BR112013017171B1

BR112013017171B1 - composição combinada heptavalente estável

Info

Publication number: BR112013017171B1
Application number: BR112013017171A
Authority: BR
Inventors: Gopinathan Kuppuswamy; Vijayanand Thiagarajan
Original assignee: Bharat Biotech International Limited
Priority date: 2011-01-05
Filing date: 2012-01-03
Publication date: 2019-12-17
Also published as: EP3459562A1; ZA201304606B; US20130280293A1; RU2013136397A; WO2012093406A2; RU2016150422A3; US10092640B2; CN103442730B; CN103442730A; WO2012093406A3; RU2705163C2; EP2661277A2; RU2016150422A; BR112013017171A2; EP3459562B1

Abstract

vacina de combinação imunogênica estável, processo de preparação de vacina de combinação estável, método de uso de moléculas antigênicas e método de administração a indivíduos humanos a presente invenção fornece uma composição imunogênica estável para prevenção e profilaxia de infecções causadas por rotavírus, vírus da poliomielite, haemophilus influenza, hepatite b, corynebacterium diphtheriae, clostridium tetani, bordatella pertusis (acelular) em uma única vacina combinada. a presente invenção também fornece uma composição imunogênica bivalente contra rotavírus e vírus da pólio. também é descrito o processo de elaboração dessas composições dos antígenos multivalentes. a presente invenção também se refere à produção e uso dessas vacinas para profilaxia contra as infecções mencionadas acima.

Description

COMPOSIÇÃO COMBINADA HEPTAVALENTE ESTÁVEL

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a uma vacina de combinação imunogênica estável para profilaxia e tratamento de quai squer genótipos ou variantes antigênicas de rotavírus , poliomielite , coqueluche , hepatite B, Haemophilus influenzae, difteria e infecções tetânicas. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a uma vacina de combinação imunogênica estável para profilaxia e tratamento contra quaisquer ge nó t ipo s ou va r i ant e s antigênicas de rotavírus , poliomielite , coqueluche , hepat i te B , Ha emophi l us infl uenzae , difteria e infecções tetânicas, em que nenhum dos antígenos componentes individuais é impedido pela presença de outros antígenos componente s , de forma a conferir título de anticorpo equivalente ou superior ao critério de soroproteção para cada componente antigênico. A presente invenção também fornece uma composição de vacina bivalente para imunizar bebês contra infecções por rotavírus e poliomielite.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A vacinação é uma ferramenta importante para manipulação de programas de assistência médica em países de senvolvidos e em de senvolvimento . A quantidade de vacinas recomendadas aumentou significativamente nos últimos anos contra infecções individuais. O cronograma de bebês e crianças pode agora exigir mais de 24 a 25 doses separadas de vacinas para imunização efetiva contra doenças mortais.

Uma vacina de combinação que pode fornecer

Petição 870190077863, de 12/08/2019, pág. 7/16

2/47 imunogenicidade contra uma grande variedade de doenças é sempre vantajosa sobre as vacinas monovalentes. Não podemos reduzir a quantidade de imunizações exigidas em crianças e bebês para protegê-los de diversas doenças fatais, mas o cumprimento pode ser aprimorado reduzindo-se a quantidade de vacinações separadas. Vacina combinada é vantajosa com relação a vacinas monovalentes, pois ela não apenas aumenta o cumprimento, mas também é eficaz para seu custo e conveniente, de forma a reduzir as possibilidades de falta de alguma vacina. Devido a complicações associadas à preparação dessas vacinas de combinação, como a estabilidade dessas vacinas de combinação devido à possível interação entre os antígenos, entretanto, isso sempre foi um desafio para a comunidade cientifica.

