CN108912214A

CN108912214A - 肠道病毒71型vp1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN108912214A
Application number: CN201810796934.9A
Authority: CN
Inventors: 温红玲; 郝树彬; 马英伟; 陶泽新; 王志玉; 庄志超; 白永娟; 王莉鸿; 李纯
Original assignee: Shandong University; Shandong Quality Inspection Center for Medical Devices
Current assignee: Shandong University; Shandong Quality Inspection Center for Medical Devices
Priority date: 2015-11-27
Filing date: 2015-11-27
Publication date: 2018-11-30
Anticipated expiration: 2035-11-27
Also published as: CN108912214B; CN105294843B; CN108912213A; CN108912213B; CN105294843A

Abstract

本发明属于免疫生物学领域，涉及一种肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用。具体的，涉及一种肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽，其具有如序列表中SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.5任一序列所示的氨基酸序列，或上述序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明还涉及所述免疫原性多肽的制备方法和在制备EV71病毒的诊断试剂中的用途。本发明的免疫原性多肽具有良好的抗原性和免疫原性，为EV71的早期诊断试剂开发和疫苗研发提供了研究基础。

Description

肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于免疫生物学技术领域，具体涉及一种肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用。

背景技术

EV71是单股正链RNA病毒，从属于小RNA病毒科肠道病毒A属，其感染可引起婴幼儿手足口病，发病时主要表现为发热、腹泻及疱疹性咽峡炎。与典型手足口病不同的是，某些EV71毒株感染可引起重症手足口病，并发症包括无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、神经源性肺水肿甚至死亡。EV71感染发病广泛，其流行范围波及亚洲、欧洲、北美洲、澳洲等，死亡率高，是目前颇受重视的公共卫生问题。

多年来，各国学者一直致力于EV71疫苗的研发，随着分子生物学及免疫学等多学科的交叉发展，EV71的重组亚单位疫苗、DNA疫苗、病毒样颗粒疫苗相继问世。其中EV71传统全灭活疫苗发展最为迅速，目前中国有三家机构已完成EV71全灭活疫苗的Ⅲ期临床试验。但全灭活疫苗存在诸多问题，例如免疫效果一般较低，无法诱导细胞毒T淋巴细胞反应，诱导产生的免疫反应持续时间较短，灭活剂对病毒抗原存在影响等；所以亟需研发新型疫苗，在保留完整免疫原性的同时有效刺激免疫应答，同时避免感染。

关于EV71的感染诊断，传统方法包括中和实验法及病毒分离法，以上方法费时费力，实验要求较高，不适于临床应用。近年来，分子生物学检测技术(如逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR))用于诊断EV71感染的应用越来越多，但是此类方法存在假阳性及假阴性，对实验技术要求较高，不易在基层医院开展。而酶联免疫吸附法(ELISA)及免疫层析法(ICA)利用抗原抗体结合的原理进行 EV71的检测，操作简单快速，目前有不少相关研究，但尚未在临床上推广。

EV71可分为A、B、C三个亚型，其中B及C亚型又可分别分为B1-B5及C1-C5型。 EV71仅含一个开放阅读框(open reading frame，ORF)，ORF的上下游分别为5’UTR和3’UTR。基因组RNA全长约含7500个核苷酸，编码具有2193个氨基酸的多聚蛋白，多聚蛋白可以水解为P1、P2、P3三个前体蛋白，最终水解为4个结构蛋白(VP1-VP4)和7个非结构蛋白(2A-2C、 3A-3D)。4个结构蛋白中，VP4包埋于病毒外壳的内侧，其余三个均暴露于病毒颗粒表面，直接接触宿主免疫系统；其中VP1蛋白具有与血清型相对应的遗传多样性，包含EV71主要的抗原决定簇，因此VP1是目前研究的热点之一，已被广泛应用于手足口病的病原检测及疫苗研究。

VP1蛋白的BC loop区(91-106氨基酸位点)是目前公认的中和抗原决定簇位点，但是否还存在其他重要的抗原决定簇尚需进一步的研究论证。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用。将VP1蛋白进行分割，研究各肽段的抗原性及免疫原性，为EV71的早期诊断试剂和疫苗研发提供基础研究。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的一个方面涉及一种肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽，其具有如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5任一序列所示的氨基酸序列，或上述序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明的再一个方面涉及编码上述免疫原性多肽的多核苷酸；具体的，所述多核苷酸的序列分别如SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供含有上述多核苷酸序列的重组载体。

