CN114438019A

CN114438019A - 一种mdck细胞系的驯化方法

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Publication number: CN114438019A
Application number: CN202210243326.1A
Authority: CN
Inventors: 乐威; 朱绍荣; 吴熠潇; 王龙超
Original assignee: SHANGHAI RONGSHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI RONGSHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2042-03-11
Also published as: CN114438019B

Abstract

本发明提供了一种MDCK细胞系的驯化方法，包括先将MDCK细胞含血清的贴壁培养，之后进行无血清悬浮培养，悬浮培养的培养液中添加适量的胰岛素。本发明的驯化方法仅需15代左右的驯化代数即可获得高生长速率且传代稳定的悬浮细胞，驯化成功率高，驯化时间短，驯化后获得的细胞污染少、安全性高。

Description

一种MDCK细胞系的驯化方法

技术领域

本发明属于病毒学领域，更具体地，本发明涉及一种MDCK细胞系的驯化方法。

背景技术

流感病毒一直对人类社会存在威胁，随着近年来全球对流感疫苗的市场需求增加，流感疫苗的市场开发前景依旧巨大。流感疫苗目前主要仍采用鸡胚生产，而动物细胞生产工艺正在逐步成为主流生产方式，该工艺不仅可以提升季节性流感疫苗的生产效率和有效性，更是有利于面对潜在的流感大流行爆发，可在短时间内快速高效生产大流行流感疫苗。

目前上市的基于动物细胞培养技术的流感疫苗多为使用贴壁MDCK细胞，然而该培养模式仍存在诸多的弊端，如：血清的引入造成培养工艺的复杂性和批次间不稳定性，且潜在的外源因子影响细胞生长和病毒复制；需要添加额外胰酶使细胞脱离微载体，增加了操作复杂性；微载体价格昂贵，使用后通常无法进行回收。而MDCK细胞在无血清培养基中的悬浮培养则可以避免以上问题，因生产工艺操作简单，不添加血清，更易实现流感疫苗的大规模生产。

将MDCK贴壁细胞驯化为悬浮细胞是实现MDCK细胞无血清悬浮培养的关键步骤。目前常用的方法为逐步降血清法和一步驯化法。诸多案例如CN109929796A均表明了采用逐步降血清法细胞驯化时间长、步骤繁琐、多出现细胞结团现象等缺陷，无法支持高密度生长。而直接驯化法如CN107460156A公开了一种通过一步驯化法获得的适应于无血清悬浮培养的MDCK细胞，但该方法因对驯化使用的培养基有着较高的要求而存在较大偶然性，细胞驯化成功存在一定几率，导致最终投入的总驯化时间也较长。

因此，本领域亟待开发进一步优化的细胞驯化方法，以简化培养程序、减少培养时间、控制培养成本，提高细胞驯化培养的成功率，促进流感疫苗的生产效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种MDCK细胞系的驯化方法。

在本发明的第一方面，提供一种MDCK细胞的驯化方法，所述方法包括：

(1)将MDCK细胞贴壁培养，贴壁培养的培养基含有血清；

(2)将(1)贴壁培养的细胞进行悬浮培养，每1～3日进行一次换培养液和传代；悬浮培养的培养液中添加1～10mg/L胰岛素，且该培养液中无血清。

在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，添加胰岛素后，传代至第3～12代，撤去胰岛素；较佳地，在悬浮培养起始后，传代至第4～11代后、较佳地至第5～8代后，撤去胰岛素。

在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，培养至传代第10～26代后、较佳地至传代第13～17代后，收获细胞，该细胞为适于接种病毒和进行病毒扩繁的细胞。

在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，添加1～8mg/L胰岛素；较佳地添加1～6mg/L胰岛素；更佳地添加1～5mg/L胰岛素；更佳地添加1.5～4mg/L胰岛素。

