CN1943789A - 抗丙肝病毒感染的dna疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明是抗丙肝病毒感染的DNA疫苗的制备及其应用。本发明利用分子克隆的技术，构建一种表达HCV包膜糖蛋白E1的重组DNA疫苗，在此基础上构建E1的六个N－糖基化突变体M1－M6，并选用其中N－糖基化突变体M2作为抗丙肝病毒感染的DNA疫苗，和在制备用于预防HCV病毒感染的DNA疫苗中的应用。本发明的优点是：实验显示HCV E1包膜糖蛋白的N－糖链可以限制宿主的细胞免疫应答，其糖基可能遮蔽病毒的T细胞表位以及B细胞表位，从而使病毒逃避免疫识别；用E1糖基化突变体M2可以作为HCV的治疗性和预防性的增强免疫原性的DNA疫苗，并且E1糖基化突变体M2制备简单，应用方便，效果显著，具有较好的应用前景。

Description

抗丙肝病毒感染的DNA疫苗

技术领域

本发明涉及分子微生物学、感染免疫领域，特别是涉及一种抗丙肝病毒感染的DNA疫苗的制备及其应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝病最重要的病因之一^[1]，我国也是丙型肝炎高发地区之一，HCV感染者约占总人口的3.2％。急性HCV感染者中大约有80％的患者会成为慢性持续性感染者^[2]，其中20％的患者经历20～30年后可进展为肝硬化，1～5％患者可进展为肝细胞性肝癌(HCC)。丙肝病毒有明显的遗传学和表型的不同^[3]，而且丙肝病毒仅能感染人类及黑猩猩，这就使针对丙肝的研究陷入困境。针对HCV感染的经典治疗方案只有用α干扰素或将α干扰素和核普类似物病毒哇合用^[4]，但该疗法有较大缺陷，副作用较大^[5]。因此，开发新型有效的丙肝疫苗已迫在眉睫。HCV包膜蛋白包括E1和E2两个糖蛋白，它们在感染中发挥着重要的作用，尤其是在HCV病毒的合成、粘附、侵袭中都起到了非常重要的作用[6]；它们不仅仅参与蛋白粒子的装配，而且在病毒入侵宿主细胞的过程中，以及包膜糖蛋白和细胞表面受体的结合在细胞膜与病毒粒子膜之间的融合中起到了非常重要的作用[7-8]。E1糖蛋白共有5个潜在的保守的N-糖基化位点，分别位于第196，209，234，305以及325个氨基酸处，其中第五个位点不参与糖基化。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种抗丙肝病毒感染的DNA疫苗，该疫苗能够提高宿主特异性的细胞免疫反应，达到临床使用效果，从而可以作为预防和治疗HCV的新型DNA疫苗，并且该疫苗制备简单，易于推广。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的抗丙肝病毒感染的DNA疫苗，由以下方法制得：

利用分子克隆的技术，构建一种表达HCV包膜糖蛋白E1的重组DNA疫苗，在此基础上构建E1的六个N-糖基化突变体M1-M6，通过比较E1的重组DNA疫苗和E1的六个N-糖基化突变体M1-M6，选用其中免疫原性最强的N-糖基化突变体M2作为抗丙肝病毒感染的DNA疫苗。

本发明提供的抗丙肝病毒感染的DNA疫苗在制备用于预防HCV病毒感染的DNA疫苗中的应用。

本发明具有以下的主要优点：

临床研究证明了细胞免疫应答在防止病人体内病毒持续感染方面发挥着重要的作用，我们的研究显示HCV E1包膜糖蛋白的N-糖链可以限制宿主的细胞免疫应答。用HCV E1蛋白的编码基因构建的E1-M2突变体重组DNA疫苗可以作为HCV的治疗性和预防性的疫苗。HCV E1上的糖基可能遮蔽病毒的T细胞表位以及B细胞表位，从而使病毒逃避免疫识别。作为免疫原性增强的DNA疫苗，E1糖基化突变体M2制备简单，应用方便，效果显著，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为E1及其突变体氨基酸位点示意图。

