CN101319011A - 多型别hcv-e1表位复合免疫原及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个含有不同HCV型别E1表位抗原基因和通用T辅助细胞表位基因的原核表达质粒pBVIL1/E1s－PADRE，该质粒转化大肠杆菌后获得的工程菌，通过诱导培养可以高效表达重组多型别HCV/E1表位复合抗原，以及该表达的多型别HCV/E1表位复合重组蛋白质在制备HCV疫苗及制备诊断试剂中应用。本发明通过选用多型别表位抗原的策略，成功构建了包含有HCV 1a、1b、2、3、4、6型HCV/E1主要中和性表位的复合免疫原，可以用作HCV疫苗免疫原的组成部分，克服HCV的变异问题；同时该抗原也可用于HCV诊断试剂的抗原。

Description

多型别HCV-E1表位复合免疫原及其编码基因与应用

技术领域：

本发明涉及一个含有多种型别HCV/E1表位的复合免疫原，及其表达质粒pBVIL1/E1s-PADRE的制备方法及其在制备疫苗与诊断试剂研究中的应用。

背景技术：

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)引起的慢性传染性疾病。由于其早期病症不明显，常不为人们所重视，其实在我国HCV感染率是比较高的，约占人群3.2％，全国预计受感染者达4000万。全球约有1.7～2.0亿HCV感染者。在多数西方国家，目前HCV感染已占据慢性肝炎病人的一半以上，是引起肝炎后肝癌的最主要病原。由于目前还没有确实有效的治疗方法，也还没有研制出疫苗，感染者中绝大部分(70％左右)可发展成慢性感染，进而部分可发展成肝硬化和肝细胞癌，因此危害极大。目前亟需发展一种有效的预防和治疗方法。

由于HCV疫苗研究的重要性，自1989年HCV基因获得克隆以来，人们一直在致力于疫苗的研究，但进展缓慢，原因是多方面的，但HCV基因高度变异，可逃逸机体免疫监察和清除是一个主要的原因。HCV为单股正链RNA病毒，被有脂质膜，表面镶嵌有两种膜糖蛋白E1和E2。目前已知在E1和E2中均含有病毒中和性抗原表位。其中E2/N-端27个氨基酸残基高度变异，称为第一高变区(HVR1)，在HVR1中含有重要的中和性抗原表位，对此文献已有大量的研究，申请人也进行了深入研究，并已获得一项国家发明专利(《丙型肝炎病毒第一高变区抗原及其融合抗原》专利号：ZL01141879.6)。目前，对HCV/E1抗原的研究相对较少，但最近有一系列的研究，证明HCV/E1抗原在HCV疫苗研究中的也具有重要的位置。

由于HCV不易在体内外大量复制，不易获得天然免疫原，早先人们用HCV/E1-E2真核表达的重组蛋白质作免疫原，用黑猩猩进行疫苗研究(Choo QL，Kuo G，Ralston R，et al.Vaccination of chimpanzees against infection by the hepatitis C virus.Proc Natl AcadSci USA.1994Feb 15；91(4)：1294-8.)，免疫动物表现出对同株病毒攻击具有一定的免疫力，说明在HCV E1和E2膜蛋白中确实存在着中和性抗原表位。但研究也显示单用某一株病毒的膜蛋白尚不能解决病毒变异的问题。用HCV/E1和/或E2的假病毒研究显示对敏感细胞的感染模式是不同的，说明E1和E2膜糖蛋白在HCV感染起始阶段有各自独立的功能(Lagging LM，Meyer K，Owens RJ，et al.Functional role of hepatitisC virus chimeric glycoproteins in the infectivity of pseudotyped virus.J Virol，1998，72(5)：3539-3546)。同时用包含有E1和E2两种膜蛋白的假病毒研究显示，对敏感细胞的感染能力可为单独存在E1或E2的假病毒感染能力高10～20倍，更说明二者在病毒感染中均起着重要的作用，是正向的协同作用(Matsuura Y，Tani H，Suzuki K，et al.Characterization of pseudotype VSV possessing HCV envelope proteins.Virology，2001，286(2)：263-275)。

另有研究用HCV感染病人外周血B细胞进行人源单克隆抗体研究，也可以筛选获得具有免疫中和活性的抗体H111，并对结合表位研究显示该抗体可以和HCV E1 N-端序列(YEVRNVSGVYH)结合。这更清楚表明了在E1抗原中确实也存在着病毒中和性抗原表位，且表位存在于E1膜蛋白的N-端(Keck ZY，Sung VM，Perkins S，et al.Human monoclonal antibody to hepatitis C virus E 1glycoprotein that blocks virusattachment and viral infectivity.J Virol.2004；78(13)：7257-63)。

更有甚者，鉴于HCV/E1中具有中和性表位，且较之E2/HVR1，E1的变异相对较小，以及在E1中也一定具有T细胞表位的事实(当然目前已有有关HCV T细胞表位研究显示，T细胞表位主要存在于核心蛋白和非结构蛋白之中)，已有人单独用HCV/E1以作为免疫原用作HCV治疗性疫苗的研究，并已进行了I、II期临床研究。如比利时学者，应用E1重组蛋白质作为免疫原，在健康人及HCV慢性感染的志愿者中进行了临床研究(Nevens F，Roskams T，Van Vlierberghe H，et al.A pilot study oftherapeutic vaccination with envelope protein E1 in 35patients with chronic hepatitis C.Hepatology.2003 Nov；38(5)：1289-96.Leroux-Roels G，Depla E，Hulstaert F，et al.Acandidate vaccine based on the hepatitis C E1 protein：tolerability and immunogenicity inhealthy volunteers.Vaccine.2004；22(23-24)：3080-6.Leroux-Roels G，Batens AH，Desombere I，et al.Immunogenicity and tolerability of intradermal administration of anHCV E1-based vaccine candidate in healthy volunteers and patients with resolved orongoing chronic HCV infection.Hum Vaccin.2005；1(2)：61-5)。结果显示HCV/E1重组蛋白为免疫原对人类是安全的，可以激发抗E1的抗体和E1特异性细胞免疫反应。在慢性HCV感染病人中，也可观察到部分病人症状有改善，表现为转氨酶降低和组织学检查有改善，但血液中HCV/RNA载量检查没有改变。此外，波兰学者用含有E1基因的质粒和重组腺病毒为免疫原，也对HCV慢性感染病人进行了临床观察，同样获得了可使病情得到表象改善的结果(Baryluk A，Polz-Dacewicz M，Sendecka M，et al.Modern achievements in research on hepatitis C vaccine.Postepy Hig Med Dosw(Online).2005Mar 22；59：98-104)，但目前还未能得出具有统计学意义的结果，因此还需进一步扩大研究以确定疫苗是否真正具有治疗作用。

