CN105288610A - 一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品，步骤一：采用无血清培养基全悬浮传代培养种细胞，所述种细胞为MDCK-α-2，3Gal；步骤二：将步骤一培养的种细胞接种细胞种毒，培养禽流感病毒，制备制苗抗原；步骤三：将步骤二制备的制苗抗原，进行稀释乳化制备疫苗，检验合格后定量分装即可；本发明具有有效降低生产成本，成品疫苗质量高，满足规模化、工业化生产优质禽流感灭活疫苗需求的特点，疫苗成品可以是单价苗、二价苗或三价苗，扩大疫苗的免疫范围，增强免疫效果，培养过程中不需更换培养基，有助于降低污染率，简化培养过程。

Description

一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品

技术领域

本发明涉及疫苗制备技术领域，具体而言涉及一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品。

背景技术

禽流感是由A型禽流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被国际兽疫局定为A类传染病。目前，疫苗免疫是国内外防治禽流感爆发的主要措施，由于MDCK细胞对各种流感病毒均较敏感，已广泛应用于流感病毒的感染、检测及培养等领域。

由于MDCK细胞具有须贴附而生长的特性，大多数厂家采用微载体细胞悬浮培养，此工艺适用于难以驯化为全悬浮的细胞，其最大培养体积不超过300升，载体培养在成本、细胞密度、操作简便性和工业放大等方面有重大的先天缺陷；少数厂家采用全悬浮细胞培养，但是使用含有动物源血清成分的培养基，提高了外源污染几率，生产成本高，所得细胞密度不高，难以达到高滴度，所接种毒仍为鸡胚毒，在培养过程中需要更换培养基，增加了污染的几率，生产过程过于繁琐；病毒液需浓缩后使用，使得产量大大降低，所生产的疫苗成品是单价苗，免疫范围过于单一，不能实现大规模工业化生产，无法满足规模化、工业化生产优质禽流感灭活疫苗的需求。

普通MDCK细胞同时存在α-2,3和α-2,6唾液酸转移酶I，而禽流感病毒倾向识别α-2,3唾液酸转移酶I，提高MDCK细胞表面α-2,3唾液酸转移酶I的受体丰度，可提高禽流感病毒吸附细胞的几率，提高禽流感病毒的滴度。

专利CN101613678A公开了一种MDCK-ST3GALI细胞系，采用此细胞系培养的禽流感病毒，在病毒滴度和蚀斑大小方面均优于普通的MDCK细胞，但是，如何将此细胞系作为种细胞培养禽流感病毒，进而获得禽流感疫苗，是一项值得技术人员深入研究和解决的技术问题。

发明内容

本发明提供了一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种禽流感灭活疫苗生产工艺，包括以下步骤：

步骤一：采用无血清培养基全悬浮传代培养种细胞，所述种细胞为MDCK-α-2，3Gal，所述MDCK-α-2，3Gal的制备方法与专利CN101613678A公开的方法相同，本发明中不再赘述；

步骤二：将步骤一培养的种细胞接种细胞种毒，培养禽流感病毒，制备制苗抗原；

步骤三：将步骤二制备的制苗抗原，进行稀释乳化制备疫苗，检验合格后定量分装即可。

进一步，采用无血清培养基全悬浮传代培养种细胞的方法为：

(1)将无血清培养基放置在36.5-37.5℃水中，加热30-40min；

(2)取种细胞冻存管，置于36.5-37.5℃的水中，并震荡使其完全融化，将细胞冻存管中的悬液转移至细胞培养瓶；

(3)取经步骤(1)处理的无血清培养基100-120ml，加入细胞培养瓶中，使初始细胞密度为0.5×10⁶-1×10⁶个/ml，并将细胞培养瓶转移至培养箱中培养；

(4)当细胞培养瓶中的细胞存活率≥90％，且细胞密度为1×10⁶-10×10⁶个/ml时，将细胞培养瓶内的种细胞无菌移种到不同体积的细胞反应器中，进行逐级放大培养。

进一步，所述细胞反应器的体积为7-2000L，所述细胞反应器内初始细胞密度0.5×10⁶-1×10⁶个/ml，所述种细胞至少经过3种不同体积的细胞反应器传代培养，并且细胞反应器的转速按照前者转速的10-20％逐级降低。

