CN114395574B

CN114395574B - 一种猪流行性腹泻病毒融合蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN114395574B
Application number: CN202210056292.5A
Authority: CN
Inventors: 张大生
Original assignee: Changsha Axybio Biotechnology Co ltd
Current assignee: Changsha Axybio Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-01-18
Filing date: 2022-01-18
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2042-01-18
Also published as: CN114395574A

Abstract

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒融合基因及其编码蛋白与应用，本发明选择猪CTLA4基因和猪流行性腹泻病毒S基因合成为融合基因CTLA4‑PEDVS；再将融合基因克隆到腺病毒穿梭载体质粒上，和腺病毒包装质粒，共转染细胞，获得重组腺病毒载体rAd‑CTLA4‑PEDVS，该种载体在纯化后可以安全使用，能够刺激更强的细胞和体液免疫应答；本发明的重组5型腺病毒rAd‑CTLA4‑PEDVS，安全性好，免疫效价高，半年免疫一次即可，适合于大规模生产，能够有效的防治猪流行性腹泻病毒，同时不产生流行性腹泻病毒的M蛋白等其他蛋白和抗体，易于区分感染动物。

Description

一种猪流行性腹泻病毒融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物科技技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒融合基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠状病毒科猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的各年龄段猪腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高度致死为特征的一种高度接触性肠道传染病。世界各地区PED广泛流行，经济损失影响重大。流行性腹泻病毒S基因核苷酸长短不一，其核苷酸长度在4143bp-4161bp之间。多年来，关于PEDV的S基因的分子流行病学数据研究较多，通过研究发现，S基因可用来作为PEDV基因分型的一个依据，可将其分为2个大的基因群，G1基因群和G2基因群，各个亚群均可细分为2个小的遗传分支，即G1-1、G1-2和G2-1、G2-2。研究还发现，G1基因群均存在有碱基缺失或插入现象(以基因插入为主)。G1基因群PEDV毒株既存在大量的氨基酸点突变外，又存在氨基酸插入和缺失现象；但G2基因群PEDV毒株却不存在氨基酸插入现象，以氨基酸点突变为主。G1基因群PEDV毒株氨基酸序列与CV777(G2基因群代表株)的同源性为93.0％-93.8％。由于PEDV只有一个血清型，氨基酸的变异并不会对血清型产生影响，但推测其和疫苗的推荐使用密切相关。对PEDV新流行株的S基因序列分析发现，PEDV流行株S基因已出现缺失(197aa)和插入(4aa)，表明随着疫苗的使用，PEDV基因组进化趋势增强。以S基因绘制PEDV遗传进化树发现PEDV可分为2个明显的分支G1和G2，G1分支主要是CV777、DR13等活疫苗株和PEDV早期分离株，而G2分支均为新PEDV流行株，主要在韩国、美国等地流行。

目前流行性腹泻疫苗主要有活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗等类型。但表现出来的免疫效果，亚单位疫苗和灭活疫苗免疫效果一般，经典的活疫苗已经保护不了变异病毒造成的危害。我们对2018年以来的数株流行性腹泻病毒S基因进行了测序，发现优势毒株S基因和CV777的氨基酸同源性非常低(多个养殖场使用免疫CV777活疫苗后，仍然发病，表明CV777不能保护新毒株造成的感染)，和AJ1102的同源性也仅为88.1％，和XJDB2的同源性为98.2％。表明近年来流行性腹泻病毒的G2分支对我国猪场造成的危害越来越大，随着我国猪场集约化程度的提高，新毒株的传播造成的潜在威胁将也来越大。经典毒株活疫苗安全但效果不佳，新毒株活疫苗的使用是否容易造成毒株变异以及排毒引起更广泛的传染，还没有足够的数据支撑。因此寻找安全有效的腹泻疫苗来控制流行性腹泻病毒对猪场的潜在危害是一个重大的课题。

鉴于此，申请此专利。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒融合基因及其编码蛋白与应用，本发明的重组5型腺病毒rAd-CTLA4-PEDVS，安全性好，免疫效价高，适合于大规模生产，能够有效的防治猪流行性腹泻病毒。

本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒融合基因。

本发明的另一目的是提供上述猪流行性腹泻病毒融合基因编码的蛋白。

本发明的再一目的是提供含有上述的猪流行性腹泻病毒融合基因的重组载体。

根据本发明的具体实施方式的猪流行性腹泻病毒融合基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示：

ATGGAAATGAAAGGGATGCACGTGGCCCAACCTGCAGTAGTGCTGGCCAACAGCCGGGGTGTTGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATGGGTCTGCAGGCAAAGCTGCCGAGGTCCGGGTGACAGTGCTGCGGCGGGCCGGCAGCCAGATGACTGAAGTCTGTGCCGCGACATATACTGTGGAGGATGAGTTGACCTTCCTTGATGACTCTACATGCACTGGCACCTCCACCGAAAACAAAGTGAACCTCACCATCCAAGGGCTGAGAGCCGTGGACACTGGGCTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCCTGTACCCACCACCCTACTATGTGGGTATGGGCAACGGGACCCAGATTTATGTCATTGATCCAGAACCATGCCCAGATTCTGATGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTGGAACTTCCATTCAGCGTATTCTTTATTGTGATGATCCTGTTAGCCAACTCAAGTGTTCTCAGGTTGCTTTTGACCTTGACGATGGTTTTTACCCTATTTCTTCTAGAAACCTTCTGAGTCATGAACAGCCAATTTCTTTTGTTACTCTGCCATCATTTAATGATCATTCTTTTGTTAACATTACTGTCTCTGCTTCCTTTGGTGGTCATAGTGGTGCCAACCTTATTGCATCTGATACTACCATCAATGGGCTTAGTTCTTTCTGTGTTGACACTAGACAATTTACCATTTCACTGTTTTATAACGTTACAAACAGTTATGGTTATGTGTCTAAATCACAGGACAGTAATTGCCCTTTCACCTTGCAATCTGTTAATGATTACCTGTCTTTTAGCAAATTTTGTGTTTCCACCAGCCTTTTGGCTAGTGCCTGTACCATAGATCTTTTTGGTTATCCTGAGTTTGGTAGTGGTGTTAAGTTTACGTCCCTTTACTTTCAATTCACAAAGGGTGAGTTGATTACTGGCACGCCTAAACCACTTGAAGGTGTCACTGACGTTTCTTTTATGACTCTGGATGTGTGCACCAAGTATACTATCTATGGCTTTAAAGGTGAGGGTATCATTACCCTTACAAATTCTAGCATTTTGGCAGGTGTTTATTACACATCTGATTCTGGACAGTTGTTAGCTTTTAAGAATGTCACTAGTGGTGCTGTTTATTCTGTCACGCCATGTTCTTTTTCAGAGCAGGCTGCATATGTTGATGATGATATAGTGGGTGTTATTTCTAGTTTGTCTAGCTCCACTTTTAACAGTACTAGGGAGTTGCCTGGTTTCTTCTACCATTCTAATGATGGCTCTAATTGTACAGAGCCTGTGTTGGTGTATAGTAACATAGGTGTTTGTAAATCTGGCAGTATTGGCTACGTCCCATCTCAGTCTGGCCAAGTCAAAATTGCACCCATGGTTACTGGGAATATCAGTATTCCCACCAACTTTAGTATGAGTATTAGGACAGAATATTTACAGCTTTACAACACGCCTGTTAGTGTTGATTGTGCCACATATGTTTGTAATGGTAACTCTCGTTGTAAACAATTACTCACCCAGTACACTGCAGCATGTAAGACCATAGAATCAGTATTACAACTCAGCGCTAGGCTTGAGTCTGTTGAAGTTAACTCTATGCTCACTATTTCTGAAGAGGCTCTACAGTTAGCTACCATTAGTTCGTTTAATGGTGATGGATATAATTTTACTAATGTGCTGGGTGTTTCTGTGTATGATCCTGCAAGTGGCAGGGTG