Desta forma, o cenário global atual exige um mètodõ mais eficaz, aceitável, eficaz para seu custo e confiável de imunização contra muitas doenças fatais. A disponibilidade de vacinas de combinação que contêm antígenos protetores contra a maior parte das doenças, para as quais a imunização universal é recomendada na infância, ajuda a simplificar a implementação, aumentar a aceitação, reduzir o custo global de programas de imunização e melhorar o controle da doença. Fatores de custo, conveniência e atendimento contribuem, portanto, com o maior uso de vacinas de combinação em comparação com vacinas monovalentes. Isso pode aumentar os pacientes ou populações sem atendimento ou a falta de comparecimento frequente (Rumke, 1994) .

O desenvolvimento de vacinas niultivalentes capazes de proteger contra difteria (D), tétano (T), coqueluche (P), poliomielite, hepatite B e Haemophilus influenzae do tipo b (Hib) foi um processo evolucionário iniciado na década de 1950,

3/47 quando toxoides de difteria e tétano foram multivalentes pela primeira vez com a vacina contra a coqueluche de células inteiras (wP) desativadas (Mallet et al, 2004). O uso de hemaglutitinina filamentosa e toxina de coqueluche desativada e desintoxicada (PT+HFA) como componentes de vacina contra coqueluche acelular foi descrito em Robinson, A., Gorrige, A. R., Funnell, S. G. P. e Fernandez, M. (1989), Serospecific Protection of Mice against Infection with Bordetella pertussis, Vaccine 7: 321-324. Vacinas que combinam antigenos de difteria, tétano e coqueluche são disponíveis e amplamente empregadas há mais de sessenta anos. Também foram desenvolvidas vacinas de combinação quadrivalentes e pentavalentes expandidas que incluem vacina contra Haemophilus influenzae do tipo b. Combinações pentavalentes que incluem DPT-Hib-Hepatite B (HB) são utilizadas em diversos países desenvolvidos e em desenvolvimento.

Algumas das vacinas com múltiplos componentes disponíveis comercialmente até aqui são mencionadas abaixo.

Tripedia® da Sanofi Pasteur é uma vacina contra difteria, tétano e coqueluche acelular (tosse convulsa) (DaPT). Ela é aprovada pela FDA para uso em bebês e crianças até sete anos de idade. Ela também é aprovada para mistura com ActHIB®, vacina contra Haemophilus influenzae do tipo b (vacina Hib) para crianças com 15 a 18 meses de idade (Trihibit®).

Daptacel®, também da Sanofi Pasteur, é uma vacina adsorvida contra coqueluche acelular e toxoides de tétano e difteria (DaPT) aprovada para imunização rotineira em bebês e crianças com seis semanas até seis anos de idade. Ela é administrada por meio de injeção intramuscular em quatro doses consecutivas da série de imunização de cinco doses. As quatro

4/47 doses são administradas em cerca de dois meses, quatro meses, seis meses e seis meses após a terceira dose.

Uma vacina Kinrix® para vírus da pólio desativado por DaPT (IPV) vem sendo comercializada fora dos Estados Unidos desde 1996, o que é equivalente a obter as vacinas DTaP e IPV como vacinas separadas com o amplificador MMR em quatro a seis anos de idade da criança.

Vacinas pentavalentes a serem mencionadas são Pediarix® (vacina adsorvida contra coqueluche acelular e toxoides de tétano e difteria, hepatite B (recombinante) e vírus da pólio desativado combinada) e Pentacel®, uma vacina DTaP-IPV/Hib que vem sendo utilizada desde 1997 como vacina combinada a ser administrada a crianças em uma série de quatro doses, com as doses primárias em dois, quatro e seis meses e uma dose amplificadora em quinze a dezoito meses.

