CN1616096A - 减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗培养方法，采用Vero细胞、脊髓灰质炎减毒株病毒，在发酵罐中进行培养，通过细胞培养规模的三级放大，使细胞培养面积相当于21000个1升玻璃瓶静置培养的面积，且细胞产量是常规1升瓶静置培养的21000倍，常规10升转瓶培养的2100倍，既减少了培养空间，又降低了培养液用量，同时也减少了劳动力投入，短时间内即可实现大规模制备细胞及病毒液，满足脊髓灰质炎灭活疫苗对大量病毒抗原的需求。另用本发明生产的病毒液制备成疫苗后，质量稳定可靠，安全性及免疫原性良好，经检定全部符合国家生物制品规程的要求。
Description
技术领域
本发明涉及脊髓灰质炎灭活疫苗的培养方法，属于医学生物技术领域。
背景技术
脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒I、II、III型引起的传播广泛且危害极大的急性传染病。临床症状引起肌肉特别是肢体松弛性麻痹，多发生于小儿，因此又称为“小儿麻痹症”。在疫苗问世前，该病在全世界范围内流行，在我国的发病率为3.18/10万。50年代中后期，美国的两位科学家Dr.Salk和Dr.Sabin先后成功研制出脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)，给人们预防和消灭脊髓灰质炎提供了有力武器。实践证明这两种疫苗都是安全有效的。我国自1960年开始生产OPV供全国儿童服用，到目前为止总计供应了40多亿人份的三价OPV，取得了辉煌的成绩。1995年我国已消灭了由本土野毒株引起的脊髓灰质炎。早期制造的IPV由于受到生产工艺的限制，抗原含量低，免疫效果不理想。80年代后，因采用现代化的大规模培养细胞和病毒的方法——微载体培养法，制备出了抗原含量高的增效IPV，其免疫效果可与OPV相媲美。
随着全世界消灭脊髓灰质炎进程的推进，口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)相关病例(VAPP)和由该疫苗衍生出的脊髓灰质炎病毒(VDPV)所引起的病例正受到人们的重视，如2000年在多美尼加和海地，2001年在菲律宾以及2002年在马达加斯加发生了疫苗衍生株引起的麻痺病例，此外疫苗病毒毒株在免疫缺陷的人体内可长期存在。为此，一些发达国家开始改变疫苗使用方案，采取先用IPV再用OPV的方案，进而过渡到仅使用IPV的方案，因为脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)能够免疫苗相关病例。然而根据野毒株生产IPV的经验，制造IPV较OPV需要更大的抗原量，单剂量病毒用量比OPV大100倍，因此，采用常规的细胞培养方法，细胞产量和病毒产量远远不能满足大规模生产减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗的需要，因此，有必要研制脊髓灰质炎减毒株病毒在微载体上的培养技术，以满足我国儿童的需要，并根除脊髓灰质炎。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能大规模生产减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗，且性能稳定、安全可靠的疫苗培养方法。
本发明是这样实现的：一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗培养方法，其特征在于它经过下列工艺步骤：
1、三级放大细胞培养：
a、首先对细胞种子进行离心清洗，按最低需求培养液(MEM)∶Vero细胞种子＝500-1000∶1的比例，接种到5-10升小容量发酵罐中进行细胞培养，控制培养温度35-37℃，pH7.0-7.4，溶解氧30-50％，并于培养第三天开始灌流，灌流量按细胞生长情况由1升/天最终增加到5升/天，培养5-7天，使细胞增殖至1-3×106个细胞/毫升，进行胰酶消化；
b、将a步骤胰酶消化过的细胞悬液，按最低需求培养液(MEM)∶Vero细胞种子＝500-1000∶1的比例，接种于50-85升中容量发酵罐中培养，控制培养温度35-37℃，pH7.0-7.4，溶解氧30-50％，在再循环培养液体积为50-100升条件下，于第三天开始进行再循环培养，培养5-7天，使细胞密度达1-3×106个细胞/毫升，进行胰酶消化；
c、将b步骤胰酶消化过的细胞悬液，按最低需求培养液(MEM)∶Vero细胞种子＝500-1000∶1的比例，接种于300-550升大容量发酵罐中培养，控制培养温度35-37℃，pH7.0-7.4，溶解氧30-50％，培养5-7天，使细胞密度为1-3×106个细胞/毫升；
2、病毒培养：收获c步骤的细胞培养液，用M199洗细胞一次，加入M199培养液，按病毒∶细胞＝0.01-0.1∶1的比例，接种脊髓灰质炎减毒株病毒，进行病毒培养，控制培养温度32-34℃，pH7.0-7.4，溶解氧20-30％，培养48-96小时，收获病毒液。