根据本发明的具体实施方式的猪流行性腹泻病毒融合基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MEMKGMHVAQPAVVLANSRGVASFVCEYGSAGKAAEVRVTVLRRAGSQMTEVCAATYTVEDELTFLDDSTCTGTSTENKVNLTIQGLRAVDTGLYICKVELLYPPPYYVGMGNGTQIYVIDPEPCPDSDGGGGSGGGGSGGGGSGTSIQRILYCDDPVSQLKCSQVAFDLDDGFYPISSRNLLSHEQPISFVTLPSFNDHSFVNITVSASFGGHSGANLIASDTTINGLSSFCVDTRQFTISLFYNVTNSYGYVSKSQDSNCPFTLQSVNDYLSFSKFCVSTSLLASACTIDLFGYPEFGSGVKFTSLYFQFTKGELITGTPKPLEGVTDVSFMTLDVCTKYTIYGFKGEGIITLTNSSILAGVYYTSDSGQLLAFKNVTSGAVYSVTPCSFSEQAAYVDDDIVGVISSLSSSTFNSTRELPGFFYHSNDGSNCTEPVLVYSNIGVCKSGSIGYVPSQSGQVKIAPMVTGNISIPTNFSMSIRTEYLQLYNTPVSVDCATYVCNGNSRCKQLLTQYTAACKTIESVLQLSARLESVEVNSMLTISEEALQLATISSFNGDGYNFTNVLGVSVYDPASGRV

根据本发明的具体实施方式的猪流行性腹泻病毒融合基因(CTLA4-PEDVS)，所述融合基因包含猪的CTLA4基因和流行性腹泻病毒的S基因(PEDVS)。所述流行性腹泻病毒的S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

ATGGAAGGAACTTCCATTCAGCGTATTCTTTATTGTGATGATCCTGTTAGCCAACTCAAGTGTTCTCAGGTTGCTTTTGACCTTGACGATGGTTTTTACCCTATTTCTTCTAGAAACCTTCTGAGTCATGAACAGCCAATTTCTTTTGTTACTCTGCCATCATTTAATGATCATTCTTTTGTTAACATTACTGTCTCTGCTTCCTTTGGTGGTCATAGTGGTGCCAACCTTATTGCATCTGATACTACCATCAATGGGCTTAGTTCTTTCTGTGTTGACACTAGACAATTTACCATTTCACTGTTTTATAACGTTACAAACAGTTATGGTTATGTGTCTAAATCACAGGACAGTAATTGCCCTTTCACCTTGCAATCTGTTAATGATTACCTGTCTTTTAGCAAATTTTGTGTTTCCACCAGCCTTTTGGCTAGTGCCTGTACCATAGATCTTTTTGGTTATCCTGAGTTTGGTAGTGGTGTTAAGTTTACGTCCCTTTACTTTCAATTCACAAAGGGTGAGTTGATTACTGGCACGCCTAAACCACTTGAAGGTGTCACTGACGTTTCTTTTATGACTCTGGATGTGTGCACCAAGTATACTATCTATGGCTTTAAAGGTGAGGGTATCATTACCCTTACAAATTCTAGCATTTTGGCAGGTGTTTATTACACATCTGATTCTGGACAGTTGTTAGCTTTTAAGAATGTCACTAGTGGTGCTGTTTATTCTGTCACGCCATGTTCTTTTTCAGAGCAGGCTGCATATGTTGATGATGATATAGTGGGTGTTATTTCTAGTTTGTCTAGCTCCACTTTTAACAGTACTAGGGAGTTGCCTGGTTTCTTCTACCATTCTAATGATGGCTCTAATTGTACAGAGCCTGTGTTGGTGTATAGTAACATAGGTGTTTGTAAATCTGGCAGTATTGGCTACGTCCCATCTCAGTCTGGCCAAGTCAAAATTGCACCCATGGTTACTGGGAATATCAGTATTCCCACCAACTTTAGTATGAGTATTAGGACAGAATATTTACAGCTTTACAACACGCCTGTTAGTGTTGATTGTGCCACATATGTTTGTAATGGTAACTCTCGTTGTAAACAATTACTCACCCAGTACACTGCAGCATGTAAGACCATAGAATCAGTATTACAACTCAGCGCTAGGCTTGAGTCTGTTGAAGTTAACTCTATGCTCACTATTTCTGAAGAGGCTCTACAGTTAGCTACCATTAGTTCGTTTAATGGTGATGGATATAATTTTACTAATGTGCTGGGTGTTTCTGTGTATGATCCTGCAAGTGGCAGGGTG