总之，单用E1为免疫原，无论是重组蛋白质还是核酸疫苗，还不能完全担当起治疗性疫苗的重任，但从中也可说明E1膜蛋白作为疫苗免疫原的一部分，应可起着重要的作用。但HCV是高度变异的病毒，膜蛋白又是病毒中变异最大的部分，虽然和E2第一高变区(HVR1)相比，E1的变异相对较小，但根据发明人对HCV数据库中E1序列比较分析，型别之间仍存在着很大的差异。这也是目前已有以E1为主的疫苗研究常只对部分病人有效的一个原因。

发明内容：

本发明目的在于提供多型别HCV/E1表位复合抗原及其编码基因，其制备方法及其应用。

本发明提供的多型别HCV/E1表位复合抗原，含有不同型别HCV/E1表位和通用T细胞表位。

具体的，可以具有下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：9；

2)将序列表中的SEQ ID №：9的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加的序列。

本发明提供编码上述多型别HCV/E1表位复合抗原的DNA分子。具体的，含有序列表中SEQ ID No：1-6的编码基因和通用T辅助细胞表位SEQ ID No：7的编码基因。更具体的，是下述序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：8的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

本发明还提供上述DNA的表达载体、转基因细胞系及宿主菌。

一种具体的表达载体，为原核表达质粒pBVIL1/E1s-PADRE。

本发明还提供多型别HCV/E1表位复合抗原的制备方法，包括：

1)构建原核表达质粒pBVIL1/E1s-PADRE

2)在大肠杆菌中表达上述质粒得到目的蛋白

3)对目的蛋白进行分离纯化

上述方法中，其中步骤1)中原核表达质粒pBVIL1/E1s-PADRE的制备方法包括以下步骤：

1)根据序列表中SEQ.ID.NO 1-6所示序列，分段设计引物PCR合成片段，插入表达载体pBVIL1，获得含有不同HCV E1片段的载体；

2)利用表达载体pBVIL1/x可方便插入基因相互连接的特点，构建含有多个不同HCV/E1表位的表达质粒pBVIL1/E1s；

3)在表达质粒pBVIL1/E1s中再插入含有2个PADRE基因片段，构建成表达质粒pBVIL1/E1s-PADRE。

本发明还提供多型别HCV/E1表位复合抗原在制备预防和/或治疗HCV疫苗的药物中的应用。

本发明还提供多型别HCV/E1表位复合抗原在制备HCV诊断试剂的抗原中的应用。

本发明通过选用多型别表位抗原的策略，成功构建了包含有HCV 1a、1b、2、3、4、6型HCV/E1主要中和性表位的复合免疫原，可以用作HCV疫苗免疫原的组成部分，克服HCV的变异问题；同时该抗原也可用于HCV诊断试剂的抗原。

附图说明：

下面结合附图对本发明作进一步详细地描述：

图1HCV E1表位片段的合成与克隆到pBVIL1载体的流程图HCV E1表位片段的PCR分步合成(图中右上部分)和原核表达载体pBVIL1经双酶切后相连接构建成不同片段(T1ab，T2-3，T4-6)表达质粒的示意图。

图2-1至图2-3为HCV E1和PADRE基因片段合成后电泳鉴定图，其中图中2-1为HCV E1片段：T1ab，T2-3和T4-6等PCR合成后直接电泳图；2-2为从构建好的质粒：pBVIL1/E1-1ab，pBVIL1/E1-T2-3和pBVIL1/E1-T4-6中用PCR扩增出片段鉴定图；2-3为合成PADRE的电泳鉴定图。

图3-1至图3-3为表达质粒pBVIL1/E1s在大肠杆菌中表达的电泳鉴定，其中图3-1为质粒pBVIL1/E1-T1ab；3-2为质粒pBVIL1/E1-T2-3；3-3为质粒pBVIL1/E1-T4-6分别转化大肠杆菌并诱导表达后的SDS-PAGE鉴定，图中箭头所指为表达的目的蛋白条带。

图4-1至图4-3为表达质粒pBVIL1/E1s的测序鉴定，其中图4-1为质粒pBVIL1/E1-T1ab；图4-2为质粒pBVIL1/E1-T2-3；图4-3为质粒pBVIL1/E1-T4-6的测序结果。

图5HCV E1表位片段相互连接流程图图中右上质粒作为基因供体，通过通用引物可从不同质粒扩增出相应片段；左上质粒用作克隆载体，第一轮用质粒pBVIL1/E1-T2-3，和片段T1ab相连获得pBVIL1/E1-T2-3-T1ab质粒。左侧向上箭头表示构建的新质粒仍可用作克隆载体，再供另一新基因片段的插入。

