CN108187039A - 一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品，属于疫苗制备技术领域，所述生产工艺为：种细胞复苏，所述种细胞为鸭胚胎干细胞；采用无动物血清培养基纯悬浮传代培养种细胞；种细胞接种细胞种毒并培养禽流感病毒，灭活；制备制苗抗原，混合，乳化，检验合格后分装，即可。本发明以鸭胚胎干细胞为基质细胞，采用纯悬浮细胞培养方式，同时，使用无动物血清培养基培养鸭胚胎干细胞，显著提高了种细胞密度，在接毒过程中接种细胞种毒，一次性完成培养过程，不需要更换培养基，有效减少培养过程中的外源污染率，得到高滴度的禽流感病毒，具有简化培养过程、提高疫苗的免疫效果、降低生产成本的特点。

Description

一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，具体地说涉及一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品。
背景技术
禽流感是由A型禽流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被国际兽疫局定为A类传染病，我国也将之列为一类动物疾病，2017年爆发的禽流感H7N9亚型给中国养殖业造成了巨大损失，同时严重威胁到公共卫生安全。目前，疫苗免疫是国内外防治禽流感爆发的主要措施，我国目前大多数厂家以鸡胚为基质生产禽流感疫苗，该工艺存在很多不足之处：该工艺对鸡胚有很大的依赖性，鸡胚的产量可能无法满足市场需求，导致一些质量低劣的鸡胚不得不作为原辅料，严重影响了产品质量；鸡胚所产出的病毒液含量并不高，产能较低；鸡胚培养过程中环境条件不够均一，批次间差异较大；来自于孵化场的鸡胚，含有不明细菌等情况不可避免，致使细菌内毒素伴随原辅料进入产品中，这对疫苗免疫效果造成很大影响，甚至出现免疫失败；鸡胚生产工艺提取鸡胚中的尿囊液，剩余的固体成分会造成大量的废弃物，对生态环境也是很大污染；鸡胚工艺的生产流程对病毒控制难度较大，严重影响生物安全，尤其对高致病性禽流感病毒来说；鸡胚供应量制约对生产企业造成成本问题。
在细胞培养技术方面，大多采用微载体细胞悬浮培养，适用于难以驯化为纯悬浮的细胞，而且载体培养在成本、细胞密度、操作简便性和工业放大等方面有重大的先天缺陷，其最大培养体积不超过300升，这限制了该技术的大规模化应用。少数采用纯悬浮细胞培养，但是先从采用的培养基上看，使用动物源血清成分的培养基使得在病毒培养或疫苗生产中遭受来自血清的外源污染的风险大大提高，同时也加大了生产成本；培养细胞的密度不高，病毒难以达到高滴度；有的在培养过程中需要更换培养基，无法达到一次性培养中间不需要更换培养基，生产过程过于繁琐，这增加了污染的几率。因此，现有技术不能实现大规模工业化生产，无法满足规模化工业化生产优质禽流感灭活疫苗的需求。
申请号为201510741286.3，名称为一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品，公开了全悬浮MDCK细胞培养禽流感病毒H5和H9亚型，使用的是无血清培养基，与鸡胚工艺、微载体MDCK贴壁细胞工艺和纸片MDCK贴壁细胞工艺比较，具有一定的优势，但所用的MDCK细胞为犬肾上皮细胞，在疫苗制备过程中无法彻底清除MDCK的残留，疫苗注射鸡或禽类动物后，由于犬禽进化亲缘关系远，存在较大的种属差异、异体排斥的原理，会引起不同程度的副反应。而且，目前流行的禽流感H7N9亚型为最新的禽流感毒株，尚没有采用细胞增殖培养H7N9亚型禽流感毒株的相关报道。
发明内容
针对现有技术的种种不足，为了解决上述问题，发明人以鸭胚胎干细胞为种细胞，采用纯悬浮细胞培养方式，繁殖H5和H7亚型禽流感病毒并制备疫苗。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种禽流感灭活疫苗生产工艺，包括以下步骤：