本发明具有下列优点和效果：本发明采用Vero细胞、脊髓灰质炎减毒株病毒(I、II型Sabin株和III型Pfizer株)，在发酵罐中用Cytodex I型微载体进行培养，通过小容量、中容量和大容量细胞培养规模的三级放大，细胞培养面积相当于21000个1升玻璃瓶静置培养的面积，或者相当于2100个转瓶的细胞培养面积(结果见表1)，细胞产量是常规1升瓶静置培养的21000倍，常规10升转瓶培养的2100倍，减少了培养空间，培养液用量仅是常规培养用量的8.3％(结果见表2)，同时也减少了劳动力投入，短时间内即可实现大规模制备细胞及病毒液，满足脊髓灰质炎灭活疫苗对大量病毒抗原的需求，用本发明生产的病毒液制备成疫苗后，质量稳定可靠，安全性及免疫原性良好，经检定全部符合国家生物制品规程的要求(结果见表3)。用本发明生产病毒液制备的疫苗，经25℃和37℃放置两周，以及4℃长期存放后，检测疫苗热稳定性，结果表明该疫苗稳定性良好，其有效期可达两年以上(结果见表4及表5)。
表1.微载体与常规培养法单个容器的细胞培养面积比较
培养容器
面积比
培养方 培养液
大小 培养面积 微载体培养/常
法 体积
类型 (升) (cm2) 规培养
(升)
微载体 发酵罐 550 350 4.2×106
静置培 玻璃瓶 1 0.2 2×102
21000
转瓶培 玻璃瓶 10 2.0 2×103
表2.微载体与常规培养法的培养液用量及细胞产量比较
培养液 细胞**
培养方法 用量比 产量比
用量(升)* 细胞产量(个)
微载体/常规 微载体/常规
微载体 350 0.083 5.25×1011
静置培养 4200 2.5×107 21000
转瓶培养 4200 2.5×108 2100
*三种培养方法相同培养面积的培养液用量
**以单个培养容器计算
从表1及表2的结果可以看出，本发明的生产工艺稳定，重复性好，能够满足Sabin-IPV疫苗生产对培养工艺的要求。
表3 两批Sabin IPV成品检定结果
项目 SI 20021101 SI 20021201
外观 橙红色透明液体 橙红色透明液体
表4 减毒株IPV25℃和37℃和热稳定性试验结果
(D抗原回收率％*)
批号 型别 25℃3周 37℃1周 37℃2周
SI001001 I 95 90 75
SI002001 II 100 100 100
SI003001 III 100 95 86
SI001002 I 85 80 53
SI002001 II 100 100 100
SI003002 III 93 93 71
*4℃DAg含量作为100％
表5 减毒株IPV4℃稳定性试验结果
DAgU/剂量 大白鼠效力试验(ED50)
型别
0月 12月 18月 24月 0月 18月
I 20 20 18 18 2.19 2.08
II 16 16 16 16 1.49 1.12
III 30 30 30 28 1.82 1.67
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
1、三级放大细胞培养：
a、首先对细胞种子进行离心清洗，按最低需求培养基液(MEM)∶Vero细胞种子＝500∶1的比例，接种到7升发酵罐中进行细胞培养，控制培养温度37℃，pH7.2，溶解氧50％，并于培养第三天开始灌流，灌流量由1升/天最终增加到5升/天，培养7天，细胞增殖至2.13×106个细胞/毫升，结束一级培养，进行胰酶消化；
b、将a步骤胰酶消化过的细胞悬液，按最低需求培养基液(MEM)∶Vero细胞种子＝500∶1的比例，接种于75升发酵罐中培养，控制培养温度37℃，pH7.2，溶解氧50％，在再循环培养液(MEM)体积为100升条件下，于第三天开始进行再循环培养，培养7天，细胞密度达2.74×106个细胞/毫升，结束二级培养，进行胰酶消化；
c、将b步骤胰酶消化过的细胞悬液，按最低需求培养基液(MEM)∶Vero细胞种子＝500∶1的比例，接种于550升发酵罐中培养，控制培养温度37℃，pH7.2，溶解氧50％，培养7天，细胞密度为1.07×106个细胞/毫升，结束三级培养；
2、病毒培养：收获c步骤得到的细胞培养液，用M199洗细胞一次，按病毒∶细胞＝0.02∶1的比例，接种I型毒种(Sabin I SO+2，UPV91-02)，进行病毒培养，控制培养温度34℃，pH7.4，溶解氧30％，培养93小时，收获病毒液353升。
实施例2
1、三级放大细胞培养：
a、首先对细胞种子进行离心清洗，按最低需求培养基液(MEM)∶Vero细胞种子＝1000∶1的比例，接种到10升发酵罐中进行细胞培养，控制培养温度35℃，pH7.0，溶解氧30％，并于培养第三天开始灌流，灌流量由1升/天最终增加到5升/天，培5天，细胞增殖至2.93×106个细胞/毫升，结束一级培养，进行胰酶消化；
b、将a步骤胰酶消化过的细胞悬液，按最低需求培养基液(MEM)∶Vero细胞种子＝1000∶1的比例，接种于85升发酵罐中培养，控制培养温度35℃，pH7.0，溶解氧40％，在再循环培养液(MEM)体积为100升条件下，于第三天开始进行再循环培养，培养6天，细胞密度达2.94×106个细胞/毫升，结束二级培养，进行胰酶消化；
