CN108753737A - 一种在mdck全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法及其应用 - Google Patents

一种在mdck全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种在MDCK全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法及其应用。所述方法包括：将MDCK细胞全悬浮培养至7.0×106～1.0×107cells/mL时，按MOI＝0.001～0.0001接种鸡胚禽流感病毒；接毒后在pH值6.9～7.3、溶氧30～60％、温度32～37℃的环境下培养，当病毒达到足够高的滴度后分离并提纯病毒粒子。本方法由于种毒无需循环，因而缩短了生产周期，且种毒变异风险大大降低。通过本发明提供的方法培养重组禽流感病毒的HA能够达到1:1024，每1ml病毒含量≥108.0TCID50，每0.1ml病毒含量≥108.0TCID50，而种毒的接入量量减少10倍以上。

Description

一种在MDCK全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种在MDCK全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法及其应用。
背景技术
现有的重组禽流感病毒在MDCK悬浮细胞上增殖方法，主要是采用鸡胚种毒在贴壁生长的MDCK细胞上进行5-10代的传代驯化，使病毒逐渐适应在贴壁细胞上增殖，然后将在贴壁细胞上驯化适应好的贴壁毒接种至悬浮细胞上再进行1-3代的传代驯化，适应了悬浮细胞的病毒才能投入至大生产进行抗原的生产，整个的种毒驯化过程需要耗费大量的人力物力，驯化时间也较长(3-6个月)，即使驯化完成后种毒的接入量也会较大(0.1％-0.3％)。再者由于禽流感病毒有16个HA亚型和9个NA亚型比较容易发生变异，通过在细胞上连续进行传代后其免疫原性可能发生不可逆转的改变。
综上所述目前所使用的这种重组禽流感病毒在MDCK悬浮细胞上增殖方法不仅较为复杂，而且病毒的驯化周期也会比较长，不利于流感大流行时疫苗的及时稳定的供应，最终病毒在细胞上连续传代其免疫效果也难以得到保证。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在MDCK全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法，所述的方法简单，种毒无需驯化，扩繁后即可使用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种在MDCK全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法，包括：
将MDCK细胞全悬浮培养至7.0×106～1.0×107cells/mL时，按MOI＝0.001～0.0001接种鸡胚禽流感病毒；
接毒后在pH值6.9～7.3、溶氧30～60％、温度32～37℃的环境下培养，当病毒达到足够高的滴度后分离并提纯病毒粒子。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
由于种毒无需循环，因而缩短了生产周期，且种毒变异风险大大降低。通过本发明提供的方法培养重组禽流感病毒的HA能够达到1:1024，每1ml病毒含量≥108.0TCID50，每0.1ml病毒含量≥108.0TCID50，而种毒的接入量量减少10倍以上。
本发明所提供的MDCK细胞系，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学中国典型培养物保藏中心。培养物名称(分类命名)：犬肾细胞MDCK-G01。
具体实施方式
本发明涉及一种在MDCK全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法，包括：
将MDCK细胞全悬浮培养至7.0×106～1.0×107cells/mL(也可以选择8.0×106cells/mL或9.0×106cells/mL)时，按MOI＝0.001～0.0001(也可以选择0.0003～0.0008，或0.0005)接种鸡胚禽流感病毒；
接毒后在pH值6.9～7.3、溶氧30～60％、温度32～37℃的环境下培养，当病毒达到足够高的滴度后分离并提纯病毒粒子；