在一种或多种实施方式中，添加2、3、4、5、6、7、8或9mg/L胰岛素。

在一种或多种实施方式中，步骤(1)中，所述的培养基为DMEM培养基，MEM培养基。

在一种或多种实施方式中，步骤(1)中，所述的培养基中添加5～15％血清，较佳地添加8～12％血清(如添加10％血清)。

在一种或多种实施方式中，步骤(1)中，MDCK贴壁细胞培养至细胞汇合度为75％～95％时、较佳地80％～90％时，弃去原培养基；较佳地，还包括用PBS洗细胞。

在一种或多种实施方式中，步骤(1)贴壁培养后(较佳地PBS洗细胞后)，还包括消化细胞的步骤；较佳地，以胰酶消化10～20分钟；较佳地，待细胞变圆后，使之从培养容器的底部或壁部分离；较佳地，还包括收集细胞的步骤，更佳地通过离心收集细胞。

在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，起始添加胰岛素的培养时，细胞密度为5×10⁵～1×10⁷个，较佳地为8×10⁵～8×10⁶个，更佳地为1×10⁶～5×10⁶个。

在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，在转速80±20rpm，温度设定为37±2℃，CO₂浓度设定为5±1％条件培养；更佳地，在转速80±10rpm，温度设定为37±1℃，CO₂浓度设定为5±0.5％条件培养。

在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，所述换培养液包括离心收集细胞以及加入新的培养液。

在一种或多种实施方式中，起始添加胰岛素的培养时，细胞密度为1.5×10⁶～3×10⁶个。

在一种或多种实施方式中，起始添加胰岛素的培养时，细胞密度为1.5×10⁶～2×10⁶个。

在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，除了添加胰岛素，培养液中基本上不添加额外的生长因子或营养成分。

在本发明的另一方面，提供一种生产病毒的方法，所述方法包括以下步骤：(a)利用前面任一所述的方法进行MDCK细胞的驯化，获得经驯化的细胞；(b)将病毒接种于(a)的经驯化的细胞，扩繁病毒。

在一种或多种实施方式中，步骤(b)中，细胞的密度为5×10⁵～2×10⁷个，较佳地为8×10⁵～1×10⁷个，更佳地为2×10⁶～8×10⁶个。

在一种或多种实施方式中，步骤(b)中，所述的病毒为流感病毒；较佳地为人流感病毒或非人哺乳动物流感病毒(如禽流感病毒、猪流感病毒)；较佳地，所述的流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒；较佳地，所述甲型流感病毒根据H抗原和N抗原的不同，H选自H1～H15，N选自N1～N9；较佳地，所述病毒包括：建系保存的病毒、原代分离的病毒或分离自个体(例如患者)的病毒。

在一种或多种实施方式中，步骤(b)中，病毒以MOI 0.0001～0.01接种；较佳地以MOI 0.0005～0.005接种；更佳地以MOI 0.0008～0.002接种。

在一种或多种实施方式中，步骤(b)中，病毒接种时，还包括添加TPCK胰酶，较佳地TPCK胰酶浓度为2～10μg/mL，更佳地TPCK胰酶浓度为3～8μg/mL。

在一种或多种实施方式中，步骤(b)中，在33±2℃，较佳地33±1℃扩繁病毒。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、在细胞生长的第0-50天，A组的活细胞密度(VCD)、细胞活率的统计结果。

图2、在细胞生长的第0-5天，C组的活细胞密度(VCD)、细胞活率的统计结果。

图3、在细胞生长的第0-50天，A组的细胞比生长速率。

图4、在细胞生长的第0-50天，B组的细胞比生长速率。

图5、在细胞生长的第0-5天，C组的细胞比生长速率。

图6、A组在驯化初期(Day 1)的细胞形态图。

图7、A组在驯化中期(Day 4)的细胞形态图。

图8、A组在驯化后期(Day 30)的细胞形态图。

图9、B组在驯化初期(Day1)的细胞形态图。

图10、B组在驯化中期(Day 4)的细胞形态图。

图11、B组在驯化后期(Day 30)的细胞形态图。

图12、C组在驯化初期(Day 1)的细胞形态图。

图13、C组在驯化中期(Day 3)的细胞形态图。

图14、C组在驯化后期(Day 4)的细胞形态图。

图15、3个批次的细胞驯化培养结果(活细胞密度(VCD)、细胞活率)。

图16、H1N1流感病毒接种后不同时间的活细胞密度(VCD)以及病毒效价的统计结果。

图17、B型流感病毒接种后不同时间的活细胞密度(VCD)以及病毒效价的统计结果。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，提供了一种MDCK细胞系的驯化方法，包括先将MDCK细胞含血清的贴壁培养，之后进行无血清悬浮培养，悬浮培养的培养液中添加适量的胰岛素。本发明的驯化方法仅需15代左右的驯化代数即可获得高生长速率且传代稳定的悬浮细胞，驯化成功率高，驯化时间短，驯化后获得的细胞污染少、安全性高。

