CN102406928A - 一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法 - Google Patents

一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法 Download PDF

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赵志鹏
侯文礼
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Abstract

本发明涉及疫苗领域，尤其是一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，依次包括人二倍体细胞的复苏、人二倍体细胞的传代培养、接种脊髓灰质炎病毒、病毒增殖培养、收获病毒培养液、病毒培养液的纯化和灭活，所述人二倍体细胞的传代培养采用多级微载体生物反应器扩增传代培养。本发明采用多级微载体生物反应器传代扩增培养细胞，生产参数控制精确，培养条件稳定，易于实现大规模化生产，也提高了疫苗单批次产量，保证了产品的质量均一和稳定。

Description

一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法
技术领域
本发明涉及疫苗领域，特别是一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法。
背景技术
脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒感染所引起的一类急性传染病，病毒主要侵犯人体脊髓灰质前角的灰、白质部分，对灰质造成永久损害，使这些神经支配的肌肉无力，出现肢体弛缓性麻痹。好发于婴幼儿，故又称小儿麻痹症。可引起肢体麻痹，易成为终生残疾，甚至危及生命。
目前现行的疫苗为口服减毒活疫苗和灭活疫苗两种。这两种疫苗的生产过程大致相同，主要区别在于灭活疫苗具有灭活及纯化的工艺。
口服减毒活疫苗其优点在于，它与自然感染类似，可产生体液及肠道局部免疫反应；所产生的免疫是终生的，抗体生成的时间较短；口服方式更易于推广；成本较低等。在公共卫生环境，如饮水和食物等方面尚存在问题的发展中国家和地区，减毒活疫苗是控制脊髓灰质炎发病及流行的有效工具。但同时，在利用减毒活疫苗全面控制或消灭了野毒株感染的地区，继续使用减毒活疫苗则存在发生疫苗相关病例，甚至出现疫苗重组毒株再感染的可能。2002年，WHO向世界各国提出了在全面消灭野毒株引起的脊髓灰质炎的基础上，自2010年起在世界范围内停止使用减毒活疫苗，而代之以灭活疫苗。而灭活疫苗则存在常规组织细胞培养方式病毒表达水平低下，难以获得大量抗原，且采用灭活疫苗进行免疫对抗原的需求量大等问题导致生产其成本昂贵，产量低。经过研究，目前我国在此领域已开发了以Sabin减毒株作为生产用毒种，以Vero细胞的微载体培养技术生产制备的灭活疫苗。但由于Vero细胞本身属传代细胞，其安全性尚存在争议。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供了一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法。
为达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，依次包括人二倍体细胞的复苏、人二倍体细胞的传代培养、接种脊髓灰质炎病毒、病毒增殖培养、收获病毒培养液、病毒培养液的纯化和灭活，所述人二倍体细胞的传代培养采用多级微载体生物反应器扩增传代培养，每级生物反应器的细胞生长达到106个/ml以上浓度时，消化细胞制备细胞悬液，按照1∶10～1∶20的放大比例进入下一级的生物反应器进行扩增培养直至达到生产所需规模。
进一步的技术方案是，所述多级生物反应器是将前一级生物反应器培养的细胞通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器中进行传代培养。
进一步的技术方案是，所述的人二倍体细胞株为WI-38，MRC-5，2BS，KMB17中的任一种。
进一步的技术方案是，所述的脊髓灰质炎病毒毒株为I、II、III型Sabin株的任一种。
进一步的技术方案是，所述的多级生物反应器为搅拌式生物反应器或摇摆式气液交替培养生物反应器。
进一步的技术方案是，所述的生物反应器中的微载体为颗粒状实心微球载体、多孔性微球载体、网状纤维结构载体或片状纤维结构载体中的任一种。
进一步的技术方案是，所述病毒增殖培养期间每天抽样观察细胞病变情况并检测病毒滴度，病毒增殖培养的培养基为含1～2％的人血白蛋白的无血清BME培养基。
进一步的技术方案是，所述收获病毒培养液的收获时间为病毒繁殖的高峰期，收获病毒培养液的方式为间隔收获方式或连续灌注式培养收获方式。
进一步的技术方案是，所述的间隔收获方式为间隔24～48小时收获培养体积80～90％的病毒培养物后继续补加含1～2％的人血白蛋白的无血清BME培养基至原培养体积的方式。
进一步的技术方案是，所述的连续灌注式培养收获方式为每天连续流出收获工作体积80～90％的病毒培养液并同时连续等量补加含1～2％的人血白蛋白的无血清BME培养基的方式。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用多级微载体生物反应器传代扩增培养细胞，生产参数控制精确，培养条件稳定，易于实现大规模化生产，也提高了疫苗单批次产量，保证了产品的质量均一和稳定。
(2)病毒培养采用无血清BME培养基，从生产源头消除了杂蛋白物质的引入，进一步提高了病毒培养液的纯度。
(3)采用人二倍体细胞作为细胞基质更为安全。
(4)通过在线式培养检测病毒滴度的方式，能够较准确的确定病毒繁殖的高峰期，从而适时收获病毒，为每批产品的质量提供了有力的保证。
具体实施方式
实施例1
一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，依次包括人二倍体细胞的复苏、人二倍体细胞的传代培养、接种脊髓灰质炎病毒、病毒增殖培养、收获病毒培养液、病毒培养液的纯化和灭活，所述人二倍体细胞的传代培养采用多级微载体生物反应器扩增传代培养，每级生物反应器的细胞生长达到106个/ml浓度时，消化细胞制备细胞悬液，按照1∶10的放大比例进入下一级的生物反应器进行扩增培养直至达到生产所需规模。
