CN103360474B - 经修饰的3a型丙型肝炎病毒包膜E2蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域。本发明提供了一种经修饰的3a型丙型肝炎病毒包膜E2蛋白及其在丙型肝炎疫苗以及HCV感染免疫诊断试剂中的应用。本发明经动物免疫试验发现3a型HCV包膜E2蛋白中的HVR1对包膜蛋白E2中的保守中和表位的免疫原性有显著抑制作用，删除HVR1可显著增强E2蛋白诱导广谱中和抗体的效力，即删除了高变区1的HCV包膜E2蛋白很有可能作为一种有效的丙型肝炎疫苗靶抗原。本发明还证实了删除了高变区1的HCV包膜E2蛋白与HCV感染者血清中E2抗体的反应明显增强，可用作HCV感染的免疫诊断抗原。

Description

经修饰的3a型丙型肝炎病毒包膜E2蛋白及其应用

本申请是2011年3月10日提交的专利申请号为201110057284.4，发明名称为“删除了高变区1的HCV包膜E2蛋白及其用途”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，是一种删除了高变区1的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）包膜E2蛋白及其在丙型肝炎疫苗以及HCV感染免疫诊断试剂中的应用。

背景技术

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）属于黄病毒科，是经血液传播的急、慢性肝炎的主要致病因子之一。HCV为单股正链RNA病毒，只有一个开放阅读框架，编码一个约3010个氨基酸的蛋白前体，包括三种结构蛋白（核心蛋白Core、包膜蛋白E1、包膜蛋白E2）和七种非结构蛋白（p7蛋白、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）（图1）（参见文献：Reed KE,Rice CM.Overviewof hepatitis C virus genome structure,polyprotein processing,and protein properties.Curr Top Microbiol Immunol.2000;242:55-84.）。NS5B为RNA依赖的RNA聚合酶，在指导RNA合成的过程中无校正功能，使得HCV基因组变异性很高，根据其基因组核苷酸序列的差异，目前将HCV分为六个基因型。目前全球HCV感染者超过1.7亿，约80％的急性HCV感染会发展为慢性感染。HCV慢性感染可导致肝硬化、肝细胞癌等终末期肝病，还与多种肝外疾病，如淋巴瘤、混合性冷球蛋白血症、肾小球肾炎、迟发性皮肤卟啉症、糖尿病等密切相关。虽然已经有免疫学和核酸检测方法，但这些方法均不能完全排除假阴性，此外，感染的“窗口期”由于抗体水平低以及病毒复制水平低，更容易造成漏检。治疗方面，目前的标准疗法是联合使用利巴韦林和聚乙二醇修饰的干扰素（IFN-α），不同基因型HCV对该疗法的敏感性有很大差异，I型HCV感染对该疗法的持久应答率仅为50%。虽然全球范围内经过血液以及血制品途径感染的丙型肝炎病例与上世纪九十年代以前相比有大幅下降，但在发展中国家血液和血制品仍然是传播HCV的重要途径。此外，每年散发性以及传播途径不明的丙型肝炎新发病例在全球范围内仍高居不下。控制HCV感染的关键措施还是依赖于开发出有效的疫苗，从1989年HCV基因组被克隆以来，丙型肝炎疫苗的研究在欧美和日本等发达国家一直是研究热点，但迄今未有有效的疫苗问世。

病毒的表面蛋白是诱导中和抗体的关键蛋白，HCV的表面蛋白是包膜蛋白。HCV包膜蛋白包括E1和E2两种，二者通过非共价键形成异二聚体，介导HCV与靶细胞表面的受体结合，并侵入靶细胞内部。目前鉴定出的HCV受体至少有四种，包括四次跨膜素家族成员CD81、B类I型清道夫受体（SR-BI）、以及紧密连接蛋白claudin1和occludin。HCV包膜E1蛋白相当于HCV蛋白前体中的第192-383位氨基酸（参见文献：Reed KE,Rice CM.Overview of hepatitis C virusgenome structure,polyprotein processing,and protein properties.Curr Top MicrobiolImmunol.2000;242:55-84.；Op De Beeck A,Cocquerel L,Dubuisson J.Biogenesisof hepatitis C virus envelope glycoproteins.J Gen Virol.2001;82(Pt11):2589-95.），目前其功能尚未研究清楚，但可能与HCV进入细胞以后的膜融合有关。HCV包膜E2蛋白相当于HCV蛋白前体中的第384-746位氨基酸（参见文献：Reed KE,Rice CM.Overview of hepatitis C virus genome structure,polyprotein processing,and protein properties.Curr Top Microbiol Immunol.2000;242:55-84.；Op DeBeeck A,Cocquerel L,Dubuisson J.Biogenesis of hepatitis C virus envelopeglycoproteins.J Gen Virol.2001;82(Pt11):2589-95.），功能相对比较清楚，E2蛋白能与HCV受体CD81和SR-BI结合，阻断E2蛋白与靶细胞表面的CD81或SR-BI结合，均能阻断HCV的感染。在E2蛋白中鉴定出了大量线性或空间构象依赖性中和抗体表位，针对这些表位的抗体在体外和体内均能有效抑制HCV感染。因此，E2蛋白可作为丙型肝炎疫苗的重要候选抗原，但是，E2蛋白是HCV全部蛋白中变异性最高的蛋白，E2蛋白的高度变异是HCV免疫逃避从而形成慢性感染的重要原因之一。

