CN103172705A

CN103172705A - 丙型肝炎病毒b细胞表位肽puhi16及其应用

Info

Publication number: CN103172705A
Application number: CN2013100614795A
Authority: CN
Inventors: 魏来; 刘如玉
Original assignee: Peking University Peoples Hospital
Current assignee: Peking University; Peking University Peoples Hospital
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2033-02-27
Also published as: CN103172705B

Abstract

本发明提供了一种新型的丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI16，采用重叠肽的方法，找到丙型肝炎病毒包膜蛋白新的线性保护性B细胞表位肽，并获得了能够中和丙型肝炎病毒1b基因亚型HCVpp的保护性抗体，这些抗体识别的表位肽，其氨基酸组成为GTYVTGGAQAHTTRGFASLF，位置为384-403（以丙型肝炎病毒H77为参考标准，Accession No.NC–004102）。该保护性B细胞表位肽的确定，为HCV治疗性抗体的研发和HCV预防性疫苗的研发提供了新的解决方案。

Description

丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI16及其应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体地说，涉及丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI16及其应用。

背景技术

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）为单股正链RNA病毒，隶属于黄病毒科。HCV基因组包括一个单一的长开放阅读框编码约由3000个氨基酸残基组成的聚合蛋白。聚合蛋白在细胞和病毒蛋白酶的作用下，裂解为三种主要结构蛋白和几种病毒复制必须的非结构蛋白。

HCV基因组高度变异，高度变异的分离株之间仅有60%核苷酸序列是同源的。HCV目前可分为6个基因型及不同亚型，HCV1b和2a基因型在我国较为常见，其中以1b型为主。某些地区有la、2b和3b型报道，6型主要见于香港和澳门地区，在南方边境省份也可见此基因型。

目前全球约有1.8亿人感染了HCV，其中约80%的感染者会慢性化，进而发展为肝硬化和肝细胞性肝癌。在我国，HCV慢性感染者约为650万。针对HCV慢性感染，最主要的治疗方式为干扰素联合利巴韦林的标准化治疗，但针对基因1型和4型治疗效果较差，且因毒副作用明显，治疗费用较高，而使大量HCV感染者被迫放弃治疗。由HCV感染导致的肝移植在西方国家已成为肝移植手术的最主要原因，在我国亦是重要原因之一，而标准化治疗方案对阻断HCV感染导致的移植肝脏再感染疗效较差，迫切需要新的预防、治疗方案。

目前，已鉴定出较多的针对HCV包膜蛋白的保护性B细胞表位，例如313-327、396-407、412-423和613-621等，这些表位相应的抗体针对HCV具有较好的中和活性。研究较多的一条保护性线性B细胞表位肽412-423（QLINTNGSWHIN），其相应的抗体，命名为HCV1，已完成临床二期实验，在黑猩猩动物模型中，250mg/kg HCV1能完全阻断HCV代表株H77（1a基因亚型）的感染。这表明在HCV感染导致的肝移植领域，该抗体在阻断移植肝脏HCV的再感染方面应用前景广阔，在HCV疫苗的研制方面，也有较为广阔的应用前景。一系列实验表明，保护性表位的鉴定，在HCV感染的预防和治疗领域，都具有十分广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI16及其应用。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI16，其氨基酸组成为GTYVTGGAQAHTTRGFASLF。

