CN103320451B - 一种预防ev71基因工程蛋白质疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预防EV71基因工程蛋白质疫苗及其制备方法，属于蛋白工程疫苗技术领域。该疫苗为序列为SEQ ID NO.1所述的预防EV71基因与真核表达载体组成。该疫苗安全性好、生产成本低、预防EV71效果明显。
Description
技术领域
本发明属于蛋白工程疫苗技术领域，具体涉及一种预防EV71基因工程蛋白质疫苗及其制备方法。
背景技术
肠道病毒71型(Enterovirus type71;EV71)自1974年首次分离报道后，许多国家和地区都曾出现EV71的流行。EV71可侵犯多个器官，引起多种临床综合征，除导致手足口病外，还包括无菌性脑膜炎、脑炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病，严重危害儿童健康，可引起社会公众的不安与恐慌，对社会经济产生重大损失。近年来，亚太地区流行的手足口病中EV71所占的比例呈上升趋势，导致该地区手足口病患者越来越严重的中枢神经系统症状。中国内地报告手足口病呈现逐年增多趋势，其中2009年手足口病1155525例，2010年1774669例，2011年1619706例，2012年大幅增加到2118441例，实验室检测结果显示，患者EV71型感染比例超过54%重症和死亡全是EV71病毒感染所致。所报告病例仍以5岁及以下儿童为主(占93.96%)，从近年的疫情情况来看，EV71感染呈现爆发时间早，流行时间长，患者大幅度上升，重症患者比例增多的趋势，因此，EV71防治的形势非常严峻。对于肠道病毒EV71，至今未有有效的治疗药物，而且其感染后发病儿童主要是0－5岁，往往发病突然，病情恶化迅速，往往来不及治疗便发展成为重症因此，开发安全、高效的EN71疫苗已经非常迫切。
目前，国内上已有EV71灭活疫苗进入临床研究阶段，但由于其生产成本高，生产条件及运输储存要求严格，因此不适合大规模生产及在广大农村地区使用。基因工程蛋白疫苗是现代疫苗研究发展的方向，其安全性好，能刺激机体产生足够的免疫反应，此外基因工程蛋白生产成本低，操作简单，适合工业化大生产和运输储存。
现在对EV71疫苗的研究主要集中在核衣壳蛋白VP1区域，研究发现VP1区域N端具有非常重要的抗体中和位点。（145－159aa）是MHC II分子CD4T细胞表位，可刺激机体产生细胞免疫，产生高水平IL-2、IFN同时，其还可以产生高滴度的抗体，抵制不同亚型的EV71感染；（163－177aa）、（208－222aa）肽段刺激机体可产生的抗体，同时，（208－222aa）在各亚型中高度保守。原核表达的全长VP1蛋白可以刺激机体产生抗体和高水平IL-10和IFN－r,小鼠食用表达VP1蛋白的转基因奶和土豆均可以产生针对EV71抗体,VP1(1-100aa)肽段在新城疫病毒中表达，可以刺激机体产生针对VP1的高滴度抗体。我们通过生物信息学软件发现，除了VP1外，VP2，VP3区域也存在抗原性较强的位点，利用杆状病毒表达P1蛋白免疫小鼠后，可以刺激机体产生高水平IFN－r,IL-10，同时产生的高滴度抗体可通过乳汁传给子代新生鼠，使新生鼠可抵抗EV71感染。因此，EV71-P1蛋白是作为EV71疫苗主要成份的首选。但是EV71-P1蛋白作为EV71疫苗主要成份在现有的技术中均没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种安全性好、生产成本低、预防EV71基因工程蛋白质疫苗。
本发明所采用的技术方案是：
一种EV71基因，序列为SEQ ID NO.1。
一种预防EV71基因工程蛋白质疫苗，该疫苗为权利要求1所述的预防EV71基因与真核表达载体组成。
优选地，所述真核表达载体为pPIC9K。
一种权预防EV71基因工程蛋白质疫苗的制备方法，包括以下步骤：