E2蛋白的变异并非随机分布，位于E2蛋白氨基末端的27个氨基酸残基（相当于HCV蛋白前体中的第384-410位氨基酸）是E2蛋白中变异性最高的区域，被称为高变区1（hypervariable region1,HVR1）（图1）（参见文献:Markedsequence diversity in the putative envelope proteins of hepatitis C viruses.Kato N,Ootsuyama Y,Tanaka T,Nakagawa M,Nakazawa T,Muraiso K,Ohkoshi S,HijikataM,Shimotohno K.Virus Res.1992;22(2):107-23.；Kato N,Ootsuyama Y,Ohkoshi S,Nakazawa T,Sekiya H,Hijikata M,Shimotohno K.Characterization of hypervariableregions in the putative envelope protein of hepatitis C virus.Biochem Biophys ResCommun.1992;189(1):119-27.）。该区域的变异频率与急性HCV感染后的感染慢性化以及肝硬化进程密切相关（参见文献:Weiner AJ,Geysen HM,ChristophersonC,Hall JE,Mason TJ,Saracco G,Bonino F,Crawford K,Marion CD,Crawford KA,et al.Evidence for immune selection of hepatitis C virus(HCV)putative envelopeglycoprotein variants:potential role in chronic HCV infections.Proc Natl Acad Sci US A.1992;89(8):3468-72.；Farci P,Shimoda A,Coiana A,Diaz G,Peddis G,Melpolder JC,Strazzera A,Chien DY,Munoz SJ,Balestrieri A,Purcell RH,Alter HJ.The outcome of acute hepatitis C predicted by the evolution of the viral quasispecies.Science.2000;288(5464):339-44.）。HVR1参与E2蛋白与SR-BI受体的结合，删除HVR1可使HCV的感染性显著降低。HVR1中含有一个或多个中和表位，具有高度免疫原性。HVR1抗体在体外能高效中和HCV感染，但HVR1抗体的中和作用具有严格的株特异性，即针对某一株HCV HVR1的抗体只能中和同一株病毒的感染，对其他株HCV的感染无中和作用。目前已公认HCV利用HVR1逃避免疫应答从而实现持续感染（参见文献:Weiner AJ,Geysen HM,Christopherson C,Hall JE,Mason TJ,Saracco G,Bonino F,Crawford K,Marion CD,Crawford KA,et al.Evidence for immune selection of hepatitis C virus(HCV)putative envelope glycoprotein variants:potential role in chronic HCV infections.Proc Natl Acad Sci U S A.1992;89(8):3468-72.；Farci P,Shimoda A,Coiana A,Diaz G,Peddis G,Melpolder JC,Strazzera A,Chien DY,Munoz SJ,Balestrieri A,Purcell RH,Alter HJ.The outcome of acute hepatitis C predicted by the evolution ofthe viral quasispecies.Science.2000;288(5464):339-44.）。

发明内容

本发明的目的是提供一种经修饰的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）包膜E2蛋白及其编码基因，以及所述蛋白及其编码基因在制备预防和治疗性丙型肝炎疫苗、制备HCV感染免疫诊断试剂中的应用。

本发明人认为，尽管E2蛋白的变异性高，但介导HCV感染的功能对其变异性必然具有特定的约束，使其变异具有一定的限度或某种特定的特征，从而保持基本的功能性结构。大量研究也证明在E2蛋白中的HVR1以外区域含有保守的线性或空间构象依赖性抗原表位。为了探讨HVR1与这些保守抗原表位在免疫原性方面的差异，我们比较了E2蛋白与删除了HVR1的E2蛋白在小鼠和家兔诱导的抗体反应以及抗体对HCV的中和作用，我们发现HVR1对这些保守抗原表位的免疫原性具有显著的抑制作用，用含有HVR1的E2蛋白或相应的编码基因免疫小动物，诱导出的E2抗体中主要是针对HVR1的抗体，针对HVR1以外区域抗原表位的抗体比重很低。删除HVR1则显著增强E2蛋白诱导针对HVR1以外区域抗原表位的抗体，免疫血清对其他株HCV的中和活性也相应显著提高。我们还发现，删除HVR1可明显提高E2蛋白与HCV感染者血清的反应。这些结果提示，删除HVR1能显著增强HCV包膜E2蛋白诱导交叉反应抗体（与异株HCV包膜蛋白反应）和交叉中和抗体（中和异株HCV感染）的能力，代表HCV疫苗研发的一种全新策略，该蛋白还可用于HCV感染的免疫诊断。

本发明首先用基因免疫（又称核酸免疫、DNA免疫）的方法将含有HVR1和删除了HVR1的E2基因分别免疫小鼠，分析HVR1对1-6基因型的E2蛋白免疫原性的影响，并用HCV假病毒（HCV pseudoparticles,HCVpp）以及细胞培养产生的HCV（cell culture produced HCV,HCVcc）为模型分析小鼠免疫血清对HCV的中和活性。结果表明：HVR1对包膜E2蛋白的免疫原性具有显著的抑制作用，当存在HVR1时，E2蛋白中的保守抗原表位难以诱导相应的抗体，免疫血清对异株HCV的中和活性很低；当删除HVR1以后，E2蛋白中保守抗原表位能高效诱导相应的抗体，免疫血清对异株HCV的中和活性显著提高；删除HVR1还能提高E2蛋白与HCV感染者血清的结合活性。在6个基因型HCV包膜E2蛋白中均存在类似现象。

随后用CHO细胞表达了1b基因型HCV包膜E2蛋白，包括含有HVR1和删除了HVR1的两种形式。表达产物用亲和层析方法纯化，然后用ISA720为佐剂，免疫家兔，检测家兔血清中的抗体并分析血清对HCV的中和活性，以及HCV感染者血清与两种形式E2蛋白的结合活性。结果显示：删除HVR1可显著增强E2蛋白诱导交叉反应抗体和交叉中和抗体，删除HVR1的E2蛋白在丙型肝炎疫苗研发中有重要用途，也可作为HCV感染的免疫诊断抗原。

本发明技术方案的具体内容如下：

1．1-6基因型共七株HCV包膜E2蛋白基因的扩增：根据相应包膜E2蛋白的基因序列设计、合成引物，以聚合酶链反应（PCR）扩增含有HVR1和删除HVR1的HCV包膜E2蛋白基因，PCR扩增产物用限制性核酸内切酶消化后插入哺乳动物细胞表达载体，然后对E2基因进行DNA测序。

2．HCV包膜E2蛋白表达产物的鉴定：将构建的表达质粒转染人胚肾（HEK）293T细胞，用酶联免疫吸附实验（ELISA）和western blot分析细胞培养上清和细胞裂解液中的E2蛋白，用抗E2蛋白的多克隆抗体为检测抗体。