所述流行性腹泻病毒的S基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：

MEGTSIQRILYCDDPVSQLKCSQVAFDLDDGFYPISSRNLLSHEQPISFVTLPSFNDHSFVNITVSASFGGHSGANLIASDTTINGLSSFCVDTRQFTISLFYNVTNSYGYVSKSQDSNCPFTLQSVNDYLSFSKFCVSTSLLASACTIDLFGYPEFGSGVKFTSLYFQFTKGELITGTPKPLEGVTDVSFMTLDVCTKYTIYGFKGEGIITLTNSSILAGVYYTSDSGQLLAFKNVTSGAVYSVTPCSFSEQAAYVDDDIVGVISSLSSSTFNSTRELPGFFYHSNDGSNCTEPVLVYSNIGVCKSGSIGYVPSQSGQVKIAPMVTGNISIPTNFSMSIRTEYLQLYNTPVSVDCATYVCNGNSRCKQLLTQYTAACKTIESVLQLSARLESVEVNSMLTISEEALQLATISSFNGDGYNFTNVLGVSVYDPASGRV

所述猪的CTLA4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：

ATGAAAGGGATGCACGTGGCCCAACCTGCAGTAGTGCTGGCCAACAGCCGGGGTGTTGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATGGGTCTGCAGGCAAAGCTGCCGAGGTCCGGGTGACAGTGCTGCGGCGGGCCGGCAGCCAGATGACTGAAGTCTGTGCCGCGACATATACTGTGGAGGATGAGTTGACCTTCCTTGATGACTCTACATGCACTGGCACCTCCACCGAAAACAAAGTGAACCTCACCATCCAAGGGCTGAGAGCCGTGGACACTGGGCTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCCTGTACCCACCACCCTACTATGTGGGTATGGGCAACGGGACCCAGATTTATGTCATTGATCCAGAACCATGCCCAGATTCTGAT

本发明将猪的CTLA4基因和最新分离的流行性腹泻病毒G2分支中的优势毒株S基因的455-890位氨基酸对应的基因连接成融合基因。连接的融合基因序列如SEQ ID NO.6所示：GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCT。

根据本发明的具体实施方式的重组载体，所述重组载体含有所述的猪流行性腹泻病毒融合基因。所述重组载体为重组腺病毒载体rAd-CTLA4-PEDVS。

优选的，所述重组载体为重组5型腺病毒载体。

根据本发明的具体实施方式的重组载体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)人工合成猪CTLA4基因和猪流行性腹泻病毒S基因融合基因CTLA4-PEDVS；

(2)将步骤(1)合成的融合基因CTLA4-PEDVS亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒P上，获得腺病毒穿梭质粒p-CTLA4-PEDVS；

(3)将步骤(2)获得的腺病毒穿梭质粒p-CTLA4-PEDVS和腺病毒包装载体共转染宿主细胞；

(4)收集细胞培养上清和细胞沉淀裂解上清，获得CTLA4-PEDVS重组腺病毒载体粗提液。

具体的，步骤(2)中，所述腺病毒穿梭载体质粒为pDC316。

更具体的，将CTLA4-PEDVS融合基因克隆到pDC316载体上EcoRI和HindIII酶切位点中，获得腺病毒穿梭质粒为pDC316-CTLA4-PEDVS。

具体的，步骤(3)中，腺病毒包装载体为pBHGlox(delta)E13Cre。

具体的，步骤(3)中，转染的宿主细胞为293系列细胞。

优选的，转染的宿主细胞为HEK293细胞。

本发明还提供上述含有所述重组载体的重组宿主株。

本发明还提供上述所述的重组载体在制备流行性腹泻疫苗或药物中的应用。

研究表明，5型腺病毒载体可以通过注射和口服产生很好的抗体，且重组5型腺病毒载体是一个安全有效的基因疫苗递送载体，在人类抗击新冠疫情中发挥了很大的作用。疫苗免疫中，好的免疫佐剂如猪的CTLA4基因，能够起到非常重要的增强细胞免疫和体液免疫的作用。基于此，本发明将猪的CTLA4基因和最新分离的流行性腹泻病毒G2分支中的优势毒株S基因的455-890位氨基酸对应的基因连接成的融合基因，克隆到腺病毒穿梭载体，包装成重组5型腺病毒载体。研究结果表明，包含CTLA4-PEDVS融合基因的重组腺病毒比单独的PEDVS基因的重组腺病毒，产生的抗体水平要高。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明首次将猪CTLA4基因和猪流行性腹泻病毒S基因组成的融合基因CTLA4-PEDVS；包装成重组腺病毒载体，该载体在纯化后可以安全使用，能够刺激更强的细胞和体液免疫应答，达到了预期的目的；

(2)试验表明，包含CTLA4-PEDVS融合基因的重组5型腺病毒载体rAd-CTLA4-PEDVS和不包含CTLA4基因的重组5型腺病毒载体rAd-PEDVS，都能够刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答，但rAd-CTLA4-PEDVS的细胞免疫和体液免疫应答水平显著高于rAd-PEDVS的应答水平，说明基因佐剂和目的基因组成的融合蛋白效果明显优于单独的目的蛋白。

(3)本发明的重组5型腺病毒rAd-CTLA4-PEDVS，安全性好，免疫效价高，半年免疫一次即可，适合于大规模生产，能够有效的防治猪流行性腹泻病毒，同时不产生流行性腹泻病毒的M蛋白等其他蛋白和抗体，易于区分感染动物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示pDC316-CTLA4-PEDVS质粒图谱；

图2显示PEDVS双酶切回收产物，其中，M(DNA MARKER)：100，250，500，750，1000，2000；1:PEDVS片段；

图3显示pDC316-PEDVS质粒图谱；

图4显示PEDVS荧光定量PCR标准曲线；

图5显示目的蛋白Western-Blotting结果。1：rAd-Null组；2：rAd-PEDVS组；3：rAd-CTLA4-PEDVS组；4：rAd-CTLA4-PEDVS-1组；5：流行性腹泻疫苗免疫组血清；

图6显示pDC316-CTLA4-PEDVS-1质粒图谱。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实验材料