（1）以河南株（gene bank）作为设计模版进行改造，去除P1蛋白中189～309和440～543位氨基酸，同时进行针对毕赤酵母的密码子优化P1基因，改造完成后得到权利要求1所述的基因序列为P1’；
（2）将P1’基因克隆到真核表达载体pPIC9K中，再电转至毕赤酵母GS115中；
（3）将最小葡萄糖培养基（MM）和最小葡萄糖培养基(MD)平板筛选后的菌株，通过不同梯度浓度的新霉素（G418）平板筛选高拷贝菌株；
（4）通过荧光定量实时PCR来确定高拷贝菌株；
（5）通过甲醇利用测试实验，测试高拷贝菌株利用甲醇能力；
（6）通过摇瓶诱导表达测试高拷贝工程菌株分泌表达p1蛋白的水平，得到高产菌株；
（7）对高产菌株连续传代，检测菌株p1蛋白表达水平稳定性；
（8）对高产菌株进行发酵液预处理，发酵液用NaOH调节pH为8.0,在室温下，利用离心机为5000rpm离心15min,取上清液；
（9）取上清液1/2柱体积过G-50葡聚糖凝胶柱，收集不进柱液体；
（10）经过葡聚糖凝胶过柱后液体，用tris碱-氯化钠（tris－Nacl）平衡，使溶液含有20mmol/L tris,50mmol/L NaCl,pH为7.8；
（11）用DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-SFF)离子交换柱平衡液平衡，使柱平衡液中含有20mmol/L tris,50mmol/L NaCl,pH为7.8；
（12）用已经平衡的发酵液过DEAE-SFF离子交换柱，反复上柱3～4次，然后，用0.1～1mol/L NaCl梯度洗脱，使该溶液含有20mmol/L Tris，pH为7.8；
（13）洗脱成份分布收集，目的蛋白收集液在50mmol/L NaCl，20mmol/LTris，pH为7.8溶液中4℃透析18h，最后得到该疫苗。
进一步地，所述步骤（7）中，p1蛋白表达条件优化标准为：
1)菌种复活：1％菌种接种于酵母浸出粉－胰蛋白胨－右旋葡萄糖混合培养基（YPD）培养基,30～32℃，250rpm，培养18～22h；
2)菌种扩大培养：10%菌种接种于基本盐培养基，30～32℃，250rpm，培养42～48h，期间12～16h,22～26h,30～36h补加1％浓度甘油一次，期间通过加入(NH4)2SO4或(NH4)OH调节pH值，使发酵液pH保持在5.0～6.0之间，测量菌体密度，最终菌量达到100～120g/L；
3）诱导蛋白表达适应期：扩大培养第三次补加甘油8h后，温度下调至28－30℃，开始加入甲醇，并使发酵液甲醇浓度保持在0.25%,6～8h；0.5%,12～14h，期间pH保持在5.0～6.0，适应期结束后，菌量达到125～150g/L；
4）蛋白质表达诱导期：温度维持28～30℃，发酵液甲醇浓度保持在0.75%,8～10h;1.2%,80～88h，期间通过加入(NH4)2SO4或(NH4)OH调节pH值，使发酵液pH保持在4.5～5.5之间。
进一步地，所述YPD培养基含0.5%PTM1，2％甘油，1％(NH4)2SO4。
进一步地，所述步骤（3）中的最小葡萄糖培养基中含有0.004%组氨酸。
本发明具有以下优点：
与传统疫苗相比，本发明基因工程蛋白质疫苗其有以下几个优点：（1）安全性好，对人类、动物健康和生态环境都没有潜在的危害，可同时用于不宜使用灭活或减毒疫苗的一些情况，如妊娠妇女；（2）其含有细胞表位及病毒中和位点，能刺激机体产生足够的免疫反应；（3）基因工程蛋白生产成本低，价格低廉，容易被广大人群接收，也适合在农村及城乡接合处手足口病高发区推广；（4）生产工艺简单，操作便捷，容易在工业化大生产中进行操作和控制（5）蛋白制成冻干粉剂后，对外界条件要求不高，方便疫苗的运输和储存。
附图说明
图1为本发明实施例1中抗体水平检测图；
图2为本发明实施例2中抗体中和EV71病毒能力测试图；
图3为本发明实施例4中干扰素－r水平检测图；
图4为本发明实施例4中白介素－10水平检测图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