3.小鼠基因免疫和血清抗体检测：将上述E2蛋白表达质粒分别免疫Balb/C小鼠，免疫三次，定期采集血清，检测小鼠血清中的E2抗体和HVR1抗体。

4.小鼠免疫血清的中和活性分析：用HCVpp和HCVcc为模型分析小鼠免疫血清对HCV的中和活性。

5.构建1b型HCV包膜E2蛋白的CHO细胞表达质粒：分别将含有HVR1和删除HVR1的1b型HCV包膜E2基因插入具有自主知识产权的CHO细胞表达质粒pCIDA-GS-neo（见本申请人已授权的中国专利ZL200610024202.5，发明名称为：一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，发明人为：赵平、廖小玲、曹洁、戚中田。），然后DNA测序鉴定。

6.稳定表达1b型HCV包膜E2蛋白的CHO细胞株的构建以及细胞培养与蛋白纯化：用脂质体将上述质粒转染CHO-K1细胞，以甲硫酰硫酸胺（MSX）筛选得到稳定转染的CHO-K1细胞克隆，然后进行无血清悬浮培养驯化，使细胞完全适应于无血清培养基生长。收集细胞培养上清，离心，超滤，然后用镍柱亲和层析纯化E2蛋白。

7．含有HVR和删除了HVR1的E2蛋白免疫家兔：分别将含有HVR和删除了HVR1的E2蛋白与免疫佐剂ISA720充分混匀，免疫家兔，免疫三次，定期采集家兔血清。

8．家兔血清抗体检测与中和活性分析：检测家兔免疫血清中的E2抗体和HVR1抗体，用HCVpp和HCVcc为模型分析家兔血清的中和活性。

9.用含有HVR和删除了HVR1的蛋白检测HCV感染者血清中的E2抗体：将等量的E2t和E2tΔ蛋白包被酶标板，用于检测HCV感染者血清中的E2抗体。

本发明提供了一种经修饰的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）包膜E2蛋白及其编码基因，所述经修饰的丙型肝炎病毒包膜E2蛋白是指删除了丙型肝炎病毒包膜E2蛋白中的高变区1的肽段。

丙型肝炎病毒包膜E2蛋白中高变区1的肽段（HVR1）是E2蛋白氨基末端的27个氨基酸，相当于HCV蛋白前体的384-410位氨基酸残基。

本发明还提供了所述蛋白及其编码基因在制备预防和治疗性丙型肝炎疫苗中的应用。

本发明还提供了所述蛋白及其编码基因在制备丙型肝炎病毒感染的免疫学诊断试剂中的应用。

本发明删除了HCV包膜E2蛋白中的高变区1，这种HCV包膜E2蛋白的免疫原性显著强于含有高变区1的HCV包膜E2蛋白，诱导抗体应答的能力显著增强；诱导交叉反应性抗体（与其他基因型、其他株HCV包膜蛋白反应的抗体）的能力显著强于含有高变区1的HCV包膜E2蛋白；诱导交叉中和抗体（中和其他基因型、其他株HCV感染性的抗体）的能力显著强于含有高变区1的HCV包膜E2蛋白；与HCV感染者血清中包膜蛋白抗体的反应显著强于含有高变区1的HCV包膜E2蛋白。

本发明证明了HVR1对HCV包膜E2蛋白中保守抗原表位的免疫原性具有显著抑制作用，删除HVR1可有效增强HCV包膜E2蛋白诱导交叉反应抗体和交叉中和抗体，为研究和开发丙型肝炎疫苗提供了一种有效的抗原设计策略，并为HCV感染的免疫学诊断提供了一种新的检测抗原。

附图说明

图1：HCV基因组编码的蛋白前体以及包膜E2蛋白的结构。HCV蛋白前体包括三种结构蛋白（核心蛋白Core、包膜蛋白E1、包膜蛋白E2）和七种非结构蛋白（p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）。包膜E2蛋白羧基端约30个氨基酸组成跨膜区，其余为胞外段，氨基端27个氨基酸组成高变区1（HVR1），HVR1为胞外段的一部分。数字为氨基酸位置。

图2：pCI-E2t和pCI-E2tΔ质粒的结构。pCI-E2t编码E2蛋白的信号肽以及胞外段，含有HVR1；pCI-E2tΔ编码删除了HVR1的E2蛋白，其余序列和pCI-E2t相同。PCMV为巨细胞病毒启动子，polyA为SV40病毒多聚腺苷酸序列。

图3：分别将1-6基因型共7株HCV包膜E2蛋白的表达质粒pCI-E2t和pCI-E2tΔ转染HEK293T细胞，用酶联免疫吸附实验检测细胞裂解液中和培养上清中的E2t（含HVR1）和E2tΔ蛋白（不含HVR1）。

图4：用细胞培养产生的HCV（HCVcc）为模型评价1a、1b和2a型E2基因免疫的小鼠血清对JFH1、J6-JFH1和H77-JFH1嵌合HCVcc的中和作用，图为各组小鼠血清中和率（%）的平均值（每组10只小鼠，血清1:100稀释）。

图5：用于转染CHO-K1细胞的E2蛋白表达质粒的结构。PCMV为巨细胞病毒CMV启动子，introD为内含子供体序列，GS为谷氨酰氨合成酶基因，introA为内含子受体序列，E2为HCV包膜E2基因E2t（含HVR1）或E2tΔ（不含HVR1），polyA为SV40病毒多聚腺苷酸序列。

图6：用CHO-K1细胞重组表达的1b型HCV包膜E2t和E2tΔ蛋白的SDS-PAGE分析。

图7：分别用HCV包膜E2t和E2tΔ蛋白与佐剂ISA720充分混匀，免疫家兔，免疫三次，每次剂量50μg，用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠血清中的同株E2t（含HVR1）、同株E2tΔ（删除了HVR1）以及同株HVR1抗体。图为不同时间点各组家兔血清中的抗体阳性率（每组10只小鼠，血清1:100稀释）。图8：用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测家兔血清中的同株E2t（含HVR1）、同株E2tΔ（删除了HVR1）以及同株HVR1抗体。图为不同时间点各组家兔血清抗体检测的光吸收值的平均值（每组10只家兔，血清1:100稀释）。