Infanrix® hexa da GlaxoSmithKline, administrada por via intramuscular, é uma vacina conjugada contra a difteria, tétano, coqueluche acelular, hepatite B (HB), poiiomielite desativada e Haemophilus influenzae do tipo b (Hib), indicada para vacinação primária e amplificadora de bebês. Infanrix hexa deverá ser administrada como um curso de vacinação primária de duas ou três doses em bebês com até seis meses de idade, inclusive, seguido por vacinação amplificadora entre 11 e 18 meses de idade, com intervalo de pelo menos seis meses ente a última dose de vacinação primária e a dose amplificadora. Um estudo detalhado da imunogenicidade e segurança de uma nova vacina combinada hexavalente líquida em comparação com a administração separada de vacinas licenciadas de referência em bebês foi publicado por Mallet, E., Fabre, P., Pines, E. et al, Pediatr. Infect. Dis. J. 2000; 19: 1119-27. Desta forma,

5/47 vacinas hexavalentes vêm sendo utilizadas em diversos países europeus, bem como nos Estados Unidos, e podem fornecer imunização apenas contra seis doenças importantes da infância com uma única injeção. É desejável que uma vacina de combinação inclua antígenos adicionais a antigenos hexavalentes, de tal forma que uma única vacinação possa incluir imunização contra outras doenças sérias, tais como rotavirus.

Rotavirus é a causa principal de doenças de diarréia severa em bebês e crianças jovens em todo o mundo. Cerca de 600.000 crianças morrem todos os anos de infecções por rotavirus, com mais de 80% de todas as mortes relacionadas a rotavirus ocorrendo em países pobres em recursos do sul da Ásia e da África subsaariana. A presente invenção ensina uma combinação inovadora de D-aP-T-Hib-HepB-IPV e antígenos de rotavirus desativados (IRV) em uma composição de vacina de combinação heptavalente estável.

Todas as vacinas de rotavirus que entraram em testes clínicos em crianças foram linhagens orais vivas e várias delas tiveram eficácia comprovada e foram aprovadas para uso. Nenhuma dessas vacinas, entretanto, foi testada na população alvo de países pobres da África e da Ásia, onde o rotavirus permanece causa importante de mortalidade infantil. Uma desvantagem substancial, entretanto, da vacina viva oral é o fato de que ela causa eventos adversos, tais como intussuscepção e os rotavirus exibem enorme diversidade (Human Vaccines 4: 3, 143147: 2008). Na presente invenção, também buscamos uma estratégia alternativa de desenvolvimento de vacina de rotavirus desativada (IRV) e esse antígeno rota como parte de vacina infantil de combinação com antígeno Sabin do tipo I, II e III combinado como uma vacina de combinação divalente

6/47 inovadora. A linhagem celular utilizada para a propagação do rotavirus são as células vero, pois essas células possuem ampla sensibilidade a diversos tipos de virus e são amplamente empregadas na produção de vacinas virais humanas. Vacinas de rotavirus não são disponíveis no estado da técnica na forma de vacinas injetáveis até agora. Todas as vacinas de rotavirus disponíveis são administradas por via oral. É desejável, portanto, incluir um antígeno de rotavirus que confira imunidade contra quaisquer linhagens de rotavirus em forma injetável em combinação com outros antígenos.

WO 1993/024148 descreve uma invenção de vacina multivalente que contém os antígenos IPV-DPT-Hib-Hepatite B em que DTP é adsorvido em hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio e Hib é adsorvido apenas em fosfato de alumínio, em que o antígeno Hib é utilizado de forma extemporânea por meio de mistura dos outros antígenos pouco antes da administração. WO 1997/00697 descreve uma vacina multivalente contra DPT-Hib e coqueluche adsorvida em fosfato de alumínio, em que um recipiente contém uma vacina seca por congelamento e o outro recipiente compreende um segundo antígeno.

WO 1998/000167 descreve uma vacina de antígeno D-TaP-IPV-Hib e WO 1999/13906 descreve uma vacina com múltiplos componentes na qual certos componentes podem ser reconstituídos a partir de um estado liofilizado pelos outros componentes da vacina ou podem existir em uma solução isolada e administra-se a vacina em um recipiente especialmente projetado no momento de realização da vacinação.