S1：种细胞复苏，所述种细胞为鸭胚胎干细胞，鸭胚胎干细胞是由鸭胚的胚盘细胞分离培养而来的具有长期自我更新能力和向所有体细胞类型分化能力的多潜能细胞，用含血清的培养基贴壁培养，驯化为纯悬浮生长方式的细胞。鸭胚胎干细胞，该细胞来源于鸭胚，属禽源细胞系，禽类病毒更加容易繁殖，病毒增殖过程中，所需生物元素来源禽类细胞，生物种属差异较小。疫苗制备过程残留的鸭胚胎干细胞的碎片和核酸与禽类免疫动物种属关系近，动物免疫副反应较小，安全性较高；
S2：采用无动物血清培养基纯悬浮传代培养种细胞，减少外源污染机会，同时，降低生产成本；
S3：种细胞接种细胞种毒并培养禽流感病毒，灭活；
S4：制备制苗抗原，混合，乳化，检验合格后分装，即可。
进一步，所述步骤S1中，种细胞复苏处理的具体方法为：
S11：取30ml无动物血清培养基放置在35-40℃水中，加热30-40min，加入50ml离心管中；
S12：取种细胞冻存管，置于35-40℃的水中，并震荡使其完全融化，将种细胞转移至步骤S11中的离心管中；
S13：拧紧盖子，颠倒离心管4-6次，离心，弃掉上清液，再加入30ml无动物血清培养基，拧紧盖子，颠倒离心管4-6次，离心力为300g，时间为6-10min；
S14：将离心管中的种细胞和无动物血清培养基转移到细胞培养瓶中，并置于二氧化碳培养箱中培养，二氧化碳浓度为4～6％。
进一步，所述步骤S2中，采用无动物血清培养基纯悬浮传代培养种细胞的具体方法为：
每天对二氧化碳培养箱内的种细胞取样，进行细胞计数以及细胞存活率计算，当细胞培养瓶中细胞存活率≥90％、细胞密度6×106-8×106个/ml时，将种细胞无菌移种到不同体积的摇床细胞反应器，进行逐级放大培养，培养过程中不需要更换培养基，减少污染几率，简化生产过程；
所述摇床细胞反应器的体积为5-1500L，且反应器内初始的细胞密度0.8×106-1×106个/ml，所述种细胞至少经过3种不同体积的反应器传代培养，并且后级反应器摇床转速按照前级反应器摇床转速的10-30％逐级降低。
相较于传统的机械搅拌式反应器，摇床细胞反应器为一次性绿色环保无菌袋，不需要高能耗的蒸汽灭菌，节约能源；摇床震荡混合，氧气利用率极高，不需要机械搅拌和通气，避免产生大量气泡以及损伤细胞，细胞密度较高。
进一步，将细胞培养袋置于摇床细胞反应器，将种细胞无菌移种至细胞培养袋中，培养条件为：
采用1mol/L的无菌碳酸钠调节pH，pH值为6.8-7.0，温度为38.5-40℃，当细胞密度达到6×106-8×106个/ml、细胞存活率≥90％时，将种细胞移种到后级摇床细胞反应器培养。在调节pH值方面，碳酸钠的调节能力比碳酸氢钠高，补料较少，不影响整个培养体系的渗透压，同时，碳酸钠比氢氧化钠碱性低，补料后不会在培养体系内引起局部pH值偏高。
进一步，所述步骤S3中，种细胞接种细胞种毒并培养禽流感病毒的具体方法为：
S31：当细胞密度达到6×106-8×106个/ml、细胞存活率≥90％时，进行细胞种毒，且细胞种毒接种剂量为摇床细胞反应器内培养基总体积的0.1％-1％，相较于鸡胚种毒，细胞种毒能够有效避免鸡胚污染可能带给疫苗的内毒素，对免疫产生更好的效果；
S32：采用1mol/L的无菌碳酸钠调节pH，pH值为7.0-7.2，温度为33-35℃，摇床转速为50-70rpm，培养65-72h。
进一步，所述步骤S3中，细胞种毒接种23-24h后，每隔2.5-3.5h采样检测病毒含量、细胞密度和细胞活力，当病毒液血凝价＞29、细胞密度＜0.5×106个/ml且细胞活力＜30％时，收获禽流感病毒，将摇床细胞反应器直接与离心机无菌连接，离心，离心力为6000-8000g，得到澄清液，将澄清液转入灭活罐中，用终浓度为1‰甲醛4℃灭活，灭活时间至少为48h，得到灭活抗原。
进一步，所述细胞种毒的病原类型为H5N1亚型或H7N9亚型。
进一步，若不需要马上使用灭活抗原，可将灭活抗原转移至4℃冷藏库存储，使用时再将其制备成制苗抗原；若需要马上使用灭活抗原，可将灭活抗原制备成制苗抗原。
现有的病毒液收获后需要-20℃冷库内冷冻保存，使用时需要化冻，工作周期较长，本发明病毒液收获后直接进行灭活，4℃冷藏保存或直接使用，降低了能耗，缩短周期。