优选的，如上所述的方法，在接种鸡胚禽流感病毒时还按照3～8μg/mL的量添加胰蛋白酶，还可以选择4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL。
胰蛋白酶能够将HA活化裂解为HA1和HA2，从而增强其感染细胞的能力。
优选的，如上所述的方法，在接种鸡胚禽流感病毒时，先将所述MDCK细胞稀释至3.5×106～5.0×106cells/mL；还可以选择4.0×106cells/mL、4.5×106cells/mL。
优选的，如上所述的方法，接毒后培养的时间为48～72小时，且当细胞活率降至50～60％时分离并提纯病毒粒子。
优选的，如上所述的方法，所述MDCK细胞，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201857，保藏时间为2018年2月10日。
该细胞系生长速率快，还具有很强的耐低氧能力，由于大型生物反应器容积较大，偶尔会发生氧气搅拌不均的问题，因而更易造成细胞缺氧死亡。该细胞系尤其适合于大型生物反应器的培养。
优选的，如上所述的方法，所述禽流感病毒选自H5N1亚型Re-8株或H7N9亚型H7-Re1株。
优选的，如上所述的方法，所述全悬浮培养在无血清培养基下进行；
优选的，以溶解后为1升溶液计算，所述培养基(又称GJ-pyj201培养基)包括以下成分：
生物素1～10×10-8M、氯化钙1～5×10-3M、硫酸铜2.8～12.8×10-9M、氰钴胺1～10×10-7M、D-泛酸钙2～8×10-5M、D-葡萄糖1.6～2.0×10-2M、硫酸亚铁2～10×10-6M、叶酸0.5～1.5×10-4M、谷胱甘肽3.5～9.5×10-7M、氢化可的松3～7×10-8M、次黄嘌呤1～5×10-5M、肌醇1～10×10-5M、硝酸铁0.3～2×10-7M、L-丙氨酸1～20×10-5M、L-精氨酸1～20×10-4M、L-天冬酰胺1～20×10-5M、L-天冬氨酸1～20×10-5M、L-半胱氨酸0.1～10×10-4M、L-胱氨酸0.1～10×10-4M、L-谷氨酸1～20×10-5M、L-谷氨酰胺1～10×10-3M、甘氨酸1～10×10-4M、L-组氨酸0.5～10×10-4M、L-异亮氨酸0.5～10×10-4M、L-亮氨酸0.5～10×10-4M、L-赖氨酸1～20×10-4M、L-蛋氨酸1～10×10-4M、L-苯丙氨酸1～10×10-4M、L-脯氨酸0.1～10×10-4M、L-丝氨酸1～20×10-4M、L-苏氨酸1～20×10-4M、L-色氨酸1～20×10-5M、L-酪氨酸1～10×10-4M、L-缬氨酸1～20×10-4M、硫辛酸1～20×10-7M、氯化镁1～20×10-5M、硫酸镁1～20×10-4M、烟酰胺1～20×10-5M、对氨基苯甲酸0.5～5g、氯化钾1～10×10-3M、腐胺1～10×10- 7M、吡多辛1～10×10-7M、核黄素1～10×10-7M、碳酸氢钠1～10×10-2M、氯化钠0.5～10×10-1M、磷酸氢二钠1～10×10-4M、磷酸二氢钠1～10×10-4M、丙酮酸钠0.1～10×10-3M、硫胺素1～20×10-6M、胸腺嘧啶脱氧核苷0.5～10×10-6M、硫酸锌0.1～10×10-6M、氯化胆碱0.1～10×10-4M、胰岛素5～15mg、转铁蛋白5～15mg、三典甲状腺氨酸1～20×10-12M以及二硫苏糖醇1～20×10-6M；
优选的，以溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素2～5×10-8M、氯化钙1～3×10-3M、硫酸铜5.8～9.8×10-9M、氰钴胺1～5×10-7M、D-泛酸钙2～7×10-5M、D-葡萄糖1.3～2.2×10-2M、硫酸亚铁1～8×10-6M、叶酸0.5～1.5×10-4M、谷胱甘肽3.5～9.5×10-7M、氢化可的松3～8×10-8M、次黄嘌呤1～5×10-5M、肌醇5～9×10-5M、硝酸铁0.8～1.6×10-7M、L-丙氨酸2～8×10-5M、L-精氨酸4～10×10-4M、L-天冬酰胺2～8×10-5M、L-天冬氨酸2～8×10-5M、L-半胱氨酸0.5～2×10-4M、L-胱氨酸0.5～2×10-4M、L-谷氨酸2～8×10-5M、L-谷氨酰胺1～4×10-3M、甘氨酸1～4×10-4M、L-组氨酸0.5～2.5×10-4M、L-异亮氨酸3～5×10-4M、L-亮氨酸3～6×10-4M、L-赖氨酸2～8×10-4M、L-蛋氨酸0.8～1.6×10-4M、L-苯丙氨酸1～4×10-4M、L-脯氨酸1～4×10-4M、L-丝氨酸1～4×10- 