图6多型别HCV E1复合表位质粒pBVIL1/E1s-PADRE构建流程图

图7原核表达质粒pBVIL1/E1s-PADRE示意图

图8-1至图8-3为重组多型别HCV E1表位复合抗原的鉴定，其中图8-1为质粒pBVIL1/E1-PADRE的测序鉴定；图8-2为pBVIL1/E1-PADRE在E.coli中表达的SDS-PAGE鉴定结果，图8-3为包涵体和纯化后的蛋白质的SDS-PAGE鉴定结果，其中图8-2中2，3，4，6，7泳道具有重组蛋白条带(箭头所指处)；图8-3为纯化样品电泳鉴定，泳道1为包涵体，泳道2为纯化蛋白质。

具体实施方式：

本发明在对E1序列进行系统分析的基础上，精选了E1中保护活性明确的抗原表位，下载了不同型别相关表位序列，进行比较分析后，筛选出主要型别的代表性序列，加以串连成多型别表位复合抗原基因。另外根据通用T细胞表位PADRE序列，合成基因，和多型别E1表位基因一起构建成重组表达质粒，进而表达能覆盖不同型别的复合免疫原，即多型别HCV/E1表位复合抗原，宜作为HCV疫苗免疫原的一个重要组成部分。

本发明的多型别HCV/E1表位复合抗原是通过以下方法制备获得的：

1、E1中和性表位的选择：查阅了大量有关E1中和表位的文献资料和数据库资料，显示在E1中存在不少B细胞表位，但多由动物实验获得，是否具有中和活性也未作鉴定。但其中用HCV感染病人外周血淋巴细胞筛选获得的人源单克隆抗体H111，研究较深入，既是人源，又具有中和活性，抗原表位存在于E1的N-末端(192～202)，应是病毒外膜蛋白和感染细胞受体接触的主要部位。根据这一分析，发明人选择了此表位。并为了较好保持表位的构象，将其周边的部分序列一并选入。具体所选的序列位于E1糖蛋白N-端的20个氨基酸残基(即HCV编码的多蛋白前体的第192～211位的氨基酸序列)。

2、HCV型别选择：全世界最主要的HCV病毒流行基因型为1b型(约占感染者的44％)，其次为1a型(29％)。我国以1b型的感染者占绝大多数(50％以上)，1a型病人虽不如西方国家，但也占相当份额(5％)。但我国2a型的感染者也较多(16％)，要引起重视。HCV/6a型病毒在国外较少，但在我国为第三大流行型(10％)，尤其在我国香港澳门一带，也应重点考虑。最后其他4、5型较少见，一并考虑选择其中的代表性序列。

3、各型别代表性序列的选择：从HCV数据库(美国洛杉矶国立图书馆HCV免疫学数据库(http://lanl.gov/content/immuno/immuno-main.html)，和欧共体的相关数据库(http://euhcvdb.ibcp.fr/euhcvdb)中，下载目前收集的HCV E1序列，取其相关的N-端序列，对这些序列进行比较分析，从中分别选出1a、1b、2、3、4、5和6型的序列，再分别建库进行比较分析，获得各型别的代表性序列，其中4和5型较少见，一并分析，只选其中的1条序列作为二型的代表性序列。具体所选择的6条代表性序列的型别与序列如序列表中序列1至序列6所示：

序列1HCV-T1a   YQVRNSSGLYHVTNDCPNSS(SEQ ID №：1)

序列2HCV-T1b.  YEVRNVSGVYHVTNDCSNSS(SEQ ID №：2)

序列3HCV-T2    VQVKNTSSSYMVTNDCSNDS(SEQ ID №：3)

序列4HCV-T3    LEWRNTSGLYVLTNDCSNSS(SEQ ID №：4)

序列5HCV-T4-5  VHYRNASGVYHVTNDCPNTS(SEQ ID №：5)

序列6HCV-T6    LTYGNSSGLYHLTNDCPNSS(SEQ ID №：6)

4.通用TH表位的选择与基因合成：抗体的产生需要有T细胞的辅助，即T辅助细胞(Th)的同时激活，可使B细胞受体和免疫辅助因子和其他细胞因子高表达。因此如果在一个抗原中同时存Th表位，可以加强抗原的免疫原活性。所以选用了通用T细胞表位(universal T epitope，genetically permissive epitope)，或称为泛DR辅助T细胞表位(pan-DR helper T cell epitopes，PADRE)。该表位可高亲和力与多种动物的T细胞受体结合，也可和人类常见HLA-DR类型的分子结合，较少受MHC限制性的影响。其序列为AKFVAAWTLKAAA，为了增加表位的活性，将两个相同的PADRE串连在一起，如序列表序列7所示。

序列7：AKFVAAWTLKAAAAKFVAAWTLKAAA(SEQ ID №：7)

5.代表性序列的连接：所选的6条E1表位的代表性序列用柔性接头(如SGGGS和/或SGGGSSGGGS)进行首尾相连，可获得含有多型别HCV-E1表位复合抗原的氨基酸序列。但为了合成方便，采用分段合成法，即先合成E1/T1ab、T2-3和T4-6三个片段，然后再加以连接成全长的基因。三个片段序列的命名和具体序列如序列10-12所示：

序列10T1ab  YEVRNVSGVYHVTNDCSNSSGGGSYQVRNSSGLYHVTNDCPNSS

序列11T2-3  LEWRNTSGLYVLTNDCSNSSGGGSVQVKNTSSSYMVTNDCSNDS

序列12T4-6  VHYRNASGVYHVTNDCPNTSGGGSLTYGNSSGLYHLTNDCPNSS

6.由氨基酸序列反推成基因序列：根据上述所选的B细胞表位的连接片段和PADRE的氨基酸序列，并为了能在大肠杆菌中获得高效表达，以E.coli的优势密码子反推成DNA序列。并分别设计各片段合成所需的引物，然后用中心模板法分别合成3个HCV/E1-T1ab、T2-3和T4-6片段以及双PADRE的基因序列。