图9：分析第三次免疫后家兔血清对HCVpp的中和作用，图为各组家兔血清中和率（%）的平均值（每组10只家兔，血清1:100稀释）。

图10：分析第三次免疫后家兔血清对JFH1、J6-JFH1和H77-JFH1嵌合HCVcc的中和作用，图为各组家兔血清中和率（%）的平均值（每组10只家兔，血清1:100稀释）。

图11：用等量E2t和E2tΔ蛋白包被酶标微孔板，用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测30例HCV感染者与10例健康人血清中的相应抗体（血清1:100稀释），数值为同一样品平行三孔光吸收值的平均值。

表1：1a、1b、2a、3、4、5、6型共7株HCV包膜E1E2基因的核苷酸序列

表2：1a、1b、2a、3、4、5、6型共7株HCV包膜E2基因的扩增引物

表3：分别将1-6基因型共7株HCV包膜E2蛋白的表达质粒pCI-E2t肌肉注射免疫小鼠，免疫三次，每次剂量20μg，用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠血清中的同株E2t（含HVR1）、同株E2tΔ（删除了HVR1）以及同株HVR1抗体。图为各组小鼠血清不同时间点的抗体阳性率（每组10只小鼠，血清1:100稀释）。

表4：分别将1-6基因型共7株HCV包膜E2蛋白的表达质粒pCI-E2t肌肉注射免疫小鼠，免疫三次，每次剂量20μg，用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠血清中的同株E2t（含HVR1）、同株E2tΔ（删除了HVR1）以及同株HVR1抗体。图为各组小鼠血清在不同时间抗体检测的光吸收值的平均值（每组10只小鼠，血清1:100稀释）。

表5：分别将1-6基因型共7株HCV包膜E2蛋白的表达质粒pCI-E2tΔ肌肉注射免疫小鼠，免疫三次，每次剂量20μg，用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠血清中的同株E2t（含HVR1）以及同株E2tΔ（删除了HVR1）抗体。图为各组小鼠血清不同时间点的抗体阳性率（每组10只小鼠，血清1:100稀释）。

表6：分别将1-6基因型共7株HCV包膜E2蛋白的表达质粒pCI-E2tΔ肌肉注射免疫小鼠，免疫三次，每次剂量20μg，用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠血清中的同株E2t（含HVR1）以及同株E2tΔ（删除了HVR1）抗体。图为各组小鼠血清在不同时间抗体检测的光吸收值的平均值（每组10只小鼠，血清1:100稀释）。

表7：用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测1a型pCI-E2t和pCI-E2tΔ质粒免疫小鼠血清中针对其他基因型E2蛋白的抗体，图为各组小鼠血清在不同时间抗体检测的光吸收值的平均值（每组10只小鼠，血清1:100稀释）。

表8：用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测1b型pCI-E2t和pCI-E2tΔ质粒免疫小鼠血清中针对其他基因型E2蛋白的抗体，图为各组小鼠血清在不同时间抗体检测的光吸收值的平均值（每组10只小鼠，血清1:100稀释）。

表9：用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测2a型pCI-E2t和pCI-E2tΔ质粒免疫小鼠血清中针对其他基因型E2蛋白的抗体，图为各组小鼠血清在不同时间抗体检测的光吸收值的平均值（每组10只小鼠，血清1:100稀释）。

表10：用HCV假病毒（HCVpp）为模型分析第三次免疫后1a、1b和2a型E2基因免疫的小鼠血清对同株和异株HCVpp中和作用，图为各组小鼠血清中和率（%）的平均值（每组10只小鼠，血清1:100稀释）。

表11：不同时间点各组家兔血清中抗异株HCV包膜E2蛋白的抗体阳性率（每组10只家兔，血清1:100稀释）。

具体实施方式

下面结合本发明的实施例和附图对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：含HVR1和删除HVR1的1-6基因型HCV包膜E2蛋白基因的扩增：

1a、1b、2a型HCV包膜蛋白E1E2基因由美国Rockefeller大学C.M.Rice教授馈赠；3a、4、5、6型HCV包膜蛋白E1E2基因由英国Nottingham大学J.K.Ball教授馈赠。基因序列见表1。根据1-6基因型（1a、1b、2a、3a、4、5、6型）共7株HCV包膜E2基因的相应序列设计、合成引物，用聚合酶链反应（PCR）扩增E2蛋白胞外段基因（相当于HCV多蛋白第364-661位氨基酸残基，第364-383位氨基酸残基作为E2蛋白的分泌性信号肽）。扩增引物（上游引物FP1、下游引物RP）的序列见表2。PCR扩增用试剂为美国Promega公司产品。

在0.5毫升离心管建立以下反应体系：

补充双蒸灭菌水至总反应体积50μl，用MJ PTC-100型PCR仪进行热循环反应：94°C变性2分钟，94°C变性40秒，60°C退火40秒，72°C延伸1分钟20秒，共进行30个循环，然后72°C延伸5分钟，温度降至4°C结束反应。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带回收，1a、1b、2a、3a、4、6型PCR产物用NheI/XbaI酶切，5型PCR产物用XhoI/XbaI酶切，酶切产物插入哺乳动物细胞表达质粒载体pCI-neo（美国Promega公司产品）。对插入的基因进行DNA测序。扩增的E2基因命名为E2t，构建的E2表达质粒命名为pCI-E2t，结构如图2所示。