进一步，将病原类型为H5N1亚型和H7N9亚型的两种灭活抗原，按照1：2混合，得到二价苗制苗抗原，将所述二价苗制苗抗原与矿物油佐剂按照1：2-1：3混合，乳化，检验合格后分装，即得禽流感灭活疫苗。现有的通过纯悬浮培养细胞技术生产疫苗的过程中，病毒液浓缩后方可使用，本发明所制得的病毒液因病毒含量较高，不需浓缩，可大幅提高产量。
另，本发明还提供一种禽流感灭活疫苗产品，采用上述的生产工艺制得。
本发明的有益效果是：
以鸭胚胎干细胞为基质细胞，采用纯悬浮细胞培养方式，同时，使用无动物血清培养基，并且对种细胞的培养条件进行优选，显著提高了种细胞密度，在接毒过程中接种细胞种毒，一次性完成培养过程，不需要更换培养基，有效减少培养过程中的外源污染率，得到高滴度的H5和H7亚型禽流感病毒，具有简化培养过程、提高疫苗的免疫效果、降低生产成本的特点。
附图说明
图1是本发明的流程框图。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。此外，以下实施例中提到的方向用词，例如“上”“下”“左”“右”等仅是参考附图的方向，因此，使用的方向用词是用来说明而非限制本发明创造。
实施例一：
如图1所示，一种禽流感灭活疫苗生产工艺，包括以下步骤：
首先，选取鸭胚胎干细胞作为种细胞，取30ml无动物血清培养基放置在35-40℃水中，加热30-40min，加入50ml离心管中，取种细胞冻存管，置于35-40℃的水中，并震荡使其完全融化，将种细胞转移至含30ml无动物血清培养基的离心管中，颠倒离心管4-6次，离心，弃掉上清液，再加入30ml无动物血清培养基，颠倒离心管4-6次，将离心管中的种细胞和无动物血清培养基转移到细胞培养瓶中，并置于二氧化碳培养箱中培养，二氧化碳浓度为4～6％，离心力为300g。
其次，当细胞培养瓶中细胞存活率≥90％、细胞密度6×106-8×106个/ml时，将种细胞无菌移种到不同体积的摇床细胞反应器，进行逐级放大培养，所述摇床细胞反应器的体积为5-1500L，且反应器内初始的细胞密度0.8×106-1×106个/ml，所述种细胞至少经过3种不同体积的反应器传代培养，并且后级反应器摇床转速按照前级反应器摇床转速的10-30％逐级降低。
将细胞培养袋置于摇床细胞反应器，将种细胞无菌移种至细胞培养袋中，采用1mol/L的无菌碳酸钠调节pH，pH值为6.8-7.0，温度为38.5-40℃，当细胞密度达到6×106-8×106个/ml、细胞存活率≥90％时，将种细胞移种到后级摇床细胞反应器培养。
再次，当细胞密度达到6×106-8×106个/ml、细胞存活率≥90％时，进行细胞种毒，且细胞种毒接种剂量为摇床细胞反应器内培养基总体积的0.1％-1％，细胞种毒的病原类型为H5N1亚型或H7N9亚型。也就是说，本发明可以制备H5和H7亚型禽流感疫苗，包含流行的H7N9禽流感，既可以预防H5N1禽流感，又可以预防H7N9禽流感。
采用1mol/L的无菌碳酸钠调节pH，pH值为7.0-7.2，温度为33-35℃，摇床转速为50-70rpm，培养65-72h，细胞种毒接种23-24h后，每隔2.5-3.5h采样检测病毒含量、细胞密度和细胞活力，当病毒液血凝价＞29、细胞密度＜0.5×106个/ml且细胞活力＜30％时，收获禽流感病毒，将摇床细胞反应器直接与离心机无菌连接，离心，离心力为6000-8000g，得到澄清液，将澄清液转入灭活罐中，用终浓度为1‰甲醛4℃灭活，灭活时间至少为48h，得到灭活抗原。
最后，所述灭活抗原转移至4℃冷藏库存储或制备成制苗抗原。
制苗抗原的获得方法为：将病原类型为H5N1亚型和H7N9亚型的两种灭活抗原，按照1：2混合，得到二价苗制苗抗原，将所述二价苗制苗抗原与矿物油佐剂按照1：2-1：3混合，乳化，检验合格后分装，即得禽流感灭活疫苗。
实施例二：
本实施例一与实施例二相同的部分不再赘述，不同的是：
所述摇床细胞反应器的体积为5L、300L、1500L，摇床转速分别为100rpm、70rpm、50rpm，pH值为6.8，温度为38.5℃。
细胞种毒接种剂量为摇床细胞反应器内培养基总体积的0.1％，pH值为7.0，温度为33℃，摇床转速为50rpm，培养65h。
将病原类型为H5N1亚型和H7N9亚型的两种灭活抗原，按照1：2混合，得到二价苗制苗抗原，将所述二价苗制苗抗原与矿物油佐剂按照1：2混合，乳化，检验合格后分装，即得禽流感灭活疫苗。
