CN103509807B

CN103509807B - 糖基化的麦芽糖结合蛋白及其制备方法与应用

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Publication number: CN103509807B
Application number: CN201310409028.6A
Authority: CN
Inventors: 陈敏; 杨公进; 马中瑞
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2033-09-10
Also published as: CN103509807A

Abstract

本发明涉及一种糖基化的麦芽糖结合蛋白及其制备方法与应用，一种麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。此糖-蛋白缀合物疫苗作为TD抗原不仅能在健康成年人体内产生持久的免疫力，而且针对上述高危人群同样有效。

Description

糖基化的麦芽糖结合蛋白及其制备方法与应用

技术领域：

本发明涉及一种糖基化的麦芽糖结合蛋白的制备方法及其制备方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术：

麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein，简称：MBP)是大肠杆菌麦芽糖转运系统的成员之一，主要负责麦芽糖的捕获和转运。由于MBP融合表达重组蛋白具有表达水平高，易于纯化等优点，MBP常作为融合标签被广泛应用。过去人们普遍认为MBP标签没有生物活性或生物活性较低，其融合表达的蛋白可直接进行生物活性研究。但最近有研究发现，MBP作为载体蛋白，能提高亚单位疫苗对抗病原菌的作用。MBP可通过作用于TLR4介导的信号通路，促进细胞因子的分泌和树突状细胞的成熟，增强细胞免疫应答作用。

将细菌多糖如O-PS、CPS连接到具有免疫原性的载体蛋白中形成糖-蛋白缀合物，此糖蛋白能引发依赖于T细胞的免疫应答，被认为是最有效和最安全的抗病原菌疫苗之一，具有广阔应用前景。合成糖蛋白疫苗的方法主要有化学法和酶法。目前被广泛应用的是化学法，通过基因工程技术表达和纯化载体蛋白，然后同提纯的病原菌表面多糖进行化学耦联。由于糖链化学激活的随机性，交联产生的糖蛋白具有高度不均一性；同时，此方法存在着步骤繁杂、操作困难等问题。近几年兴起的酶法利用空肠弯曲菌N-连接糖基化途径同大肠杆菌脂多糖合成途径相似性的特点，将空肠弯曲菌的一种寡糖基转移酶PglB构建到大肠杆菌中，通过这种改造后的PglB介导的大肠杆菌糖蛋白合成系统，可以体内一步法合成糖蛋白。酶法克服了化学法的不足，具有很大潜力，近几年其理论和方法也不断改进和完善。

MBP表面某些特定的位置氨基酸序列的变化，如突变，缺失，插入等不会影响其本身转运麦芽糖的活性。有研究证明，MBP蛋白第178位和341位氨基酸残基插入7-13个氨基酸残基，不会影响该蛋白的活性。天然的MBP没有可被PglB识别的糖基化位点。因此建立一种方法使MBP可被PglB识别且有效糖基化成为合成糖蛋白的前提和关键。

发明内容：

本发明的目的在于建立一种有效的麦芽糖结合蛋白糖基化方法，同时将麦芽糖结合蛋白引入糖蛋白疫苗中，解决了现有技术中的空白和不足，也拓展了糖蛋白疫苗的范围。

一种麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种麦芽糖结合蛋白，它是由SEQ ID NO.3所示氨基酸序列在178位和341位分别结合来自大肠杆菌O157:H7的脂多糖O-PS组成。

上述麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut的制备方法，包括如下步骤：

(1)设计一对嵌合引物，其序列分别为：

malE-178-1：5’TGTTGCGTTCTGGTC，malE-178-2：5’GACCAGAACGCAACA；

设计一对模板基因的最远端上下游引物，分别为：

k-waaL-F：CTCGAGAAAAAAAACTGGATAGCGTACTGGAACAGAGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC和

k-waaL-R：TTACTTGTTTTTCATCGCTAATAATAAGCCGGCGTAAACATGGGAATTAGCCATGGTCC

然后以malE-178-1和k-waaL-F为引物，以malE基因为模板，合成PCR片段k-waaL-F-malE-178-1；然后以malE-178-2和k-waaL-R为模板，合成片段malE-178-2-k-waaL-R；