前述的重组载体，其出发载体为pET-49b(+)。

本发明还提供含有上述重组载体的重组表达菌。

前述的重组表达菌，其出发菌株为大肠杆菌DE3。

本发明还提供肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽的表达和纯化方法，其包括如下步骤：

(1)将SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.10所示的基因片段和载体pET-49b(+)，经SpeI及HandⅢ双酶切后，连接构建得到表达载体pET-49b(+)-VP1、pET-49b(+)-VP1^79-432、 pET-49b(+)-VP1^436-864、pET-49b(+)-VP1^436-735和pET-49b(+)-VP1^565-864；

(2)将步骤(1)的表达载体pET-49b(+)-VP1、pET-49b(+)-VP1^79-432、pET-49b(+)-VP1^436-864、 pET-49b(+)-VP1^436-735和pET-49b(+)-VP1^565-864转化至大肠杆菌DE3，筛选阳性克隆，诱导表达重组蛋白；

(3)将步骤(2)的重组蛋白采用谷胱甘肽巯基转移酶(GST)琼脂糖凝胶纯化，即得。

步骤(1)中，SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.10所示的基因片段的构建方法为：以SDLY107 (GenBank:JX244186.1)全长cDNA为PCR模板，以SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.20所示的引物序列为扩增引物，经PCR扩增得到VP1基因全长片段及4段VP1基因片段，分别为VP1、VP1^79-432、VP1^436-864、VP1^436-735和VP1^565-864。

扩增的引物序列具体如下：

SpeI VP1 Primer F：5’-CGGACTAGTGGAGATAGGGTGGCAGATGTAATTG-3’；(SEQ IDNO.11)；

HindIII VP1 Primer R:5’-CCCAAGCTTCTAAAGAGTGGTGATCGCTGTGCG-3’；(SEQ IDNO.12)；

1 VP1 SpeI Primer F:5'-CGGACTAGTATGCCCACAGGCCAGAACACACAGGTGA-3’； (SEQID NO.13)；

1 VP1 HindIII Primer R:5'-CCCAAGCTTCTACCCGGTGGGTGTGCACGCAACAAAA-3’；(SEQ ID NO.14)；

2 VP1 SpeI Primer F:5’-CGGACTAGTATGGTTGTCCCACAATTGCTCCAATATA-3’； (SEQID NO.15)；

2 VP1 HindIII Primer R:5’-CCCAAGCTTCTAACCAGTTGGCTTAATGGAGTTG-3’； (SEQID NO.16)；

3 VP1 SpeI Primer F:5'-CGGACTAGTGTTGTCCCACAATTGCTCCAATA-3’；(SEQ IDNO.17)；

3 VP1 HandIII Primer R:5’-CCCAAGCTTCTAGTACTTGGACTTGGAGGTCC-3’；(SEQ IDNO.18)；

4 VP1 SpeI Primer F:5’-CGGACTAGTCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTC-3’；(SEQ IDNO.19)；

4 VP1 HandIII Primer R:5’-CCCAAGCTTCTAACCAGTTGGCTTAATGGAGTT-3’；(SEQID NO.20)。

本发明还提供上述肠道病毒71型的VP1抗原的免疫原性多肽在制备EV71病毒的诊断试剂中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明在EV71结构蛋白VP1上BC loop区(91-106氨基酸位点)之外发现了新的免疫原性多肽，该多肽具有良好的抗原性和免疫原性，为EV71的早期诊断试剂开发和疫苗研发提供了研究基础。

(2)本发明的免疫原性多肽的表达和纯化方法操作简单、方便、省时，有利于实现大规模的工业化生产。

附图说明

图1：VP1蛋白的表达及鉴定结果；图中，1：蛋白marker；2：未转化过质粒的DE3菌体；3：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达3h；4：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达3h；5：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达4h；6：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达4h；7：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达5h；8：以浓度为0.67mmol/L的IPTG 诱导表达5h。VP1-GST融合蛋白分子量为59kd。

图2：免疫原性多肽VP1^79-432的表达及鉴定结果；图中，1：蛋白marker；2：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达3h；3：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达3h；4：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达4h；5：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达4h；6：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达5h；7：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达5h。 VP1^79-432-GST融合蛋白分子量约为39kd；8：未转化过质粒的DE3菌体。