用两步PCR法制备删除了HVR1的E2蛋白胞外段基因（相当于HCV多蛋白第364-661位氨基酸残基，但缺失第384-411位氨基酸残基）。各株基因的扩增引物（上游引物FP1、上游引物FP2、下游引物RP）的序列见表2。PCR反应的引物用FP2和RP，其他组分同上，热循环反应条件同上，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带回收，再进行PCR反应，引物用FP1和RP，其他组分同上，热循环反应条件同上，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带回收，用NheI/NotI酶切，酶切产物插入哺乳动物细胞表达质粒载体pCI-neo（美国Promega公司产品）。对插入的基因进行DNA测序。扩增的E2基因命名为E2tΔ，构建的E2表达质粒命名为pCI-E2tΔ，其表达调控结构如图2所示：PCMV为巨细胞病毒启动子，E2为HCV包膜E2基因E2t或E2tΔ，polyA为SV40病毒多聚腺苷酸序列。

表1：HCV包膜蛋白E1E2基因序列

1a型H77株	Genbank Accession：AF009606.1 GI：2316097	如SEQ ID NO:1所示
			1b型Con1株	Genbank Accession:AJ238799.1 GI:5420376	如SEQ ID NO:2所示
2a型J6株	Genbank Accession:D00944.4 GI:221650	如SEO ID NO:3所示
			3a型UKN3A1.28C株		如SEQ ID NO:4所示
4型UKN4.21.16株		如SEQ ID NO:5所示
			5型UKN5.15.7株		如SEQ ID NO:6所示
6型UKN6.5.8株		如SEQ ID NO:7所示

表2：扩增HCV包膜E2基因的引物序列

实施例2：1-6基因型HCV包膜E2蛋白表达产物的鉴定：

用含有10％胎牛血清的DMEM培养液传代培养人胚肾（HEK）293T细胞，细胞80%融合时，以0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代接种于35mm细胞培养皿，培养过夜。将4μg质粒上述构建的1-6基因型共7株HCV包膜E2蛋白表达质粒pCI-E2t（含HVR1）、pCI-E2tΔ（删除了HVR1）及空载体pCI-neo分别与10μl转染试剂脂质体Lipofectamine（美国Invitrogen公司产品）混匀，转染HEK293T细胞，操作按照使用说明进行。将质粒-脂质体混合物加入细胞培养皿以后，将细胞培养皿置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中，8小时后加1ml含10%胎牛血清的完全DMEM培养液，继续培养48小时。然后吸出培养上清，用400μl含2%SDS以及蛋白酶抑制剂（美国Roche公司产品）的磷酸盐缓冲液（PBS）裂解贴壁生长的细胞。将细胞培养上清液和细胞裂解液分别进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，再进行western blot分析，检测抗体为羊抗HCV包膜E2蛋白多克隆抗体（美国BioDesign公司产品），酶标第二抗体为辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗羊IgG（美国Sigma公司产品），用化学发光法检测反应条带。操作均参照《分子克隆实验指南第二版》（科学出版社，1995）进行。结果显示：1-6基因型共7株HCV包膜E2蛋白均可在质粒转染的HEK293细胞内表达，并能分泌至细胞培养上清中，分子量为5万到6万道尔顿之间；对于同一株HCV，含有HVR1和删除HVR1的E2蛋白的表达和分泌水平相似。

用酶联免疫吸附实验（ELISA）进一步分析HVR1对E2蛋白的表达和分泌的影响。HCV包膜蛋白为高度糖基化蛋白，凝集素可特异吸附E2蛋白上的N-糖苷，因而可用于E2蛋白的检测。将凝集素GNA（美国Sigma公司产品）用PBS溶解成浓度20μg/ml，加入酶标微孔板（美国Corning公司产品），每孔0.1ml，置于4℃冰箱过夜，次日吸除GNA，每孔用0.2ml PBS缓冲液洗一次，然后每孔加入含3%牛血清白蛋白及0.05%Tween20的PBS缓冲液（封闭液）0.1ml，室温放置2小时，然后吸除封闭液，每孔加入质粒pCI-E2t或pCI-E2tΔ转染的HEK293T细胞的裂解液或培养上清0.1ml（细胞裂解液和培养上清均用封闭液稀释50倍），室温放置2小时，然后吸除细胞裂解液或培养上清，每孔加入用封闭液1000倍稀释的羊抗HCV包膜E2蛋白多克隆抗体0.1ml，室温放置40分钟，然后吸除血清，用含0.05%Tween20的PBS缓冲液（洗液）洗孔5次，然后每孔加入用封闭液稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG（美国Sigma公司产品）0.1ml，室温放置40分钟，然后吸除抗体，用洗液洗孔5次，每孔加入含TMB的底物液0.1ml，室温避光放置10分钟后，加入2M硫酸和30%过氧化氢溶液各0.05ml，混匀，用酶标仪检测450nm波长的光吸收值，参考波长630nm。结果于图3所示，在细胞裂解液和细胞培养上清中均可检测到HCV包膜E2蛋白，HVR1存在与否不影响E2蛋白的表达和分泌。

实施例3：小鼠基因免疫与抗体检测：

用质粒提取试剂盒（德国Qiagen公司产品）大量制备与纯化上述1-6基因型共7株HCV包膜E2蛋白表达质粒pCI-E2t、pCI-E2tΔ及空载体pCI-neo，溶解于PBS缓冲液（pH7.4），调整浓度至100μg/ml，免疫Balb/C小鼠，每种质粒免疫10只小鼠，每侧胫骨前肌注射质粒溶液0.1ml，折合剂量为每只小鼠20μg质粒。共免疫三次，间隔时间二周。每次免疫前一天（时间分别为0、2、4周，首次采血时间定为0周）以及末次免疫后每隔二周（共7次，时间分别为6、8、10、12、14、16、18周）从小鼠眼眶取血，用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠血清中的E2t（含HVR1）、E2tΔ（删除了HVR1）以及HVR1抗体。E2t、E2tΔ抗体检测：将质粒pCI-E2t及pCI-E2tΔ分别转染接种于10cm平皿的HEK293T细胞，72小时后收集细胞培养上清。将凝集素GNA（美国Sigma公司产品）用PBS溶解成浓度20μg/ml，加入酶标微孔板（美国Corning公司产品），每孔0.1ml，置于4℃冰箱过夜，次日吸除GNA，每孔用0.2ml PBS缓冲液洗一次，然后每孔加入含3%牛血清白蛋白及0.05%Tween20的PBS缓冲液（封闭液）0.1ml，室温放置2小时，然后吸除封闭液，每孔加入质粒pCI-E2t或pCI-E2tΔ转染的HEK293T细胞培养上清0.1ml，室温放置2小时，然后吸除细胞培养上清，每孔加入用封闭液稀释的小鼠免疫血清0.1ml，室温放置40分钟，然后吸除血清，用含0.05%Tween20的PBS缓冲液（洗液）洗孔5次，然后每孔加入用封闭液稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG（美国Sigma公司产品）0.1ml，室温放置40分钟，然后吸除抗体，用洗液洗孔5次，每孔加入含TMB的底物液0.1ml，室温避光放置10分钟后，加入2M硫酸和30%过氧化氢溶液各0.05ml，混匀，用酶标仪检测450nm波长的光吸收值，参考波长630nm。相同稀释度下，pCI-E2t及pCI-E2tΔ免疫血清光吸收值超过空载体pCI-neo免疫血清平均光吸收值的2.1倍为抗体阳性。