c、将b步骤胰酶消化过的细胞悬液，按最低需求培养基液(MEM)∶Vero细胞种子＝1000∶1的比例，接种于500升发酵罐中培养，控制培养温度35℃，pH7.0，溶解氧50％，培养6天，细胞密度为1.77×106个细胞/毫升，结束三级培养；
2、病毒培养：收获c步骤得到的细胞培养液，用M199洗细胞一次，按病毒∶细胞＝0.1∶1的比例，接种I型毒种(Sabin I SO+2，UPV91-02)，进行病毒培养，控制培养温度32℃，pH7.0，溶解氧20％，培养50小时，收获病毒液。
用与实施例1相同的方法进行了九批培养，结果见表6和表7
表6.九批550升规模细胞培养结果：
体积(L) 培养
细胞倍增数
开始 细胞数
批号 开始 结 时间 本次 总
日期 (106/ml)
束 (h)
SI 00-1001 2000.03.28 350 370 88.5 2.57 10.82 1.24
SI 00-2001 2000.05.23 353 359 90.5 2.10 10.34 1.13
SI 00-3001 2000.07.25 350 370 93.0 2.85 10.69 0.90
SI 01-1001 2001.06.03 314 327 168.0 2.39 10.68 1.07
SI 01-3001 2001.08.05 262 352 120.0 3.01 9.75 1.16
SI 02-1001 2002.08.20 320 350 144.8 2.01 9.09 0.94
SI 02-2001 2002.07.21 344 345 141.0 2.05 9.81 1.01
SI 02-3001 2002.09.24 355 361 143.5 1.85 10.25 1.06
SI 03-2001 2003.04.15 347 361 144.0 3.04 11.46 0.93
表7.九批550升规模病毒培养结果：
体积(L) 细胞数
病毒培养 滴度
批号 开始日期 (106/ml 温度 时间 (logCCID50/
开始 结束
) (℃) (h) ml)
SI 2000.04.
350 370 1.27 33.5 66.50 8.400
00-1001 01
SI 2000.05.
350 362 1.10 33.5 75.50 7.850
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SI 2000.07.
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SI 2002.08.
340 352 0.94 32.5 65.00 8.620
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SI 2002.07.
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SI 2003.04.
328 332 0.93 33.0 65.00 7.875
03-2001 21
Claims (1)
1、一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗培养方法，其特征在于它经过下列工艺步骤：
1)、三级放大细胞培养：
a、首先对细胞种子进行离心清洗，按最低需求培养液(MEM)∶Vero细胞种子＝500-1000∶1的比例，接种到5-10升小容量发酵罐中进行细胞培养，控制培养温度35-37℃.pH7.0-7.4，溶解氧30-50％，并于培养第三天开始灌流，灌流量按细胞生长情况由1升/天最终增加到5升/天，培养5-7天，使细胞增殖至1-3×106个细胞/毫升，进行胰酶消化；
b、将a步骤胰酶消化过的细胞悬液，按最低需求培养液(MEM)∶Vero细胞种子＝500-1000∶1的比例，接种于50-85升中容量发酵罐中培养，控制培养温度35-37℃，pH7.0-7.4，溶解氧30-50％，在再循环培养液体积为50-100升条件下，于第三天开始进行再循环培养，培养5-7天，使细胞密度达1-3×106个细胞/毫升，进行胰酶消化；
c、将b步骤胰酶消化过的细胞悬液，按最低需求培养液(MEM)∶Vero细胞种子＝500-1000∶1的比例，接种于300-550升大容量发酵罐中培养，控制培养温度35-37℃，pH7.0-7.4，溶解氧30-50％，培养5-7天，使细胞密度为1-3×106个细胞/毫升；
2)、病毒培养：收获c步骤的细胞培养液，用M199洗细胞一次，加入M199培养液，按病毒∶细胞＝0.01-0.1∶1的比例，接种脊髓灰质炎减毒株病毒，进行病毒培养，控制培养温度32-34℃，pH7.0-7.4，溶解氧20-30％，培养48-96小时，收获病毒液。
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