4M、L-苏氨酸2～6×10-4M、L-色氨酸2～6×10-5M、L-酪氨酸1～4×10-4M、L-缬氨酸2～6×10-4M、硫辛酸2～8×10-7M、氯化镁2～9×10-5M、硫酸镁2～12×10-4M、烟酰胺1～4×10-5M、对氨基苯甲酸0.5～4.5g、氯化钾2～6×10-3M、腐胺2～8×10-7M、吡多辛0.5～3×10-7M、核黄素3～8×10-7M、碳酸氢钠1～6×10-2M、氯化钠0.5～2.5×10-1M、磷酸氢二钠2～8×10-4M、磷酸二氢钠2～7×10-4M、丙酮酸钠0.3～1.8×10-3M、硫胺素3～9×10-6M、胸腺嘧啶脱氧核苷0.5～4×10-6M、硫酸锌0.5～3×10-6M、氯化胆碱0.1～2×10-4M、胰岛素5～10mg、转铁蛋白5～10mg、三典甲状腺氨酸2～7×10-12M以及二硫苏糖醇2～9×10-6M。
优选的，以溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素3×10-8M、氯化钙2×10-3M、硫酸铜7.8×10-9M、氰钴胺3×10-7M、D-泛酸钙5×10-5M、D-葡萄糖1.8×10-2M、硫酸亚铁5×10-6M、叶酸1×10-4M、谷胱甘肽6.5×10-7M、氢化可的松5×10-8M、次黄嘌呤3×10-5M、肌醇7×10-5M、硝酸铁1.2×10-7M、L-丙氨酸5×10-5M、L-精氨酸7×10-4M、L-天冬酰胺5×10-5M、L-天冬氨酸5×10-5M、L-半胱氨酸1×10-4M、L-胱氨酸1×10-4M、L-谷氨酸5×10-5M、L-谷氨酰胺2.5×10-3M、甘氨酸2.5×10-4M、L-组氨酸1.5×10-4M、L-异亮氨酸4.2×10-4M、L-亮氨酸4.5×10-4M、L-赖氨酸5×10-4M、L-蛋氨酸1.2×10- 4M、L-苯丙氨酸2.2×10-4M、L-脯氨酸1.5×10-4M、L-丝氨酸2.5×10-4M、L-苏氨酸4.5×10- 4M、L-色氨酸4.4×10-5M、L-酪氨酸2.1×10-4M、L-缬氨酸4.5×10-4M、硫辛酸5.1×10-7M、氯化镁6×10-5M、硫酸镁7×10-4M、烟酰胺1.7×10-5M、对氨基苯甲酸2g、氯化钾4.2×10-3M、腐胺5×10-7M、吡多辛1.5×10-7M、核黄素5.8×10-7M、碳酸氢钠2.9×10-2M、氯化钠1.19×10- 1M、磷酸氢二钠5×10-4M、磷酸二氢钠4.5×10-4M、丙酮酸钠1×10-3M、硫胺素6.4×10-6M、胸腺嘧啶脱氧核苷1.5×10-6M、硫酸锌1.5×10-6M、氯化胆碱1×10-4M、胰岛素5mg、转铁蛋白5mg、三典甲状腺氨酸5×10-12M以及二硫苏糖醇6.5×10-6M。
更优选的，以溶解后为1升溶液计算，所述培养基还包括：
亚油酸0.5～4.5×10-7M、苯酚红1～6×10-5M、泊洛沙姆0.5～3.5g、前列腺素E2 3～10×10-8M、H2SeO3 1～5×10-8M以及Na2SiO3 2～9×10-7M；
以溶解后为1升溶液计算，所述培养基中的上述成分还可以选择下述的添加量：亚油酸2×10-7M、苯酚红3.6×10-5M、泊洛沙姆2g、前列腺素E27×10-8M、H2SeO3 3×10-8M以及Na2SiO3 5×10-7M。
优选的，如上所述的培养基，所述培养基溶解时所用的溶剂选自蒸馏水、超纯水、去离子水、注射用水、能与水以任意比互溶的醇、碱性水溶液和酸性水溶液中的一种或几种。
前述任一项所述的培养基的制备方法，包括：将所有培养基成份混在一起成培养基干粉后分散于溶剂中。
优选的，在制备时刻将将培养基大量组份进行精加工混在一起成培养基干粉，微量组份单独配成微量组份液。
优选的，如上所述的制备方法，所述方法还包括调节pH、过滤除菌。
优选的，如上所述的方法，所述方法还包括：
从所述病毒粒子中分离出病毒抗原并提纯和/或灭活。
根据本发明的一方面，本发明还涉及前述方法在制备禽流感病毒疫苗中的应用。