图3：免疫原性多肽VP1^436-864的表达及鉴定结果；图中，1：蛋白marker；2：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达3h；3：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达3h；4：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达4h；5：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达4h；6：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达5h；7：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达5h。 VP1^436-864GST融合蛋白分子量约为40kd；8：未转化过质粒的DE3菌体。

图4：免疫原性多肽VP1^436-735的表达及鉴定结果；图中，1：蛋白marker；2：未转化过质粒的DE3菌体；3：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达3h；4：以浓度为0.67mmol/L 的IPTG诱导表达3h；5：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达4h；6：以浓度为0.67mmol/L 的IPTG诱导表达4h；7：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达5h；8：以浓度为0.67mmol/L 的IPTG诱导表达5h。VP1^436-735-GST融合蛋白分子量为40kd。

图5：免疫原性多肽VP1^565-864的表达及鉴定结果；图中，1：蛋白marker；2：未转化过质粒的DE3菌体；3：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达3h；4：以浓度为0.67mmol/L 的IPTG诱导表达3h；5：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达4h；6：以浓度为0.67mmol/L 的IPTG诱导表达4h；7：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达5h；8：以浓度为0.67mmol/L 的IPTG诱导表达5h。VP1^565-864-GST融合蛋白分子量为37kd。

图6：纯化的VP1蛋白抗原性检测结果；图中，1：阴性对照；2：纯化后的VP1-GST融合蛋白，VP1-GST融合蛋白分子量为59kd；3：未纯化的VP1-GST融合蛋白；一抗为鼠源抗 EV71血清。

图7：纯化的VP1^79-432蛋白抗原性检测结果；图中，1：未纯化的VP1^79-432-GST融合蛋白，VP1^79-432-GST融合蛋白的分子量约为39kd；2-3：纯化的VP1^79-432-GST融合蛋白；4：阴性对照；一抗为鼠源抗EV71血清。

图8：纯化的VP1^436-864蛋白抗原性检测结果；图中，1：未纯化的VP1^436-864-GST融合蛋白，VP1^436-864-GST融合蛋白的分子量约为40kd；2：纯化的VP1^436-864-GST融合蛋白；3：阴性对照；一抗为鼠源的抗EV71血清。

图9：纯化的VP1^436-735蛋白抗原性检测结果；图中，1：未纯化的VP1^436-735-GST融合蛋白，VP1^436-735-GST融合蛋白的分子量约为40kd；2：纯化的VP1^436-735-GST蛋白；3：阴性对照；一抗为鼠源的抗EV71血清。

图10：纯化的VP1^565-864蛋白抗原性检测结果；图中，1：未纯化的VP1^565-864-GST融合蛋白，VP1^565-864-GST融合蛋白的分子量约为37kd；2：纯化的VP1^565-864-GST蛋白；3：阴性对照；一抗为鼠源的抗EV71血清。

图11：VP1蛋白及免疫原性多肽的免疫原性的鉴定结果；图中，1、2、3分别为EV71病毒，阴性对照及蛋白marker。阴性对照为RD细胞离心后上清。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

下述实施例中所用到的实验材料和试剂如下：

1.实验材料：

1.1细胞、病毒及实验动物

所用细胞为人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma cells，RD)。RD细胞生长至对数生长期时接种EV71 SDLY107病毒，待细胞病变至80％左右时，-40℃和室温之间反复冻融三次后 4℃10,000r/min离心10分钟取上清，收获病毒并储存于-80℃冰箱中。Balb/c小鼠共25只，昆明鼠5只，购自山东大学实验动物中心。

1.2实验试剂

所用主要试剂为病毒RNA提取试剂盒(OMEGA，中国)、逆转录试剂盒(TOYOBO，日本)、DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒(OMEGA，中国)；细胞培养基、血清(HyClone，美国)；LA Taq酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker(Takara，中国)；限制性内切酶、蛋白 Marker(Thermo，美国)；PVDF膜(Millipore,美国)；5×蛋白上样缓冲液(碧云天，中国)； BCA蛋白定量试剂盒(艾德莱，中国)；辣根酶标记山羊抗鼠IgG、浓缩型DAB试剂盒(中杉金桥，中国)；GST单克隆抗体(Proteintech，美国)；TMB单组份显色液(索莱宝，中国)； GST琼脂糖凝胶(康为世纪，中国)；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；测序由上海博尚生物技术公司完成。