图2和图3：E1及其突变体真核表达产物的免疫印迹(Western Blot)鉴定结果的示意图。

图4为LDH实验检测DNA免疫小鼠的CTL反应结果的示意图。

图4中纵坐标：CTL活性(％)；横坐标：效应细胞与靶细胞比例。

图5为DNA免疫后的体内肿瘤形成抑制实验结果的示意图。

图5中纵坐标：肿瘤体积(mm³)；横坐标：注射肿瘤细胞后天数。

图6和图7显示了用ELISPOT的方法检测E1特异性的细胞因子IFN-γ(A)和IL-4(B)分泌细胞的数目。

图6中纵坐标：每次10⁶脾细胞中IFN-γ产生的细胞数；横坐标：组别；图中阴影表示：未刺激；图中空框表示：用E1蛋白刺激。

图7中纵坐标：每次10⁶脾细胞中IL-4产生的细胞数；横坐标：组别；图中阴影表示：未刺激；图中空框表示：用E1蛋白刺激。

具体实施方式

本发明利用分子克隆的技术，成功构建了表达HCV包膜糖蛋白E1的重组DNA疫苗，并在此基础上构建了E1的六个N-糖基化突变体(M1-M6)，将它们作为DNA疫苗，研究糖基化对机体免疫应答的影响。发现E1-M2可以提高宿主特异性的细胞免疫反应，可以作为抗HCV病毒的免疫反应的新型有效DNA疫苗。

上述E1的重组DNA疫苗由包括以下步骤制得：

(1)HCV E1的原核表达载体的制备：

先以HCV全基因组作为模板，进行PCR反应，获得HCV E1 DNA片段，进行HCVE1原核表达载体pGEX-KG-HCV-E1的构建。

然后将得到的pGEX-KG-HCV-E1经酶切鉴定正确后进行测序，保存测序正确的克隆。

(2)HCV E1的真核表达载体的制备

将获得的HCV E1片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-His B中。

所述E1的六个N-糖基化突变体M1-M6是基于步骤(2)的基础上进行构建。

所述E1的六个N-糖基化突变体M1-M6是用RT-PCR和Western Blot的方法检测其真核表达产物。

本发明提供的所述N-糖基化突变体M2重组DNA疫苗，其在制备用于预防HCV病毒感染的DNA疫苗中的应用。

下面结合实施例和附图对本发明的制备方法作进一步说明。

1.HCV包膜糖蛋白E1的原核表达载体的构建、表达与鉴定及抗体制备：

以HCV全基因组作为模板，进行PCR反应，获得HCV E1 DNA片段，进行HCV E1原核表达载体pGEX-KG-HCV-E1的构建，其构建方法是：提取pGEX-KG质粒DNA，将得到的pGEX-KG及E1 DNA片段用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化，分别回收pGEX-KG和E1，在T4 DNA连接酶的作用下，16℃连接目的片断E1和载体pGEX-KG，16℃，16小时。将连接产物进行转化，挑取单个克隆，加入到3ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的无菌液体LB中，37℃，16小时。提取质粒DNA pGEX-HCV-E1，然后将得到的pGEX-KG-HCV-E1经酶切鉴定正确后进行测序，保存测序正确的克隆。

将高表达水平的pGEX-HCV-E1重组质粒菌株接种于含50μg/ml的Amp抗菌素的2XTY培养基，30℃振荡培养至OD₆₀₀1-2之间，加入IPTG至终浓度0.1mM诱导，30℃振荡培养4小时浓缩菌株后超声破碎，加入TritonX-100至终浓度为1％，轻混30分钟后，离心取上清，加入Gluthathion-Sepharose 4B室温轻混30分钟后用PBS洗涤三次，即得到纯化的GST-E1-Sepharose 4B。

pGEX-HCV-E1原核表达产物的SDS-PAGE检测：取适量纯化的HCV E1蛋白，进行HCV E1的兔多克隆抗体的制备，并用Western Blot鉴定HCV E1的兔多克隆抗体。