基因、载体和细胞：重组腺病毒包装载体系统，pDC316穿梭质粒与腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E13Cre；HEK293细胞、大肠杆菌DH5α由长沙爱科博生物科技有限公司实验室保存。

主要试剂：EcoRI、HindIII、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；转染试剂Lipo2000购自Invitrogen公司。DMEM/High Glucose细胞培养基；胰酶溶液购自Hyclone公司；胎牛血清FBS购自Gibco公司；青霉素/链霉素溶液购自Gibco公司。其余试剂均为进口或者国产分析纯。

在一些较为具体的实施例中重组载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)人工合成猪CTLA4基因和猪流行性腹泻病毒S基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)融合基因CTLA4-PEDVS；

(4)收集细胞培养上清和细胞沉淀裂解上清，获得CTLA4-PEDVS重组腺病毒粗提液。

具体的，步骤(2)中，所述腺病毒穿梭载体质粒为pDC316。

具体的，步骤(3)中，腺病毒包装载体为pBHGlox(delta)E13Cre。

具体的，步骤(3)中，转染的宿主细胞为HEK293细胞。

以下为更为具体的实施例。

实施例1 pDC316-CTLA4-PEDVS、pDC316-PEDVS质粒的构建和蛋白表达

1.1融合基因

(1)人工合成猪CTLA4基因和猪流行性腹泻病毒S基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，采用毒株S基因的保守区域第450-890氨基酸的片段)融合基因CTLA4-PEDVS；合成的CTLA4-PEDVS融合基因(如SEQ ID NO.1所示)；

(2)人工合成猪CTLA4基因和猪流行性腹泻病毒S基因(采用毒株S基因的第493-708氨基酸的片段)融合基因CTLA4-PEDVS-1；

融合基因CTLA4-PEDVS-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：

ATGGAAATGAAAGGGATGCACGTGGCCCAACCTGCAGTAGTGCTGGCCAACAGCCGGGGTGTTGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATGGGTCTGCAGGCAAAGCTGCCGAGGTCCGGGTGACAGTGCTGCGGCGGGCCGGCAGCCAGATGACTGAAGTCTGTGCCGCGACATATACTGTGGAGGATGAGTTGACCTTCCTTGATGACTCTACATGCACTGGCACCTCCACCGAAAACAAAGTGAACCTCACCATCCAAGGGCTGAGAGCCGTGGACACTGGGCTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCCTGTACCCACCACCCTACTATGTGGGTATGGGCAACGGGACCCAGATTTATGTCATTGATCCAGAACCATGCCCAGATTCTGATGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTCAGCGTATTCTTTATTGTGATGATCCTGTTAGCCAACTCAAGTGTTCTCAGGTTGCTTTTGACCTTGACGATGGTTTTTACCCTATTTCTTCTAGAAACCTTCTGAGTCATGAACAGCCAATTTCTTTTGTTACTCTGCCATCATTTAATGATCATTCTTTTGTTAACATTACTGTCTCTGCTTCCTTTGGTGGTCATAGTGGTGCCAACCTTATTGCATCTGATACTACCATCAATGGGCTTAGTTCTTTCTGTGTTGACACTAGACAATTTACCATTTCACTGTTTTATAACGTTACAAACAGTTATGGTTATGTGTCTAAATCACAGGACAGTAATTGCCCTTTCACCTTGCAATCTGTTAATGATTACCTGTCTTTTAGCAAATTTTGTGTTTCCACCAGCCTTTTGGCTAGTGCCTGTACCATAGATCTTTTTGGTTATCCTGAGTTTGGTAGTGGTGTTAAGTTTACGTCCCTTTACTTTCAATTCACAAAGGGTGAGTTGATTACTGGCACGCCTAAACCACTTGAAGGTGTCACTGACGTTTCTTTTATGACTCTGGATGTGTGCACCAAGTATACTATCTATGGCTTTAAAGGTGAGGGTATCATTACCCTTACAAATTCT

(3)人工合成猪CTLA4基因和猪流行性腹泻病毒S基因(采用毒株S基因对应的S蛋白全长片段)融合基因CTLA4-PEDVS-2；

1.2将CTLA4-PEDVS、CTLA4-PEDVS-1、CTLA4-PEDVS-2融合基因分别克隆到pDC316载体上EcoRI和HindIII酶切位点中，转化到top10大肠杆菌，克隆命名为pDC316-CTLA4-PEDVS(如图1)、pDC316-CTLA4-PEDVS-1(如图6)、pDC316-CTLA4-PEDVS-2。

1.3用引物F/R扩增pDC316-CTLA4-PEDVS质粒中的PEDVS基因。

F：5'-CGTGAATTCCACCATGGAAGGAACTTCCATTCAGCGTATTC-3'，

R：5'-CGGAAGCTTCACACCCTGCCACTTGCAGGAT-3'。

对PCR产物进行EcoRI和HindIII酶切，酶切后的产物进行回收，回收产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。

将其亚克隆到pDC316载体中的EcoRI和HindIII酶切位点中，转化到Top10大肠杆菌，阳性克隆命名为pDC316-PEDVS(如图3)。

1.4pDC316-CTLA4-PEDVS、pDC316-CTLA4-PEDVS-1、pDC316-CTLA4-PEDVS-2、pDC316-PEDVS和pBHGlox(delta)E13Cre质粒提取

采用中提试剂盒提取质粒，对提取的质粒进行定量测定，达到转染要求就进行下一步试验。

1.5融合蛋白的真核表达

(1)在10cm培养皿里接种1×10⁶个HEK293细胞，培养到细胞长满皿底的80-90％；

(2)使用lipo2000脂质体进行转染：分别取pDC316-CTLA4-PEDVS、pDC316-CTLA4-PEDVS-1、pDC316-CTLA4-PEDVS-2、pDC316-PEDVS质粒(pDC316-RFP能产生红色荧光，作为阳性对照来监控转染效率)5μg到0.5mL无血清的DMEM培养基中，同时取按10μL lipo2000加入到0.5mL无血清的DMEM培养基中室温静置10min；