进一步，所述种细胞在细胞反应器内的培养条件为：

pH值为6.95-7.15，溶氧浓度为45％-55％，温度为36.5-37℃，转速为60-90rmp，压强为100-200mbar。

进一步，在培养过程中，向细胞反应器内通入无菌的1-1.5N的NaHCO₃补料液，并实时监测细胞反应器内葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于3g/L时，向细胞反应器内流加不含钠离子的流加培养基，所述流加培养基为无血清培养基的8-10倍浓缩液。

在培养过程中，种细胞会消耗细胞反应器内培养基的营养成分，为了保障种细胞的正常生长，当葡萄糖含量低于3g/L时，向细胞反应器内流加高浓度的培养基，而培养基中的钠离子会改变溶液的渗透压，因此，选择不含钠离子的流加培养基。

进一步，所述步骤二中，将步骤一培养的种细胞接种细胞种毒，培养禽流感病毒的方法为：

(1)进行种毒接种时，细胞反应器中细胞存活率≥90％，且细胞密度为3×10⁶-15×10⁶个/ml，细胞种毒接种剂量为细胞反应器内培养基总体积的1％-10％；

(2)种毒接种后，将细胞反应器的温度设置为39-41℃，并将转速降低40-50％，维持2-4h；

(3)将细胞反应器的转速恢复至种毒接种时转速，每6-8h降低1-2℃；

(4)细胞种毒接种23-24h后，每隔2.5-3.5h采样检测病毒含量、细胞密度和细胞活力，当病毒液血凝价＞2¹⁰，细胞密度＜3×10⁶个/ml，且细胞活力＜30％时，收获禽流感病毒；

(5)将禽流感病毒进行澄清、灭活处理，按照常规方式制备制苗抗原。

降低转速，有助于增加细胞种毒与种细胞的接触几率，从而提高细胞种毒吸附效率，提高病毒滴度，同时，将细胞反应器的温度设置为39-41℃，有助于促使种细胞表面与细胞种毒结合的受体充分展开，并有效结合。

进一步，所述细胞种毒的病原类型为H5N1亚型或H9N1亚型。

进一步，所述细胞种毒的制备方法为：

将所述种细胞采用无血清培养基进行全悬浮传代培养，当细胞密度达到9×10⁶-10×10⁶个/ml时，接入禽流感病毒的病原，禽流感病毒接入剂量为细胞反应器内培养基总体积的3％-4％，在35-36℃条件下，培养46-50h，经-70℃冻融后离心，血凝价＞1：2¹⁰时，收获细胞种毒，并将其保存在-70℃至-60℃的环境中，备用。

细胞种毒可以避免鸡胚的诸多缺陷，有效避免种间病毒传播，另外，鸡胚种毒成本高、产能低、污染环境，而细胞种毒可大批量生产、清洁环保。

进一步，所述步骤三中，将步骤二制备的制苗抗原，进行稀释乳化制备疫苗的方法为：

将所述制苗抗原使用磷酸盐缓冲液稀释为水相，将水相、矿物油佐剂按照1：2-1：3混合乳化，所述制苗抗原为单价苗、二价苗或三价苗，所述单价苗的制苗抗原稀释4-20倍，所述二价苗的制苗抗原稀释2-10倍，所述三价苗的制苗抗原稀释2-6倍。

另，本发明还提供了一种禽流感灭活疫苗产品，所述疫苗产品采用所述的生产工艺制得。

所述疫苗产品可以为H5N1疫苗或H9N1疫苗，并且所述疫苗产品可以为单价苗、二价苗或三价苗，有助于扩大疫苗的免疫范围，增强免疫效果，适用范围广，实用性强。

为了提高种细胞的密度，获得高滴度的禽流感病毒，发明人对种细胞的培养条件进行如下优选：

一、发明人选用NaHCO₃作为补料液，由于NaHCO₃呈现弱碱性，其通入细胞反应器后，不会引起反应器内局部pH值迅速升高，能够比较温和、平稳的调节反应器内的pH值；而行业内现用NaOH作为补料液，由于NaOH呈现强碱性，能够在一定程度上降低培养基的缓冲能力，并且容易引起反应器内局部pH值迅速升高，不利于种细胞的生长；