实施例三：
本实施例一与实施例二相同的部分不再赘述，不同的是：
所述摇床细胞反应器的体积为5L、50L、300L、1500L，摇床转速分别为100rpm、90rpm、70rpm、50rpm，pH值为6.9，温度为39℃。
细胞种毒接种剂量为摇床细胞反应器内培养基总体积的0.15％，pH值为7.1，温度为34℃，摇床转速为60rpm，培养68h。
将病原类型为H5N1亚型和H7N9亚型的两种灭活抗原，按照1：2混合，得到二价苗制苗抗原，将所述二价苗制苗抗原与矿物油佐剂按照1：2.5混合，乳化，检验合格后分装，即得禽流感灭活疫苗。
实施例四：
本实施例一与实施例二相同的部分不再赘述，不同的是：
所述摇床细胞反应器的体积为50L、500L、1500L，摇床转速分别为90rpm、60rpm、50rpm，pH值为7.0，温度为40℃。
细胞种毒接种剂量为摇床细胞反应器内培养基总体积的2.5％，pH值为7.2，温度为35℃，摇床转速为70rpm，培养72h。
将病原类型为H5N1亚型和H7N9亚型的两种灭活抗原，按照1：2混合，得到二价苗制苗抗原，将所述二价苗制苗抗原与矿物油佐剂按照1：3混合，乳化，检验合格后分装，即得禽流感灭活疫苗。
对实施例二至实施例四制备的禽流感灭活疫苗进行性状、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，测定结果下表所示：
第一对比实验：
实验一：不同接毒量测试
1.1目的：MDCK细胞作为种细胞，采用不同的接毒量即MOI值(病毒含量与细胞数的比值)，比较繁殖出的病毒含量是否不同。
1.2材料：生长48h的MDCK悬浮细胞；接毒培养基；H7N9毒株。
1.3方法：生长状态良好的MDCK悬浮细胞平均分到5个瓶中，分别按照MOI＝0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001接种病毒，接毒后置于33℃、5％CO2培养箱中培养，接毒后分别在培养24h、48h、72h取样检测HA(病毒血凝素滴度)，其单位为2n。
1.4实验结果如表1所示。
表1：
HA/MOI 0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001
24h 1 0 0 0 0
48h 3 3 3 3 3
72h 3 3 4 3 3
1.5结论：不同的接毒量没有改变繁殖出病毒的HA，其中，MOI＝0.001时，HA值稍高于其他，在后续实验中可采用此接毒量接种。
实验二：采用梯度细胞密度接毒
2.1目的：MDCK细胞采用不同的细胞数接种H7N9毒株，比较繁殖出的病毒含量是否不同，对H7N9病毒滴度进行优化。
2.2材料：生长48h的MDCK悬浮细胞，接毒培养基，H7N9毒株。
2.3方法：生长状态良好的MDCK悬浮细胞，5个细胞瓶中分别注入细胞密度为300万、600万、800万、1000万、1200万的细胞液，按照MOI＝0.001接种病毒，接毒后置于33℃、5％CO2培养箱中培养，接毒后分别在培养24h、48h、72h取样检测HA。
2.4实验结果如表2所示。
表2：
2.5结论：相同的接毒量，不同的细胞密度，并没有提高接毒后病毒液的HA，在细胞密度较低和较高的条件下，HA反而会降低，后续接毒细胞密度要控制得当。
实验三：病毒在细胞上连续传代的适应
3.1目的：采用细胞密度为800万的MDCK细胞液接种H7N9毒株，在连续传代过程中对H7N9病毒滴度进行优化。
3.2材料：生长48h的MDCK悬浮细胞，接毒培养基，H7N9毒株。
3.3方法：生长状态良好的MDCK悬浮细胞，从胚毒F0开始接种细胞进行传代，传代时接种的H7N9毒株是上一代产生的细胞毒，按照MOI＝0.001接种病毒，接毒后置于33℃、5％CO2培养箱中培养，接毒后分别在培养24h、48h、72h取样检测HA，按照相同的方法连续繁殖8代病毒。
3.4实验结果如表3所示。
表3：
3.5结论：在适当且相同的接毒量和接毒细胞密度的条件下，H7N9毒株连续传8代并没有大幅提高接毒后病毒液的HA，在第5代后HA提高了一个滴度，通过此方法提高的HA可以忽略不计。