HVR1抗体检测：1-6基因型共7株HCV包膜E2蛋白HVR1合成肽（上海吉尔生化有限公司合成）用DMSO溶解成浓度0.5mg/ml，用PBS稀释至浓度0.05mg/ml，加入酶标微孔板，每孔0.1ml，置于4℃冰箱过夜，次日吸除HVR1合成肽溶液，每孔用0.2ml PBS缓冲液洗一次，然后每孔加入封闭液0.1ml，室温放置2小时后，用洗液洗孔5次，然后每孔加入稀释的小鼠血清，检测HVR1抗体，后续的操作方法同上。

结果：1-6基因型共7株HCV E2基因免疫的小鼠中（共14种质粒，每种质粒免疫10只小鼠），首次免疫后，pCI-E2t质粒免疫的小鼠血清中超过80%可检测到同株HVR1抗体和同株E2t（含HVR1）抗体，但仅有1a、2a、3和5基因型可检测到同株E2tΔ抗体，阳性率分别为10%、30%、20%和20%（表3）。第二次免疫后，小鼠血清中的同株HVR1和同株E2t抗体水平明显升高（表4），阳性率均达到100%（表3），同株E2tΔ抗体水平也有升高，但阳性率均低于50%（表3）。第三次免疫后，小鼠血清中的E2tΔ抗体水平进一步升高（表4），但阳性率均不超过60%（表3）。

首次免疫后，质粒pCI-E2tΔ免疫的小鼠血清中同株E2tΔ抗体阳性率即达到或超过90%（表5），第二次免疫后，各组小鼠血清抗同株E2tΔ抗体水平明显升高（表6），阳性率达到100%（表5）。同株E2t抗体和同株E2tΔ抗体水平相似（表6），所有小鼠血清中未检测到HVR1抗体，这和质粒pCI-E2tΔ编码的E2蛋白中不含HVR1相一致。

用异株HCV包膜E2蛋白检测小鼠血清中的相应抗体，其趋势与小鼠血清中的针对同株E2tΔ的抗体水平基本一致。表7、8、9显示用其他6株包膜E2t蛋白检测1a、1b和2a型pCI-E2t和pCI-E2tΔ质粒免疫的小鼠血清中的相应抗体，pCI-E2t质粒免疫小鼠血清中的针对异株E2蛋白的抗体水平显著低于pCI-E2tΔ质粒免疫的小鼠血清。3、4、5和6型pCI-E2t质粒免疫小鼠血清中的针对异株E2蛋白的抗体水平也显著低于pCI-E2tΔ质粒免疫的小鼠血清。

结果表明：HVR1可高效诱导抗体反应，当E2中存在HVR1时，针对HVR1以外的抗原表位诱导抗体应答的效力显著降低，删除HVR1可显著增强E2蛋白其他表位的免疫原性，提高E2蛋白诱导的交叉反应抗体水平。

表3：6个基因型7株pCI-E2t质粒免疫组小鼠不同时间的抗体阳性率（%）

表4：6个基因型7株型pCI-E2t质粒免疫组小鼠不同时间抗体检测的光吸收值

表5：6个基因型7株pCI-E2tΔ免疫组小鼠不同时间的抗体阳性率（%）

表6：6个基因型7株型pCI-E2tΔ免疫组小鼠不同时间抗体检测的光吸收值

表7：1a型pCI-E2t和pCI-E2tΔ质粒免疫小鼠血清中针对其他基因型E2蛋白抗体检测的光吸收值

表8：1b型pCI-E2t和pCI-E2tΔ质粒免疫小鼠血清中针对其他基因型E2蛋白抗体检测的光吸收值

表9：2a型pCI-E2t和pCI-E2tΔ质粒免疫小鼠血清中针对其他基因型E2蛋白抗体检测的光吸收值

实施例4：小鼠免疫血清的病毒中和活性分析：

用HCVpp以及HCVcc为模型分析小鼠免疫血清对HCV的中和活性。

HCV假病毒颗粒（HCV pseudoparticles,HCVpp）是一种嵌合病毒，内部是逆转录病毒的核衣壳，基因组为双链RNA，编码有便于检测的报告基因（绿色荧光蛋白基因或者荧光素酶基因），表面是病毒包膜，包膜中镶嵌有HCV包膜E1、E2蛋白。HCVpp的感染特性与HCV相似，常用人肝癌细胞系Huh7或其衍生的细胞系如Huh7.5作为其感染的靶细胞，是评价抗体中和作用的重要模型。将HCV包膜蛋白表达质粒与逆转录病毒包装质粒共转染HEK293T细胞即可获得HCVpp。