2.HCV E1真核表达质粒pcDNA3.1(-)/Myc-His B-E1的构建：

将获得的HCV E1片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-His B中，其方法是：以HCV全基因组作为模板，进行PCR反应，获得HCV E1 DNA片段；提取pcDNA3.1(-)/Myc-His B质粒DNA，将得到的pcDNA3.1(-)/Myc-His B及E1 DNA片段用限制性内切酶EcoRI和BamHI消化，分别回收pcDNA3.1(-)/Myc-His B及E1，在T4 DNA连接酶的作用下，16℃连接目的片断E1和载体pcDNA3.1(-)/Myc-His B，16℃，16小时。

将连接产物进行转化，挑取单个克隆，加入到3ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的无菌液体LB中，37℃，16小时。提取质粒DNA pcDNA3.1(-)/Myc-His B-E1，然后将得到的pcDNA3.1(-)/Myc-His B-HCV-E1经酶切鉴定正确后进行测序，保存测序正确的克隆。

并在上述的基础上，构建HCV E1的六个糖基化突变体的真核表达载体(见图1)，其中：E1-M1，E1-M2，E1-M3和E1-M4是单突变体，E1-M5和E1-M6是双突变体。

所述E1的六个N-糖基化突变体M1-M6的构建方法是：以重组质粒pcDNA3.1(-)/Myc-His B-HCV-E1为模板，以含突变位点的寡聚核苷酸链为引物，分别进行两次PCR反应。具体包括以下步骤：

(1)以第一个糖基化位点的点突变为例，两个反应体系为：

下列反应体系将合成突变体的前段产物E1-1U：

      10×Taq DNA Polymerase buffer    5μl

      25mM MgSO4                       3μl

      10mM dNTP                        1μl

      上游引物E1S(20μM)               1μl

      下游引物p2(20μM)                1μl

      模板                             1μl

      Taq DNA Polymerase               1μl

      灭菌双蒸水                       37μl

      总体积                           50μl

下列反应体系将合成突变体的后段产物E1-1D：

      10×Taq DNA Polymerase buffer    5μl

      25mM MgSO4                       3μl

      10mM dNTP                        1μl

      上游引物p1(20μM)                1μl

      下游引物E1A(20μM)               1μl

      模板                             1μl

      Taq DNA Polymerase               1μl

      灭菌双蒸水                       37μl

      总体积                           50μl

在Taq DNA Polymerase的作用下，95℃预变性2分钟，95℃36秒、55℃36秒、68℃1分24秒，共进行28个循环，72℃终延伸5分钟。

引物序列如下：

pair 1：p1(5′-CTACCAAGTGCGC GATTCCTC-3′)

and p2(5′- GAGGAATCGCGCACTTGGTAG-3′)；

pair 2：p3(5′-GATTGCCCT GATTCG AGTATTG-3′)

and p4(5′-CAAT ACTCGAATCAGGGCAATC-3′)；

pair 3：p5，(5′-GTTCGCGAG GGT GACGCCTCGAGGTCTTG-3′)

and p6(5′-CAAGACCT CGAGGCGTCACCCTCG CGAAC-3′)；

pair 4：p7(5′-GACGCAAAGCTGC GATTGTTCTATCTAC-3′)

and p8(5′-GTAGAT AGAACAATCGCAGCTTTGCGTC-3′)；

上述序列中：有下划线的碱基代表N-糖基化位点，斜体表示的碱基代表突变位点。

(2)分别回收两次PCR产物E1-1U及E1-1D，以作为下次PCR反应的模板。

具体方法是：以E1-1U及E1-1D作为PCR反应的模板，以E1S和E1A作为引物，进行PCR反应。将得到的PCR产物和载体pcDNA3.1(-)/Myc-His B用EcoRI和BamHI进行酶切。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳、回收，再将回收产物电转化入大肠杆菌DH5α中。