以PCR片段k-waaL-F-malE-178-1和malE-178-2-k-waaL-R混合物作共同模板，以k-waaL-F和k-waaL-R为引物，合成PCR产物，制得在N178位插入五肽糖基化序列位点的malE突变基因；

(2)设计一对嵌合引物，其序列分别为：

malE-341-1：TGTTGCGTTCTGGTCACGCGGATCTTTCACCAACTC和

malE-341-2：GACCAGAACGCAACAATTGCCGCCACTATGGAAAAC

设计一对模板基因的最远端上下游引物，分别为：

t-waaL-F：GTATGTCTCTTGCAGATTTG和

t-waaL-R：ATGGCGTAACTCAAAGATTC

然后以malE-341-1和t-waaL-F为引物，以步骤(1)制得的在N178位插入五肽糖基化序列位点的malE突变基因为模板，合成PCR片段t-waaL-F-malE-341-1；然后以malE-341-2和t-waaL-R为模板，合成片段malE-341-2-t-waaL-R；

以PCR片段t-waaL-F-malE-341-1和malE-341-2-t-waaL-R混合物作共同模板，以t-waaL-F和t-waaL-R为引物，合成PCR产物，制得在N178位和N341位都插入五肽糖基化序列位点的malE突变基因。

上述麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut在制备麦芽糖结合蛋白中的应用。

上述应用，步骤如下：

本发明所述关于糖蛋白疫苗的制备，包括1)用MBP替代PglB的天然底物蛋白AcrA，拓展了蛋白的种类；

2)将表达MBP的malE基因和表达PglB的pglB基因同时构建到一个质粒载体pBAD24中，大大简化了步骤，同时为其利用提供了便利。

其中：

1)所述表达大肠杆菌MBP蛋白的malE基因来自质粒pMAL-p5X，基因大小为1176bp。

2)所述pBAD24-pglB-malE的构建方法：在pglB基因两侧设计酶切位点NcoI和SmaI(NcoI-pglB-SmaI)；在malE基因前设计SD序列，并在两侧设计酶切位点SmaI和SalI(SmaI-SD-malE-SalI)。通过酶切连接将上述两序列插入到质粒pMAL-p5X中。

有益效果

此糖-蛋白缀合物疫苗作为TD抗原不仅能在健康成年人体内产生持久的免疫力，而且针对上述高危人群(例如婴幼儿)同样有效。

附图说明

图1：N-连接糖基化途径同脂多糖合成途径的相似性比较(A、B)以及大肠杆菌PglB介导的糖蛋白合成系统的构建(C)。

图2：malE基因糖基化序列插入操作示意图。

其中：虚线所指示的序列即为插入糖基化序列。

图3：表达质粒pM(pBAD24-malE_mut)、pP(pBAD24-pglB)、pPM(pBAD24-pglB-malE_mut)的构建。

图4：waaL基因敲除相关PCR检测琼脂糖凝胶电泳图。

其中：M：1kb DNA ladder；1：waaL基因(E.coli O86:K61:B7)；2和5：kana抗性敲除基因(E.coli O86:K61:B7/ΔwaaL::FRT-kana-FRT)；3和4：FRT位点基因(E.coliO86:K61:B7/ΔwaaL::FRT)；所用引物为检测引物t-waaL-F和t-waaL-R。

图5：Western bolt分析检测MBP蛋白糖基化。

其中：1：MBP-Mut蛋白(含pM)；2：pglB蛋白(含pP)；3：糖基化的MBP-Mut蛋白(含pPM)；以上3种蛋白均在E.coli O86:K61:B7/ΔwaaL::FRT中表达。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述，实施例中的实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。