7.基因片段的克隆与连接：HCV/E1-T1ab、T2-3和T4-6片段经Xho I和Xba I双酶切后可以方便地插入pBVIL1表达载体(表达载体pBVIL1及其构建方法和用途：专利号：ZL 00 100695.9)，然后利用该载体的特点，将3个基因片段连接起来。最后再插入双PADRE的基因序列，构建成“多型别HCV E1表位复合抗原表达质粒”，命名为：pBVIL1/E1s-PADRE。

8.转化大肠杆菌获得工程菌及表达产物的纯化：表达载体pBVIL1是原核高效表达载体，一般基因均可以包涵体形式获得高效的表达。再通过包涵体纯化、变性溶解和离子交换柱层析等处理，可以获得能用作免疫原的重组蛋白质纯品。

以下实施例只是用于解释本发明，而不以任何方式限制本发明。

在这里“代表性表位”含有两层意思，一是“表位”，只有那些能激发机体产生抗体或细胞免疫反应的部位才是表位，取表位可以尽可能排除抗原中无关的甚至有害的成分；二是“代表性”序列，由于HCV高变，表位区段的序列变异，即使同一型别或同一亚型也可能存着很多不同的序列，因此必须要选出最具代表性的序列，以便产生的抗体可有较大的覆盖面。

实施例1HCV E1表位代表性序列的筛选

1.HCV E1中和性表位的筛选在HCV Immunology Database中，记载有有关HCV E1抗体表位的总结，其中人源抗体仅有H111和U1/30～33系列抗体。U1/30～33系列抗体为早年(Siemoneit K，Cardoso Mda S，et al.Human monoclonal antibodies forthe immunological characterization of a highly conserved protein domain of the hepatitis Cvirus glycoprotein E1.Clin Exp Immunol.1995；101(2)：278-83)研究的人源单克隆抗体，是用合成肽(314～330)筛检的结果，但该抗体和重组E1抗原结合作用不明确，也没有研究其是否具有中和活性。其他抗体多数是在动物实验时获得。故本发明选择了中和性抗体H111的作用表位。此外，在H111表位附近还存在着A4(m)和159抗体作用表位，所以选择从192～211片段，也包括了这两个表位，这样既可保证H111表位的完整和周边环境，也可满足动物实验的需要。

2.不同型别表位序列的比较与代表性序列筛选E1N-端的序列是有较大变异的，为了能使所选表位具有较好的代表性，下载了网络数据库中收集的E1序列。在欧共体HCV数据库(http://euhcvdb.ibcp.fr/euhcvdb)中共收集有1482条E1序列，在美国洛杉矶的数据库(http://lanl.gov/content/immuno/immuno-main.html)中收集有459条E1序列，二数据库中序列绝大部分是重复的，所以只以前者为依据进行了序列比较研究。在1482条序列中，有部分序列未注明所属型别，但在初步序列比较分析后，多般序列可以进行归类，对个别未能归类序列和有残缺的序列予以剔除，这样共有1429条序列进行比较分析。

在1429条序列中，1a型序列最多，占一半以上，共783条；尽管在世界范围内1b型HCV感染率是最高的，但在该数据库中收集的序列不如1a型多，居第2位，共有339条；其他1型的亚型1c，1d等均较少，总共只29条；2型HCV总共收集有72条，3型有98条，4型和5型均较少，两型总共47条，放在一起分析，6型有61条。

为了简化比较，只截取所选表位区段(192～211)，经初步比较显示，该区段序列是具有型特异性的，即同型序列一般都具较高的相似性，比较后可排列在一起。为了获得各型别的代表性序列，对各型别序列分别建库后再比较，选取各自的代表性序列，如序列表中序列1至序列6所示。

实施例2重组多型别HCV E1表达质粒的构建

前面已选出HCV E1的代表性序列，也确定了通用TH表位序列PADRE，但他们都是氨基酸序列，如要以重组蛋白质形式表达，还需先转化为基因序列，并克隆到表达载体，为此进行了以下的研究：

2.1合成基因引物的设计：根据序列10、11，12按大肠杆菌偏性密码子反推出基因序列，分别设计基因合成的三组引物，并在其5’及3’端分别加上连接臂，以便可用通用引物扩增后加入酶切位点，可和载体连接。三组设计的引物的具体序列如序列13-30所示：