(3)挑选克隆、提取质粒DNA、用EcoRI和BamHI酶切进行鉴定并进行琼脂糖凝胶电泳初步筛选阳性克隆。

(4)初步得到的、酶切鉴定正确的克隆送至上海博亚生物技术有限公司测序，得到四个单点突变体，分别命名为M1/M2/M3/M4。在单点突变体M1、M3的基础上，用M1和M3分别作为PCR的模板，用类似单点突变体构建的方法得到了双点突变体M5和M6，其中M5为第一个和第二个糖基化位点的联合突变，M6为第三个和第四个糖基化位点的联合突变。E1及其突变体真核表达产物的免疫印迹(Western Blot)鉴定：进行CT26细胞的培养与传代，将重组质粒DNA转染CT26细胞，获得稳定表达HCVE1蛋白的细胞系，并用RT-PCR方法和Western Blot检测稳定表达E1野生型及六个突变体的CT26细胞内E1的表达。本鉴定结果：图2为收获转染质粒DNA的CT26细胞并用Western Blot分析。将质粒注射小鼠48h后，检测注射部位小鼠肌肉组织E1及其突变体的表达(见图3)。

3.所述E1的六个N-糖基化突变体M1-M6是用RT-PCR和Western Blot的方法检测其真核表达产物，具体是：

(1)RT-PCR方法检测稳定表达E1野生型及六个突变体的CT26细胞内E1的表达

1)样品处理：培养细胞：收获细胞1-5×10⁷，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。

2)加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置5min。

3)4℃离心，12000g×15min，取上清。

4)加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

5)4℃离心，12000g×10min，弃上清。

6)加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。

7)晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解(65℃促溶10-15min)。

8)RNA定量，用DNA酶消化残余的DNA。

9)取RNA11μl(总量为0.1-5μg)，加入美国天美(Promega)公司生产的oligo(dT)18primer 1μl，70℃作用5min后，冰上放置以冷却混合物。

10)依次加入下列物质：

      5×reaction buffer         4μl

      Ribolock ^TM  Ribonuclease 1μl

      inhibitor

      10mM dNTP mix              2μl

      总体积                     20μl

11)37℃作用5min，加入美国天美(Promega)公司生产的RevertAid^TM M-MuLVReverseTranscriptase 1μl，42℃作用60min后，70℃加热10min以终止反应，

12)用得到得cDNA作为模板，以E1S和E1A作为引物，进行PCR反应，反应体系见前述内容。

13)在Taq DNA Polymerase的作用下，进行PCR反应，反应条件是：

A.95℃，5min，

B.95℃，36sec；60℃，36sec；72℃，84sec；共28个循环，

C.72℃，5min。

14)将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

(2)真核表达产物的Western Blot检测

收获细胞，按常规方法裂解细胞，得到细胞裂解液，

制备12％浓缩胶，以及5％分离胶。常规方法进行SDS-PAGE电泳，当示踪迹跑出样品孔后1小时，停止电泳，按照顺序进行Western Blot，30V，过夜，取出硝酸纤维膜，按照常规方法操作，最后用HRP-羊抗兔二抗，以及底物DAB显色。

4.E1野生型和六个糖基化位点突变体的重组DNA疫苗分别免疫BALB/C小鼠，用ELISPOT方法以及肿瘤形成抑制试验和LDH法进行特异性CTL的功能检测。

(1)重组质粒DNA免疫BALB/C小鼠：

大剂量提取质粒DNA，使用0.5％盐酸普鲁卡因(100μl/只)预先处理BALB/C小鼠，于双侧后腿股四头肌注射(8组)，三天后相同的部位注射提取的高纯度质粒DNA。免疫分组以及每组注射剂量如表1所示。DNA免疫，共四次，每次间隔10天。末次免疫后第10天处死老鼠，部分全血用于分离血清，用于检测抗体滴度；另一部分全血抗凝室温，放置用于其它指标的检测。