二、发明人经过研究发现，细胞反应器内的pH值呈酸性时，种细胞呼吸产生的CO₂等排泄物较难排出，排泄物长时间积累后，容易导致种细胞死亡；而细胞反应器内的pH值呈碱性时，种细胞的生长速度慢，因此，发明人将pH值设置为6.95-7.15，为种细胞生长提供较优的中性环境；

三、发明人将溶氧浓度设置为45％-55％，溶氧浓度高，容易导致细胞反应器内pH值呈碱性；溶氧浓度低，促使种细胞呼吸不畅，生长缓慢，导致种细胞进入无氧呼吸阶段，导致细胞反应器内pH值呈酸性；

四、细胞反应器内的温度高时，容易引起种细胞内的蛋白质变性，导致种细胞失去活性死忙；相反，细胞反应器内的温度低时，导致种细胞内的各种酶活性降低，新陈代谢缓慢，进而影响种细胞生长，因此，发明人将种细胞的生长温度设置为36.5-37℃；

五、细胞反应器内的压强低于外界大气压时，外界空气容易进入细胞反应器中，增加污染率；细胞反应器内的压强明显高于外界大气压时，种细胞容易破裂，并且增加了氧气通入难度，导致溶氧浓度过低，因此，发明人将压强设置为100-200mbar；

六、发明人将转速设置为60-90rmp，并且细胞反应器的转速按照前者转速的10-20％逐级降低，种细胞借助体积不断增大的细胞反应器，实现逐级放大培养，伴随着体积增大，在搅拌作用下，细胞反应器内产生涡流的维持时间加长，导致培养基、种细胞和补料液等混合物的流动惯性增大，因此，需要逐级降低转速，另外，转速过快产生较大的涡流剪切力，容易破坏种细胞。

以上所述培养条件相辅相成，共同发挥作用，促使本发明培养出高密度的种细胞，同时，发明人采用细胞种毒进行接毒，并将细胞反应器内的温度进行调整，为禽流感病毒的生长提供合适的温度环境，促使本发明培养出高滴度的禽流感病毒，制得免疫效果显著的疫苗。

本发明的有益效果如下：

1、本发明采用全悬浮培养MDCK-α-2，3Ga细胞技术生产禽流感病毒，提供了一种全新的生产工艺，且生产出的禽流感病毒需要经过稀释后使用，具有成品疫苗质量高、有效提高产量的特点。

2、本发明使用无血清培养基，并且对种细胞的培养条件进行优选，显著提高了种细胞密度，在接毒过程中接种细胞种毒，一次性完成培养过程，不需要更换培养基，有效减少培养过程中的外源污染率，得到高滴度的禽流感病毒，具有简化培养过程、提高疫苗的免疫效果、降低生产成本的特点。

3、本发明对种细胞培养过程中的pH值、溶氧浓度、温度、转速和压强进行优选，为种细胞创造较优的培养条件，同时发明人选用NaHCO₃作为补料液，能够温和调节pH值，避免破坏种细胞，有助于种细胞生长，显著提高细胞密度。

4、本发明培养的种细胞密度高，因此，可以实现7-2000L的生物反应器培养规模，满足了规模化、工业化生产优质禽流感灭活疫苗的需求。

5、本发明在培养过程中向细胞反应器内流加不含钠离子的培养基，既能维持细胞反应器内葡萄糖的含量，又不会改变溶液的渗透压，为种细胞提供良好的培养环境。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

本实施例中，所述无血清培养基的名称为所述细胞种毒的病原类型为H5N1亚型，分支为Re-6株，所述流加培养基为无血清培养基的8倍浓缩液。

一种禽流感灭活疫苗生产工艺，所述生产工艺包括以下步骤：

步骤一：采用无血清培养基全悬浮传代培养种细胞；

(1)将无血清培养基放置在36.5℃水中，加热30min；

(2)取1支MDCK-α-2，3Gal细胞冻存管，置于36.5℃的水中，并震荡使其完全融化，将细胞冻存管中的悬液转移至摇瓶中；

(3)在摇瓶中加入100ml的无血清培养基，初始细胞密度为0.5×10⁶个/ml，并将摇瓶转移至二氧化碳培养箱中培养，其中，二氧化碳的浓度为4％；

(4)检测到摇瓶内细胞存活率为91％，且细胞密度为2×10⁶个/ml时，将摇瓶内的MDCK-α-2，3Gal细胞无菌移种到7L细胞反应器进行培养，初始细胞密度为0.5×10⁶个/ml；