本发明是将已报道的中国人1b基因亚型HCV分离株包膜蛋白序列进行序列比对，找出包膜蛋白全长的共识序列。应用重叠肽的方法，将HCV包膜蛋白全长（共识序列），即从第192位氨基酸至第746位氨基酸（以丙型肝炎病毒H77为参考标准，Accession No.NC–004102），拆分为57条不同的多肽（不包括跨膜区），其中序列192-35、384-413、444-523、544-613和624-717中，每条多肽长度为20个氨基酸，相邻多肽重叠10个氨基酸；序列404-453、514-553和604-633中，每条多肽长度为15个氨基酸，相邻多肽重叠10个氨基酸。通过人工合成法合成这些多肽，分别将这些多肽免疫Balb/c小鼠，以获取多克隆抗体（抗血清），共免疫3次，每次间隔2周，50μg/次。将获得的多克隆抗体进行效价检测，方法包括间接ELISA（参考文献：Ndongo N,Berthillon P,Pradat P,Vieux C,Bordes I,Berby F,Maynard M,Zoulim F,Trepo C,Petit MA.Hepatology2010;52:1531-1542.）。将血清按比例稀释为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000和1:128000八个浓度，在1:128000稀释比例下，490nm处OD值≥0.25，且1:128000稀释浓度时多克隆抗体OD值与阴性对照孔OD值比值≥2，被判定为多克隆抗体效价合格。将获得的HCV多克隆抗体，进行HCV假病毒颗粒（HCV-pseudotyped particles，HCVpp）中和实验，方法包括包装具有荧光素酶报告基因的1a、1b、2a、3a、4a、5和6共七种不同基因型/亚型的HCVpp（参考文献：Tong Y,Zhu Y,Xia X,Liu Y,Feng Y,Hua X,Chen Z,Ding H,Gao L,Wang Y,Feitelson MA,Zhao P,Qi ZT.J Virol，2011;85:2793-2802.），然后将57种HCV多克隆抗体，分别按不同的稀释比例，与七种不同基因型/亚型的HCVpp分别混合，然后加入至预接种Huh7.5细胞的96孔板中，72小时后检测荧光素酶活性，并与对照孔进行比较，以确定不同多克隆抗体中和HCVpp的活性（参考文献：Tarr AW,Urbanowicz RA,Jayaraj D,Brown RJ,McKeating JA,Irving WL,Ball JK.J Virol2012;86:2739-2749.），进而确定保护性B细胞表位肽。

实验结果表明，序列384-403（以丙型肝炎病毒H77为参考标准，Accession No.NC–004102）为保护性B细胞表位肽，相应的氨基酸组成为GTYVTGGAQAHTTRGFASLF，将其命名为PUHI16，其相应的多克隆抗体能中和1b基因亚型HCVpp。

本发明还提供所述丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI16在制备抗HCV药物及HCV预防性疫苗中的应用。以PUHI16表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物（如Balb/c小鼠），制备多克隆抗体。或者，以PUHI16表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术和DNA重组技术，制备出识别PUHI16表位肽抗原的人源化单克隆抗体。将以上制得的多克隆抗体或单克隆抗体单独或联合用于阻断1b基因型慢性HCV感染者肝移植术中及术后HCV再感染。

本发明进一步提供HCV1b基因亚型中和性抗体，其是以所述的丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI16为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物（如Balb/c小鼠），制备的多克隆抗体。

前述的中和性抗体，将PUHI16表位肽分别与载体蛋白KLH和BSA偶联（其中，BSA偶联表位肽用于免疫完成后Balb/c小鼠血清抗体滴度检测）（参考文献：Darwish IA,Alzoman NZ,Abuhejail RM,El-Samani TE.Chem Cent J2012;6:125.），KLH偶联表位肽抗原和佐剂按等体积混合，乳化后，采用皮下注射法分3次免疫Balb/c小鼠，免疫完成后，收集血清中的抗体，即得。

具体地，将PUHI16表位肽分别与载体蛋白KLH和BSA偶联（其中，BSA偶联表位肽用于免疫完成后Balb/c小鼠血清抗体滴度检测），KLH偶联表位肽抗原和佐剂按等体积混合，乳化完全后，分别于第1天、15天、29天以颈背部多点皮下注射法免疫8-12周龄的Balb/c小鼠，共免疫3次，第一次使用氟氏完全佐剂，后两次使用不完全氟氏佐剂，每只小鼠每次注射500μl乳化后抗原，抗原量为50μg，免疫完成后，血清中的抗体滴度采用间接ELISA方法进行检测。收集血清中的抗体，即得。

本发明通过重叠肽的方法，找到丙型肝炎病毒包膜蛋白新的线性保护性B细胞表位肽，并获得了能够中和丙型肝炎病毒1b基因亚型HCVpp的保护性抗体，这些抗体识别的表位肽即为保护性B细胞表位肽，其氨基酸组成为GTYVTGGAQAHTTRGFASLF，位置为384-403（以丙型肝炎病毒H77为参考标准，Accession No.NC–004102）。该保护性B细胞表位肽的确定，为HCV治疗性抗体的研发和HCV预防性疫苗的研发提供了新的解决方案。