WO 2000/07623 descreve uma composição de vacina com múltiplos componentes que contém componentes de vacina contra a coqueluche acelular (PT e FHA), toxoide de difteria (DT),

7/47 toxoide de tétano (TT), um conjugado de polissacarídeo capsular de Haemophilus influenze tipo b e toxoide de tétano ou toxoide de difteria (Hib), Hepatite B Superfície Ag (HBsAg) e vírus da pólio desativado (IPV) que podem estar em uma única solução ou certos componentes podem ser reconstituídos de um estado liofilizado pelos outros componentes da vacina. WO 2002/000249 descreve um polissacarídeo capsular de H. influenza b não adsorvido sobre um sal adjuvante de alumínio e dois ou mais polissacarideos bacterianos adicionais que podem incluir coqueluche de células inteiras, toxoide de tétano, toxoide de difteria, antígeno da superfície de hepatite B (HbsAg) e/ou polissacarideos conjugados de N. menigitides tipo A, B ou C na forma de antígenos em uma única vacina trivalente e/ou quadrivalente. WO 2006/097851 descreve uma vacina multivalente que pode ser preparada de forma extemporânea no momento do uso por meio da mistura de dois componentes, em que o primeiro componente compreende antígenos D, T, wP e HBsAg e um segundo componente compreende um conjugado de Hib e um ou mais conjugados meningocócicos. WO 2007/054820 refere-se a uma composição de vacina em que os antígenos D, T e aP são especificamente adsorvidos sobre hidróxido de alumínio e os antígenos Hib e Hep B são adsorvidos sobre fosfato de alumínio que não existe em uma composição estável totalmente líquida.

A Patente Norte-Americana 6.333.036 discorre sobre uma vacina multivalente que utiliza polissacarídeo conjugado de Hib fosfato de polirribosilribitol (PRP) adosrvido a fosfato de alumínio que inclui antígenos D, T e aP. 0 antígeno Hep B é adsorvido a hidróxido de alumínio e não é uma composição totalmente líquida para formar uma vacina multivalente.

A Patente Européia 1028750 ensina uma vacina

8/47 multivalente que possui D, T, aP adsorvidos a fosfato de alumínio e o antigeno Hep B não é adsorvido a hidróxido de alumínio e também não existe em uma composição liquida estável isolada para formar uma vacina combinada.

Embora a erradicação da poliomielite do mundo ocidental e seu declínio global seja resultado do uso bem sucedido da vacina contra a pólio oral (OPV) na maior parte do mundo (Plotkin, 1995), o risco potencial de poliomielite paralítica associada à vacina (VAPP) com OPV levou muitos países a mudar para o uso de IPV para imunização rotineira. Algumas outras publicações do estado da técnica neste campo são Plotkin, S. A., Inactivated Poliomyelitis Vaccine for the United States: a Missed Vaccination Opportunity, Pediatr. Infect. Dis. J. 1995; 14: 835-9 e Rümke, H. C., Are Different Combined Vaccines Needed in Different Parts of Europe? A Point of View From a Northern European Country, Biologicals 1994; 22: 425-7. Todos os pedidos de patente detalhados acima possuem diferentes adjuvantes para diferentes antígenos e não estão presentes na forma de composição líquida isolada em uma única ampola.

WO 2008/044611 descreve um método de preparação de uma vacina IPV-DPT misturada que compreende um vírus da pólio Sabin desativado das linhagens do tipo I, II e III cultivado em células Vero, um antigeno protetor contra Bordetella pertussis, um toxoide de difteria e um toxoide do tétano, o que envolve a etapa de produção de uma linhagem de vírus da pólio Sabin que possui alto título.