实施例1：肠道病毒71型的VP1抗原的免疫原性多肽的表达和纯化

1.扩增EV71 SDLY107株病毒的cDNA

使用OMEGA公司的Viral RNA kit试剂盒提取SDLY107株病毒的RNA，病毒株SDLY107分离自山东省临沂市人民医院死亡的手足口病患儿，经鉴定为强毒株(毒株感染细胞后，细胞病变快而强，动物病理特征明显)，毒株已经进行全序列分析(GenBank:JX244186.1)，使用TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR Kit逆转录生成cDNA。

2.引物设计与PCR扩增

以SDLY107全长cDNA为PCR模板，设计PCR扩增的引物，引物序列如表1所示：

表1引物序列

以SDLY107全长cDNA为PCR模板，SpeI VP1 Primer F为上游引物，HindIII VP1Primer R为下游引物扩增SDLY107毒株的VP1全长基因(如SEQ ID NO.6所示)；以1 VP1SpeI Primer F/1 VP1 HindIII Primer R、2 VP1 SpeI Primer F/2 VP1 HindIII PrimerR、3 VP1 SpeI Primer F/3 VP1 HindIII Primer R及4VP1 SpeI Primer F/4VP1 HindIIIPrimer R为引物扩增4段 VP1基因片段，即：VP1^79-432(如SEQ ID NO.7所示)、VP1^436-864(如SEQ ID NO.8所示)、 VP1^436-735(如SEQ ID NO.9所示)、VP1^565-864(如SEQ ID NO.10所示)。

PCR条件：94℃预变性10min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；72℃终末延伸10min共30个循环。

3.表达载体的构建

SpeI和HindIII双酶切pET-49b(+)载体及“2.引物设计与PCR扩增”中所得DNA片段：SpeI 与HindIII FastDigest enzyme各2μL，DNA片段10μg，10×FastDigest GreenBuffer 5μl，水补齐至50μl，37℃酶切4h。胶回收酶切片段，T4连接酶连接过夜获得重组质粒pET-49b(+)-VP1、 pET-49b(+)-VP1^79-432、pET-49b(+)-VP1^436-864、pET-49b(+)-VP1^436-735、pET-49b(+)-VP1^565-864。

4.VP1蛋白及免疫原性多肽的表达及鉴定

将上述所构建的重组质粒10μL转化至100μL大肠杆菌DE3中，加入LB液体培养基890μL，37℃160rpm 1h后，取100μL菌液均匀涂布于固体琼脂培养基，37℃过夜。次日挑取经卡那霉素(30μg/ml)筛选阳性菌落，接种于5mL LB(含卡那霉素)液体培养基中，37℃160rpm震荡培养过夜；次日按比例1:100接种于新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD值达到0.8-1.0时，加入异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)0.33mmol/L,继续培养4-5h，取1mL菌液，4℃10000r/min离心2min收集菌体，加入80μL磷酸盐缓冲液(PBS)将菌体重悬，上述样品按1：4加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀后沸水浴7min，4℃10000r/min 离心2min，取上清进行电泳后，将菌液蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶粉封闭40min；一抗用兔源的抗GST抗体(1:5000)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后，二抗加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(1:5000)，室温孵育30min,TBST洗膜3次后加DAB显色观察结果。结果分别如图1-图5所示。如图所示，以IPTG浓度为0.33mmol/L，诱导表达4-5h 后，蛋白表达量较高。

5.VP1蛋白及免疫原性多肽的纯化

离心收集IPTG诱导的表达菌体，PBS重悬菌体(每50mL菌体加3mLPBS)，按照1:100比例加入100mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)冰浴中超声破碎，10000r/min离心，弃上清，将沉淀重悬于19.7mL Buffer A(Tris-base：50mM、EDTA：0.5mM、NaCl：50mM、甘油： 5％、DTT5mM)及0.3mL 20％的十二烷基肌氨酸钠(SKL)贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置至包涵体溶解；4℃10000r/min离心10分钟，取上清；加20％聚乙二醇(PEG4000) 210ul及50mM的氧化型谷胱甘肽420ul，加100mM的还原型谷胱甘肽420ul，静置30min至2h，以PBS(pH8.0)透析，然后用抗GST亲和层析柱纯化，操作过程严格遵守说明书。蛋白浓度测定使用BCA蛋白定量试剂盒。