一种预防EV71基因工程蛋白质疫苗的制备方法，包括以下步骤：
（1）以河南株作为设计模版进行改造，去除P1蛋白中189～309和440～543位氨基酸，同时进行针对毕赤酵母的密码子优化P1基因，改造完成后得到权利要求1所述的基因序列为P1’，所述P1基因改造设计参照的原始的病毒株是Human enterovirus71strain Henan10-08-China(gene bank GU366191.1GI:285013169)；
（2）将P1’基因克隆到真核表达载体pPIC9K中，再电转至毕赤酵母GS115中；
（3）MM,MD平板筛选后的菌株，通过不同梯度浓度的G418平板筛选高拷贝菌株；
（4）通过荧光定量实时PCR来确定高拷贝菌株；
（5）通过甲醇利用测试实验，测试高拷贝菌株利用甲醇能力；
（6）通过摇瓶诱导表达测试高拷贝工程菌株分泌表达p1蛋白的水平，得到高产菌株；
（7）对高产菌株连续传代，检测菌株p1蛋白表达水平稳定性，p1蛋白表达条件优化标准为：
1)菌种复活：1％菌种接种于YPD培养基,0.5%YPD培养基含PTM1，2％甘油，1％(NH4)2SO4，30～32℃，250rpm，培养18～22h；
2)菌种扩大培养：10%菌种接种于基本盐培养基，30～32℃，250rpm，培养42～48h，期间12～16h,22～26h,30～36h补加1％浓度甘油一次，期间通过加入(NH4)2SO4或(NH4)OH调节pH值，使发酵液pH保持在5.0～6.0之间，测量菌体密度，最终菌量达到100～120g/L；
3）诱导蛋白表达适应期：扩大培养第三次补加甘油8h后，温度下调至28－30℃，开始加入甲醇，并使发酵液甲醇浓度保持在0.25%,6～8h；0.5%,12～14h，期间pH保持在5.0～6.0，适应期结束后，菌量达到125～150g/L；
4）蛋白质表达诱导期：温度维持28～30℃，发酵液甲醇浓度保持在0.75%,8～10h;1.2%,80～88h，期间通过加入(NH4)2SO4或(NH4)OH调节pH值，使发酵液pH保持在4.5～5.5之间。
（8）对高产菌株进行发酵液预处理，发酵液为NaOH，调节pH为8.0,在室温下，利用离心机为5000rpm离心15min,取上清液；
（9）取上清液1/2柱体积过G-50葡聚糖凝胶柱，收集不进柱液体；
（10）经过葡聚糖凝胶过柱后液体，用tris－Nacl平衡，使溶液含有20mmol/L tris,50mmol/L NaCl,pH为7.8；
（11）用DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-SFF)离子交换柱平衡液平衡，使柱平衡液中含有20mmol/L tris,50mmol/L NaCl,pH为7.8；
（12）用已经平衡的发酵液过DEAE-SFF离子交换柱，反复上柱3～4次，然后，用0.1～1mol/L NaCl梯度洗脱，使该溶液含有20mmol/L Tris，pH为7.8；
（13）洗脱成份分布收集，目的蛋白收集液在50mmol/L NaCl，20mmol/L Tris，pH为7.8溶液中4℃透析18h，最后得到该疫苗。
对该疫苗进行蛋白免疫原性分析，分别以2ug,20ugEV71-P1蛋白剂量免疫家兔3次，同剂量灭活病毒（C4亚型）同时注射(1,14,28天)，血清25周抗体效价水平变化如图1所示。从抗体检测结果来看，20ugEV71-P1蛋白剂量免疫家兔实验组，免疫5周后开始出现抗体，2ugEV71-P1蛋白剂量免疫家兔实验组第6周才能检测到抗体，但随后2ug和20ug剂量实验组抗体水平变化并无明显区别，所测抗体曲线重合，抗体15周后达到高峰，并且在所测的25周时间范围内，仍然保持高滴度抗体水平。因此P1蛋白免疫机体效果与免疫剂量并无正比关系。2ug与20ug灭活EV71免疫家兔实验组，免疫4周均开始出现抗体，抗体滴度在8－9周到达高峰后开始急剧下降，到18周左右，已经测不到抗体；从图中还可以看到灭活EV71免疫家兔效果与剂量相关，20ug免疫效果明显强于2ug。