优选的，如上所述的应用，所述疫苗为减毒活疫苗、全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、重组载体疫苗或核酸疫苗。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种适应MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，以用超纯水溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素1×10-8M、氯化钙5×10-3M、硫酸铜2.8×10-9M、氰钴胺1×10-7M、D-泛酸钙2×10-5M、D-葡萄糖2.0×10-2M、硫酸亚铁2×10-6M、叶酸0.5×10-4M、谷胱甘肽9.5×10-7M、氢化可的松3×10-8M、次黄嘌呤1×10-5M、肌醇10×10-5M、硝酸铁0.3×10-7M、L-丙氨酸20×10-5M、L-精氨酸20×10-4M、L-天冬酰胺1×10-5M、L-天冬氨酸20×10-5M、L-半胱氨酸0.1×10- 4M、L-胱氨酸10×10-4M、L-谷氨酸1×10-5M、L-谷氨酰胺10×10-3M、甘氨酸1×10-4M、L-组氨酸10×10-4M、L-异亮氨酸0.5×10-4M、L-亮氨酸10×10-4M、L-赖氨酸1×10-4M、L-蛋氨酸10×10-4M、L-苯丙氨酸1×10-4M、L-脯氨酸10×10-4M、L-丝氨酸1×10-4M、L-苏氨酸20×10-4M、L-色氨酸1×10-5M、L-酪氨酸1×10-4M、L-缬氨酸20×10-4M、硫辛酸1×10-7M、氯化镁20×10- 5M、硫酸镁1×10-4M、烟酰胺20×10-5M、对氨基苯甲酸0.5g、氯化钾10×10-3M、腐胺1×10-7M、吡多辛10×10-7M、核黄素1×10-7M、碳酸氢钠10×10-2M、氯化钠1×10-1M、磷酸氢二钠10×10-4M、磷酸二氢钠1×10-4M、丙酮酸钠1×10-3M、硫胺素1×10-6M、胸腺嘧啶脱氧核苷10×10-6M、硫酸锌0.1×10-6M、氯化胆碱10×10-4M、胰岛素5mg、转铁蛋白15mg、三典甲状腺氨酸1×10-12M以及二硫苏糖醇20×10-6M。
制备方法为：将所有培养基成份进行精加工混在一起成培养基干粉，将按配方比例进行组合好的培养基干粉加入注射用水进行搅拌溶解20分钟，然后加入氢氧化钠搅拌20分钟，再加碳酸氢钠再进行搅拌20分钟，配制后pH＝7.2-7.4。
实施例2
一种适应MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，以用超纯水溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素3×10-8M、氯化钙2×10-3M、硫酸铜7.8×10-9M、氰钴胺3×10-7M、D-泛酸钙5×10-5M、D-葡萄糖1.8×10-2M、硫酸亚铁5×10-6M、叶酸1×10-4M、谷胱甘肽6.5×10-7M、氢化可的松5×10-8M、次黄嘌呤3×10-5M、肌醇7×10-5M、硝酸铁1.2×10-7M、L-丙氨酸5×10-5M、L-精氨酸7×10-4M、L-天冬酰胺5×10-5M、L-天冬氨酸5×10-5M、L-半胱氨酸1×10-4M、L-胱氨酸1×10-4M、L-谷氨酸5×10-5M、L-谷氨酰胺2.5×10-3M、甘氨酸2.5×10-4M、L-组氨酸1.5×10-4M、L-异亮氨酸4.2×10-4M、L-亮氨酸4.5×10-4M、L-赖氨酸5×10-4M、L-蛋氨酸1.2×10- 4M、L-苯丙氨酸2.2×10-4M、L-脯氨酸1.5×10-4M、L-丝氨酸2.5×10-4M、L-苏氨酸4.5×10- 4M、L-色氨酸4.4×10-5M、L-酪氨酸2.1×10-4M、L-缬氨酸4.5×10-4M、硫辛酸5.1×10-7M、氯化镁6×10-5M、硫酸镁7×10-4M、烟酰胺1.7×10-5M、对氨基苯甲酸2g、氯化钾4.2×10-3M、腐胺5×10-7M、吡多辛1.5×10-7M、核黄素5.8×10-7M、碳酸氢钠2.9×10-2M、氯化钠1.19×10- 1M、磷酸氢二钠5×10-4M、磷酸二氢钠4.5×10-4M、丙酮酸钠1×10-3M、硫胺素6.4×10-6M、胸腺嘧啶脱氧核苷1.5×10-6M、硫酸锌1.5×10-6M、氯化胆碱1×10-4M、胰岛素5mg、转铁蛋白5mg、三典甲状腺氨酸5×10-12M以及二硫苏糖醇6.5×10-6M。
制备方法为：以配制1升计，将培养基中质量大于0.1g的组份进行精加工混在一起成培养基干粉，培养基中质量小于0.1g的组份单独配成微量组份液。培养基干粉加入注射用水进行搅拌溶解30分钟，加入微量组份液搅拌10分钟，然后加入碳酸氢钠再进行搅拌10分钟，通过搅拌加入氢氧化钠调节pH＝7.2-7.4。