如本文所用，“传代”通常包括：使流感病毒在细胞培养物中复制；例如从培养物上清液收集复制的病毒；和将收集的复制病毒转移到未感染的细胞培养物中。可重复该过程。

如本文所用，除非另外说明，所述的“细胞”或“病毒生产细胞”是指适用于进行病毒扩增/繁殖的细胞，其被在适当的培养基找中培养，感染病毒后，可为病毒提供适当的组装环境。所述的细胞较佳地为非人哺乳动物细胞，更佳地为MDCK细胞。所述的病毒较佳地为流感病毒。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，所述的“基本上”不排除“完全”，例如“基本上无”Y的组合物可完全无Y。该词语“基本上”可视需要从本发明定义中省去。

细胞驯化方法

本发明人致力于促进MDCK细胞的驯化培养，经过广泛而深入的研究，发现在适当的阶段添加适量的胰岛素是成功实现高效MDCK细胞驯化的关键性因素。

基于本发明人的这一新发现，本发明提供了用于进行MDCK细胞驯化的方法，包括：(1)将MDCK细胞贴壁培养，贴壁培养的培养基含有血清；(2)将(1)贴壁培养的细胞进行悬浮培养，每1～3日进行一次换培养液和传代；悬浮培养的培养液中添加1～10mg/L胰岛素，且该培养液中无血清。

本发明中，采用的病毒生产细胞为犬细胞系，较佳地为MDCK细胞系(马-达二氏犬肾细胞系)。MDCK细胞可为病毒提供良好的复制环境。相对于鸡胚法和其他细胞基质来生产流感病毒，MDCK细胞无血清悬浮培养因生产工艺操作简单，不添加血清，更易实现流感疫苗的大规模生产。但是，在本领域中，如何将MDCK细胞从贴壁培养驯化为悬浮培养，维持其良好的状态，仍然是有待于提高和优化的方面。

本发明中，使用悬浮培养的方式培养流感病毒生产细胞。作为本发的优选方式，使用无血清悬浮培养的方式(没有来自人或动物来源的血清添加剂)培养流感病毒生产细胞。

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，将含血清培养基中贴壁培养的MDCK细胞消化并离心，并使用无血清培养基重悬细胞，添加适量胰岛素促进悬浮细胞存活概率，使用连续传代方式进行驯化培养。

胰岛素一般是动物胰岛素或重组人工胰岛素，动物胰岛素主要从猪或牛的胰腺中提取，易引入外源性病毒，存在生物安全问题；重组人工胰岛素常常通过基因工程菌发酵生产，例如使用大肠杆菌，虽然比之动物源性的降低了生物安全问题，但仍存在引入外源因子的风险，特别是针对生物疫苗产品，对引入的非目的蛋白都是要通过后续工艺去除的。本发明采用的是重组的人工胰岛素，在细胞悬浮驯化过程中添加后并及时去除；较佳地，添加胰岛素后，传代至第3～12代，撤去胰岛素。去除胰岛素后悬浮细胞生长情况和未去除胰岛素相当。当MDCK细胞能够悬浮并开始生长时去除胰岛素，继续传代直至细胞完全适应单个悬浮生长，且生长速率高且稳定。

本发明的驯化方法，相较于逐步降血清法更快速高效，在驯化第15代左右既已能达到较为理想的驯化目标，获得的悬浮细胞生长速率快(＞0.65d^-1)且活率高(＞90％)，高于逐步降血清方法；而进一步的传代则使得悬浮细胞的生长速率更高。