附图说明

图1为本发明实施例1中筛选HCV包膜蛋白保护性B细胞表位肽的流程示意图。

图2为本发明实施例2中保护性B细胞表位肽384-403（PUHI16）相应抗体效价检测结果。

图3为本发明实施例3中保护性B细胞表位肽384-403（PUHI16）相应抗体的1b基因亚型HCVpp中和实验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI16的获得

1.1多肽抗原及多克隆抗体的制备

在NCBI数据库中查找已报道的中国人1b基因亚型HCV分离株HCV全长蛋白质序列数据，将收集到的序列进行比对，找出包膜蛋白全长（以丙型肝炎病毒H77为参考标准，Accession No.NC–004102，氨基酸残基位置为192-747）的共识序列。从第192为氨基酸残基开始，人工合成长度为20个氨基酸的多肽，相邻多肽重叠10个氨基酸（例如第一条序列为192-211，第二条则为202-221，以此类推）。序列404-453、514-553和604-633包括CD81(HCV侵入细胞的受体之一)可能的结合位点，在此序列范围内的每条合成多肽长度为15个氨基酸，相邻多肽重叠10个氨基酸。包膜蛋白跨膜区序列不在合成多肽范围之内，共合成57条多肽。将每条多肽分别与载体蛋白KLH和BSA偶联（参考文献：Darwish IA,Alzoman NZ,Abuhejail RM,El-Samani TE.Chem Cent J2012;6:125.），其中，BSA偶联多肽用于免疫完成后Balb/c小鼠血清抗体滴度检测，KLH偶联多肽抗原和佐剂按等体积混合，乳化完全后分别于第1天、15天、29天以颈背部多点皮下注射的方法免疫Balb/c小鼠（8-12周龄），共3次。第一次氟氏完全佐剂，后两次为不完全氟氏佐剂，每只小鼠每次注射500μl乳化后抗原，抗原量为50μg。免疫完成后，血清中抗体滴度采用间接ELISA方法进行检测，结果显示46条多肽获得相应多克隆抗体（抗血清），11条多肽未产生相应抗体。

1.2HCVpp的制备

HCVpp由HCV包膜蛋白E1E2表达质粒和HIV gag/pol(pLP1)、HIV rev(pLP2)、编码荧光素酶的pLenti6质粒一起共转染293T细胞获得。HCV包膜蛋白E1E2表达质粒是将HCV包膜蛋白E1E2编码序列克隆至pCR3.1(Invitrogen)载体构建而成，转染293T细胞后，可以表达出HCV包膜蛋白E1E2。本发明中所用7种不同基因型/亚型HCV包膜蛋白E1E2DNA编码序列来自于不同基因型HCV感染者,将这些DNA编码序列分别克隆至pCR3.1载体，构建HCV包膜蛋白E1E2表达质粒，具体方法参考Lavillette D,Tarr AW,Voisset C,Donot P,Bartosch B,Bain C,Patel AH,Dubuisson J,Ball JK,Cosset FL.Hepatology2005;41:265-274。HIV gag/pol(pLP1)、HIV rev(pLP2)、编码荧光素酶的pLenti6质粒购自invitrogen公司。HCVpp的制备过程包括：分别将7种不同基因型/亚型（基因1a、1b、2a、3a、4a、5和6型）的HCV包膜蛋白E1E2表达质粒与HIV gag/pol(pLP1)、HIV rev(pLP2)、编码荧光素酶的pLenti6质粒一起共转染293T细胞，转染后置于37℃细胞培养箱中，孵育48小时后收集含有HCVpp的细胞培养上清，即可获得7种不同基因型/亚型的HCVpp（参考文献：Tong Y,Zhu Y,Xia X,Liu Y,FengY,Hua X,Chen Z,Ding H,Gao L,Wang Y,Feitelson MA,Zhao P,QiZT.J Virol，2011;85:2793-2802.）。0.45μm滤器过滤后，应用美国PALL公司100K超滤浓缩离心管浓缩20倍，即可用于HCVpp中和实验。