(5)检测到细胞存活率为91.5％，细胞密度为4.5×10⁶个/ml时，将MDCK-α-2，3Gal细胞无菌移种到130L细胞反应器培养，初始细胞密度为0.5×10⁶个/ml；

(6)检测到细胞存活率为93％，细胞密度为8.2×10⁶个/ml时，将MDCK-α-2，3Gal细胞无菌移种到650L细胞反应器培养，初始细胞密度为0.5×10⁶个/ml；

(7)检测到细胞存活率为93.5％，细胞密度为11.6×10⁶个/ml时，将MDCK-α-2，3Gal细胞无菌移种到2000L细胞反应器培养，初始密度为0.5×10⁶个/ml；

上述7L、130L、650L、2000L细胞反应器的校准方法如下：

(1)校准细胞反应器pH电极和pO₂电极，将无菌1NNaHCO₃补料液连接至细胞反应器补料口；

(2)将细胞反应器及附属管道用纯蒸汽SIP35min(≥121℃)；

(3)调节细胞反应器的压强，设定pH值、温度、转速等参数，通入压缩空气校准溶氧电极，溶氧稳定后进行溶氧斜率校准，设定溶氧参数；

上述7L、130L细胞反应器内的培养条件为：pH值为6.95，溶氧浓度为45％，温度为36.5℃，压强为120mbar，7L细胞反应器内的转速为90rmp，130L细胞反应器内的转速为80rmp；

上述650L、2000L细胞反应器内的培养条件为：pH值为7.0，溶氧浓度为50％，温度为37℃，压强为150mbar，650L细胞反应器内的转速为70rmp，2000L细胞反应器内的转速为60rmp；

当各细胞反应器内葡萄糖含量低于3g/L时，向细胞反应器内流加不含钠离子的流加培养基，初始细胞密度过低时，导致细胞群体效应差，细胞生长缓慢；

步骤二：将步骤一培养的种细胞接种细胞种毒，培养禽流感病毒，制备制苗抗原；

(1)检测到2000L细胞反应器中细胞存活率为95％，且细胞密度为14.6×10⁶个/ml时，领取H5N1亚型Re-6株细胞种毒，按照细胞反应器内培养基总体积的1％，接入反应器，种毒接种后，将细胞反应器的温度设置为39℃，并将转速降低40％，维持2h，之后每6h降低1℃，并将转速恢复至种毒接种时速度，细胞种毒接种23h后，每隔2.5h采样检测病毒含量、细胞密度和细胞活力，当病毒液血凝价为2048，细胞密度为2.5×10⁶个/ml，且细胞活力为25％时，收获禽流感病毒；

(2)将收获的禽流感病毒，利用连续流离心机离心，得到澄清液转入灭活罐中，用终浓度为2‰甲醛灭活，按照常规方式制备制苗抗原；

所述细胞种毒的制备方法为：将所述种细胞采用上述培养方式进行传代培养，当细胞密度达到9×10⁶个/ml时，接入Re-6株，Re-6株的接入剂量为细胞反应器内培养基总体积的3％，在35℃条件下，培养46h，经-70℃冻融后离心，血凝价＞1：2¹⁰时，收获细胞种毒，并将其保存在-70℃的环境中，备用；

步骤三：将步骤二制备的制苗抗原，使用磷酸盐缓冲液稀释15倍为水相，将水相、注射用白油按照1：2混合乳化，得到禽流感病毒H5N1亚型Re-6株疫苗成品，检验合格后，按照标准定量分装即可。

所述注射用白油由杭州石化有限责任公司提供，其生产批号为20140901，按照《重组禽流感病毒H5N1亚型灭活疫苗(细胞源，Re-6株)制造及检验试行规程》进行性状、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，测定结果如表1。