(3)将步骤(2)中含质粒的溶液分别逐滴加入到含lipo2000的溶液中，混匀，室温静置15min；

(4)将步骤(3)溶液加入到HEK293细胞中，6小时换含10％FBS的DMEM完全培养基继续培养；

(5)观察pDC316-RFP转染组的HEK293细胞是否产生红色荧光。转染后48小时，pDC316-RFP组能看到很强的红色荧光。说明转染效果非常好；

(6)分别收集pDC316-CTLA4-PEDVS、pDC316-CTLA4-PEDVS-1、pDC316-CTLA4-PEDVS-2、pDC316-PEDVS质粒转染组的细胞上清(含有真核表达的融合蛋白)备用。

实施例2包装重组5型腺病毒rAd-CTLA4-PEDVS、rAd-CTLA4-PEDVS-1和rAd-PEDVS

在包装重组病毒的过程中发现，S蛋白全长片段很难出毒(可能片段太大的原因)，因此全长片段不适合用来做重组腺病毒载体。

2.1包装重组5型腺病毒

(1)在10cm培养皿里种1×10⁶个HEK293细胞，培养到细胞铺满皿底80-90％；

(2)使用lipo2000脂质体进行转染：分别取pDC316-CTLA4-PEDVS、pDC316-CTLA4-PEDVS-1、pDC316-PEDVS质粒1μg和pBHGlox(delta)E13Cre的质粒3μg加入到0.5mL无血清的DMEM培养基中，同时取按10μL lipo2000加入到0.5mL无血清的DMEM培养基中室温静置10min；

(3)将步骤(2)中质粒的溶液逐滴加入到含lipo2000的溶液中，混匀，室温静置15min；

(4)将上步溶液加入到HEK293细胞中，6小时换含10％FBS的DMEM完全培养基继续培养；

(5)细胞长满后按照1:3进行传代，培养基为10％FBS的完全培养基:

传代3天后，每天观察细胞病态反应(CPE)；

当细胞有明显的CPE现象，且有>50％脱壁时即收细胞进行裂解收病毒，步骤如下：

1)收集细胞于15mL的干净离心管中。

2)1500g离心5min。

3)留1mL上清，多余部分弃去。

4)在干冰浴及37℃间快速反复冻融三次。

5)2000g离心15min。

2.2放大培养重组腺病毒(200个平皿为例)

(1)在直径10cm培养皿里接种3×10⁶个HEK293细胞；

(2)细胞长满后按照1:5进行传代，直到一共有200个皿细胞；

(3)将适量上步实验中得到的含腺病毒的细胞裂解上清加入到95％融会度的HEK293细胞中；

(4)大约48-72h，细胞有明显的CPE现象时，分别对细胞上清和细胞沉淀进行收集细胞。

(5)细胞沉淀用PBS洗三遍后，按照细胞培养上清的1/10体积加入PBS进行细胞重悬，-80℃和37℃反复冻融三次后，离心，收集上清备用。

2.3.PCR测定重组腺病毒的滴度

将收集的细胞培养上清和细胞沉淀裂解上清，用荧光定量PCR进行病毒滴度测定。引物序列如下：

PEDVS-153F：5'-CTAGGGAGTTGCCTGGTTTCTTC-3'，

PEDVS-153R：5'-TAACCATGGGTGCAATTTTGAC-3'，

PEDVS-153PROBE：5'-FAM-ACCATTCTAATGATGGCTC-BHQ1-3'；

反应体系：2x PCR mix，10μL；PEDVS-153F，1μL；DNA，2μL；H2O，5μL；PEDVS-153R，1μL；PEDVS-153PROBE，1μL。

反应条件：95℃，3min；95℃，15s 40cycle；60℃，30s。

反应结束后的阳性对照的扩增曲线如图4所示。根据结果计算得出标准曲线方程为：y＝-0.2803Logx+13.211；R²＝0.9997。

表1不同浓度标准品荧光定量PCR对应的CT值结果

根据标准曲线计算出目的病毒的滴度。得出rAd-CTLA4-PEDVS、rAd-CTLA4-PEDVS-1和rAd-PEDVS细胞培养上清中的病毒的滴度大致为2～5×10⁸次方个/mL；rAd-CTLA4-PEDVS、rAd-CTLA4-PEDVS-1和rAd-PEDVS细胞沉淀裂解上清中的病毒滴度为5～10×10⁹次方个/mL。rAd-CTLA4-PEDVS、、rAd-CTLA4-PEDVS-1和rAd-PEDVS病毒产量差异不明显。

实施例3测定rAd-CTLA4-PEDVS、rAd-CTLA4-PEDVS-1、rAd-PEDVS注射小鼠血清中的IgG水平

3.1重组rAd-CTLA4-PEDVS、rAd-CTLA4-PEDVS-1、rAd-PEDVS免疫小鼠

在小鼠模型上，研究重组rAd-CTLA4-PEDVS、rAd-CTLA4-PEDVS-1、rAd-PEDVS疫苗的免疫剂量，测定血清中IgG测定。

SPF级别的昆明小鼠(4-6周龄)，购自湖南景达实验动物有限公司。将重组腺病毒载体+生理盐水制成疫苗，注射体积为50μL，免疫后每周采血，制备血清冻存于-70℃冰箱备用。小鼠分组、免疫剂量及免疫部位如表2所示：

表2免疫分组及情况

备注：rAd5-Null*，为没有插入基因的空载体包装的重组病毒。某疫苗在首次免疫2周后进行第2次免疫。

3.2免疫印迹法对血清中PEDVS抗体的测定结果

(1)取1.4中的细胞培养上清100微升，加入蛋白上样缓冲液。

(2)将3.1中制备的样本10微升加入到点样孔，进行10％的SDS-PAGE电泳。电泳条件：恒压100V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。

(3)转膜，将电泳结束后的胶块上的蛋白转移到PVDF膜上。

(4)封闭：将膜完全浸没5％的脱脂奶粉-TBST中，室温轻摇30min。

(5)用TBST，分别将3.1项下收集的各组(rAd5-Null，rAd-PEDVS，rAd-CTLA4-PEDVS，某疫苗)血清进行100倍稀释，在抗体孵育盒中，室温孵育10min，放4℃过夜。

(6)第二天从4℃拿出膜。洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。

(7)用TBST按1:5000的比例，稀释Goat Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP二抗，将稀释的而抗体加入抗体孵育盒中，室温孵育40min。