1.3HCVpp中和实验和荧光素酶活性检测

将Huh7.5细胞预接种于含DMEM完全培养基的96孔板中，接种密度为1×10⁴/孔。置于37℃细胞培养箱中孵育。第二天，将含HCVpp的上清（20μl/孔）和不同的多克隆抗体及阴性对照血清以不同的稀释比例混合（多克隆抗体及阴性对照血清稀释比例分别为1:50、1:100、1:200、1:400、1:800），未加多克隆抗体及阴性血清的HCVpp上清亦作为对照，并加入终浓度为4μg/ml的聚凝胺（polybrene），总体积为100μl/孔（不足100μl用DMEM完全培养基补足至100μl），37℃孵育1小时，然后加至96孔板中，每个稀释浓度均做3个平行孔。37℃孵育5小时后，弃去细胞培养上清，更换为新鲜的完全DMEM培养基，37℃孵育72小时。用荧光素酶检测系统(Promega)检测，包括弃去细胞培养上清，PBS洗1遍，加入细胞裂解液20μl/孔，孵育10分钟后加入底物荧光素100μl/孔，置于荧光发光检测仪读取数值。

1.4中和性多克隆抗体和保护性B细胞表位肽的确定

与未加多克隆抗体和阴性对照血清的对照孔相比，加入多克隆抗体后，荧光素酶活性值降低50%及以上，认为有中和活性。PUHI16相应抗体在1:50稀释比例时，能降低1b基因亚型HCVpp感染细胞荧光素酶活性约54.2%，可以认定为该多克隆抗体为中和性多克隆抗体，其识别的表位肽，即PUHI16（氨基酸组成为GTYVTGGAQAHTTRGFASLF），为保护性B细胞表位肽。

筛选HCV包膜蛋白保护性B细胞表位肽的流程示意图如图1所示。

实施例2保护性B细胞表位肽384-403（PUHI16）相应抗体的制备及效价检测

1.1保护性B细胞表位肽384-403（PUHI16）相应抗体的制备

将人工合成的丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI16分别与KLH和BSA偶联（参考文献：Darwish IA,Alzoman NZ,Abuhejail RM,El-Samani TE.Chem Cent J2012;6:125.），其中，BSA偶联表位肽用于免疫完成后Balb/c小鼠血清抗体滴度检测，KLH偶联表位肽抗原和佐剂按等体积混合，乳化完全后分别于第1天、15天、29天以颈背部多点皮下注射的方法免疫Balb/c小鼠（8-12周龄），共3次。第一次氟氏完全佐剂，后两次为不完全氟氏佐剂，每只小鼠每次500μl乳化后抗原，抗原量为50μg。

1.2保护性B细胞表位肽384-403（PUHI16）相应抗体效价检测

免疫完成后，血清抗体滴度采用间接ELISA方法进行检测。具体方法包括：将BSA偶联的相应表位肽抗原包被于96孔板中，用含10%山羊血清的1×PBS进行封闭，200μl/孔，37℃孵育1小时。用PBS洗3遍后，加入不同稀释比例的多克隆抗体（抗血清），稀释比例分别为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000和1:128000，37℃孵育2小时。用PBST（含0.05%Tween20的1×PBS）洗4遍后，加入偶联辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体，37℃孵育1小时。PBST洗4遍后，加入底物室温孵育30分钟，2N HCL终止反应，测定490nm处的OD值。多克隆抗体的每个稀释浓度均做3个平行孔。分别以稀释比例和OD值为横纵坐标作图，如果线性关系良好且多克隆抗体在1:128000稀释浓度时OD值≥0.25，且1:128000稀释浓度时多克隆抗体OD值与阴性对照孔OD值比值≥2，说明该多克隆抗体效价良好，可用于HCVpp中和实验。