进一步的技术方案是，所述多级生物反应器是将前一级生物反应器培养的细胞通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器中进行传代培养。
进一步的技术方案是，所述的人二倍体细胞株为WI-38，所述的脊髓灰质炎病毒毒株为I型Sabin株。
进一步的技术方案是，所述的多级生物反应器为搅拌式生物反应器，其中的微载体为颗粒状实心微球载体。
进一步的技术方案是，所述病毒增殖培养期间每天抽样观察细胞病变情况并检测病毒滴度，病毒增殖培养的培养基为含1％的人血白蛋白的无血清BME培养基。
进一步的技术方案是，所述收获病毒培养液的收获时间为病毒繁殖的高峰期，所述收获病毒培养液的方式为间隔收获方式，具体为间隔24小时收获培养体积80％的病毒培养物后继续补加含1％的人血白蛋白的无血清BME培养基至原培养体积的方式。
实施例2
一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，依次包括人二倍体细胞的复苏、人二倍体细胞的传代培养、接种脊髓灰质炎病毒、病毒增殖培养、收获病毒培养液、病毒培养液的纯化和灭活，所述人二倍体细胞的传代培养采用多级微载体生物反应器扩增传代培养，每级生物反应器的细胞生长达到107个/ml浓度时，消化细胞制备细胞悬液，按照1∶20的放大比例进入下一级的生物反应器进行扩增培养直至达到生产所需规模。
进一步的技术方案是，所述多级生物反应器是将前一级生物反应器培养的细胞通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器中进行传代培养。
进一步的技术方案是，所述的人二倍体细胞株为MRC-5，所述的脊髓灰质炎病毒毒株为II型Sabin株。
进一步的技术方案是，所述的多级生物反应器为摇摆式气液交替培养生物反应器，其中的微载体为多孔性微球载体。
进一步的技术方案是，所述病毒增殖培养期间每天抽样观察细胞病变情况并检测病毒滴度，病毒增殖培养的培养基为含2％的人血白蛋白的无血清BME培养基。
进一步的技术方案是，所述收获病毒培养液的收获时间为病毒繁殖的高峰期，所述收获病毒培养液的方式为连续灌注式培养收获方式，具体为每天连续流出收获工作体积90％的病毒培养液并同时连续等量补加含2％的人血白蛋白的无血清BME培养基的方式。
实施例3
一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，依次包括人二倍体细胞的复苏、人二倍体细胞的传代培养、接种脊髓灰质炎病毒、病毒增殖培养、收获病毒培养液、病毒培养液的纯化和灭活，所述人二倍体细胞的传代培养采用多级微载体生物反应器扩增传代培养，每级生物反应器的细胞生长达到106个/ml浓度时，消化细胞制备细胞悬液，按照1∶10的放大比例进入下一级的生物反应器进行扩增培养直至达到生产所需规模。
进一步的技术方案是，所述多级生物反应器是将前一级生物反应器培养的细胞通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器中进行传代培养。
进一步的技术方案是，所述的人二倍体细胞株为2BS，所述的脊髓灰质炎病毒毒株为III型Sabin株。
进一步的技术方案是，所述的多级生物反应器为搅拌式生物反应器，其中的微载体网状纤维结构载体。
进一步的技术方案是，所述病毒增殖培养期间每天抽样观察细胞病变情况并检测病毒滴度，病毒增殖培养的培养基为含1.5％的人血白蛋白的无血清BME培养基。
进一步的技术方案是，所述收获病毒培养液的收获时间为病毒繁殖的高峰期，所述收获病毒培养液的方式为间隔收获方式，具体为为间隔48小时收获培养体积90％的病毒培养物后继续补加含1.5％的人血白蛋白的无血清BME培养基至原培养体积的方式。
实施例4
一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，依次包括人二倍体细胞的复苏、人二倍体细胞的传代培养、接种脊髓灰质炎病毒、病毒增殖培养、收获病毒培养液、病毒培养液的纯化和灭活，所述人二倍体细胞的传代培养采用多级微载体生物反应器扩增传代培养，每级生物反应器的细胞生长达到108个/ml浓度时，消化细胞制备细胞悬液，按照1∶10的放大比例进入下一级的生物反应器进行扩增培养直至达到生产所需规模。
进一步的技术方案是，所述多级生物反应器是将前一级生物反应器培养的细胞通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器中进行传代培养。
进一步的技术方案是，所述的人二倍体细胞株为KMB17，所述的脊髓灰质炎病毒毒株为II型Sabin株。
进一步的技术方案是，所述的多级生物反应器为摇摆式气液交替培养生物反应器，其中的微载体为片状纤维结构载体。
进一步的技术方案是，所述病毒增殖培养期间每天抽样观察细胞病变情况并检测病毒滴度，病毒增殖培养的培养基为含2％人血白蛋白的无血清BME培养基。
进一步的技术方案是，所述收获病毒培养液的收获时间为病毒繁殖的高峰期，所述收获病毒培养液的方式为连续灌注式培养收获方式，具体为每天连续流出收获工作体积80％的病毒培养液并同时连续等量补加含2％人血白蛋白的无血清BME培养基的方式。
按照实施例1-4所述方法，采用100L生物反应器制备人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗3批，采用Hep-2细胞(药典规定方法)检测病毒收获物滴度，制备疫苗后免疫豚鼠采血检测抗体阳转率。
Sabine株I型，病毒收获液滴度平均达到8.21gCCID50/ml，经40倍超滤浓缩，制备疫苗接种豚鼠，抗体阳转率100％，牛血清含量低于30ng/ml。
Sabine株II型，病毒收获液滴度平均达到7.51gCCID50/ml，经80倍超滤浓缩，制备疫苗接种豚鼠，抗体阳转率100％，，牛血清含量低于50ng/ml。
Sabine株III型，病毒收获液滴度平均达到7.81gCCID50/ml，经60倍超滤浓缩，制备疫苗接种豚鼠，抗体阳转率100％，牛血清含量低于40ng/ml。