实验材料

本实施例所用菌株、质粒及引物表1所示。

表1本实施例所用载体/质粒/引物

实施例1

合成含五肽糖基化序列(DQNAT)的麦芽糖结合蛋白

根据中心法则，DNA转录成RNA，RNA翻译成蛋白质。因此，在DNA水平上对malE基因进行改造，插入编码DQNAT的碱基序列，然后对改造后的malE基因表达，即得含有五肽糖基化位点的MBP。以质粒pMAL-p5X中的malE基因为模版，以表一中所列malE-178-1、malE-178-2、malE-341-1、malE-341-2、malE-F、malE-R为引物，分两次分别在MBP的N178、N341位插入五肽糖基化序列(DQNAT)。

步骤如图所示，以在MBP N178位插入DQNAT为例，具体说明如下：

1)引物malE-178-1的5'端和malE-178-2的5'端互补，负责合成DQNAT；两引物的3'端分别同模板malE基因相同或互补。malE-F和mal-F分别是malE基因的上、下游引物。

2)以malE-F和malE-178-1为引物对，以malE基因为模板，PCR反应合成片段F-1。同理以malE-R和malE-178-2为引物对，合成片段2-R。

3)以malE-F和malE-R为引物对，以片段F-1和2-R混合物为模板，PCR反应合成malE_mut-178基因。

同理，在MBP N341位插入DQNAT，按照上述说明，在malE_mut-178基因的基础上合成终产物malE_mut-178,341。

此基因改造得到的malE_mut-178,341基因在malE基因的基础上共插入了30个碱基(每个位点分别15个碱基)。此基因表达的蛋白即为在N178和N341分别插入一个五肽糖基化序列(DQNAT)的麦芽糖结合蛋白。

得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut，其编码翻译的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。SEQ ID NO.2为未改造前的核苷酸序列，其编码翻译的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例2

PglB介导的大肠杆菌糖蛋白合成系统的构建

以模式菌大肠埃希菌O86:K61:B7为例详述具体步骤，如下：

敲除E.coli O86:K61:B7的waaL基因。敲除方法参见λ-Red重组系统。用到敲除引物k-waaL-F、k-waaL-R和检测引物t-waaL-F、t-waaL-R；用到的质粒有pKD46、pKD4和pCP20。敲除验证结果如图4所示。部分条件简要说明如下：

(1)pKD46的转化与Red重组系统的的诱导表达：将编码Red重组基因的质粒pKD46用化学法转化入E.coli O86:K61:B7中，接种于含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，30℃250rpm培养过夜。然后以1％接种量转接于50mL新鲜的含1‰Amp LB液体培养基中，培养一个小时OD600＝0.2～0.4，添加终浓度为1％L-阿拉伯糖，30℃250rpm培养至OD600＝0.6～0.8。

(2)感受态细胞的制备与电击转化：将菌液转移至无菌离心管中，冰浴20min。离心收集菌体，用50mL预冷的10％甘油离心洗涤三次。最后用1mL预冷的10％甘油重悬浮菌体，制成感受态细胞。取200μL感受态细胞与10μL敲除片段混匀，转移至预冷的电转杯中。设置电压为2500kV，脉冲为25μF，控制器为200Ω。电击完成后立即向电转杯中加入1mLSOC培养基，混匀后转入EP管中，30℃200rpm培养1h。然后将电转化液离心取菌体，涂布于含50μg/mL kana的LB平板，挑取单菌落用检测引物PCR验证结果。42℃培养16～24h，此时，pKD46丢失。

利用引物pglB-F和pglB-R合成pglB基因

将malE_mut-178,341基因和pglB基因通过酶切连接先后构建到同一质粒pBAD24中，即pPM。然后转化进入E.coli O86:K61:B7/ΔwaaL中。具体方法参见《精编分子生物学实验指南》(第四版)。

糖蛋白的表达和检测

PglB介导的大肠杆菌糖蛋白合成系统构建好之后，该工程菌即可用于表达糖蛋白。以已改造好的具有糖蛋白合成系统的E.coli O86ΔwaaL/pPM为例，具体步骤如下：