用HCVpp分析抗体的中和活性：将感染性在线性范围的一定量HCVpp分别与一定稀释度的小鼠血清（包括空质粒免疫的对照组小鼠血清以及E2基因免疫的小鼠血清）混匀，37℃放置45分钟，然后加入接种有Huh7.5靶细胞的96孔板内（加入病毒前先吸除原培养基），37℃培养5小时后换完全DMEM培养基，继续培养48小时，吸除培养液，裂解细胞，检测细胞裂解液中的荧光素酶活性，荧光素酶活性为HCVpp感染的定量指标，用相对荧光素酶活性单位表示。细胞裂解液以及荧光素酶检测试剂为美国Promega公司产品。中和百分率=（对照组血清处理孔的相对荧光素酶活性单位-E2基因免疫血清处理孔的相对荧光素酶活性单位）÷对照组血清处理孔的相对荧光素酶活性单位×100%。

细胞培养产生的HCV（cell culture produced HCV,HCVcc）是真正的HCV，用体外转录得到的2a基因型JFH-1株HCV全长基因组RNA转染人肝癌细胞系Huh7或其衍生的细胞系如Huh7.5，可获得HCVcc。目前仅有JFH-1株可制备出HCVcc，而其他株HCV不能制备出HCVcc。将其他株HCV的结构基因（结构基因中包含包膜蛋白基因）与JFH-1株的非结构基因进行重组，可能得到嵌合的HCVcc，这也是用于评价抗体中和活性的更真实模型。

用HCVcc分析抗体的中和活性：将感染性在1000FFU(foci forming unit)/mlHCVcc0.4ml分别与一定稀释度的小鼠血清（包括空质粒免疫的对照组小鼠血清以及E2基因免疫的小鼠血清）混匀，最终体积0.8ml，37℃放置45分钟，然后加入接种有Huh7.5靶细胞的96孔板内（加入病毒前先吸除原培养基），37℃培养5小时后换完全DMEM培养基，继续培养48小时，然后吸除培养液，用甲醛固定细胞，用免疫荧光方法检测表达HCV蛋白的Huh7.5细胞，检测抗体是针对HCV非结构蛋白NS5A的单克隆抗体，示踪抗体是荧光素标记的抗小鼠IgG，操作结束后在荧光显微镜下计数荧光阳性的细胞。中和百分率=（对照组血清处理孔的荧光阳性细胞数-E2基因免疫血清处理孔的荧光阳性细胞数）÷对照组血清处理孔的荧光阳性细胞数×100%。

结果：表10显示第三次免疫后1a、1b和2a型E2基因免疫小鼠血清对同株和异株HCVpp中和作用，可见质粒pCI-E2t免疫血清与pCI-E2tΔ免疫血清均能有效中和同株HCVpp的感染，其效果相似；但是，pCI-E2tΔ免疫血清对异株HCVpp的中和作用显著强于pCI-E2t免疫血清。其他4个基因型E2免疫血清对HCVpp的中和作用与此类似，删除HVR1均显著提高小鼠免疫血清的中和活性。

用JFH1、J6-JFH1和H77-JFH1嵌合HCVcc为模型评价小鼠免疫血清的中和活性，图4显示1a、1b和2a基因型E2免疫血清对该三株HCVcc的中和作用，可见pCI-E2tΔ免疫血清对三株HCVcc的中和作用都显著强于pCI-E2t免疫血清的中和作用。

表10：1a、1b和2a型E2基因免疫的小鼠血清对同株和异株假病毒（pp）的中和百分率（%）

实施例5：构建1b型HCV包膜E2蛋白（含HVR1和不含HVR1）的CHO细胞表达质粒：

分别以质粒pCI-E2t、pCI-E2tΔ为模板，PCR扩增1b型Con1株HCV包膜E2基因E2t和E2tΔ基因，上游引物用FP1，下游引物用RP-C，FP1和RP-C引物的序列见表2。下游引物RP-C的3末端含6个组氨酸的编码序列，6个组氨酸残基作为蛋白纯化的标签。PCR产物以NheI和SalI酶切，然后插入本实验室构建的具有自主知识产权的CHO细胞表达质粒pCIDA-GS-neo。PCR反应体系以及热循环条件参照实施例1中所述。操作均参照《分子克隆实验指南第二版》（科学出版社，1995）进行。得到的质粒结构如图5所示：PCMV为巨细胞病毒CMV启动子，introD为内含子供体序列，GS为谷氨酰氨合成酶基因，introA为内含子受体序列，E2为HCV包膜E2基因E2t（含HVR1）或E2tΔ（不含HVR1），polyA为SV40病毒多聚腺苷酸序列。

实施例6：稳定表达HCV包膜E2蛋白（含HVR1和不含HVR1）的悬浮生长CHO-K1细胞株的构建以及E2蛋白的表达和纯化：

用含10％胎牛血清的DMEM培养液传代培养CHO-K1细胞，细胞80%融合时，以0.25%胰蛋白酶消化细胞，接种于35mm细胞培养皿，次日将4μg上述E2表达质粒与10μl脂质体转染试剂Lipofectamine（美国Invitrogen产品）混匀，转染CHO-K1细胞，操作按照使用说明进行。将质粒-脂质体混合物加入细胞培养皿以后，将细胞培养皿置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中，8小时后加1ml含10%胎牛血清的DMEM培养液，继续培养48小时。然后将细胞以0.25%胰蛋白酶消化，接种于5个100mm细胞培养皿，用含有10%透析的胎牛血清的GMEM-S培养液（美国Sigma公司产品）培养，加甲硫酰硫酸胺（MSX）（美国Sigma公司产品）至终浓度25μmol/L，3-4天后细胞开始死亡，两周后培养皿形成由单个细胞增殖而形成的克隆，挑单个克隆接种于96孔板，继续用含25μmol/L MSX的GMEM-S培养液培养，一周后培养上清用westernblot法检测E2蛋白的表达，对表达水平最高的克隆以胰蛋白酶消化，有限稀释接种96孔板，继续用25μmol/L MSX的GMEM-S培养液培养，二周后，将长有单克隆的孔内细胞转移至24孔板，继续培养，细胞铺满孔板以后转移至小方瓶内放大培养，随后用无血清培养基（JRH产品）逐渐替代GMEM-S培养基，使细胞逐渐适应完全无血清培养基，从贴壁生长转变为悬浮生长。将悬浮细胞改用摇瓶培养，培养体积逐渐增大至100毫升。收获的细胞培养上清以离心去除细胞，再以超滤进行浓缩，随后用镍离子金属鳌合层析的方法进行纯化（德国Qiagen公司产品），每一百毫升培养液中可得到E2蛋白30毫克。图6为纯化产物E2t和E2tΔ蛋白的SDS-PAGE分析。