(8)洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。

(9)ECL加到膜上后反应2min，胶片曝光：10s-3min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2min，定影。

(10)免疫印迹的结果。

免疫印迹的结果如图5所示，第1组血清没有目的条带出现，第2，3，4，5组血清分别有目的条带出现，差别在于PEDVS蛋白的表达。说明rAd-PEDVS、rAd-CTLA4-PEDVS、rAd-CTLA4-PEDVS-1注射和流行性腹泻疫苗免疫后的血清都能和真核表达的PEDVS蛋白产生特异性的抗原抗体反应。因为CTLA4-PEDVS融合蛋白大小为62kD，所以各组血清的Western-Blotting结果条带都在62kD处。

3.3间接ELISA检测分离的血清样本中总IgG

包被上步制备的PEDVS蛋白抗原，以1μg/mL浓度，每孔100μL包被96孔酶标板，37℃2h，然后用PBST(PBS+吐温)洗涤。每孔加100μL 5％脱脂乳的PBST封闭液，37℃封闭1h，洗涤；每孔加入PBS稀释(1:100)的待检免疫血清，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入PBS稀释(1:2000)的HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗小鼠IgG作为二抗，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入100μL TMB显色液(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，室温显色10min后每孔加入50μL2M的硫酸终止反应，酶标仪测OD_450nm吸光值。分析结果。当样品OD₄₅₀值≥(阴性血清的OD₄₅₀值+3倍标准方差)时即为阳性。

免疫4周后的血清PEDVS IgG抗体检测结果如表3所示：

表3免疫4周后小鼠血清中PEDVS IgG抗体水平

由表3可以看出，rAd5-Null组没有产生特异的PEDVS IgG抗体；rAd-PEDVS组、rAd-CTLA4-PEDVS组、rAd-CTLA4-PEDVS-1组和流行性腹泻疫苗免疫组血清，都检测到较高的PEDVS IgG抗体，其中，rAd-CTLA4-PEDVS组和流行性腹泻疫苗免疫组血清的抗体水平显著高于rAd5-PEDVS组、rAd-CTLA4-PEDVS-1组，rAd-CTLA4-PEDVS组和流行性腹泻疫苗免疫组血清的抗体水平差异不显著，说明rAd-CTLA4-PEDVS组一次免疫和某腹泻疫苗二次免疫的产生的抗体水平相当。

3.4测定rAd5-CTLA4-PEDVS注射小鼠血清中的IgG亚型和评价免疫效果

血清中IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体(试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)，ELISA测定结果如表4：

表4血清中IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体检测结果

IgG1水平升高，表明保护性免疫中免疫应答向Th2(体液免疫应答)方向发展；IgG2a水平升高，提示保护性免疫中免疫应答向Th1(细胞免疫应答)方向发展。由表4可以看出，和rAd5-Null组相比，rAd-PEDVS组、rAd-CTLA4-PEDVS组、rAd-CTLA4-PEDVS-1组和某腹泻疫苗免疫组的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体都升高了；rAd-CTLA4-PEDVS组和rAd-CTLA4-PEDVS-1组IgG1低于某腹泻疫苗免疫组，但rAd-CTLA4-PEDVS组IgG2a高于某腹泻疫苗免疫组和rAd-CTLA4-PEDVS-1组，这些结果说明，rAd-CTLA4-PEDVS组体液免疫应答水平低于某腹泻疫苗免疫组，但是rAd-CTLA4-PEDVS组细胞免疫应答水平高于某腹泻疫苗免疫组。说明本发明rAd-CTLA4-PEDVS可加强小鼠的细胞免疫状态，从而增强细胞免疫水平，能产生较强的细胞免疫应答；提高机体免疫力，提高抗感染能力。

为了获得针对新分离的流行性腹泻病毒G2分支的疫苗，我们选择了优势毒株S基因的保守区域第450-890氨基酸的片段、第493-708氨基酸的片段和S基因对应的S蛋白全长片段。在包装重组病毒的过程中发现，S蛋白全长片段很难出毒(可能片段太大的原因)，因此全长片段不适合用来做重组腺病毒载体；我们已经授权的专利(专利号201610527708)中使用了S基因的第493-708氨基酸的片段和布鲁氏菌OMP16蛋白融合表达能够通过乳酸菌作为载体通过口服在猪中产生了很好的抗体。但该片段包装的腺病毒和本研究中的融合片段相比，虽然出毒量一样，但本研究的片段产生的抗体水平更高，这一原因可能是乳酸菌与腺病毒是不同的载体相关。通过基因对比确定S基因的保守区域；同时，CTLA-4主要在淋巴器官的T细胞活化阶段发挥作用,通过与T细胞激活性受体CD28竞争性结合共同的配体CD80和CD86,抑制T细胞的过度活化，免疫调理作用，我们的融合蛋白通过腺病毒载体介导产生了预期的效果。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 长沙爱科博生物科技有限公司

<120> 一种猪流行性腹泻病毒融合蛋白及其编码基因与应用

<130> 20220217

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggaaatga aagggatgca cgtggcccaa cctgcagtag tgctggccaa cagccggggt 60