1)PglB与MBP-Mut在E.coli O86ΔwaaL/pPM中的表达。将E.coli O86ΔwaaL/pPM接种于5mL含100μg/mL Amp LB液体培养基中，37℃ 250rpm培养过夜；以1％接种量将菌转接于100mL含100μg/mL Amp LB液体培养基中，37℃ 250rpm培养至OD600＝0.6，加入终浓度为0.2％L-阿拉伯糖，16℃ 250rpm继续培养20h，诱导PglB及MBP-Mut表达，制得L-阿拉伯糖诱导表达的E.coli O86ΔwaaL/pPM全细胞蛋白。

2)将L-阿拉伯糖诱导表达的E.coli O86ΔwaaL/pPM全细胞蛋白进行SDS-PAGE后转膜，以购买的Anti-His antibody为一抗(购于Clontech公司)，以辣根氧化酶标记的羊抗小鼠IgG为二抗进行Western blot检测MBP的糖基化。利用化学发光底物进行显影。Western blot步骤参见《精编分子生物学实验指南》(第四版)。结果如图5所示。

实施例3

麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut的制备方法，包括如下步骤：

(1)设计一对嵌合引物，其序列分别为：

malE-178-1：5’TGTTGCGTTCTGGTC，

malE-178-2：5’GACCAGAACGCAACA；

设计一对模板基因的最远端上下游引物，分别为：

k-waaL-F：CTCGAGAAAAAAAACTGGATAGCGTACTGGAACAGAGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC和

k-waaL-R：TTACTTGTTTTTCATCGCTAATAATAAGCCGGCGTAAACATGGGAATTAGCCATGGTCC；

(2)设计一对嵌合引物，其序列分别为：

malE-341-1：TGTTGCGTTCTGGTCACGCGGATCTTTCACCAACTC和

malE-341-2：GACCAGAACGCAACAATTGCCGCCACTATGGAAAAC；

设计一对模板基因的最远端上下游引物，分别为：

t-waaL-F：GTATGTCTCTTGCAGATTTG和

t-waaL-R：ATGGCGTAACTCAAAGATTC；

本发明所述关于麦芽糖结合蛋白糖基化改造的方法，包括

1)从基因水平上对翻译MBP的malE基因进行分子改造，在malE基因中插入可被PglB识别的氨基酸序列所对应的碱基序列；

2)MBP的插入位点选择为氨基酸序列的178位(N178-N179)和341位(N341-N342)；

3)文献报道PglB可识别的氨基酸序列是D/E-X-N-Z-S/T(X和Z可以是除了组氨酸外的任意常见氨基酸)，我们进一步将X选定为谷氨酰胺，将Z选定为丙氨酸，最终将糖基化序列选定为DQNAT；

4)用于翻译五肽糖基化序列的碱基序列选定为GACCAGAACGCAACA(5’-3’)。

其中：

1)所述对malE基因的改造的方法是：设计一对嵌合引物1和2，其5’端为插入序列且互补(1为5’TGTTGCGTTCTGGTC—，2为5’GACCAGAACGCAACA—)，其3’端序列分别同插入位点两侧的模板基因互补或相同。同时设计一对模板基因的最远端上下游引物，分别为F和R。然后以1和F为引物，以malE基因为模板，合成PCR片段F-1。同理，以2和R为模板，合成片段2-R。最后以PCR片段F-1和2-R混合物作共同模板，以F和R为引物，合成PCR产物。此PCR产物即为在特定位点插入一个五肽糖基化序列的malE突变基因。

2)所述在MBP蛋白178位和341位氨基酸插入糖基化序列的方法是：按照上述malE基因改造的方法先在MBP的N178位插入糖基化序列，然后以此malE_mut-N178基因为模板，同样按照malE基因改造的方法完成N341位糖基化序列的插入。两次malE基因改造后，即得在N178位和N341位都插入糖基化序列的MBP。

上述基因改造中的PCR反应使用pfu聚合酶，反应条件按说明。

实施例4

糖基化MBP免疫小鼠

(1)实验动物的准备

将3-4周的BALB/C雌性小鼠分为3组，对照组5只，实验一组和二组分别为8只。

(2)免疫用糖基化MBP的准备

L-阿拉伯糖诱导表达的E.coli O86ΔwaaL/pPM全细胞蛋白，按照常规方法进行糖基化MBP蛋白的纯化。方法可参见步骤参见《精编分子生物学实验指南》(第四版)。