实施例7：用E2t和E2tΔ蛋白免疫家兔：

分别将重组表达的1b型E2t和E2tΔ蛋白用PBS缓冲液调整浓度至0.25mg/ml，与等体积油/水乳剂型佐剂ISA720（法国Seppic公司产品）充分混匀，室温放置30分钟，然后于后背部两点皮下注射免疫家兔，每点注射0.2ml，共0.4ml，含E2t或E2tΔ蛋白50μg，二周一次，共免疫三次。用同样剂量牛血清白蛋白（美国Sigma公司产品）联合ISA720佐剂免疫家兔作为对照。每组10只家兔。

实施例8：家兔血清中的抗体检测以及病毒中和活性分析

定期检测家兔血清中的E2t抗体、E2tΔ抗体、HVR1抗体以及血清对HCV的中和活性。抗体检测中，酶标抗体用HRP标记的羊抗兔IgG（美国Sigma公司产品），其他操作以及使用的耗材、试剂均同实施例3中所述。

结果：E2t蛋白免疫的家兔在首次免疫后血清中同株E2t以及HVR1抗体的阳转率为100%，同株E2tΔ抗体阳转率为30%。第二次免疫后，同株E2tΔ抗体阳转率为50%。第三次免疫后，同株E2tΔ抗体阳转率为60%（图7）。抗体水平变化见图8，可见HVR1抗体水平的增长以及衰减均较快，而E2tΔ抗体水平衰减较缓慢。E2tΔ蛋白免疫的家兔在首次免疫后血清中同株E2t以及E2tΔ抗体的阳转率为90%，第二次免疫后，同株E2t以及E2tΔ抗体阳转率为100%。一直未检测到HVR1抗体，这和E2tΔ蛋白中不含HVR1相符。

用异株HCV包膜E2蛋白检测小鼠血清中的相应抗体，其趋势与小鼠血清中的针对同株E2tΔ的抗体水平基本一致。E2t蛋白免疫诱导的抗其他6株HCV包膜E2蛋白抗体阳性率显著低于E2tΔ蛋白免疫诱导的E2抗体水平（表11）。E2t蛋白免疫诱导的抗其他6株HCV包膜E2蛋白抗体水平也显著低于E2tΔ蛋白免疫诱导的E2抗体水平。

结果表明：重组蛋白免疫与基因免疫诱导的抗体应答的特征相似，即HVR1显著抑制E2蛋白中保守表位诱导的抗体应答，删除HVR1可显著增强E2蛋白中保守表位的免疫原性，提高E2蛋白诱导的交叉反应抗体水平。

用HCVpp模型评价家兔血清的中和活性，方法同实施例4中所述。结果显示：E2t和E2tΔ蛋白免疫的家兔血清对同株HCVpp的中和活性相似，E2tΔ蛋白免疫血清对异株HCVpp的中和作用显著强于E2t蛋白免疫血清（图9）。

用JFH1、J6-JFH1和H77-JFH1嵌合HCVcc为模型评价小鼠免疫血清的中和活性，方法同实施例4中所述。结果显示：E2tΔ蛋白免疫的家兔血清对三株HCVcc的中和作用都显著强于E2t蛋白免疫的家兔血清（图10）。

表11：1b型E2蛋白免疫家兔血清在不同时间点抗异株HCV包膜E2蛋白的抗体阳性率（%）

实施例9：用E2t和E2tΔ蛋白检测HCV感染者血清中的E2抗体

将E2t和E2tΔ蛋白用PBS缓冲液稀释至浓度20μg/ml，加入酶标微孔板（美国Corning公司产品），每孔0.1ml，置于4℃冰箱过夜，次日吸除E2蛋白，每孔用0.2ml PBS缓冲液洗一次，然后每孔加入含3%牛血清白蛋白及0.05%Tween20的PBS缓冲液（封闭液）0.1ml，室温放置2小时，每孔加入用封闭液1：100稀释的HCV感染者血清或HCV、HBV抗体以及核酸检测均为阴性的健康成人血清0.1ml，室温放置40分钟，然后吸除血清，用含0.05%Tween20的PBS缓冲液（洗液）洗孔5次，然后每孔加入用封闭液稀释的HRP标记的羊抗人IgG（美国Sigma公司产品）0.1ml，室温放置40分钟后，吸除抗体，用洗液洗孔5次，每孔加入含TMB的底物液0.1ml，室温避光放置10分钟，然后加入2M硫酸和30%过氧化氢溶液各0.05ml，混匀，用酶标仪检测450nm波长的光吸收值，参考波长630nm。

检测了30份HCV感染者血清以及10份HCV、HBV抗体以及核酸检测均为阴性的健康成人血清，结果如图11所示，E2tΔ蛋白检测的抗体水平明显高于E2t蛋白检测的抗体。

Claims (5)

1.经修饰的3a型丙型肝炎病毒包膜E2蛋白，其特征在于所述经修饰的丙型肝炎病毒包膜E2蛋白是指删除了丙型肝炎病毒包膜E2蛋白中的高变区1的肽段。

2.根据权利要求1所述的经修饰的3a型丙型肝炎病毒包膜E2蛋白在制备预防性丙型肝炎疫苗中的应用。

3.根据权利要求1所述的经修饰的3a型丙型肝炎病毒包膜E2蛋白在制备丙型肝炎病毒感染的免疫学诊断试剂中的应用。

4.一种如权利要求1所述的经修饰的3a型丙型肝炎病毒包膜E2蛋白的编码基因在制备预防性丙型肝炎疫苗中的应用。

5.一种如权利要求1所述的经修饰的3a型丙型肝炎病毒包膜E2蛋白的编码基因在制备丙型肝炎病毒感染的免疫学诊断试剂中的应用。