2.1.1HCV/E1-T1ab基因合成的引物：

T1abF(3)  GGAGGTGGATCTTATGAAGTGCGCAACGTGAG        序列13

T1abF(2)  GCGCAACGTGAGCGGTGTGTACCATGTCACTAATGACT  序列14

T1abF(1)  TCACTAATGACTGCAGTAACTCTAGCGGTGGAGGCTCT  序列15

T1abR(1)  AGACCCGATGAATTACGAACCTGATAAGAGCCTCCACC  序列16

T1abR(2)  TCGGGCAGTCGTTAGTTACGTGATACAGACCCGATGAA  序列17

T1abR(3)  ACCTCCACCACTAGAACTATTCGGGCAGTCGT        序列18

注：引物中具下划线部分为连接臂序列(下同)。

2.1.2HCV/E1-T2-3基因合成的引物：

T2-3F(3)  GGAGGTGGATCTCTGGAATGGCGCAATACTAG        序列19

T2-3F(2)  GCGCAATACTAGCGGCTTATATGTGCTGACGAACGACT  序列20

T2-3F(1)  TGACGAACGACTGCAGTAACTCTAGCGGTGGAGGTTCT  序列21

T2-3R(1)  GAAGATGAGGTATTCTTCACCTGCACAGAACCTCCACC  序列22

T2-3R(2)  TGGAGCAATCGTTGGTGACCATGTAAGAAGATGAGGTA  序列23

T2-3R(3)  ACCTCCACCACTGCTGTCATTGGAGCAATCGT        序列24

2.1.3HCV/E1-T4-6基因合成的引物：

T4-6F(3)  GGAGGTGGATCTCTGACCTATGGCAATAGCAG        序列25

T4-6F(2)  TGGCAATAGCAGTGGTCTCTACCATCTGACGAACGATT  序列26

T4-6F(1)  TGACGAACGATTGTCCAAATTCTAGCGGTGGAGGTTCT  序列27

T4-6R(1)  AGACCCGATGAATTGCCATAGGTCAAAGAACCTCCACC  序列28

T4-6R(2)  TTGGGCAGTCGTTAGTCAAGTGGTACAGACCCGATGAA  序列29

T4-6R(3)  ACCTCCACCACTAGAACTATTTGGGCAGTCGT        序列30

2.1.4PADRE基因合成的引物：在基因合成引物设计时，在两端直接引入酶切位点Spe I和BamH I，以便和质粒相连。具体设计的引物如序列31-34所示：

F2  GCACTAGTGCGAAATTTGTTGCGGCATGG         序列31

F1  GTTGCGGCATGGACTCTTAAGGCAGCTGCGGCTAAA  序列32

R1  TTTCAACGTCCAAGCTGCAACGAATTTAGCCGCAGC  序列33

R2  GCGGATCCTTACGCTGCTGCTTTCAACGTCCA      序列34

注：序列中斜体字部分为酶切位点

2.1.5通用引物设计为了便于引入酶切位点和质粒连接，设计了一组通用引物(GF，GR)，该引物的3’端和合成E1基因片段两端的连接臂匹配，5’端具有酶切位点。具体序列如序列35和序列36所示(斜体为酶切位点)：

GF GCACTAGTGGAGGTGGATCT  序列35

GR GCGTCGACACCTCCACCACT  序列36

2.2基因片段用中心模板法PCR合成：以上四组引物设计后，均委托北京三博远志生物工程有限公司合成并纯化。用去离子水配制成50μmol/L的贮存液，用时5倍稀释(使用液10μmol/L)，-20度保存备用。基因片段均用中心模板法合成，即先用最中间的一对引物(F1，R1)，以引物3’端相互补区互为模板，进行PCR延伸获得中间段，再以中间段为模板，用F2，R2为引物。具体方法如下：

2.2.1材料

试剂：Taq DNA聚合酶试剂盒为上海生工生物公司产品；PCR产物纯化试剂盒为博大泰克公司产品。其它试剂均为国产分析纯试剂。

主要仪器设备：PE公司生产的GeneAmp PCR System2400PCR扩增仪；THZ-95型台式恒温振荡培养箱；高速台式离心机(北京六一仪器厂)；电热三用水浴箱(北京长风仪器仪表厂)；洁净工作台(北京半导体设备厂)；EPC3000恒流恒压电泳仪(北京六一仪器厂)。

2.2.2方法

采用中心模板法合成基因片段：分4步PCR合成HCV E1表位的3个片段，三片段合方法一致，图1右上部分为合成的流程图，具体合成方法如下：

第一步扩增体系为：10×PCR Buffer 5μl，MgCl₂(2.5mM)5μl，dNTP Mixture(2.5mM)4μl，合成引物(10μM)R1、F1各1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)1μl，加去离子水至50μl。PCR反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性30s，58℃退火30s、72℃延伸30s，扩增5个循环；72℃继续延伸1min。

随后两步扩增均以上一步PCR产物稀释50倍作为模板进行。扩增体系同上，只是引物第二步PCR选用R2和F2，第三步选用R3和F3。PCR反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性30s，55℃退火30s、72℃延伸30s，扩增30个循环；72℃继续延伸5min。三次PCR扩增后所得目的基因即为HCV-E1ab。为引物酶切位点，在第四步PCR中以通用引物(序列33和序列34)进行扩增，其他同前，获得两端含有酶切点的PCV片段。

以同样方法分别合成另两个片断HCV-E1-T2-3和HCV-E1-T4-6。

PADRE片段的PCR合成：方法同前，只是所用的引物不同(序列31-34)，而且只需两步PCR即可合成，由于两端已含有酶切位点，也不需要用通用引物扩增即可完成。

2.2.3PCR产物的纯化与回收

按照北京博大泰克生物基因技术有限责任公司的“PCR片断快速胶回收试剂盒”说明书将以上的4种PCR产物分别进行纯化，具体操作步骤如下：

PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下目的条带所在的胶块，按100μg/650μl溶胶液比例加入溶胶液，55℃溶胶；溶解的胶液全量移入吸附柱，12000rpm，离心1min；弃去回收管中废液，加入500μl漂洗液，12000rpm，离心1min；重复步骤c一次后，弃去回收管中废液，12000rpm，离心2min彻底弃除废液；将吸附柱放入一干净的离心管中，在吸附膜的中央加入30μl洗脱液，室温静置5min；12000rpm，离心1min，收集洗脱液，-20℃储存备用。

2.3HCV E1片段表达质粒的构建

选择表达载体pBVIL1(表达载体pBVIL1及其构建方法和用途：专利号：ZL 00100695.9)作为克隆载体，把上述合成的三段不同HCV E1片段分别插入该载体，构建成pBVIL1/E1s表达质粒。具体技术方法如下：