实施例二：

本实施例中，所述细胞种毒的病原类型为H5N1亚型，分支为Re-6株、Re-8株，所述流加培养基为无血清培养基的9倍浓缩液，本实施例与实施例一相同的部分不再赘述，不同的是：

步骤一：采用无血清培养基全悬浮传代培养种细胞；

(1)将无血清培养基放置在37℃水中，加热37min；

(2)取2支MDCK-α-2，3Gal细胞冻存管，分别置于37℃的水中，并震荡使其完全融化，将细胞冻存管中的悬液分别转移至锥形瓶中；

(3)在锥形瓶中加入110ml的无血清培养基，初始细胞密度为0.8×10⁶个/ml，分别将锥形瓶转移至二氧化碳培养箱中培养，其中，二氧化碳的浓度为5％；

(4)检测到锥形瓶内细胞存活率为96％，且细胞密度为1.5×10⁶个/ml时，分别将锥形瓶内的MDCK-α-2，3Gal细胞无菌移种到30L细胞反应器进行培养，初始细胞密度为0.7×10⁶个/ml；

(5)检测到细胞存活率为94.5％，细胞密度为5.5×10⁶个/ml时，分别将MDCK-α-2，3Gal细胞无菌移种到700L细胞反应器培养，初始细胞密度为0.8×10⁶个/ml；

(8)检测到细胞存活率为93％，细胞密度为9.2×10⁶个/ml时，分别将MDCK-α-2，3Gal细胞无菌移种到1500L细胞反应器培养，初始细胞密度为0.95×10⁶个/ml；

上述30L、700L细胞反应器内的培养条件为：pH值为6.98，溶氧浓度为50％，温度为36.8℃，压强为100mbar，30L细胞反应器内的转速为80rmp，700L细胞反应器内的转速为70rmp；

上述1500L细胞反应器内的培养条件为：pH值为7.1，溶氧浓度为55％，温度为36.9℃，压强为160mbar，1500L细胞反应器内的转速为60rmp；

步骤二：分别检测到1500L细胞反应器中细胞存活率为94％，且细胞密度为12.1×10⁶个/ml时，领取H5N1亚型Re-6株、Re-8株细胞种毒，按照细胞反应器内培养基总体积的5％，分别接入反应器，种毒接种后，将细胞反应器的温度均设置为40℃，并将转速降低45％，维持3h，之后每7h降低1.5℃，并将转速恢复至种毒接种时速度，细胞种毒接种23.5h后，每隔3h采样检测病毒含量、细胞密度和细胞活力，当病毒液血凝价为4096，细胞密度为1.9×10⁶个/ml，且细胞活力为22％时，收获禽流感病毒；

所述Re-6株、Re-8株细胞种毒的制备过程中，当细胞密度达到9.5×10⁶个/ml时，分别接入Re-6株、Re-8株，接入剂量均为细胞反应器内培养基总体积的3.5％，在35.5℃条件下，培养48h，经-70℃冻融后离心，血凝价＞1：2¹⁰时，收获细胞种毒，并将其保存在-65℃环境中，备用；

将两种禽流感病毒分别进行澄清、灭活，并将所述两者等比例混合作为二价苗的制苗抗原；

步骤三：将步骤二制备的制苗抗原，使用磷酸盐缓冲液稀释9倍为水相，将水相、美孚白矿油Marcol52按照1：2.5混合乳化，得到禽流感病毒H5N1亚型Re-6株+Re-8株二价苗成品，检验合格后，按照标准定量分装即可。

按照<<重组禽流感病毒H5N1亚型二价灭活疫苗(细胞源，Re-6株+Re-8株)制造及检验试行规程>>进行性状、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，测定结果如表1。

实施例三：

本实施例中，所述细胞种毒的病原类型为H5N1亚型，分支为Re-6株、Re-7株、Re-8株，所述流加培养基为无血清培养基的10倍浓缩液，本实施例与实施例一相同的部分不再赘述，不同的是：

步骤一：采用无血清培养基全悬浮传代培养种细胞，其中，取3支MDCK-α-2，3Gal细胞冻存管，水浴环境为37.5℃，在摇瓶中分别加入120ml的无血清培养基，初始细胞密度为1×10⁶个/ml，并将摇瓶分别转移至二氧化碳培养箱中培养，二氧化碳的浓度为6％；