相较于一步驯化法成功率更高，本发明的方法不受驯化所用无血清培养基的品质限制，更具有普遍应用价值，且其综合所用驯化时间短于一步驯化法。

作为本发明的一种优选实施例，在贴壁培养阶段，先将于添加10％新生牛血清的DMEM培养基中培养的MDCK贴壁细胞培养至细胞汇合度为80％～90％。

作为本发明的一种优选实施例，在贴壁培养后，弃去旧培养基并用PBS润洗两遍，加入胰酶溶液消化10～20分钟；待细胞变圆后，轻轻拍打容器底部使MDCK细胞解离，加入含血清培养基终止消化，接着，将收集到的MDCK细胞悬液离心(1000rpm，10min)并弃上清液。

作为本发明的一种优选实施例，在悬浮驯化培养阶段，用无血清培养基重悬细胞团，转移至摇瓶中并加入1～10mg/L胰岛素，并将细胞密度控制于1.5～2.0×10⁶个细胞/mL，摇床转速设定为80rpm，温度设定为37℃，CO₂浓度设定为5％。之后，每日对摇瓶中细胞取样计数并用无血清培养基进行离心换液传代，每次操作后摇瓶中继续添加胰岛素，重复操作。随后，当MDCK细胞在添加有胰岛素的无血清培养基中悬浮并开始连续生长几代后，下一次传代将胰岛素去除，只用无血清培养基进行传代，直至MDCK细胞能在无血清培养基中完全单个悬浮生长，生长速率高且稳定。

根据本发明的实施例结果，采用本发明的驯化方法，自转入无血清培养基中培养传代15代后，MDCK细胞能够在无血清培养基中实现单个悬浮培养，细胞大小均一且透亮，驯化成功后的MDCK悬浮细胞生长快速且传代稳定，比生长速率在0.65d^-1以上。

根据本发明的实施例结果，采用本发明的驯化方法驯化成功的细胞生长性能优良，批式培养中最大细胞密度可达9×10⁶个细胞/mL以上，且活率维持在97％以上。

根据本发明的实施例结果，采用本发明的驯化方法验证了胰岛素在MDCK细胞悬浮驯化中的关键作用，并证明了该方法用于驯化细胞的成功率很高，可以有效缩短驯化工作量和驯化总时间。

采用本发明的驯化方法最终驯化得到的悬浮细胞培养体系中去除了胰岛素，降低了生物安全风险，且减轻了下游纯化的压力。

采用本发明的驯化方法相较于逐步降血清法步骤更加简便，驯化周期更短，驯化成功的细胞形态更佳且少结团，细胞生长也更快；相较于一步驯化法，该法对于培养基的品质要求更低，且驯化成功率更高，驯化总成本和总时间更少。

基于所述驯化方法的病毒扩繁

本发明的驯化方法获得的MDCK细胞可应用于病毒的扩繁，进而应用于病毒疫苗的制备。

MDCK细胞对不同型和亚型的流感病毒均有良好的敏感性，从而其适宜用于流感病毒的扩增。

流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒。作为本发明的优选方式，所述的流感病毒为人流感病毒。作为本发明的优选方式，所述的流感病毒为甲型流感病毒或乙型流感病毒。甲型流感病毒根据H抗原和N抗原的不同，H选自H1～H15，N选自N1～N9。

适用于本发明的培养的流感病毒可以是已经建系的病毒，也可以是原代分离的病毒，生物体(例如患者)分离的病毒。流感病毒可分离自呼吸分泌物，包括但不限于：直接抽吸物，漱口水，鼻腔洗涤液，鼻腔拭子，咽管拭子，咽部拭子等。这些样品通常从疑似被流感病毒感染的患者获取，包括患有新型流感病毒株的患者。

可通过多种方法由含病毒的液体收获病毒颗粒。纯化方法可包括用线性蔗糖梯度溶液(含有去污剂以破坏病毒颗粒)进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。

本发明的方法所获得的流感病毒可冻存、复苏、传代以及长时间维持培养。

作为本发明的一种优选实施方式中，采用本发明描述的驯化方法驯化成功的细胞增强对流感病毒H1N1、H3N2和B型的扩增能力，获得的病毒滴度高，H1N1流感病毒可获得256(HAU/50μL)的HA滴度，B型流感病毒可获2560(HAU/50μL)的HA滴度。