(2)LDH实验检测DNA免疫小鼠的CTL反应：

小鼠细胞毒性T细胞(CTL)杀伤活性效应细胞为免疫小鼠的脾细胞。靶细胞为稳定转染了E1-WT及M1-M6各突变体的CT26细胞。将培养板250g离心4分钟，以混匀效靶细胞。37℃孵育4小时。加入10μl裂解液到靶细胞最大LDH释放组及体积校正组。继续培养45分钟，250g离心4分钟，每孔吸取50μl上清到酶标板相应孔中。解冻稀释液，恢复至室温后，加入底物瓶内，混匀后，每孔加50μl稀释底物，37℃孵育30分钟。每孔加入50μl终止液，1小时内读板。特异性杀伤效率按以下公式计算：

特异性杀伤率(％)＝(实验组释放-实验组自发释放-靶细胞自发释放)/靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)×100％。

由图4可知，本发明和阴性对照组IL-2相比，各实验组的CTL反应明显增强。但野生型pE1和pE1-M1或pM3-M6各组之间未见明显差异(结果未显示)。与野生型相比，pE1-M2免疫小鼠的体外CTL反应明显增强(p＜0.05)。

(3)DNA免疫后的体内肿瘤形成抑制实验：

肿瘤形成抑制实验可以在一定程度上反映小鼠体内的细胞免疫功能，即体内的特异性CTL反应。小鼠的分组及免疫同前，在末次免疫的第十天，于小鼠背部接种2×10⁶个表达相应抗原的的CT26细胞(其与BALB/C小鼠具有相同MHC表型)，定期观察肿瘤大小及成瘤率。

实验结果见图5：我们在DNA免疫组小鼠背部以2×10⁶的密度接种表达相应抗原的与BALB/C小鼠具有相同MHC表型的CT26细胞。各个实验组的肿瘤体积均小于阴性对照IL-2组或空载组(p＜0.05)。而且，pE1-M2组小鼠的肿瘤体积是各个实验组中体积最小的，其与E1-WT组相比，p＜0.05。

6.ELISPOT实验：

包被板子，分离小鼠脾细胞，调整细胞浓度至2×106个/孔。封闭ELISPOT培养板，加入已准备好的细胞，细胞总数在2×105个/孔。37℃5％CO2温箱孵育12h。依次加入生物素标记的检测抗体和酶标记的抗体(GABA)，加入显色剂显色后，观察斑点的形成。去除显色液，使用去离子水清洗ELISPOT板。室温干燥ELISPOT板，在倒置显微镜下观察结果或使用自动酶联斑点图像分析仪进行分析。

实验结果显示：在经过E1蛋白的刺激后，各实验组活性细胞的数目都明显高于刺激前的水平。实验组DNA免疫小鼠的E1特异性的细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌细胞的数量都比阴性对照组的水平要高(p＜0.05)，而且同野生型相比，突变体pE1-M2组产生IFN-γ的细胞数目明显增加(p＜0.05)。各实验组产生IL-4的细胞数目与野生型相比没有显著性差异。图6为产生IFN-γ的T细胞数目/10⁶脾细胞。图7为产生IL-4的T细胞数目/10⁶脾细胞。^*p＜0.05，与Vector组相比；^**p＜0.05，与pE1-WT组相比。