(1)检测到摇瓶内细胞存活率为93.4％，且细胞密度为2.2×10⁶个/ml时，分别将摇瓶内的MDCK-α-2，3Gal细胞无菌移种到50L细胞反应器进行培养，初始细胞密度为0.85×10⁶个/ml；

(2)检测到细胞存活率为95.2％，细胞密度为6.3×10⁶个/ml时，分别将MDCK-α-2，3Gal细胞无菌移种到1200L细胞反应器培养，初始细胞密度1×10⁶个/ml；

(3)检测到细胞存活率为96.7％，细胞密度为13.9×10⁶个/ml时，分别将MDCK-α-2，3Gal细胞无菌移种到2000L细胞反应器培养，初始细胞密度为0.9×10⁶个/ml；

上述50L细胞反应器内的培养条件为：pH值为7.0，溶氧浓度为53％，温度为37℃，压强为130mbar，50L细胞反应器内的转速为80rmp；

上述1200L、2000L细胞反应器内的培养条件为：pH值为7.06，溶氧浓度为65％，温度为36.7℃，压强为180mbar，1200L细胞反应器内的转速为70rmp，2000L细胞反应器内的转速为60rmp；

步骤二：分别检测到2000L细胞反应器中细胞存活率为97.2％，且细胞密度为14.8×10⁶个/ml时，领取H5N1亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株细胞种毒，按照细胞反应器内培养基总体积的10％，分别接入反应器，种毒接种后，将细胞反应器的温度均设置为41℃，并将转速降低50％，维持4h，之后每8h降低2℃，并将转速恢复至种毒接种时速度，细胞种毒接种24h后，每隔3.5h采样检测病毒含量、细胞密度和细胞活力，当病毒液血凝价为8192，细胞密度为1.7×10⁶个/ml，且细胞活力为21％时，收获禽流感病毒；

所述Re-6株、Re-7株、Re-8株细胞种毒的制备过程中，当细胞密度达到10×10⁶个/ml时，分别接入Re-6株、Re-7株、Re-8株，接入剂量均为细胞反应器内培养基总体积的4％，在36℃条件下，培养50h，经-70℃冻融后离心，血凝价＞1：2¹⁰时，收获细胞种毒，并将其保存在-60℃环境中，备用；

将三种禽流感病毒分别进行澄清、灭活，并将所述三者等比例混合作为三价苗的制苗抗原；

步骤三：将步骤二制备的制苗抗原，使用磷酸盐缓冲液稀释4倍为水相，将水相、sonneborn低粘度矿物油(型号为ytol)按照1：3混合乳化，得到禽流感病毒H5N1亚型Re-6株+Re-7+Re-8株三价苗成品，检验合格后，按照标准定量分装即可。

按照<<重组禽流感病毒H5N1亚型三价灭活疫苗(细胞源，Re-6株+Re-7+Re-8株)制造及检验试行规程>>进行性状、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，测定结果如表1：

表1：

上述数据由山东信得动物疫苗有限公司提供

对比实验一：

将普通MDCK细胞作为种细胞，采用普通全悬浮培养工艺，制备禽流感病毒H5N1亚型Re-6株疫苗，标记为疫苗一；本发明实施例一中所得产品标记为疫苗二；

所述普通全悬浮培养工艺，采用无血清培养基，NaOH作为补料液，流加含钠离子的培养基，接种鸡胚毒，各细胞反应器内转速、温度均相同，其他培养条件与本发明实施例一中的条件相同，对所述两种疫苗进行分析，得出数据如表2：

表2：

上述数据由山东信得动物疫苗有限公司提供

通过如上数据分析，在细胞数量、病毒滴度和产能方面，疫苗二显著优于疫苗一，且免疫效果显著，综合以上数据，本发明选用MDCK-α-2，3Gal细胞作为种细胞，有助于提高受体丰度，同时，对培养条件进行优选，获得高细胞密度、高病毒滴度的禽流感病毒，从而适应规模化、工业化生产优质禽流感灭活疫苗的需求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：采用无血清培养基全悬浮传代培养种细胞，所述种细胞为MDCK-α-2，3Gal；