实施例3
一种适应MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，以用去离子水溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素2×10-8M、氯化钙3×10-3M、硫酸铜5.8×10-9M、氰钴胺5×10-7M、D-泛酸钙2×10-5M、D-葡萄糖2.2×10-2M、硫酸亚铁1×10-6M、叶酸1.5×10-4M、谷胱甘肽3.5×10-7M、氢化可的松8×10-8M、次黄嘌呤1×10-5M、肌醇9×10-5M、硝酸铁0.8×10-7M、L-丙氨酸8×10- 5M、L-精氨酸4×10-4M、L-天冬酰胺8×10-5M、L-天冬氨酸2×10-5M、L-半胱氨酸2×10-4M、L-胱氨酸0.5×10-4M、L-谷氨酸8×10-5M、L-谷氨酰胺1×10-3M、甘氨酸4×10-4M、L-组氨酸0.5×10-4M、L-异亮氨酸5×10-4M、L-亮氨酸3×10-4M、L-赖氨酸8×10-4M、L-蛋氨酸0.8×10-4M、L-苯丙氨酸4×10-4M、L-脯氨酸1×10-4M、L-丝氨酸4×10-4M、L-苏氨酸2×10-4M、L-色氨酸6×10-5M、L-酪氨酸1×10-4M、L-缬氨酸6×10-4M、硫辛酸2×10-7M、氯化镁9×10-5M、硫酸镁2×10-4M、烟酰胺4×10-5M、对氨基苯甲酸0.5g、氯化钾6×10-3M、腐胺2×10-7M、吡多辛3×10-7M、核黄素3×10-7M、碳酸氢钠6×10-2M、氯化钠0.5×10-1M、磷酸氢二钠8×10-4M、磷酸二氢钠2×10-4M、丙酮酸钠1.8×10-3M、硫胺素3×10-6M、胸腺嘧啶脱氧核苷4×10-6M、硫酸锌0.5×10-6M、氯化胆碱2×10-4M、胰岛素5mg、转铁蛋白10mg、三典甲状腺氨酸2×10-12M以及二硫苏糖醇9×10-6M。
制备方法为：将所有培养基成份进行精加工混在一起成培养基干粉，将按配方比例进行组合好的培养基干粉加入注射用水进行搅拌溶解20分钟，然后加入氢氧化钠搅拌20分钟，再加碳酸氢钠再进行搅拌20分钟，配制后pH＝7.2-7.4。
实施例4
一种适应MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，以用注射用水溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素5×10-8M、氯化钙1×10-3M、硫酸铜9.8×10-9M、氰钴胺1×10-7M、D-泛酸钙7×10-5M、D-葡萄糖1.3×10-2M、硫酸亚铁8×10-6M、叶酸0.5×10-4M、谷胱甘肽9.5×10-7M、氢化可的松3×10-8M、次黄嘌呤5×10-5M、肌醇5×10-5M、硝酸铁1.6×10-7M、L-丙氨酸2×10- 5M、L-精氨酸10×10-4M、L-天冬酰胺2×10-5M、L-天冬氨酸8×10-5M、L-半胱氨酸0.5×10-4M、L-胱氨酸2×10-4M、L-谷氨酸2×10-5M、L-谷氨酰胺4×10-3M、甘氨酸1×10-4M、L-组氨酸2.5×10-4M、L-异亮氨酸3×10-4M、L-亮氨酸6×10-4M、L-赖氨酸2×10-4M、L-蛋氨酸1.6×10-4M、L-苯丙氨酸1×10-4M、L-脯氨酸4×10-4M、L-丝氨酸1×10-4M、L-苏氨酸6×10-4M、L-色氨酸2×10-5M、L-酪氨酸4×10-4M、L-缬氨酸2×10-4M、硫辛酸8×10-7M、氯化镁2×10-5M、硫酸镁12×10-4M、烟酰胺1×10-5M、对氨基苯甲酸4.5g、氯化钾2×10-3M、腐胺8×10-7M、吡多辛0.5×10-7M、核黄素8×10-7M、碳酸氢钠1×10-2M、氯化钠2.5×10-1M、磷酸氢二钠2×10-4M、磷酸二氢钠7×10-4M、丙酮酸钠0.3×10-3M、硫胺素9×10-6M、胸腺嘧啶脱氧核苷0.5×10-6M、硫酸锌3×10-6M、氯化胆碱0.1×10-4M、胰岛素10mg、转铁蛋白5mg、三典甲状腺氨酸7×10-12M、二硫苏糖醇2×10-6M、亚油酸0.5×10-7M、苯酚红1×10-5M、泊洛沙姆3.5g、前列腺素E2 3×10-8M、H2SeO3 5×10-8M以及Na2SiO3 2×10-7M。
制备方法为：以配制1升计，将培养基中质量大于0.1g的组份进行精加工混在一起成培养基干粉，培养基中质量小于0.1g的组份单独配成微量组份液。培养基干粉加入注射用水进行搅拌溶解30分钟，加入微量组份液搅拌10分钟，然后加入碳酸氢钠再进行搅拌10分钟，通过搅拌加入氢氧化钠调节pH＝7.2-7.4。