实施例2
本实施例1制备得到的疫苗进行血清抗体滴度中和实验，其效果如图2所示。抗体中和实验表明：2ugEV71-P1蛋白剂量免疫家兔实验组最高抗体稀释度可以达到1：32，在检测的20周内可以保持比较高水平稀释度，同剂量灭活EV71免疫组相比，虽然也可以达到1：32比例稀释度，但其抗体滴度下降非常快。
实施例3
本实施例1制备得到的疫苗进行攻毒实验：EV71-P1蛋白2ug剂量免疫Balc鼠（雌）3次，同剂量灭活病毒（C4亚型）同时注射(14,28,60天)雌鼠怀孕后，新生鼠出生8小时内攻毒，实验结果如下：
EV71-P1免疫组：
新生鼠可以同时抵抗B（BrCr）型，C2,C4亚型EV71病毒感染，对不同亚型的病毒株可以形成交叉免疫保护
新生鼠对攻毒量为1x104LD50C2,C4亚型EV71病毒感染,5x103LD50B（BrCr）型EV71病毒感染100%保护
新生鼠对抗攻毒量为5x104LD50C2,C4亚型EV71感染75％保护,1x104LD50B（BrCr）型EV71病毒感染80％保护
灭活EV71实验组：
1）新生鼠可以同时抵抗B（BrCr）型，C2,C4亚型EV71病毒感染，对不同亚型的病毒株可以形成交叉免疫保护
2）新生鼠可抗攻毒量为1x104LD50B型（BrCr）,C2,C4亚型EV71病毒感染100%保护
3）新生鼠对抗攻毒量为5x104LD50,B型（BrCr）,C2,C4亚型EV71感染40％保护,B型（BrCr）EV71病毒感染50％保护
从实验结果可得出，EV71-P1蛋白免疫母鼠后，母鼠体内产生的抗体可以使新生鼠抵抗EV71病毒的感染（1X104LD50）。
实施例4
本实施例1制备得到的疫苗进行刺激细胞因子水平检测：EV71-P1蛋白10ug剂量免疫Balc鼠2次，检测血液中相关细胞因子水平结果如图3至图4所示。从细胞因子检测结果显示，P1蛋白免疫小鼠后，其体内IFN-r,IL－10,水平与灭活病毒及空白对照相比明显增高，有显著性差别，IL-10水平与空白对照相比明显增高，但比灭活病毒免疫组稍低，但并无显著性差异。结果表明，EV71-P1蛋白可以有效刺激Th1,Th2类免疫途径。
与传统疫苗相比，本发明工程蛋白作为疫苗其有以下几个优点：（1）安全性好，对人类、动物健康和生态环境都没有潜在的危害，可同时用于不宜使用灭活或减毒疫苗的一些情况，如妊娠妇女；（2）其含有细胞表位及病毒中和位点，能刺激机体产生足够的免疫反应；基（3）因工程蛋白生产成本低，价格低廉，容易被广大人群接收，也适合在农村及城乡接合处手足口病高发区推广；（4）生产工艺简单，操作便捷，容易在工业化大生产中进行操作和控制（5）蛋白制成冻干粉剂后，对外界条件要求不高，方便疫苗的运输和储存。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
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1.一种EV71基因，其特征在于，序列为SEQ ID NO.1。
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| EV71类病毒颗粒的表达和免疫原性的初步评价;郭莉莉 等;《中国生物工程杂志》;20130131;第33卷(第1期);8-13 * |
| GenBank: GU366191.1;Jiang,T. et al.;《GenBank》;20110307;1-3 * |
| 肠道病毒71型病毒样颗粒的制备、纯化与鉴定;蒋维;《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20101015(第10期);1-63 * |
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