实验四：延长收毒时间
4.1目的：采用细胞密度为800万的MDCK细胞液接种H7N9毒株，探究在整个培养过程中病毒液HA可达到的峰值时间。
4.2材料：生长48h的MDCK悬浮细胞，接毒培养基，H7N9毒株。
4.3方法：生长状态良好的MDCK悬浮细胞，按照MOI＝0.001接种病毒，接毒后置于33℃、5％CO2培养箱中培养，接毒后分别在培养24h、48h、72h、96h、120h、144h取样检测HA。
4.4实验结果如表4所示：
表4：
4.5结论：培养过程中HA出现先增后减的趋势，72小时可以达到峰值，但是检测到的峰值并不高，达不到标准水平，其中，样1和样2为平行样。
实验五：不同培养温度繁殖病毒
5.1目的：采用细胞密度为800万的MDCK细胞液接种H7N9毒株，在不同的温度条件下对H7N9病毒滴度进行优化。
5.2材料：生长48h的MDCK悬浮细胞，接毒培养基，H7N9毒株。
5.3方法：生长状态良好的MDCK悬浮细胞，将细胞液平均分到4个培养瓶中，按照MOI＝0.001接种病毒，接毒分别置于25℃、30℃、33℃、37℃以及5％CO2培养箱中培养，接毒后分别在培养24h、48h、72h取样检测HA。
5.4实验结果如表5所示。
表5：
5.5结论：通过改变温度来培养H7N9毒株没有提高病毒滴度。
实验六：病毒在不同PH条件下培养
6.1目的：采用细胞密度为800万的细胞液接种H7N9毒株，在不同的pH条件下对H7N9病毒滴度进行优化。
6.2材料：生长48h的MDCK悬浮细胞，接毒培养基，H7N9毒株。
6.3方法：选取生长状态良好的MDCK悬浮细胞，将细胞液平均分到7个培养瓶中，分别调节pH为6.0、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、8.0，按照MOI＝0.001接种病毒，接毒分别置于33℃、5％CO2培养箱中培养，接毒后分别在培养24h、48h、72h取样检测HA。
6.4实验结果如表6所示。
表6：
6.5结论：通过改变病毒培养体系的pH值，没有提高H7N9毒株的病毒滴度。
终上所述：通过以上6个实验可以看出，MDCK细胞不能繁殖出高滴度的H7N9病毒液，也就是说H7N9毒株不适应MDCK细胞。
第二对比实验：
实验一：不同接毒量测试
1.1目的：鸭胚胎干细胞采用不同MOI值，比较繁殖出的病毒含量是否不同。
1.2材料：生长48h的悬浮鸭胚胎干细胞；接毒培养基；H7N9毒株。
1.3方法：生长状态良好的鸭胚胎干细胞悬浮细胞平均分到5个瓶中，分别按照MOI＝0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001接种病毒，接毒后置于33℃、5％CO2培养箱中培养，接毒后分别在培养24h、48h、72h取样检测HA。
1.4实验结果如表7所示。
表7：
HA/MOI 0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001
24h 4 4 4 0 0
48h 6 8 9 9 9
72h 6 8 9 9 9
1.5结论：随着MOI降低，HA出现升高现象，在MOI＝0.001～0.00001之间的HA趋于最高。
实验二：采用梯度细胞密度接毒
2.1目的：悬浮鸭胚胎干细胞采用不同的细胞数接种H7N9毒株，比较繁殖出的病毒含量是否不同，对H7N9病毒滴度进行优化。
2.2材料：生长48h的鸭胚胎干细胞悬浮细胞，接毒培养基，H7N9毒株。
2.3方法：生长状态良好的鸭胚胎干细胞悬浮细胞，5个细胞瓶中分别注入细胞密度为300万、600万、800万、1000万、1200万的细胞液，按照MOI＝0.001接种病毒，接毒后置于33℃、5％CO2培养箱中培养，接毒后分别在培养24h、48h、72h取样检测HA。
2.4实验结果如表8所示。
表8：
2.5结论：低细胞密度和高细胞密度不能很好地繁殖病毒，随着细胞密度的增加，HA出现先高后低的趋势。
实验三：病毒在细胞上连续传代的适应
3.1目的：采用细胞密度为800万的鸭胚胎干细胞液接种H7N9毒株，在连续传代过程中对H7N9病毒滴度进行优化。