实施例5
一种适应MDCK细胞全悬浮培养的无血清培养基，以用注射用水溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素3×10-8M、氯化钙2×10-3M、硫酸铜7.8×10-9M、氰钴胺3×10-7M、D-泛酸钙5×10-5M、D-葡萄糖1.8×10-2M、硫酸亚铁5×10-6M、叶酸1×10-4M、谷胱甘肽6.5×10-7M、氢化可的松5×10-8M、次黄嘌呤3×10-5M、肌醇7×10-5M、硝酸铁1.2×10-7M、L-丙氨酸5×10-5M、L-精氨酸7×10-4M、L-天冬酰胺5×10-5M、L-天冬氨酸5×10-5M、L-半胱氨酸1×10-4M、L-胱氨酸1×10-4M、L-谷氨酸5×10-5M、L-谷氨酰胺2.5×10-3M、甘氨酸2.5×10-4M、L-组氨酸1.5×10-4M、L-异亮氨酸4.2×10-4M、L-亮氨酸4.5×10-4M、L-赖氨酸5×10-4M、L-蛋氨酸1.2×10- 4M、L-苯丙氨酸2.2×10-4M、L-脯氨酸1.5×10-4M、L-丝氨酸2.5×10-4M、L-苏氨酸4.5×10- 4M、L-色氨酸4.4×10-5M、L-酪氨酸2.1×10-4M、L-缬氨酸4.5×10-4M、硫辛酸5.1×10-7M、氯化镁6×10-5M、硫酸镁7×10-4M、烟酰胺1.7×10-5M、对氨基苯甲酸2g、氯化钾4.2×10-3M、腐胺5×10-7M、吡多辛1.5×10-7M、核黄素5.8×10-7M、碳酸氢钠2.9×10-2M、氯化钠1.19×10- 1M、磷酸氢二钠5×10-4M、磷酸二氢钠4.5×10-4M、丙酮酸钠1×10-3M、硫胺素6.4×10-6M、胸腺嘧啶脱氧核苷1.5×10-6M、硫酸锌1.5×10-6M、氯化胆碱1×10-4M、胰岛素5mg、转铁蛋白5mg、三典甲状腺氨酸5×10-12M、二硫苏糖醇6.5×10-6M、亚油酸2×10-7M、苯酚红3.6×10- 5M、泊洛沙姆2g、前列腺素E2 7×10-8M、H2SeO3 3×10-8M以及Na2SiO3 5×10-7M。
制备方法为：以配制1升计，将培养基中质量大于0.1g的组份进行精加工混在一起成培养基干粉，培养基中质量小于0.1g的组份单独配成微量组份液。培养基干粉加入注射用水进行搅拌溶解30分钟，加入微量组份液搅拌10分钟，然后加入碳酸氢钠再进行搅拌10分钟，通过搅拌加入氢氧化钠调节pH＝7.2-7.4。
实施例6
本实验例提供了对保藏编号为CCTCC NO:C201857的MDCK细胞的培养效果。
一、方法
1.1摇瓶细胞的制备
按常规方法从液氮中复苏冻存的悬浮种细胞，用吸管将细胞液加入到500ml三角摇瓶中，加入pH值为7.0±0.2的过滤除菌无血清培养基至100ml。将摇瓶置于摇床内，37℃，120转/分～140转/分进行培养扩繁。待细胞数量足够时，可接种反应器培养。
1.2 5L反应器细胞培养
取经摇瓶培养好的悬浮MDCK细胞，以1.0～2.0×106cells/ml的密度接种到5L反应器培养，培养体积为2L，转速120转/分、温度37℃、溶氧40％～50％、pH值7.0±0.2，每隔24小时取样，观察细胞生长情况，同时进行细胞计数和葡萄糖含量测定。待细胞密度≥2.0×106cells/ml时，将5L反应器的培养体积流加至4.5L，调整反应器控制参数(转速120转/分～140转/分、温度37℃、溶氧40％～50％、pH值7.0±0.2)继续培养。每隔24小时取样，观察细胞生长情况，同时进行细胞计数和葡萄糖含量测定，待细胞密度达到6.0～9.0×106cells/ml时，转出4L至25L反应器内，余下0.5L用细胞培养液流加至5L体积继续培养。
1.3反应器放大培养
将从5L反应器转移出的细胞接入提前灭菌并预孵细胞培养液的25L反应器中培养，以1.0～2.0×106cells/ml的密度接种到25L反应器培养，培养体积为20L～25L，转速100转/分～130转/分、温度37℃、溶氧40％～50％、pH值7.0±0.2，每隔24小时取样，观察细胞生长情况，同时进行细胞计数和葡萄糖含量测定，待25L反应器的细胞密度达到6.0～9.0×106cells/ml时，将细胞转入提前灭菌并预孵细胞培养液的125L反应器中继续放大培养(转速80～100转/分、温度37℃、溶氧40％～50％、pH值7.0±0.2)。每隔24小时取样，观察细胞生长情况，同时进行细胞计数和葡萄糖含量测定，当细胞密度达到6.0～9.0×106cells/ml时，适时将细胞转入下一级放大的细胞反应器(5倍放大)，待终级反应器(6000L)细胞密度达到8.0×106～1.0×107cells/ml时可用于接毒培养。