本发明制备的病毒可被应用于制备流感病毒疫苗。疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于全病毒颗粒、“分裂”病毒颗粒或基于纯化的表面抗原。流感抗原也可以病毒体形式出现。制造任意这些类型的疫苗时都可应用本发明的方法制备的病毒。

采用灭活病毒时，该疫苗可包含完整的病毒颗粒、分裂病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。用于灭活病毒的化学方式包括使用有效量的一种或多种以下试剂进行处理：去污剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二乙胺(binaryethylamine)、乙酰基乙烯亚胺或它们的组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或γ射线辐射。

另一种形式的灭活流感抗原是病毒体。病毒体可通过用去污剂增溶流感病毒，然后去除核壳和重建含病毒糖蛋白的膜来制备。另一种制备病毒体的方法包括：加入病毒膜糖蛋白至磷脂过量，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。

流感病毒可被减毒。流感病毒可以是温度敏感型。流感病毒可以是冷适应性病毒。使用活病毒作为抗原时这三种特征特别有用。

HA是灭活流感疫苗中的主要免疫原，例如通过SRID检测参考HA水平使疫苗剂量标准化。

活病毒例如通过以下方法制备疫苗：培养病毒，然后从含病毒颗粒的流体纯化病毒颗粒。例如，所述流体可通过离心分离并用缓冲液(例如含蔗糖、磷酸钾和谷氨酸单钠)稳定。

作为一种形式，用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、曲通X-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、TergitolNP9等)处理纯化的病毒颗粒以获得裂解病毒颗粒，从而产生亚病毒颗粒制剂。裂解流感病毒的方法是本领域熟知的。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化完整病毒来裂解病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。

纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。制备纯化形式的这些蛋白质的方法是本领域熟知的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、MDCK细胞驯化的过程优化

为了获得状态良好、生长快速、单个悬浮生长、可供后续病毒感染及繁殖用的细胞，发明人经过了深入的研究筛选，研究了多类型、多种类的候选材料(化学物质以及生物生长因子等)，意外地发现胰岛素对于MDCK细胞驯化的过程优化具有显著的意义。本实施例研究了该优选材料及其促进细胞驯化中的作用。

1、实验方法

MDCK细胞驯化过程包括：

(1)贴壁培养

将于添加10％新生牛血清的DMEM培养基中培养的MDCK贴壁细胞培养至细胞汇合度为80％～90％时，弃去旧培养基并用PBS润洗两遍。

将细胞培养物加入胰酶溶液消化；待细胞变圆后，轻轻拍打容器底部使MDCK细胞解离，加入含血清培养基(10％新生牛血清的DMEM培养基)终止消化。

将收集到的MDCK细胞悬液离心(1000rpm，10min)并弃上清液，获得富集的细胞。

(2)悬浮培养

接上述(1)步骤，用无血清培养基(10％新生牛血清的DMEM培养基)重悬细胞团，转移至摇瓶中并加入2.5mg/L胰岛素，并将细胞密度控制于1.5～2.0×10⁶个细胞/mL，摇床转速设定为80rpm，温度设定为37℃，CO₂浓度设定为5％。

根据细胞生长状态每隔1～3日对摇瓶中细胞取样计数并用无血清培养基进行离心换液传代，每次操作后摇瓶中继续添加胰岛素，重复操作。

细胞分组设置：

A组：加胰岛素(Day10起去除)；

B组：加胰岛素(未去除)；

C组：不加胰岛素；

MDCK贴壁细胞消化重悬加入无血清培养基后，于Day 0在A和B组培养液中加入终浓度为2.5mg/L的重组人胰岛素，以C组不加胰岛素的培养液作为对照，进行培养。细胞连续生长5代后，A组去掉胰岛素(Day10去掉)，B组不去掉胰岛素继续传代，直至能够稳定传代。