2.3.1材料 大肠杆菌DH5α，分别用于质粒的克隆、扩增、测序和表达。原核融合表达载体pBVIL1和pBV220。DNA相对分子质量标准DL2000、DL15000购自大连宝生物公司；T4DNA连接酶为Promega公司产品。质粒提取试剂盒购自博大泰克生物公司。蛋白胨及酵母提取物为Oxoid公司产品；DNA电泳用琼脂糖购自Promega公司；氨苄青霉素针剂为华北制药有限公司产品；甲叉双丙烯酰胺均为Boehringer Mannheim公司产品，TEMED购自Promega公司。

2.3.2主要仪器：BIO-RAD蛋白电泳仪，型号为Power/PAC 300；Kodak自动凝胶成像系统，型号为Cold spring Transilluminator 2020D；Soniprep 150超声仪；SIGMA公司生产的3K18高速冷冻离心机。

2.3.3pBVIL1质粒提取

转化有pBVIL1工程菌液培养过夜，按照北京博大泰克生物基因技术有限责任公司的质粒快速提取试剂盒产品说明书提取质粒，具体操作步骤如下：

a收集1.5ml过夜培养的菌液沉淀，加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮；

b加入150μl溶液2，轻轻颠倒混匀，使菌体充分裂解；

c加入150μl溶液3，轻轻颠倒混匀，室温放置5分钟；4℃/12,000rpm离心12min；

d将上清与420μl结合缓冲液混匀，共同移入吸附柱，室温/12,000rpm离心1min；

e倒掉废液，加入750μl漂洗液，12,000rpm离心1min，重复一次；

f再次12,000rpm离心2min，尽量去除漂洗液；

g将吸附柱放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央加入50μl无菌水，室温静置2-5min；12,000rpm离心2min，收集洗脱液，-20℃贮存备用。

2.3.4酶切

将上述纯化回收的PCR产物及提取的pBVIL1质粒分别用Xho I和Xba I限制性内切酶双酶切，酶切体系：

PCR纯化产物(或纯化pBVIL 1)     2μg

10×Buffer                     4μl

Sal I                          1μl

Xba I                          1μl

100×BSA                       0.4μl

加无菌水至40μl，37℃酶切4h。

2.3.5连接

酶切后的目的片段用胶回收试剂盒纯化，具体操作步骤同前。将酶切后的片段和酶切后的质粒进行连接，连接反应体系为10ul：

PCR产物双酶切回收片段         2μl

pBVIL1双酶切回收片段        1μl

T4DNA连接酶                 1μl

2×连接酶缓冲液             5μl

去离子水至10ul

16℃连接过夜。

2.3.6转化

第二天在超净工作台中，将10μl 16℃连接过夜产物，加入到200μl感受态DH5α细菌悬液中，轻轻旋转混匀，冰浴30min，立即转移到42℃水浴热休克2min，每管加入0.5ml LB液体培养基(不含Amp⁺)，37℃摇床培养1h后，取200μl均匀地涂于选择LB琼脂培养基平皿上(含Amp⁺)，超净工作台中吹干后，置37℃恒温箱倒置培养过夜，获得HCV E1片段工程菌。

2.3.7表达质粒pBVIL1/E1s的鉴定

从三组E1片段构建的三种质粒，分别为pBVIL1/E1-T1ab，pBVIL1/E1-T2-3和pBVIL1/E1-T4-6，并分别转化大肠杆菌后获得三株工程菌，进行了以下鉴定：

2.3.7.1PCR鉴定：

分别以上述构建好的质粒pBVIL1/E1-1a1b，pBVIL1/E1-2a3a和pBVIL1/E1-4a6a为模板，用通用连接引物GF和GR引物，进行PCR扩增，PCR扩增，扩增方法同前。结果如图3-2所示，可分别扩增出相应的基因片段，扩增出的片段和合成片段(图3-1)一致，说明质粒构建是成功的。

2.3.7.2诱导表达鉴定：

培养基平皿上随机挑取单克隆菌落，加到3ml LB(Amp⁺)试管中，37℃培养过夜。每个克隆各取100μl培养过夜的培养菌，加到3ml LB(Amp⁺)试管中，37℃培养至对数期，转移试管至42℃水浴摇床，诱导表达，诱导4h后，取1ml菌液，离心取沉淀，加100μl蒸馏水和50μl样品处理液，煮沸5min，进行SDS-PAGE，胶经考马斯亮兰染色，脱色液脱色后观察电泳结果。

电泳结果如图2-1、2-2、2-3所示，三种工程菌都可以表达相应分子量的重组蛋白质，也说明质粒和工程菌构建成功。

2.3.7.3测序鉴定：

用PCR法可以扩增出相应片段，转化菌通过诱导可表达相应的蛋白条带，说明质粒已构建成功，但这还不够，还要进行序列测定，证明序列正确无误才行。所以分别从三株工程菌中提取质粒，进行序列测定。测定结果证明三个质粒中插入序列和预期的序列是完全一致的(测序谱图请参照图4-1、4-2、4-3)。

2.4HCV多型别E1复合表位质粒的构建

前面已获得正确的三种质粒：pBVIL1/E1-T1ab，pBVIL1/E1-T2-3与pBVIL1/E1-T4-6及其工程菌，也已获得了双PADRE的基因片段，但为了能获得多型别和更有效的免疫原，还必须要把他们相互连接起来，构建成一个免疫原。为此，利用质粒pBVIL1可以实现多片段连接的特点，把三个片段连接起来，构建多型别HCV/E1s表达质粒，并最后把PADRE片段也插入该质粒，获得多型别HCV/E1-PADRE复合表位表达质粒和表达工程菌。

片段的连接方法流程如图5所示，通过第一轮连接就可以获得质粒pBVIL1/E1/T2-3-T1ab，由于该质粒中片段间的连接是通过互补酶切点(Xba I和Spe I)间的连接，连接后不能再以这二酶切开，所以该质粒可再作为载体，经再一轮的连接，插入E1-T4-6片段而获得包含有三个片段和六个不同型别的质粒pBVIL1/E1/T2-3-T1ab-T4-6(简称pBVIL1/E1s)。