Claims (10)

1.一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，依次包括人二倍体细胞的复苏、人二倍体细胞的传代培养、接种脊髓灰质炎病毒、病毒增殖培养、收获病毒培养液、病毒培养液的纯化和灭活，其特征在于：所述人二倍体细胞的传代培养采用多级微载体生物反应器扩增传代培养，每级生物反应器的细胞生长达到106个/ml以上浓度时，消化细胞制备细胞悬液，按照1∶10～1∶20的放大比例进入下一级的生物反应器进行扩增培养直至达到生产所需规模。
2.根据权利要求1所述的一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述多级生物反应器是将前一级生物反应器培养的细胞通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器中进行传代培养。
3.根据权利要求1所述的一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述的人二倍体细胞株为WI-38，MRC-5，2BS，KMB17中的任一种。
4.根据权利要求1所述的一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述的脊髓灰质炎病毒毒株为I、II、III型Sabin株的任一种。
5.根据权利要求2所述的一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述的多级生物反应器为搅拌式生物反应器或摇摆式气液交替培养生物反应器。
6.根据权利要求5所述的一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述的生物反应器中的微载体为颗粒状实心微球载体、多孔性微球载体、网状纤维结构载体或片状纤维结构载体中的任一种。
7.根据权利要求1所述的一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述病毒增殖培养期间每天抽样观察细胞病变情况并检测病毒滴度，病毒增殖培养的培养基为含1～2％的人血白蛋白的无血清BME培养基。
8.根据权利要求1所述的一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述收获病毒培养液的收获时间为病毒繁殖的高峰期，收获病毒培养液的方式为间隔收获方式或连续灌注式培养收获方式。
9.根据权利要求8所述的一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述的间隔收获方式为间隔24～48小时收获培养体积80～90％的病毒培养物后继续补加含1～2％的人血白蛋白的无血清BME培养基至原培养体积的方式。
10.根据权利要求8所述的一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述的连续灌注式培养收获方式为每天连续流出收获工作体积80～90％的病毒培养液并同时连续等量补加含1～2％的人血白蛋白的无血清BME培养基的方式。
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