2、实验结果

利用上述的培养方法，进行分组培养，记录每天取样获得的样品的活细胞密度(VCD)、细胞活率、细胞比生长速率(μ)。结果如表1A、表1B和表1C。

表1A

表1B

表1C

在细胞生长的第0-50天，A组的活细胞密度(VCD)、细胞活率的统计结果如图1。图中靠上的折线代表细胞活率、靠下的折线代表VCD。

在细胞生长的第0-5天，C组的活细胞密度(VCD)、细胞活率的统计结果如图2；因生长不理想5天后培养终止。图中靠上的折线代表细胞活率、靠下的折线代表VCD。

在细胞生长的第0-50天，A组的细胞比生长速率如图3。

在细胞生长的第0-50天，B组的细胞比生长速率如图4。

在细胞生长的第0-5天，C组的细胞比生长速率如图5；因生长不理想5天后培养终止。

A组在驯化后的不同天数，观测其细胞形态，结果如图6(驯化初期(Day1))，图7(驯化中期(Day 4))，图8(驯化后期(Day 30))。

B组在驯化后的不同天数，观测其细胞形态，结果如图9(驯化初期(Day1))，图10(驯化中期(Day 4))，图11(驯化后期(Day 30))。

C组在驯化后的不同天数，观测其细胞形态，结果如图12(驯化初期(Day1))，图13(驯化中期(Day 3))，图14(驯化后期(Day 4))；该组在很早就进入驯化后期。

根据上述，各组细胞的状态总结如下：

加胰岛素组(B组)：细胞从贴壁转为悬浮时，第一天继续生长，随后细胞密度和活率下降，在第3天的时候细胞多为结团，活率欠佳。随着传代进行，细胞密度和活率逐渐恢复，细胞生长逐渐加快。

加胰岛素、之后去胰岛素组(A组)：传代至15代左右时已能使细胞驯化完全，细胞呈单个悬浮生长，细胞大小均一且透亮，细胞生长稳定，比生长速率＞0.65d^-1，生长速率高且稳定，表明细胞驯化非常成功。

不加胰岛素组(C组)：细胞从贴壁转为悬浮时，第一天继续生长，随后细胞密度和活率下降，在第3天的时候细胞多为结团，活率欠佳。随着传代进行，细胞密度和活率进一步下降，于第4天细胞基本死亡，表明细胞无法存活。

综上可见，未去胰岛素的细胞驯化规律与去胰岛素的细胞驯化相似，且最后获得的悬浮细胞形态与生长也相似，最终效果相同。表明利用胰岛素驯化并适时去除能够达到与始终添加胰岛素相同的效应，但是由于使用的胰岛素量少，一方面成本低，另一方面引入外源物导致后期生物安全风险更低，且减轻了下游纯化的压力。

实施例2、胰岛素法的驯化成功率分析

根据实施例1，胰岛素法进行细胞驯化具有显著的效应，可维持细胞/传代的细胞的良好的存活状态，生长速率高，传代次数多。本实施例中，进一步验证加胰岛素法的驯化成功率，用该方法多次重复驯化细胞，验证该法成功驯化细胞的再现性和稳定性。

1、实验方法

采用实施例1的细胞、培养基以及驯化方法，进行3个批次(A组)的细胞驯化培养。

2、实验结果

3个批次的细胞驯化培养结果如表2A、表2B和图15所示。

表2A

表2B

根据上述，进行了三批采用相同策略的细胞驯化，在培养液中添加2.5mg/L的胰岛素，由结果可知三批细胞均驯化成功，细胞均能成功存活于添加了胰岛素的培养液中。后期细胞生长稳定可通过长期传代实现，表明用该策略细胞驯化成功率为100％。

实施例3、经驯化的MDCK细胞的质量分析

本实施例中，考察驯化后的MDCK细胞生长情况。

1、实验方法

将实施例1的方法(A组)驯化好的细胞在无血清培养基中做批培养，每日检测活细胞密度、细胞活率、葡萄糖与乳酸含量，细胞活率降低至65％以下停止培养。进行两个批次的培养。

2、实验结果

驯化后的MDCK细胞生长情况如表3。

表3

根据上表结果可以看出，当接种密度为1.0×10⁶个细胞/mL时，其生长第3天为其高峰，细胞量可达8.5×10⁶个细胞/mL以上且高活率。这一结果也表明，驯化后的细胞能够维持较长时间的活性，从而可很好地配合病毒的接种以及繁殖。