实施例2：VP1蛋白及免疫原性多肽的抗原性鉴定

1.Western Blot法鉴定抗原性：

将实施例1制备的蛋白样品按1:4加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀后沸水浴7min， 4℃10000r/min离心2min，取上清进行电泳后，将菌液蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶粉封闭40min；一抗用鼠源的抗EV71多抗(1:5000)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后，二抗加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(1:5000)，室温孵育30min，TBST洗膜3次后加DAB显色观察结果。同时将pET-49b(+)空载体转化至DE3大肠杆菌诱导表达产物作为阴性对照。结果分别如图6-图10所示。如图所示，蛋白纯化效果较好，经鉴定，纯化的蛋白均具有抗原性。

2.ELISA法鉴定抗原性：

将实施例1制备的蛋白样品包被于ELISA包被板上，每种蛋白设立两个稀释度，使用包被缓冲液进行稀释(包被缓冲液：每1L蒸馏水中含Na₂CO₃:1.59g,NaHCO₃:2.93g)，第一个稀释度蛋白浓度为：2.08×10^-2mg/mL，第二个稀释度蛋白浓度为：1.04×10^-2mg/mL；蛋白包被后 4℃过夜；次日PBST洗板3次，每次3min；5％牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭1h；PBST洗板3次，每次3min；一抗用鼠源的抗EV71多抗(1：5000)37℃孵育2h；PBST洗板6次，每次3min；二抗加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(1：5000)，37℃孵育1h； PBST洗板6次，每次3min；TMB单组份显色液显色。同时将pET-49b(+)空载体转化至DE3 大肠杆菌诱导表达产物作为阴性对照。检测结果如表2所示。

表2 ELISA法鉴定抗原性检测结果

如表2所示，以GST蛋白为阴性对照，无论稀释度1或稀释度2，VP1抗原及其免疫原性多肽的A值较GST蛋白的A值有2倍以上增长，鉴定为阳性结果，即所纯化的蛋白具有抗原性。

实施例3：VP1蛋白及免疫原性多肽的免疫原性的鉴定

将实施例1纯化后的VP1蛋白及免疫原性多肽与弗氏佐剂按照体积比1:1比例混匀后免疫Balb/c小鼠，每种蛋白免疫5只小鼠，共免疫4次。初次免疫1.0mg蛋白加弗式完全佐剂， 2周后免疫0.5mg蛋白加弗氏不完全佐剂，之后间隔1周连续免疫0.5mg蛋白加弗氏不完全佐剂两次，于末次免疫一周后摘眼球取血；同时使用pET-49b(+)空载体表达蛋白免疫小鼠取血作为阴性对照。Western Blot检测血清与EV71病毒是否能够发生特异性反应，以检测蛋白免疫原性。结果如图11所示。

如图所示，将RD细胞培养的EV71病毒加入聚丙烯酰胺凝胶的上样孔内，将RD细胞离心所得上清加入上样孔内作阴性对照，以纯化的VP1蛋白及其多肽免疫BALB/c小鼠后所得血清为一抗，EV71病毒、VP1-GST融合蛋白、VP1^79-432-GST融合蛋白、VP1^436-864GST融合蛋白、VP1^436-735-GST融合蛋白及VP1^565-864-GST融合蛋白免疫小鼠后所得血清能与EV71病毒发生特异性结合，图中所示条带分子量约为35KD(EV71结构蛋白VP1)；GST蛋白免疫小鼠所得血清也能与EV71病毒发生特异性结合，但是图中所示条带分子量大小非EV71结构蛋白VP1；PBS免疫小鼠所得血清与EV71病毒无特异性结合(阴性对照)。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

山东省医疗器械产品质量检验中心

<120> 肠道病毒71型的VP1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用

<130> 2015

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 297

<212> PRT

<213> SDLY107株VP1氨基酸序列

<400> 1

Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser Ile Gly Asp Ser Val

1 5 10 15

Ser Arg Ala Leu Thr His Ala Leu Pro Ala Pro Thr Gly Gln Asn Thr

20 25 30

Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys Val Pro Ala Leu Gln

35 40 45

Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Ser Met Ile

50 55 60

Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr Thr Leu

65 70 75 80

Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Glu Ile Asp Leu Pro

85 90 95

Leu Lys Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala Asn Trp Asp Ile Asp