1.4分别将3个6000L生物反应器准备好并灭菌备用，按照反应器编号将1#、2#、3#培养基以无菌的方法过滤至对应的反应器中预孵24h。培养基预孵后无异常即可按照1.5×106-2.0×106cells/mL的密度将种细胞分别接种至三个反应器，接种后调整好反应器温度37℃、pH7.0、溶氧30-60％、搅拌转速40-60rpm等参数并开启自控。接种后24h取样观察并进行细胞计数，接种后48h再次取样观察并计数，细胞的比生长速率μ应该≥0.69。当细胞密度达到8.0×106～9.0×106cells/mL左右时即可补充接毒液调整细胞密度进行接毒。
二、结果：
2.1三种培养基的细胞增殖情况对比
当种细胞的接种密度均为1.5×106～2.0×106cells/mL的情况下，培养0h、24h、48h时取样进行活细胞计数并镜检观察细胞的状态，镜检观察1#、2#培养基培养细胞有少量结团外，且有形状不规则细胞，3#培养基培养细胞状态良好，细胞都比较圆润、表面光滑、大小均一。培养后0h、24h、48h时取样计数，从表1可以看出3#的细胞增殖最快，细胞密度达到1.0×107cells/mL以上，细胞活力维持在98％以上。
表1 MDCK细胞在不同培养基上的增殖情况
2.2H7-Re1株在三种培养基培养的MDCK细胞上的增殖情况对比
细胞培养48h后补充接毒液，将3个6000L反应器的细胞密度都调整至4.5×106cells/mL左右，按照MOI为10-3接入同一批种毒，在接种病毒时还按照5μg/mL的量添加胰蛋白酶。接毒后24小时取样测HA，3#反应器HA较高，达到1:256，病变也比较明显。最终48h收毒时，当细胞活率降至50～60％时分离并提纯病毒。3#反应器的毒价最高，HA达到1:1024，每1ml病毒含量达到108.37TCID50，每0.1ml病毒含量达到108.17EID50，结果见表2。
表2病毒在MDCK细胞上的增殖情况
其中，1#培养基按照申请公布号CN105543163A，申请公布日为2016.05.04的专利申请文件的实施例3进行配制。
2#培养基的按照实施例2配制得到。
3#培养基的按照实施例5配制得到。
实验例
按实施例6中1.1～1.4的培养条件培养申请人筛选得到的G01(保藏编号为CCTCCNO:C201857的MDCK细胞)、G02、G03细胞，培养基均采用3#培养基，区别仅在于，在步骤1.4中，将溶氧控制在25-35％，从而模拟生物反应器中局部缺氧的环境。
在培养0h和24h时取样观察细胞活率。
表3不同MDCK细胞在低氧环境下的细胞活率
其中，G01细胞明显具备更强的对低氧环境的忍耐能力。
按实验例1中1.1～1.4的培养条件培养申请人筛选得到的G01细胞，区别仅在于，在步骤1.4中，先均用3#培养基以无菌的方法过滤至对应的反应器中预孵24h，以使得3个反应器中的初始细胞活率一致。随后在正式培养时，将溶氧控制在25-35％，从而模拟生物反应器中局部缺氧的环境，同时将三个反应器中的培养基都分别替换为1#、2#、3#培养基。
表4不同培养基对MDCK-G01细胞在低氧环境下的细胞活率
从表4可知，3#培养基能进一步提升MDCK-G01细胞的耐低氧能力。
这可能是由于本申请所添加的既定量的谷胱甘肽、泊洛沙姆、PGE2等成分能够有效调节MDCK-G01细胞细胞膜的通透性，促进更高效率的气体交换。此外亚硒酸、Na2SiO3、亚油酸和泊洛沙姆等成分还能减少细胞的团聚，可进一步增加氧气的利用效率。
由于大型生物反应器容积较大，偶尔会发生氧气搅拌不均的问题，因而更易造成细胞缺氧死亡。本发明申请人制备疫苗时常采用3000L～6000L的大型生物反应器进行细胞培养，因而对细胞的耐低氧能力要求较高。本发明所提供的MDCK-G01细胞系配合特定的培养基可取得较为理想的培养效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种在MDCK全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法，其特征在于，包括：
将MDCK细胞全悬浮培养至7.0×106～1.0×107cells/mL时，按MOI＝0.001～0.0001接种鸡胚禽流感病毒；