3.2材料：生长48h的鸭胚胎干细胞悬浮细胞，接毒培养基，H7N9毒株。
3.3方法：生长状态良好的鸭胚胎干细胞悬浮细胞，从胚毒F0开始接种细胞进行传代，传代时接种的H7N9毒株是上一代产生的细胞毒，按照MOI＝0.001接种病毒，接毒后置于33℃、5％CO2培养箱中培养，接毒后分别在培养24h、48h、72h取样检测HA，按照相同的方法连续繁殖8代病毒。
3.4实验结果如表9所示。
表9：
3.5结论：通过传代没有提高HA，随着传代次数的增加HA呈现上升趋势，但是在第五代之后HA能稳定到29。
实验四：延长收毒时间
4.1目的：采用细胞密度为800万的鸭胚胎干细胞液接种H7N9毒株，探究在整个培养过程中病毒液HA可达到的峰值时间。
4.2材料：生长48h的鸭胚胎干细胞悬浮细胞，接毒培养基，H7N9毒株
4.3方法：生长状态良好的鸭胚胎干细胞悬浮细胞，按照MOI＝0.001接种病毒，接毒后置于33℃、5％CO2培养箱中培养，接毒后分别在培养24h、48h、72h、96h、120h、144h取样检测HA。
4.4实验结果如表10所示。
表10：
4.5结论：细胞在培养过程中HA出现先增后减的趋势，72小时就可达到峰值，且达到标准水平，其中，样1和样2为平行样。
实验五：不同培养温度繁殖病毒
5.1目的：采用细胞密度为800万的鸭胚胎干细胞液接种H7N9毒株，在不同的温度条件下对H7N9病毒滴度进行优化。
5.2材料：生长48h的鸭胚胎干细胞悬浮细胞，接毒培养基，H7N9毒株。
5.3方法：生长状态良好的鸭胚胎干细胞悬浮细胞，将细胞液平均分到4个培养瓶中，按照MOI＝0.001接种病毒，接毒分别置于25℃、30℃、33℃、37℃以及5％CO2培养箱中培养，接毒后分别在培养24h、48h、72h取样检测HA。
5.4实验结果如表11所示。
表11：
5.4结论：随着温度的升高，HA呈现先高后低的趋势，在33℃时，HA最高，因此，得出33℃适宜病毒的繁殖。
实验六：病毒在不同PH条件下培养
6.1目的：采用细胞密度为800万的鸭胚胎干细胞液接种H7N9毒株，在不同的pH条件下对H7N9病毒滴度进行优化。
6.2材料：生长48h的鸭胚胎干细胞悬浮细胞，接毒培养基，H7N9毒株。
6.3方法：选取生长状态良好的鸭胚胎干细胞悬浮细胞，将细胞液平均分到7个培养瓶中，分别调节pH为6.0、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、8.0，按照MOI＝0.001接种病毒，接毒分别置于33℃、5％CO2培养箱中培养，接毒后分别在培养24h、48h、72h取样检测HA。
6.4实验结果如表12所示。
表12：
HA/pH 6.0 6.5 6.75 7.0 7.25 7.5 8.0
24h 0 0 3 4 4 4 0
48h 0 5 8 9 8 7 0
72h 0 7 9 9 9 9 0
6.5结论：通过改变病毒培养体系的pH值，没有提高H7N9毒株的病毒滴度,但是，在pH值为6.75～7.5之间病毒的HA最高。
综上所述：通过以上6个实验可以看出，鸭胚胎干细胞能稳定繁殖出高滴度的H7N9病毒液，也就是说，H7N9毒株能适应鸭胚胎干细胞。
综合第一对比试验和第二对比试验可以看出：鸭胚胎干细胞繁殖H7N9病毒株优势完全大于MDCK细胞，其HA高5个滴度。同时，H7N9毒株能很快适应鸭胚胎干细胞，随着传代代次的增加HA呈现上升趋势，并且能达到较高水平，而H7N9毒株并不能适应MDCK细胞，改变多种培养方式，HA并不能升高，随着传代代次的增加，HA并不能改变，始终保持较低水平。此外，从配制疫苗标准来衡量，MDCK细胞繁殖H7N9毒株产生的HA远远达不到标准，鸭胚胎干细胞繁殖H7N9毒株产生的HA已达到并超过疫苗制备的国家标准(HA为28)。因此，鸭胚胎干细胞能繁殖H7N9毒株并运用于实践中。
以上已将本发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。

Claims (10)

1.一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1：种细胞复苏，所述种细胞为鸭胚胎干细胞；