实施例4、驯化后的细胞的病毒扩增分析

本实施例中，考察将实施例1的方法(A组)驯化好的细胞的病毒扩增情况。

1、实验方法

当细胞生长至4×10⁶个细胞/mL时，用H1N1和B型流感病毒感染细胞，MOI为0.001，同时添加TPCK胰酶，浓度为5μg/mL，于33℃培养。每24h取样，并检测病毒HA滴度。

2、实验结果

驯化后的MDCK细胞的病毒扩增分析结果如表4。

表4

H1N1流感病毒接种后不同时间的活细胞密度(VCD)以及病毒效价的统计结果如图16。

B型流感病毒接种后不同时间的活细胞密度(VCD)以及病毒效价的统计结果如图17。

结果显示，分别用H1N1和B型人流感病毒感染驯化好的MDCK悬浮细胞，两种病毒类型都能产生很高的HA滴度，其中H1N1流感病毒可获得256(HAU/50μL)的HA滴度，B型流感病毒可获2560(HAU/50μL)的HA滴度。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims

1.一种MDCK细胞的驯化方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将MDCK细胞贴壁培养，贴壁培养的培养基含有血清；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，添加胰岛素后，传代至第3～12代，撤去胰岛素；较佳地，在悬浮培养起始后，传代至第4～11代后、较佳地至第5～8代后，撤去胰岛素。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，培养至传代第10～26代后、较佳地至传代第13～17代后，收获细胞，该细胞为适于接种病毒和进行病毒扩繁的细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，添加1～8mg/L胰岛素；较佳地添加1～6mg/L胰岛素；更佳地添加1～5mg/L胰岛素；更佳地添加1.5～4mg/L胰岛素。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的培养基为DMEM培养基，MEM培养基；和/或

步骤(1)中，所述的培养基中添加5～15％血清，较佳地添加8～12％血清；和/或

步骤(1)中，MDCK贴壁细胞培养至细胞汇合度为75％～95％时、较佳地80％～90％时，弃去原培养基；较佳地，还包括用PBS洗细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)贴壁培养后，还包括消化细胞的步骤；较佳地，以胰酶消化10～20分钟；较佳地，待细胞变圆后，使之从培养容器的底部或壁部分离；较佳地，还包括收集细胞的步骤，更佳地通过离心收集细胞。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，起始添加胰岛素的培养时，细胞密度为5×10⁵～1×10⁷个，较佳地为8×10⁵～8×10⁶个，更佳地为1×10⁶～5×10⁶个；和/或

步骤(2)中，在转速80±20rpm，温度设定为37±2℃，CO₂浓度设定为5±1％条件培养；更佳地，在转速80±10rpm，温度设定为37±1℃，CO₂浓度设定为5±0.5％条件培养；和/或

步骤(2)中，所述换培养液包括离心收集细胞以及加入新的培养液。

8.一种生产病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)利用权利要求1～7任一所述的方法进行MDCK细胞的驯化，获得经驯化的细胞；和

(b)将病毒接种于(a)的经驯化的细胞，扩繁病毒。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，细胞的密度为5×10⁵～2×10⁷个，较佳地为8×10⁵～1×10⁷个，更佳地为2×10⁶～8×10⁶个。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述的病毒为流感病毒；较佳地为人流感病毒或非人哺乳动物流感病毒；较佳地，所述的流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒；较佳地，所述甲型流感病毒根据H抗原和N抗原的不同，H选自H1～H15，N选自N1～N9；较佳地，所述病毒包括：建系保存的病毒、原代分离的病毒或分离自个体的病毒；和/或

步骤(b)中，病毒以MOI 0.0001～0.01接种；较佳地以MOI 0.0005～0.005接种；更佳地以MOI 0.0008～0.002接种；和/或

步骤(b)中，病毒接种时，还包括添加TPCK胰酶，较佳地TPCK胰酶浓度为2～10μg/mL，更佳地TPCK胰酶浓度为3～8μg/mL；和/或

步骤(b)中，在33±2℃，较佳地33±1℃扩繁病毒。