100 105 110

Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr Tyr

115 120 125

Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr Gly

130 135 140

Glu Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala

145 150 155 160

Pro Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn

165 170 175

Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val

180 185 190

Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr

195 200 205

Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Ala

210 215 220

Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Thr

225 230 235 240

Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met Lys

245 250 255

His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn Tyr Leu

260 265 270

Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser Ile Lys Pro Thr Gly

275 280 285

Ala Ser Arg Thr Ala Ile Thr Thr Leu

290 295

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> VP1抗原的免疫原性多肽（基因79-432所对应的氨基酸序列）

<400> 2

Pro Thr Gly Gln Asn Thr Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly

1 5 10 15

Lys Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala

20 25 30

Ser Asp Glu Ser Met Ile Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser

35 40 45

Thr Ala Glu Thr Thr Leu Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val

50 55 60

Gly Glu Ile Asp Leu Pro Leu Lys Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr

65 70 75 80

Ala Asn Trp Asp Ile Asp Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys

85 90 95

Val Glu Leu Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val

100 105 110

Ala Cys Thr Pro Thr Gly

115

<210> 3

<211> 143

<212> PRT

<213> VP1抗原的免疫原性多肽（基因436-864所对应的氨基酸序列）

<400> 3

Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala Pro

1 5 10 15

Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro

20 25 30

Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val Pro

35 40 45

Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro

50 55 60

Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Ala Cys

65 70 75 80

Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Thr Ser

85 90 95

Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met Lys His

100 105 110

Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn Tyr Leu Phe

115 120 125

Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser Ile Lys Pro Thr Gly

130 135 140

<210> 4

<211> 100

<212> PRT

<213> VP1抗原的免疫原性多肽（基因436-735所对应的氨基酸序列）

<400> 4

Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala Pro

1 5 10 15

Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro

20 25 30

Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val Pro

35 40 45

Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro

50 55 60

Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Ala Cys

65 70 75 80

Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Thr Ser

85 90 95

Lys Ser Lys Tyr

100

<210> 5

<211> 100

<212> PRT

<213> VP1抗原的免疫原性多肽（基因565-864所对应的氨基酸序列）

<400> 5

Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe

1 5 10 15

Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu

20 25 30

Glu Tyr Gly Ala Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg

35 40 45

Thr Val Gly Thr Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile Tyr

50 55 60

Met Arg Met Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn

65 70 75 80

Gln Asn Tyr Leu Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser Ile

85 90 95

Lys Pro Thr Gly

100

<210> 6

<211> 891

<212> DNA

<213> VP1全长基因

<400> 6

ggagataggg tggcagatgt aattgaaagt tccataggag atagcgtgag cagagccctc 60

actcacgctc taccagcacc cacaggccag aacacacagg tgagcagtca tcgactggat 120

acaggcaagg ttccagcact ccaagctgct gaaattggag catcatcaaa tgctagtgac 180

gagagcatga ttgagacacg ctgtgtcctt aactcgcaca gtacagctga gaccactctt 240

gatagtttct tcagtagggc gggattagtt ggagagatag atctccctct taagggcaca 300

actaacccaa atggttatgc caactgggac atagatataa caggttacgc gcaaatgcgt 360

agaaaggtag agctattcac ctacatgcgc tttgatgcag agttcacttt tgttgcgtgc 420

acacccaccg gggaagttgt cccacaattg ctccaatata tgtttgtgcc acccggagcc 480