附表

表1                                         免疫组别及注射剂量

分组	注射剂量
		1.空白对照N.S2.阴性对照pcDNA3.1/Myc-His-B+IL-23.阳性对照pE1-WT+IL-24.实验组A pE1-M1+IL-25.实验组B pE1-M2+IL-26.实验组C pE1-M3+IL-26.实验组D pE1-M4+IL-26.实验组E pE1-M5+IL-26.实验组C pE1-M6+IL-2	100μl100μg/100μ+500U/100μl100μg/100μl+500U/100μl100μg/100μl+500U/100μl100μg/100μl+500U/100μl100μg/100μl+500U/100μl100μg/100μl+500U/100μl100μg/100μl+500U/100μl100μg/100μl+500U/100μl

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Claims (5)

1.一种抗丙肝病毒感染的DNA疫苗，其特征是由以下方法制得：

利用分子克隆的技术，构建一种表达HCV包膜糖蛋白E1的重组DNA疫苗，在此基础上构建E1的六个N-糖基化突变体M1-M6，通过比较E1的重组DNA疫苗和E1的六个N-糖基化突变体M1-M6，选用其中免疫原性最强的N-糖基化突变体M2作为抗丙肝病毒感染的DNA疫苗。

2.如权利要求1所述的疫苗，其中所述E1的重组DNA疫苗由包括以下步骤制得：

(1)HCV E1的原核表达载体的制备

先以HCV全基因组作为模板，进行PCR反应，获得HCV E1 DNA片段，进行HCVE1原核表达载体pGEX-KG-HCV-E1的构建，其构建方法包括以下步骤：

提取pGEX-KG质粒DNA，将得到的pGEX-KG及E1 DNA片段用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化，分别回收pGEX-KG和E1，在T4 DNA连接酶的作用下，16℃连接目的片断E1和载体pGEX-KG，16小时，

将连接产物进行转化，挑取单个克隆，加入到3ml含有浓度为50μg/ml氨苄青霉素的无菌液体LB中，37℃，16小时，

提取质粒DNA pGEX-HCV-E1，然后将得到的pGEX-KG-HCV-E1经酶切鉴定正确后进行测序，保存测序正确的克隆，

(2)HCV E1的真核表达载体的制备

将获得的HCV E1片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-His B中，其方法是：

以HCV全基因组作为模板，进行PCR反应，获得HCV E1 DNA片段；提取pcDNA3.1(-)/Myc-His B质粒DNA，将得到的pcDNA3.1(-)/Myc-His B及E1 DNA片段用限制性内切酶EcoRI和BamH I消化，分别回收pcDNA3.1(-)/Myc-His B及E1，在T4 DNA连接酶的作用下，16℃连接目的片断E1和载体pcDNA3.1(-)/Myc-His B，16℃，16小时，

将连接产物进行转化，挑取单个克隆，加入到3ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的无菌液体LB中，37℃，16小时，

提取质粒DNA pcDNA3.1(-)/Myc-His B-E1，然后将得到的pcDNA3.1(-)/Myc-HisB-HCV-E1经酶切鉴定正确后进行测序，保存测序正确的克隆。

3.如权利要求1或2所述的疫苗，其中所述E1的六个N-糖基化突变体M1-M6是基于权利要求2所述HCV E1的真核表达载体的制备基础上进行构建，其方法是：以重组质粒pcDNA3.1(-)/Myc-His B-HCV-E1为模板，以含突变位点的寡聚核苷酸链为引物，分别进行两次PCR反应，