gttgccagct ttgtgtgtga gtatgggtct gcaggcaaag ctgccgaggt ccgggtgaca 120

gtgctgcggc gggccggcag ccagatgact gaagtctgtg ccgcgacata tactgtggag 180

gatgagttga ccttccttga tgactctaca tgcactggca cctccaccga aaacaaagtg 240

aacctcacca tccaagggct gagagccgtg gacactgggc tctacatctg caaggtggag 300

ctcctgtacc caccacccta ctatgtgggt atgggcaacg ggacccagat ttatgtcatt 360

gatccagaac catgcccaga ttctgatggt ggcggtggct cgggcggtgg tggatctggt 420

ggcggcggat ctggaacttc cattcagcgt attctttatt gtgatgatcc tgttagccaa 480

ctcaagtgtt ctcaggttgc ttttgacctt gacgatggtt tttaccctat ttcttctaga 540

aaccttctga gtcatgaaca gccaatttct tttgttactc tgccatcatt taatgatcat 600

tcttttgtta acattactgt ctctgcttcc tttggtggtc atagtggtgc caaccttatt 660

gcatctgata ctaccatcaa tgggcttagt tctttctgtg ttgacactag acaatttacc 720

atttcactgt tttataacgt tacaaacagt tatggttatg tgtctaaatc acaggacagt 780

aattgccctt tcaccttgca atctgttaat gattacctgt cttttagcaa attttgtgtt 840

tccaccagcc ttttggctag tgcctgtacc atagatcttt ttggttatcc tgagtttggt 900

agtggtgtta agtttacgtc cctttacttt caattcacaa agggtgagtt gattactggc 960

acgcctaaac cacttgaagg tgtcactgac gtttctttta tgactctgga tgtgtgcacc 1020

aagtatacta tctatggctt taaaggtgag ggtatcatta cccttacaaa ttctagcatt 1080

ttggcaggtg tttattacac atctgattct ggacagttgt tagcttttaa gaatgtcact 1140

agtggtgctg tttattctgt cacgccatgt tctttttcag agcaggctgc atatgttgat 1200

gatgatatag tgggtgttat ttctagtttg tctagctcca cttttaacag tactagggag 1260

ttgcctggtt tcttctacca ttctaatgat ggctctaatt gtacagagcc tgtgttggtg 1320

tatagtaaca taggtgtttg taaatctggc agtattggct acgtcccatc tcagtctggc 1380

caagtcaaaa ttgcacccat ggttactggg aatatcagta ttcccaccaa ctttagtatg 1440

agtattagga cagaatattt acagctttac aacacgcctg ttagtgttga ttgtgccaca 1500

tatgtttgta atggtaactc tcgttgtaaa caattactca cccagtacac tgcagcatgt 1560

aagaccatag aatcagtatt acaactcagc gctaggcttg agtctgttga agttaactct 1620

atgctcacta tttctgaaga ggctctacag ttagctacca ttagttcgtt taatggtgat 1680

ggatataatt ttactaatgt gctgggtgtt tctgtgtatg atcctgcaag tggcagggtg 1740

<210> 2

<211> 580

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Glu Met Lys Gly Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala

1 5 10 15

Asn Ser Arg Gly Val Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Gly Ser Ala Gly

20 25 30

Lys Ala Ala Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Arg Ala Gly Ser Gln

35 40 45

Met Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Thr Val Glu Asp Glu Leu Thr

50 55 60

Phe Leu Asp Asp Ser Thr Cys Thr Gly Thr Ser Thr Glu Asn Lys Val

65 70 75 80

Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Ile

85 90 95

Cys Lys Val Glu Leu Leu Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Val Gly Met Gly

100 105 110

Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser

115 120 125

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Thr Ser Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp Asp Pro Val Ser Gln

145 150 155 160

Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp Asp Gly Phe Tyr Pro

165 170 175

Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ile Ser Phe Val

180 185 190

Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr Val Ser

195 200 205

Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser Asp Thr

210 215 220

Thr Ile Asn Gly Leu Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln Phe Thr

225 230 235 240

Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val Ser Lys

245 250 255

Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn Asp Tyr

260 265 270

Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala Ser Ala

275 280 285

Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys

290 295 300

Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile Thr Gly

305 310 315 320

Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val Ser Phe Met Thr Leu

325 330 335

Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe Lys Gly Glu Gly Ile

340 345 350

Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Ile Leu Ala Gly Val Tyr Tyr Thr Ser

355 360 365

Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Val Thr Ser Gly Ala Val

370 375 380

Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln Ala Ala Tyr Val Asp

385 390 395 400

Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser Ser Ser Thr Phe Asn

405 410 415

Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr His Ser Asn Asp Gly Ser

420 425 430

Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser Asn Ile Gly Val Cys Lys

435 440 445

Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln Ser Gly Gln Val Lys Ile

450 455 460

Ala Pro Met Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile Pro Thr Asn Phe Ser Met

465 470 475 480

Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr Asn Thr Pro Val Ser Val

485 490 495

Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn Ser Arg Cys Lys Gln Leu

500 505 510

Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr Ile Glu Ser Val Leu Gln

515 520 525

Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val Asn Ser Met Leu Thr Ile

530 535 540

Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile Ser Ser Phe Asn Gly Asp

545 550 555 560

Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val Ser Val Tyr Asp Pro Ala

565 570 575

Ser Gly Arg Val

580

<210> 3

<211> 1314

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

atggaaggaa cttccattca gcgtattctt tattgtgatg atcctgttag ccaactcaag 60

tgttctcagg ttgcttttga ccttgacgat ggtttttacc ctatttcttc tagaaacctt 120

ctgagtcatg aacagccaat ttcttttgtt actctgccat catttaatga tcattctttt 180

gttaacatta ctgtctctgc ttcctttggt ggtcatagtg gtgccaacct tattgcatct 240

gatactacca tcaatgggct tagttctttc tgtgttgaca ctagacaatt taccatttca 300

ctgttttata acgttacaaa cagttatggt tatgtgtcta aatcacagga cagtaattgc 360

cctttcacct tgcaatctgt taatgattac ctgtctttta gcaaattttg tgtttccacc 420

agccttttgg ctagtgcctg taccatagat ctttttggtt atcctgagtt tggtagtggt 480

gttaagttta cgtcccttta ctttcaattc acaaagggtg agttgattac tggcacgcct 540

aaaccacttg aaggtgtcac tgacgtttct tttatgactc tggatgtgtg caccaagtat 600

actatctatg gctttaaagg tgagggtatc attaccctta caaattctag cattttggca 660

ggtgtttatt acacatctga ttctggacag ttgttagctt ttaagaatgt cactagtggt 720

gctgtttatt ctgtcacgcc atgttctttt tcagagcagg ctgcatatgt tgatgatgat 780

atagtgggtg ttatttctag tttgtctagc tccactttta acagtactag ggagttgcct 840

ggtttcttct accattctaa tgatggctct aattgtacag agcctgtgtt ggtgtatagt 900

aacataggtg tttgtaaatc tggcagtatt ggctacgtcc catctcagtc tggccaagtc 960

aaaattgcac ccatggttac tgggaatatc agtattccca ccaactttag tatgagtatt 1020

aggacagaat atttacagct ttacaacacg cctgttagtg ttgattgtgc cacatatgtt 1080

tgtaatggta actctcgttg taaacaatta ctcacccagt acactgcagc atgtaagacc 1140

atagaatcag tattacaact cagcgctagg cttgagtctg ttgaagttaa ctctatgctc 1200

actatttctg aagaggctct acagttagct accattagtt cgtttaatgg tgatggatat 1260

aattttacta atgtgctggg tgtttctgtg tatgatcctg caagtggcag ggtg 1314

<210> 4

<211> 438

<212> PRT

<213> 未知

<400> 4

Met Glu Gly Thr Ser Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp Asp Pro Val