cctaagccag attctaggga atcccttgca tggcaaaccg ccactaaccc ctcagttttt 540

gtcaagctgt cagaccctcc tgcgcaggtt tcagtgccat tcatgtcacc tgcgagtgct 600

tatcaatggt tttatgacgg atatcccaca ttcggagaac acaaacagga gaaagatctt 660

gaatacgggg catgtcctaa taacatgatg ggcacgttct cagtgcggac tgtggggacc 720

tccaagtcca agtacccttt agtggttagg atttacatga gaatgaagca cgtcagggcg 780

tggatacctc gcccgatgcg taaccagaac tacctattca aagccaaccc aaattatgct 840

ggcaactcca ttaagccaac tggtgccagt cgcacagcga tcaccactct t 891

<210> 7

<211> 354

<212> DNA

<213> VP1（79-432）基因

<400> 7

cccacaggcc agaacacaca ggtgagcagt catcgactgg atacaggcaa ggttccagca 60

ctccaagctg ctgaaattgg agcatcatca aatgctagtg acgagagcat gattgagaca 120

cgctgtgtcc ttaactcgca cagtacagct gagaccactc ttgatagttt cttcagtagg 180

gcgggattag ttggagagat agatctccct cttaagggca caactaaccc aaatggttat 240

gccaactggg acatagatat aacaggttac gcgcaaatgc gtagaaaggt agagctattc 300

acctacatgc gctttgatgc agagttcact tttgttgcgt gcacacccac cggg 354

<210> 8

<211> 429

<212> DNA

<213> VP1（436-864）基因

<400> 8

gttgtcccac aattgctcca atatatgttt gtgccacccg gagcccctaa gccagattct 60

agggaatccc ttgcatggca aaccgccact aacccctcag tttttgtcaa gctgtcagac 120

cctcctgcgc aggtttcagt gccattcatg tcacctgcga gtgcttatca atggttttat 180

gacggatatc ccacattcgg agaacacaaa caggagaaag atcttgaata cggggcatgt 240

cctaataaca tgatgggcac gttctcagtg cggactgtgg ggacctccaa gtccaagtac 300

cctttagtgg ttaggattta catgagaatg aagcacgtca gggcgtggat acctcgcccg 360

atgcgtaacc agaactacct attcaaagcc aacccaaatt atgctggcaa ctccattaag 420

ccaactggt 429

<210> 9

<211> 300

<212> DNA

<213> VP1（436-735）基因

<400> 9

gttgtcccac aattgctcca atatatgttt gtgccacccg gagcccctaa gccagattct 60

agggaatccc ttgcatggca aaccgccact aacccctcag tttttgtcaa gctgtcagac 120

cctcctgcgc aggtttcagt gccattcatg tcacctgcga gtgcttatca atggttttat 180

gacggatatc ccacattcgg agaacacaaa caggagaaag atcttgaata cggggcatgt 240

cctaataaca tgatgggcac gttctcagtg cggactgtgg ggacctccaa gtccaagtac 300

<210> 10

<211> 300

<212> DNA

<213> VP1（565-864）基因

<400> 10

caggtttcag tgccattcat gtcacctgcg agtgcttatc aatggtttta tgacggatat 60

cccacattcg gagaacacaa acaggagaaa gatcttgaat acggggcatg tcctaataac 120

atgatgggca cgttctcagt gcggactgtg gggacctcca agtccaagta ccctttagtg 180

gttaggattt acatgagaat gaagcacgtc agggcgtgga tacctcgccc gatgcgtaac 240

cagaactacc tattcaaagc caacccaaat tatgctggca actccattaa gccaactggt 300

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cggactagtg gagatagggt ggcagatgta attg 34

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cccaagcttc taaagagtgg tgatcgctgt gcg 33

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cggactagta tgcccacagg ccagaacaca caggtga 37

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cccaagcttc tacccggtgg gtgtgcacgc aacaaaa 37

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cggactagta tggttgtccc acaattgctc caatata 37

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cccaagcttc taaccagttg gcttaatgga gttg 34

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cggactagtg ttgtcccaca attgctccaa ta 32

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cccaagcttc tagtacttgg acttggaggt cc 32

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cggactagtc aggtttcagt gccattcatg tc 32

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cccaagcttc taaccagttg gcttaatgga gtt 33

Claims

1.一种肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽，特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。

2.编码权利要求1所述免疫原性多肽的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.10所示。

3.一种重组载体，其含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的重组载体，特征在于，其出发载体为pET-49b(+)。

5.一种重组表达菌，其含有权利要求4所述的重组载体。

6.如权利要求所述的重组表达菌，特征在于，其出发菌株为大肠杆菌DE3。

7.一种制备权利要求1所述的免疫原性多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将SEQ ID NO.10所示的基因片段和载体pET-49b(+)，经SpeI及HandⅢ双酶切后，连接构建得到表达载体pET-49b(+)-VP1^565-864；

(2)将步骤(1)的表达载体pET-49b(+)-VP1^565-864转化至大肠杆菌DE3，筛选阳性克隆，诱导表达重组蛋白；

(3)将步骤(2)的重组蛋白采用谷胱甘肽巯基转移酶琼脂糖凝胶纯化，即得。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，SEQ ID NO.10所示的基因片段的构建方法为：以SDLY107全长cDNA为PCR模板，以SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20所示的引物序列为扩增引物，经PCR扩增得到。

9.权利要求1所述的免疫原性多肽在制备EV71病毒的诊断试剂中的应用。