在此基础上，利用质粒pBVIL1/E1s中E1基因3’端的Xba I酶切点，及质粒中IL-13’端BamH I酶切点，可如图6所示，插入含有两个PADRE的合成基因片段，构建成多型别HCV E1表位和PADRE表位复合抗原表达质粒pBVIL1/E1s-PADRE。完整pBVIL1/E1s-PADRE质粒的结构如图7所示。

对构建的质粒pBVIL1/E1s-PADRE进行测序鉴定，测序结果(可参考图8-1)证明序列和设计序列一致，见序列表SEQ ID No：8。

2.5重组多型别HCV/E1表位复合抗原的表达与纯化

将上述构建的原核表达质粒pBVIL1/E1s-PADRE转化E.coli可获得重组工程菌，如上2.3.7.2方法进行扩增培养和诱导表达、电泳鉴定，结果如图8-2所示，目的基因以包涵体形式高效的表达多型别HCV E1表位复合抗原。其氨基酸序列参见SEQ IDNo：9。

诱导表达菌经超声波破菌，包涵体洗涤，再以8M脲变性溶解后，经2次离子交换层析(Q-Sepharose Fast Flow和S-Sepharose Fast Flow)，再进行G50凝胶过滤脱盐，经SDS-PAGE鉴定，证明可获得电泳纯的重组多型别HCV E1表位复合抗原，电泳鉴定结果如图8-3所示。

实施例3重组多型别HCV/E1表位复合抗原免疫原性分析

经上述实施例1和2，已获得了重组多型别HCV E1复合表位抗原，但该抗原是否具有免疫原性，即是否可以有效刺激机体产生抗体，还需进一步研究，为此设计了免疫方案，免疫小鼠三次。并在每次免疫后半月取血测定免疫鼠的抗体水平。为了在测定抗体滴度时避免受到抗原中融合的部分IL-1分子的干扰，还构建了pBV/E1s-PADRE表达质粒，该质粒可表达不含IL-1的多型别HCV/E1表位复合抗原(制备步骤参见上述实施例，只是在质粒的构建过程没有引入IL-1)，作为抗体测定的抗原。具体操作按以下进行：

3.1材料

实验动物与抗原：Balb/c小鼠，雌性，6周龄，由军事医学科学院实验动物中心提供。佐剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购自中山公司；质粒大量提取试剂盒购自博大泰克生物公司。

3.2方法

3.2.1动物的分组与免疫

将5周龄雌性Balb/c小鼠，随机分为3组，用重组蛋白和不同的佐剂一起免疫，每组10只，共免疫3次，分别于第0、4、8周进行。动物分组及各组免疫方案如下。

第1组为空白对照组；第2组为蛋白抗原(50μg/只，下同)加弗氏不完全佐剂；第3组为蛋白抗原加弗氏完全佐剂。

实验动物分组一览表

组别	佐剂名称与量	第一次免疫	第二次免疫	第三次免疫
					1	空白对照组	缓冲液+不全佐剂	同左	同左
2	弗氏不全佐剂	Ag+不全佐剂	同左	同左
					3	弗氏完全佐剂	Ag+完全佐剂	Ag+不全佐剂	Ag+不全佐剂

每组小鼠于每次免疫后3周经尾静脉取血，分离血清进行间接ELISA检测抗体滴度，检测抗原的体液免疫反应。

3.3血清抗体的ELISA检测

小鼠尾静脉取血，室温放置3h，3000r/min离心10min，吸出血清，采用ELISA法检测血清中的抗体滴度。

将纯化的蛋白用pH9.6的包被液稀释至终浓度为4μg/ml，包被ELISA板，4℃过夜，甩弃孔中液体，PBST洗涤1次，2％酪蛋白室温封闭4h，弃去封闭液，拍干ELISA板。将免疫鼠血清用PBS倍比稀释后，加入各孔，100μl/孔，37℃30min，PBST洗涤，加入HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应20min，PBST洗涤，TMB显色10min，2M硫酸终止反应。同时设立正常鼠血清的阴性对照和PBS空白对照，于SPECTRAIII酶联仪检测450nm的A值。结果判定，以待测样品的A值与阴性对照的A值之比大于或等于2.1(P/N≥2.1)为阳性，显示阳性结果的最大抗体稀释度为免疫小鼠的血清抗体效价。

血清抗体的ELISA检测结果(表中数据为抗体稀释度)

组别	佐剂名称	第一次免疫	第二次免疫	第三次免疫
					1	空白对照组	1∶200	1∶200	1∶200
2	弗氏不全佐剂	1∶800	1∶1600	1∶3200
					3	弗氏完全佐剂	1∶6400	1∶6400	1∶12800

3.4结果讨论

从上表结果可以看出，用重组多型别HCV/E1表位复合免疫原免疫动物后，经一次免疫后，均可测到特异性的抗体反应，并随着免疫次数的增加，抗体水平也随之增加。说明该重组免疫原确实具有良好的免疫原性。另外从本例辅于不同佐剂免疫的结果来看，如想获得较高的抗体滴度，佐剂的应用也非常必要。动物实验常用的弗氏完全佐剂效果相当好。

总结：HCV疫苗研究是当前生物学研究中的热点与难点，病毒变异逃逸机体免疫系统是疫苗研究的瓶颈，本发明旨在克服这一难点，选用多型别表位抗原的策略，成功构建了包含有HCV 1a、1b、2、3、4、6型HCV/E1主要中和性表位的复合免疫原。可以用作HCV疫苗免疫原的组成部分，克服HCV的变异问题。同时该抗原也可用于HCV诊断试剂的抗原。