保护性B细胞表位肽384-403（PUHI16）相应抗体效价检测结果如图2所示。

实施例3B细胞表位肽384-403（PUHI16）相应抗体中和1b基因亚型HCVpp感染Huh7.5细胞的检测

将所获得的效价合格的多克隆抗体进行HCVpp中和实验。方法包括将Huh7.5细胞预接种于含DMEM完全培养基的96孔板中，接种密度为1×10⁴/孔。置于37℃细胞培养箱中孵育。第二天，将含HCVpp的上清（20μl/孔）和不同的多克隆抗体及阴性对照血清以不同的稀释比例混合（多克隆抗体及阴性对照血清稀释比例分别为1:50、1:100、1:200、1:400、1:800），未加抗体及阴性血清的HCVpp上清亦作为对照，并加入终浓度为4μg/ml的聚凝胺（polybrene），总体积为100μl/孔（不足100μl用DMEM完全培养基补至100μl），37℃孵育1小时，加至96孔板中，每个稀释浓度均做3个平行孔。37℃孵育5小时后，弃去细胞培养上清，更换为新鲜的完全DMEM培养基，37℃孵育72小时。用荧光素酶检测系统(Promega)检测，方法包括弃去细胞培养上清，PBS洗1遍，加入细胞裂解液20μl/孔，孵育10分钟后加入底物荧光素100μl/孔，置于荧光发光检测仪读取数值。将检测结果进行统计分析，与未加多克隆抗体和阴性对照血清的对照孔相比，加入多克隆抗体后荧光素酶活性值降低50%及以上，认为具有中和活性。从而进一步验证该抗体对某一种或几种基因型/亚型的HCVpp是否具有中和活性。

保护性B细胞表位肽384-403（PUHI16）相应抗体的1b基因亚型HCVpp中和实验结果如图3所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

Ndongo N,Berthillon P,Pradat P,Vieux C,Bordes I,Berby F,Maynard M,et al.Association of Anti-E1E2Antibodies with Spontaneous Recovery or Sustained ViralResponse to Therapy in Patients Infected with Hepatitis C Virus.Hepatology2010;52:1531-1542.

Tong Y,Zhu Y,Xia X,Liu Y,Feng Y,Hua X,Chen Z,et al.Tupaia CD81,SR-BI,claudin-1,and occludin support hepatitis C virus infection.J Virol2011;85:2793-2802.

Tarr AW,Urbanowicz RA,Jayaraj D,Brown RJ,McKeating JA,Irving WL,Ball JK.Naturally occurring antibodies that recognize linear epitopes in the amino terminus ofthe hepatitis C virus E2protein confer noninterfering,additive neutralization.J Virol2012;86:2739-2749.

Darwish IA,Alzoman NZ,Abuhejail RM,El-Samani TE.Synthesis of hapten andpreparation of specific polyclonal antibody with high affinity for lenalidomide,thepotent drug for treatment of multiple myeloma.Chem Cent J2012;6:125.

Lavillette D,Tarr AW,Voisset C,Donot P,Bartosch B,Bain C,Patel AH,et al.Characterization of host-range and cell entry properties of the major genotypes andsubtypes of hepatitis C virus.Hepatology2005;41:265-274.

Claims

1.丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI16，其特征在于，其氨基酸组成为GTYVTGGAQAHTTRGFASLF。

2.权利要求1所述丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI16在制备抗HCV药物中的应用。

3.权利要求1所述丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI16在制备HCV预防性疫苗中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以PUHI16表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备多克隆抗体。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以PUHI16表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术和DNA重组技术，制备出识别PUHI16表位肽抗原的人源化单克隆抗体。

6.HCV1b亚型中和性抗体，其是以权利要求1所述的丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI16为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备的多克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的中和性抗体，其特征在于，将PUHI16表位肽与载体蛋白KLH偶联，KLH偶联表位肽抗原和佐剂按等体积混合，乳化后，采用皮下注射法分3次免疫Balb/c小鼠，免疫完成后，收集血清中的抗体，即得。

8.根据权利要求7所述的中和性抗体，其特征在于，将PUHI16表位肽与载体蛋白KLH偶联，KLH偶联表位肽抗原和佐剂按等体积混合，乳化完全后，分别于第1天、15天、29天以颈背部多点皮下注射法免疫8-12周龄的Balb/c小鼠，共免疫3次，第一次使用氟氏完全佐剂，后两次使用不完全氟氏佐剂，每只小鼠每次注射500μl乳化后抗原，抗原量为50μg，免疫完成后，收集血清中的抗体，即得。