步骤二：将步骤一培养的种细胞接种细胞种毒，培养禽流感病毒，制备制苗抗原；

步骤三：将步骤二制备的制苗抗原，进行稀释乳化制备疫苗，检验合格后定量分装即可。

2.根据权利要求1所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于：采用无血清培养基全悬浮传代培养种细胞的方法为：

(1)将无血清培养基放置在36.5-37.5℃水中，加热30-40min；

(2)取种细胞冻存管，置于36.5-37.5℃的水中，并震荡使其完全融化，将细胞冻存管中的悬液转移至细胞培养瓶；

(3)取经步骤(1)处理的无血清培养基100-120ml，加入细胞培养瓶中，使初始细胞密度为0.5×10⁶-1×10⁶个/ml，并将细胞培养瓶转移至培养箱中培养；

(4)当细胞培养瓶中的细胞存活率≥90％，且细胞密度为1×10⁶-10×10⁶个/ml时，将细胞培养瓶内的种细胞无菌移种到不同体积的细胞反应器中，进行逐级放大培养。

3.根据权利要求2所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于：所述细胞反应器的体积为7-2000L，所述细胞反应器内初始细胞密度0.5×10⁶-1×10⁶个/ml，所述种细胞至少经过3种不同体积的细胞反应器传代培养，并且细胞反应器的转速按照前者转速的10-20％逐级降低。

4.根据权利要求3所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于：所述种细胞在细胞反应器内的培养条件为：

pH值为6.95-7.15，溶氧浓度为45％-55％，温度为36.5-37℃，转速为60-90rmp，压强为100-200mbar。

5.根据权利要求4所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于：在培养过程中，向细胞反应器内通入无菌的1-1.5N的NaHCO₃补料液，并实时监测细胞反应器内葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于3g/L时，向细胞反应器内流加不含钠离子的流加培养基，所述流加培养基为无血清培养基的8-10倍浓缩液。

6.根据权利要求5所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于：所述步骤二中，将步骤一培养的种细胞接种细胞种毒，培养禽流感病毒的方法为：

(1)进行种毒接种时，细胞反应器中细胞存活率≥90％，且细胞密度为3×10⁶-15×10⁶个/ml，细胞种毒接种剂量为细胞反应器内培养基总体积的1％-10％；

(2)种毒接种后，将细胞反应器的温度设置为39-41℃，并将转速降低40-50％，维持2-4h；

(3)将细胞反应器的转速恢复至种毒接种时转速，每6-8h降低1-2℃；

(4)细胞种毒接种23-24h后，每隔2.5-3.5h采样检测病毒含量、细胞密度和细胞活力，当病毒液血凝价＞2¹⁰，细胞密度＜3×10⁶个/ml，且细胞活力＜30％时，收获禽流感病毒；

(5)将禽流感病毒进行澄清、灭活处理，按照常规方式制备制苗抗原。

7.根据权利要求6所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于：所述细胞种毒的病原类型为H5N1亚型或H9N1亚型。

8.根据权利要求7所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于：所述细胞种毒的制备方法为：

将所述种细胞采用无血清培养基进行全悬浮传代培养，当细胞密度达到9×10⁶-10×10⁶个/ml时，接入禽流感病毒的病原，禽流感病毒接入剂量为细胞反应器内培养基总体积的3％-4％，在35-36℃条件下，培养46-50h，经-70℃冻融后离心，血凝价＞1：2¹⁰时，收获细胞种毒，并将其保存在-70℃至-60℃的环境中，备用。

9.根据权利要求8所述的一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于：所述步骤三中，将步骤二制备的制苗抗原，进行稀释乳化制备疫苗的方法为：

将所述制苗抗原使用磷酸盐缓冲液稀释为水相，将水相、矿物油佐剂按照1：2-1：3混合乳化，所述制苗抗原为单价苗、二价苗或三价苗，所述单价苗的制苗抗原稀释4-20倍，所述二价苗的制苗抗原稀释2-10倍，所述三价苗的制苗抗原稀释2-6倍。

10.一种禽流感灭活疫苗产品，其特征在于：采用如权利要求1-9任意一项所述的生产工艺制得。