(3)免疫程序

a.实验一组的每只小鼠注射糖基化MBP 150μl，分别在7，14，21，35天免疫。

b.实验二组的小鼠注射0.2mg/ml的糖基化MBP 150μl。分别在7，14，21，35天免疫。

c.对照组注射PBS。

(4)血液的采集

每隔10天采集小鼠的血液。处理后，ELISA检测血清中的IgG的含量。

(5)血液的处理：

a.尾部采血

小鼠于小烧杯中固定，将小鼠的尾部自烧杯的底部取出，用灭菌的手术剪剪血困难时，停止采血。将盛有血液的PCR小管室温静置1h，待血清析出，4,000rpm室温离心，收集上清液即可获得小鼠的血清。

b.眼眶采血法。

用拇指和食指捏住小鼠的头部，用小指和无名指固定小鼠的尾部，使小鼠身体侧弯，小鼠的眼球会突出，用灭菌的尖嘴镊子插入小鼠的眼眶，将眼球迅速摘除，用Eppendorf管采集收集到的小鼠血液，室温静置1h，待血清析出后，4,000rpm离心，收集上清液，获得小鼠的抗血清。

2.2.10免疫小鼠的抗体水平的检测

将小鼠的血清提取液100倍稀释，将样本按2n在96孔板中倍比稀释，每孔100μl，每个样本重复两次。ELISA法检测血液中的抗体水平,检测各孔的吸光光度值，将吸光光度值大于对照两倍的孔的稀释度定为抗体的效价。

2.3.8小鼠免疫试验

糖基化MBP能刺激小鼠产生高水平的体液免疫和细胞免疫。在免疫后的第3个周小鼠的抗体水平达到最高值。实验一组效价为12000。实验二组的效价为13000。

通过上述结果分析,糖基化MBP能刺激小鼠产生高水平的体液免疫和细胞免疫。

Claims

1.一种麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut的制备方法，其特征在于，麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括如下步骤：

（1）设计一对嵌合引物，其序列分别为：

malE-178-1：5’TGTTGCGTTCTGGTC，malE-178-2：5’GACCAGAACGCAACA；

设计一对模板基因的最远端上下游引物，分别为：

k-waaL-F：CTCGAGAAAAAAAACTGGATAGCGTACTGGAACAGAGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC和

k-waaL-R：TTACTTGTTTTTCATCGCTAATAATAAGCCGGCGTAAACATGGGAATTAGCCATGGTCC

然后以malE-178-1和k-waaL-F为引物，以malE基因为模板，合成PCR片段k-waaL-F- malE-178-1；然后以malE-178-2和k-waaL-R为模板，合成片段malE-178-2- k-waaL-R；

以PCR片段k-waaL-F- malE-178-1和malE-178-2- k-waaL-R混合物作共同模板，以k-waaL-F和k-waaL-R为引物，合成PCR产物，制得在N178位插入五肽糖基化序列位点的malE突变基因；

（2）设计一对嵌合引物，其序列分别为：

malE-341-1：TGTTGCGTTCTGGTCACGCGGATCTTTCACCAACTC和

malE-341-2：GACCAGAACGCAACAATTGCCGCCACTATGGAAAAC

设计一对模板基因的最远端上下游引物，分别为：

t-waaL-F：GTATGTCTCTTGCAGATTTG和t-waaL-R：ATGGCGTAACTCAAAGATTC

然后以malE-341-1和t-waaL-F为引物，以步骤（1）制得的在N178位插入五肽糖基化序列位点的malE突变基因为模板，合成PCR片段t-waaL-F- malE-341-1；然后以malE-341-2和t-waaL-R为模板，合成片段malE-341-2- t-waaL-R；

以PCR片段t-waaL-F- malE-341-1和malE-341-2- t-waaL-R混合物作共同模板，t-waaL-F和t-waaL-R为引物，合成PCR产物，制得在N178位和N341位都插入五肽糖基化序列位点的malE突变基因。