接毒后在pH值6.9～7.3、溶氧30～60％、温度32～37℃的环境下培养，当病毒达到足够高的滴度后分离并提纯病毒粒子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在接种鸡胚禽流感病毒时还按照3～8μg/mL的量添加胰蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在接种鸡胚禽流感病毒时，先将所述MDCK细胞稀释至3.5×106～5.0×106cells/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，接毒后培养的时间为48～72小时，且当细胞活率降至50～60％时分离并提纯病毒粒子。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述MDCK细胞，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201857，保藏时间为2018年2月10日。
6.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述禽流感病毒选自H5N1亚型Re-8株或H7N9亚型H7-Re1株。
7.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述全悬浮培养在无血清培养基下进行；
优选的，以溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素1～10×10-8M、氯化钙1～5×10-3M、硫酸铜2.8～12.8×10-9M、氰钴胺1～10×10-7M、D-泛酸钙2～8×10-5M、D-葡萄糖1.6～2.0×10-2M、硫酸亚铁2～10×10-6M、叶酸0.5～1.5×10-4M、谷胱甘肽3.5～9.5×10-7M、氢化可的松3～7×10-8M、次黄嘌呤1～5×10-5M、肌醇1～10×10-5M、硝酸铁0.3～2×10-7M、L-丙氨酸1～20×10-5M、L-精氨酸1～20×10-4M、L-天冬酰胺1～20×10-5M、L-天冬氨酸1～20×10-5M、L-半胱氨酸0.1～10×10-4M、L-胱氨酸0.1～10×10-4M、L-谷氨酸1～20×10-5M、L-谷氨酰胺1～10×10-3M、甘氨酸1～10×10-4M、L-组氨酸0.5～10×10-4M、L-异亮氨酸0.5～10×10-4M、L-亮氨酸0.5～10×10-4M、L-赖氨酸1～20×10-4M、L-蛋氨酸1～10×10-4M、L-苯丙氨酸1～10×10-4M、L-脯氨酸0.1～10×10-4M、L-丝氨酸1～20×10-4M、L-苏氨酸1～20×10-4M、L-色氨酸1～20×10-5M、L-酪氨酸1～10×10-4M、L-缬氨酸1～20×10-4M、硫辛酸1～20×10-7M、氯化镁1～20×10-5M、硫酸镁1～20×10-4M、烟酰胺1～20×10-5M、对氨基苯甲酸0.5～5g、氯化钾1～10×10-3M、腐胺1～10×10- 7M、吡多辛1～10×10-7M、核黄素1～10×10-7M、碳酸氢钠1～10×10-2M、氯化钠0.5～10×10-1M、磷酸氢二钠1～10×10-4M、磷酸二氢钠1～10×10-4M、丙酮酸钠0.1～10×10-3M、硫胺素1～20×10-6M、胸腺嘧啶脱氧核苷0.5～10×10-6M、硫酸锌0.1～10×10-6M、氯化胆碱0.1～10×10-4M、胰岛素5～15mg、转铁蛋白5～15mg、三典甲状腺氨酸1～20×10-12M以及二硫苏糖醇1～20×10-6M；
更优选的，所述培养基还包括：
亚油酸0.5～4.5×10-7M、苯酚红1～6×10-5M、泊洛沙姆0.5～3.5g、前列腺素E2 3～10×10-8M、H2SeO3 1～5×10-8M以及Na2SiO3 2～9×10-7M。
8.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
从所述病毒粒子中分离出病毒抗原并提纯和/或灭活。
9.前述任一项权利要求所述的方法在制备禽流感病毒疫苗中的应用。
10.如权利要求9所述之应用，所述疫苗为减毒活疫苗、全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、重组载体疫苗或核酸疫苗。
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