S2：采用无动物血清培养基纯悬浮传代培养种细胞；
S3：种细胞接种细胞种毒并培养禽流感病毒，灭活；
S4：制备制苗抗原，混合，乳化，检验合格后分装，即可。
2.根据权利要求1所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于，所述步骤S1中，种细胞复苏处理的具体方法为：
S11：取30ml无动物血清培养基放置在35-40℃水中，加热30-40min，加入50ml离心管中；
S12：取种细胞冻存管，置于35-40℃的水中，并震荡使其完全融化，将种细胞转移至步骤S11中的离心管中；
S13：颠倒离心管4-6次，离心，弃掉上清液，再加入30ml无动物血清培养基，颠倒离心管4-6次；
S14：将离心管中的种细胞和无动物血清培养基转移到细胞培养瓶中，并置于二氧化碳培养箱中培养。
3.根据权利要求2所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于，所述步骤S2中，采用无动物血清培养基纯悬浮传代培养种细胞的具体方法为：
当细胞培养瓶中细胞存活率≥90％、细胞密度6×106-8×106个/ml时，将种细胞无菌移种到不同体积的摇床细胞反应器，进行逐级放大培养；
所述摇床细胞反应器的体积为5-1500L，且反应器内初始的细胞密度0.8×106-1×106个/ml，所述种细胞至少经过3种不同体积的反应器传代培养，并且后级反应器摇床转速按照前级反应器摇床转速的10-30％逐级降低。
4.根据权利要求3所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于，将细胞培养袋置于摇床细胞反应器，将种细胞无菌移种至细胞培养袋中，培养条件为：
采用1mol/L的无菌碳酸钠调节pH，pH值为6.8-7.0，温度为38.5-40℃，当细胞密度达到6×106-8×106个/ml、细胞存活率≥90％时，将种细胞移种到后级摇床细胞反应器培养。
5.根据权利要求3所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于，所述步骤S3中，种细胞接种细胞种毒并培养禽流感病毒的具体方法为：
S31：当细胞密度达到6×106-8×106个/ml、细胞存活率≥90％时，进行细胞种毒，且细胞种毒接种剂量为摇床细胞反应器内培养基总体积的0.1％-1％；
S32：采用1mol/L的无菌碳酸钠调节pH，pH值为7.0-7.2，温度为33-35℃，摇床转速为50-70rpm，培养65-72h。
6.根据权利要求5所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于，所述步骤S3中，细胞种毒接种23-24h后，每隔2.5-3.5h采样检测病毒含量、细胞密度和细胞活力，当病毒液血凝价＞29、细胞密度＜0.5×106个/ml且细胞活力＜30％时，收获禽流感病毒，将摇床细胞反应器与离心机无菌连接，离心，得到澄清液，将澄清液转入灭活罐中，用终浓度为1‰甲醛4℃灭活，灭活时间至少为48h，得到灭活抗原。
7.根据权利要求6所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于，所述细胞种毒的病原类型为H5N1亚型或H7N9亚型。
8.根据权利要求7所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于，
所述灭活抗原转移至4℃冷藏库存储或制备成制苗抗原。
9.根据权利要求8所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于，将病原类型为H5N1亚型和H7N9亚型的两种灭活抗原，按照1：2混合，得到二价苗制苗抗原，将所述二价苗制苗抗原与矿物油佐剂按照1：2-1：3混合，乳化，检验合格后分装，即得禽流感灭活疫苗。
10.一种禽流感灭活疫苗产品，其特征在于：采用如权利要求1-9任意一项所述的生产工艺制得。
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