1 5 10 15

Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp Asp Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ile Ser

35 40 45

Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr

50 55 60

Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser

65 70 75 80

Asp Thr Thr Ile Asn Gly Leu Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln

85 90 95

Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val

100 105 110

Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn

115 120 125

Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala

130 135 140

Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly

145 150 155 160

Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile

165 170 175

Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val Ser Phe Met

180 185 190

Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe Lys Gly Glu

195 200 205

Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Ile Leu Ala Gly Val Tyr Tyr

210 215 220

Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Val Thr Ser Gly

225 230 235 240

Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln Ala Ala Tyr

245 250 255

Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser Ser Ser Thr

260 265 270

Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr His Ser Asn Asp

275 280 285

Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser Asn Ile Gly Val

290 295 300

Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln Ser Gly Gln Val

305 310 315 320

Lys Ile Ala Pro Met Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile Pro Thr Asn Phe

325 330 335

Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr Asn Thr Pro Val

340 345 350

Ser Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn Ser Arg Cys Lys

355 360 365

Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr Ile Glu Ser Val

370 375 380

Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val Asn Ser Met Leu

385 390 395 400

Thr Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile Ser Ser Phe Asn

405 410 415

Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val Ser Val Tyr Asp

420 425 430

Pro Ala Ser Gly Arg Val

435

<210> 5

<211> 381

<212> DNA

<213> 未知

<400> 5

atgaaaggga tgcacgtggc ccaacctgca gtagtgctgg ccaacagccg gggtgttgcc 60

agctttgtgt gtgagtatgg gtctgcaggc aaagctgccg aggtccgggt gacagtgctg 120

cggcgggccg gcagccagat gactgaagtc tgtgccgcga catatactgt ggaggatgag 180

ttgaccttcc ttgatgactc tacatgcact ggcacctcca ccgaaaacaa agtgaacctc 240

accatccaag ggctgagagc cgtggacact gggctctaca tctgcaaggt ggagctcctg 300

tacccaccac cctactatgt gggtatgggc aacgggaccc agatttatgt cattgatcca 360

gaaccatgcc cagattctga t 381

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 未知

<400> 6

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtggatct ggtggcggcg gatct 45

<210> 7

<211> 1062

<212> DNA

<213> 未知

<400> 7

atggaaatga aagggatgca cgtggcccaa cctgcagtag tgctggccaa cagccggggt 60

gttgccagct ttgtgtgtga gtatgggtct gcaggcaaag ctgccgaggt ccgggtgaca 120

gtgctgcggc gggccggcag ccagatgact gaagtctgtg ccgcgacata tactgtggag 180

gatgagttga ccttccttga tgactctaca tgcactggca cctccaccga aaacaaagtg 240

aacctcacca tccaagggct gagagccgtg gacactgggc tctacatctg caaggtggag 300

ctcctgtacc caccacccta ctatgtgggt atgggcaacg ggacccagat ttatgtcatt 360

gatccagaac catgcccaga ttctgatggt ggcggtggct cgggcggtgg tggatctggt 420

ggcggcggat ctcagcgtat tctttattgt gatgatcctg ttagccaact caagtgttct 480

caggttgctt ttgaccttga cgatggtttt taccctattt cttctagaaa ccttctgagt 540

catgaacagc caatttcttt tgttactctg ccatcattta atgatcattc ttttgttaac 600

attactgtct ctgcttcctt tggtggtcat agtggtgcca accttattgc atctgatact 660

accatcaatg ggcttagttc tttctgtgtt gacactagac aatttaccat ttcactgttt 720

tataacgtta caaacagtta tggttatgtg tctaaatcac aggacagtaa ttgccctttc 780

accttgcaat ctgttaatga ttacctgtct tttagcaaat tttgtgtttc caccagcctt 840

ttggctagtg cctgtaccat agatcttttt ggttatcctg agtttggtag tggtgttaag 900

tttacgtccc tttactttca attcacaaag ggtgagttga ttactggcac gcctaaacca 960

cttgaaggtg tcactgacgt ttcttttatg actctggatg tgtgcaccaa gtatactatc 1020

tatggcttta aaggtgaggg tatcattacc cttacaaatt ct 1062

Claims

1.一种猪流行性腹泻病毒融合基因，其特征在于，所述融合基因包含猪的CTLA4基因和流行性腹泻病毒的S基因，所述猪流行性腹泻病毒融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒融合基因编码的蛋白，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒融合基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒融合基因，所述重组载体为重组5型腺病毒载体。

4.一种权利要求3所述的重组载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）合成猪CTLA4基因和猪流行性腹泻病毒S基因融合基因CTLA4-PEDVS；

（2）将步骤（1）合成的融合基因CTLA4-PEDVS克隆到腺病毒穿梭载体质粒P上，获得腺病毒穿梭质粒p-CTLA4-PEDVS；

（3）将步骤（2）获得的腺病毒穿梭质粒p-CTLA4-PEDVS和腺病毒包装载体共转染宿主细胞；

（4）收集细胞培养上清和细胞沉淀裂解上清，获得CTLA4-PEDVS重组腺病毒粗提液。

5.根据权利要求4所述的重组载体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述腺病毒穿梭载体质粒为pDC316。

6.根据权利要求4所述的重组载体的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，腺病毒包装载体为pBHGlox(delta)E13Cre。

7.根据权利要求4所述的重组载体的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，转染的宿主细胞为293系列细胞。

8.根据权利要求7所述的重组载体的制备方法，其特征在于，转染的宿主细胞为HEK293细胞。

9.含有权利要求1所述融合基因的重组宿主株。

10.权利要求1所述的融合基因在制备流行性腹泻疫苗或药物中的应用。