序列表

<160>9

<210>1

<211>20

<212>PRT

<213>HCV E1 1a型(T1a)

<220>

<223>

<400>1

Tyr Gln Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys

1               5                   10                  15

Pro Asn Ser Ser

            20

<210>2

<211>20

<212>PRT

<213>HCV E1 1b型(T1b)

<220>

<223>

<400>2

Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp Cys

1               5                   10                  15

Ser Asn Ser Ser

            20

<210>3

<211>20

<212>PRT

<213>HCV E1 2型(T2)

<220>

<223>

<400>3

Val Gln Val Lys Asn Thr Ser Ser Ser Tyr Met Val Thr Asn Asp Cys

1               5                   10                  15

Ser Asn Asp Ser

            20

<210>4

<211>20

<212>PRT

<213>HCV E1 3型(T3)

<220>

<223>

<400>4

Leu Glu Trp Arg Asn Thr Ser Gly Leu Tyr Val Leu Thr Asn Asp Cys

1               5                   10                  15

Ser Asn Ser Ser

            20

<210>5

<211>20

<212>PRT

<213>HCV E1 4型(T4)

<220>

<223>

<400>5

Val His Tyr Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp Cys

1               5                   10                  15

Pro Asn Thr Ser

            20

<210>6

<211>20

<212>PRT

<213>HCV E1 6型(T6)

<220>

<223>

<400>6

Leu Thr Tyr Gly Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Leu Thr Asn Asp Cys

1               5                   10                  15

Pro Asn Ser Ser

            20

<210>7

<211>26

<212>PRT

<213>Double-pan-DR helper T cell epitopes(PADRE)

<220>

<223>

<400>7

Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Lys Phe

1               5                   10                  15

Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

            20                  25

<210>8

<211>567

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

ggtggtggat ctctggaatg gcgcaatact agcggcttat atgtgctgac gaacgactgc     60

agtaactcta gcggtggagg ttctgtgcag gtgaagaata cctcatcttc ttacatggtc    120

accaacgatt gctccaatga cagcagtggt ggaggttcta gtggtggtgg atcttatgaa    180

gtgcgcaacg tgagcggtgt gtaccatgtc actaatgact gcagtaactc tagcggtgga    240

ggctcttatc aggttcgtaa ttcatcgggt ctgtatcacg taactaacga ctgcccgaat    300

agttctagtg gtggaggttc tagtggtggt ggatctgtgc actatcgcaa tgcaagcggt    360

gtttaccatg tgaccaacca cagcccaaac acttctggtg gaggttctct gacctatggt    420

aatagctctg gcttatacca cctcactaac gactgcccaa attcatcgag tggtggaggt    480

tctagtgcga aatttgttgc ggcatggact cttaaggcag ctgcggctaa attcgttgca    540

gcttggacgt tgaaagcagc agcgtaa                                        567

<210>9

<211>188

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

Gly Gly Gly Ser Leu Glu Trp Arg Asn Thr Ser Gly Leu Tyr Val Leu

1               5                   10                  15

Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Lys

            20                  25                  30

Asn Thr Ser Ser Ser Tyr Met Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Asp Ser

        35                  40                  45

Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Glu Val Arg Asn Val

    50                  55                  60

Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Gly Gly

65                  70                  75                  80

Gly Ser Tyr Gln Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn

                85                  90                  95

Asp Cys Pro Asn Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser

            100                 105                 110

Val His Tyr Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn His Ser

        115                 120                 125

Pro Asn Thr Ser Gly Gly Gly Ser Leu Thr Tyr Gly Asn Ser Ser Gly

    130                 135                 140

Leu Tyr His Leu Thr Asn Asp Cys Pro Asn Ser Ser Ser Gly Gly Gly

145                 150                 155                 160

Ser Ser Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala

                165                 170                 175

Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

            180                 185

Claims (10)

1、一种多型别HCV/E1表位复合抗原，含有不同型别HCV/E1表位和通用T细胞表位。

2、根据权利要求1所述多型别HCV/E1表位复合抗原，其特征在于，具有下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：9；

2)将序列表中的SEQ ID №：9的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加的序列。

3、一种DNA分子，编码权利要求1所述的多型别HCV/E1表位复合抗原。

4、根据权利要求3所述的DNA分子，含有不同型别HCV/E1表位抗原的编码基因SEQID NO：1-6和通用T辅助细胞表位的编码基因SEQ ID NO：7。

5、根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA是下述序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：8的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

6、含有权利要求3或4或5所述DNA的表达载体、转基因细胞系及宿主菌。

7、根据权利要求6所述的表达载体，为原核表达质粒pBVIL1/E1s-PADRE。

8、权利要求1所述的多型别HCV/E1表位复合抗原的制备方法，包括：

1)构建原核表达质粒pBVIL1/E1s-PADRE，

2)在大肠杆菌中表达上述质粒得到目的蛋白，

3)对目的蛋白进行分离纯化。

9、根据权利要求8所述的多型别HCV/E1表位复合抗原的制备方法，其中步骤1)中原核表达质粒pBVIL1/E1s-PADRE的制备方法包括以下步骤：

1)根据序列表中SEQ.ID.NO 1-6所示序列，分段设计引物PCR合成片段，插入表达载体pBVIL1，获得含有不同HCV E1片段的载体；

2)利用表达载体pBVIL1/x可方便插入基因相互连接的特点，构建含有多个不同HCV/E1表位的表达质粒pBVIL1/E1s；

3)在表达质粒pBVIL1/E1s中再插入含有2个PADRE基因片段，构建成表达质粒pBVIL1/E1s-PADRE。

10、权利要求1所述的多型别HCV/E1表位复合抗原在制备预防和/或治疗HCV疫苗的药物或在制备HCV诊断试剂的抗原中的应用。

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