具体包括以下步骤：

(1)以第一个糖基化位点的点突变为例，两个反应体系为：

下列反应体系将合成突变体的前段产物E1-1U：

10×Taq DNA Polymerase buffer    5μl

25mM MgSO4                       3μl

10mM dNTP                        1μl

上游引物E1S(20μM)               1μl

下游引物p2(20μM)                1μl

模板                             1μl

Taq DNA Polymerase               1μl

灭菌双蒸水                       37μl

总体积                           50μl

下列反应体系将合成突变体的后段产物E1-1D：

10×Taq DNA Polymerase buffer    5μl

25mM MgSO4                       3μl

10mM dNTP                        1μl

上游引物p1(20μM)                1μl

下游引物E1A(20μM)               1μl

模板                             1μl

Taq DNA Polymerase               1μl

灭菌双蒸水                       37μl

总体积                           50μl

在Taq DNA Polymerase的作用下，95℃预变性2分钟，95℃36秒、55℃36秒、68℃1分24秒，共进行28个循环，72℃終延伸5分钟，

(2)分别回收两次PCR产物E1-1U及E1-1D，以作为下次PCR反应的模板，具体是：

以E1-1U及E1-1D作为PCR反应的模板，以E1S和E1A作为引物，进行PCR反应；将得到的PCR产物和载体pcDNA3.1(-)/Myc-His B用EcoRI和BamH I进行酶切；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳、回收，再将回收产物电转化入大肠杆菌DH5α中，

(3)挑选克隆、提取质粒DNA、用EcoRI和BamHI酶切进行鉴定并进行琼脂糖凝胶电泳初步筛选阳性克隆，

(4)初步得到的、酶切鉴定正确的克隆送至上海博亚生物技术有限公司测序，得到四个单点突变体，分别命名为M1/M2/M3/M4；在单点突变体M1、M3的基础上，用M1和M3分别作为PCR的模板，用类似单点突变体构建的方法得到了双点突变体M5和M6，其中M5为第一个和第二个糖基化位点的联合突变，M6为第三个和第四个糖基化位点的联合突变。

4.如权利要求3所述的疫苗，其中所述E1的六个N-糖基化突变体M1-M6是用RT-PCR和Western Blot的方法检测其真核表达产物，具体是：

(1)RT-PCR方法检测稳定表达E1野生型及六个突变体的CT26细胞内E1的表达

1)样品处理：培养细胞：收获细胞1-5×10⁷，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min，

2)加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置5min，

3)4℃离心，12000g×15min，取上清，

4)加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min，

5)4℃离心，12000g×10min，弃上清，

6)加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀；4℃，7500g×5min，弃上清，

7)晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解，65℃促溶10-15min，

8)RNA定量，用DNA酶消化残余的DNA，

9)取RNA11μl(总量为0.1-5μg)，加入美国天美公司的oligo(dT)¹⁸primer 1μl，70℃作用5min后，冰上放置以冷却混合物，

10)依次加入下列物质：

5×reaction buffer              4μl

Ribolock ^TM Ribonuclease       1μl

inhibitor

10mM dNTP mix                   2μl

总体积                          20μl

11)37℃作用5min，加入美国天美公司的RevertAid^TM M-MuLV Reverse Transcriptase1μl，42℃作用60min后，70℃加热10min以终止反应，

12)用得到的DNA作为模板，以E1S和E1A作为引物，进行PCR反应，反应体系是：

10×Taq DNA Polymerase buffer    5μl

25mM MgSO4                       3μl

10mM dNTP                        1μl

上游引物(20μM)                  1μl

下游引物(20μM)                  1μl

模板                             1μl

Taq DNA Polymerase               1μl

灭菌双蒸水                       37μl

总体积                           50μl

13)在Taq DNA Polymerase的作用下，进行PCR反应，反应条件是：

A.95℃，5min，

B.95℃，36sec；60℃，36sec；72℃，84sec；共28个循环，

C.72℃，5min，

14)将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，

(2)真核表达产物的Western Blot检测：

收获细胞，按常规方法裂解细胞，得到细胞裂解液，

制备12％浓缩胶，以及5％分离胶；常规方法进行SDS-PAGE电泳，当示踪迹跑出样品孔后1小时，停止电泳，按照顺序进行Western Blot，30V，过夜，

取出硝酸纤维膜，按照常规方法操作，最后用HRP-羊抗兔二抗，以及底物DAB显色。

5.权利要求1所述N-糖基化突变体M2重组DNA疫苗在制备用于预防HCV病毒感染的DNA疫苗中的应用。

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