病毒收获方式。
病度滴度的测定采用TCID50方法。
所使用的培养基为美国Hyclone公司DMEM高糖培养基，货号为SH30243.01；以色列Biological Industries公司的胎牛血清（FBS），货号为04-001-1ACS；Sigma-Aldrich公司的胰酶，货号为T4049。
如图5所示，当TOI为3 d时，获得的病毒滴度最高，在第5 dpi（day postinfection，感染天数）病毒滴度达到7.4 log10 TCID50·mL-1。因此TOI为3 d为最佳接毒时间。另外，接毒时间为第7 d时，在第4 dpi病毒滴度略高于7.4 log10 TCID50·mL-1，但接毒时间晚了4天，影响疫苗生产效率。
如图6所示，当MOI为0.001，在第5 dpi获得的病毒滴度最高，为7.3 log10TCID50·mL-1。因此MOI为0.001为最佳接毒剂量。
如图7所示，当采用“全收”工艺时，每日收获的猪伪狂犬病毒滴度在第3 dpi达到最大，在5 dpi可累计收获100 mL毒液。PRV病毒总滴度可达8.81 log10 TCID50。相对于“一次收获”的单次收获工艺，采用“全收”工艺收获病毒总量的提高了1.29倍，即一次“全收”工艺为最佳病毒收获方法。
如图8所示，当工艺放大至1 L固定床生物反应器时，接毒后5 d累计收获2.5 L含病毒的培养基，收获病毒的总滴度达到10.25 log10 TCID50，相当于177,828剂量疫苗；当工艺放大至5 L固定床生物反应器时，接毒后5 d累计收获12.5 L含病毒的培养基，收获病毒的总滴度达到11.13 log10 TCID50，相当于1,348,962剂量疫苗。在工艺逐级放大过程中，收获病毒的总滴度、疫苗剂量均与反应器的体积呈正比关系，该结果证明本发明反应器系统优化得到的猪伪狂犬病毒疫苗工艺可以逐级放大至固定床生物反应器。

Claims (7)

1.一种反应器系统，其特征在于：所述反应器系统包括离心管架、离心管和振荡二氧化碳培养箱；所述离心管插装于所述离心管架上，所述离心管架安装于所述振荡二氧化碳培养箱内的托盘上；所述离心管包括管体和盖子，所述管体的内腔下部固定有载体，所述盖子开设有透气孔并内置有过滤膜，所述过滤膜封装所述透气孔；所述载体为供细胞贴壁生长载体，所述载体填装于载体容器内，所述载体容器为圆柱形筒体并由筛网制得，所述载体容器与离心管的管壁间隔设置；所述载体容器通过支架固定于所述离心管内，所述支架包括一对固定环，一对所述固定环环绕设置于所述载体容器的上、下两端的外部，所述固定环的外侧壁与所述离心管的内侧壁过盈配合，所述固定环的内侧壁与所述载体容器的外侧壁过盈配合，所述固定环上开设有沿环形方向分布的过液孔。
2.根据权利要求1所述的反应器系统，其特征在于：所述载体包括片状载体、琼脂糖球状载体。
3.根据权利要求1所述的反应器系统，其特征在于：所述筛网的材质为不锈钢金属材质或塑料材质。
4.权利要求1～3中任一项所述的反应器系统在细胞源猪伪狂犬疫苗生产的工艺条件的高通量开发中的应用，所述细胞源猪伪狂犬疫苗的种子细胞为贴壁型细胞。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述工艺条件包括接毒时间、接毒剂量、病毒收获方法，所述接毒时间的高通量开发的步骤包括将种子细胞分别接种于封装有细胞培养基的离心管内，进行细胞培养，在预设的不同生长时间阶段，倒掉离心管中的细胞培养基，添加病毒维持培养基，进行病毒接种，根据病毒滴度判断最佳的接毒时间；所述接毒剂量的高通量开发的步骤包括将种子细胞分别接种于封装有细胞培养基的离心管内，进行细胞培养，在所述最佳的接毒时间，倒掉离心管中的细胞培养基，添加病毒维持培养基，进行不同接毒剂量的病毒接种，根据病毒滴度判断最佳的接毒剂量；所述病毒收获方法的高通量开发的步骤包括将种子细胞分别接种于封装有细胞培养基的离心管内，进行细胞培养，在所述最佳的接毒时间，倒掉离心管中的细胞培养基，添加病毒维持培养基，按所述最佳的接毒剂量进行接毒，分别采取一次全收工艺、半收工艺、全收工艺收获离心管内的细胞维持培养基，根据收获的细胞维持培养基体积、病毒滴度计算疫苗收获剂量，根据疫苗收获剂量判断最佳的收获方式。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述种子细胞包括Vero细胞、CHO细胞、ST细胞、PK-15细胞。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述种子细胞为Vero细胞，所述细胞培养的步骤为加入20mL、37℃预热的含10%的胎牛血清的DMEM培养基，将Vero细胞按照0.2×106个/mL的浓度接种于所述离心管中，旋紧盖子后置于温度为37℃、5% CO2浓度的振荡培养箱中振荡培养，转速设置为180rpm；所述离心管为50ml，0.4克Fibra-Cel1片状载体装填于所述载体容器中，所述载体容器与管体内壁的间隙为3mm～5mm。
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