Todos os pedidos de patente mencionados acima necessitam da reconstituição dos componentes individuais antes da administração da vacina. Eles não podem ser denominados

9/47 combinados no sentido literário do termo, mas podem ser denominados vacinas multivalentes para conferir imunidade contra, no máximo, seis antígenos. A mistura de componentes antigênicos antes da administração de diferentes ampolas resulta na redução do título do anticorpo contra qualquer antígeno específico devido à interferência de interações antigênicas. A publicação norte-americana 2011/0206726A1 ensina uma vacina de combinação hexavalente totalmente líquida que compreende antígenos D-T-aP-IPV, Hep B e Hib, em que Hib não é substancialmente adsorvido a nenhum adjuvante, D-T-aP é adsorvido a hidróxido de alumínio e Hep B é adsorvido a fosfato de alumínio em uma única ampola. Ela também especifica que a competição antigênica nessas vacinas multivalentes frequentemente resulta em redução da reação a certos antígenos individuais. O pedido de patente reconhece um problema inerente de mistura de vacinas liofilizadas com vacinas líquidas, o que representa uma restrição suplementar para os médicos e envolve a possibilidade de sua má condução. Ele também reconhece que o uso de seringas com múltiplos compartimentos que possuem câmaras separadas para vacinas líquidas e liofilizadas é de execução muito difícil e nenhuma redução dos custos de produção da vacina é possível e, consequentemente, também nenhuma redução do custo de imunização. Embora esse pedido descreva uma vacina de combinação líquida em uma única ampola, ele não descreve uma composição de vacina combinada que contém até sete antígenos diferentes. Ele não menciona a concessão de proteção ou imunidade a infecções causadas por rotavirus na composição de vacina combinada.

Na presente invenção, portanto, foi possível desenvolver essa vacina heptavalente de combinação que pôde

10/47 também fornecer proteção contra vírus da pólio, rotavirus, Haemophilus influenzae, hepatite B, difteria, tétano e coqueluche acelular por meio de administração utilizando uma única vacina combinada. A presente invenção supera as limitações do estado da técnica por meio do fornecimento de uma vacina heptavalente de combinação estável (vírus da pólio desativado (Sabin), rotavírus desativado, Haemophilus influenzae do tipo b, antígeno da superfície da hepatite B, difteria, tétano e coqueluche (aP) ) , que permite a vacinação contra poliomielite, rotavírus, Hib, hepatite B, difteria, tétano e coqueluche por meio de uma única injeção que é estável e atende aos critérios de soroproteção efetiva contra cada um dos antígenos com interferência antigênica mínima na vacina combinada.

OBJETO DA INVENÇÃO

O objeto principal da presente invenção é o de fornecer uma vacina heptavalente de combinação que induz a imunogenicidade em seres humanos contra pelo menos sete doenças.

Outro objeto da presente invenção é o de fornecer uma vacina heptavalente de combinação totalmente estável que permite a vacinação contra poliomielite, rotavirus, Hib, hepatite B, difteria, tétano e coqueluche por meio de uma única inj eção.

Outro objeto da presente invenção é o de fornecer uma vacina heptavalente de combinação estável (IPV-IRV-Hib-HBsAgDPT) que compreende vírus da pólio desativado (Sabin tipo I, II, III), rotavírus desativado, linhagem 116E, Haemophilus influenzae tipo b, antígeno da superfície de hepatite B e antígenos de difteria, tétano e coqueluche (aP) em uma única

11/47 vacina combinada.

Um objeto adicional da presente invenção é o fornecimento de um método de preparação de uma vacina heptavalente de combinação de vírus da pólio desativado (Sabin tipo I, II, III), rotavirus desativado, Haemophilus influenzae tipo b, antigeno da superfície da hepatite B (HBsAg), difteria, tétano e coqueluche (aP).

Ainda outro objeto da presente invenção é o fornecimento de uma vacina de combinação inovadora bivalente de vírus da pólio desativado e rotavirus desativado para evitar e tratar infecções com rotavirus e poliomielite em crianças em uma única vacina combinada.

Um objeto adicional da presente invenção é o de

fornecer um método de preparação de	vacina	bivalente	de
combinação.
RESUMO DA INVENÇÃO
Consequentemente, a presente	invenção	fornece uma
vacina de combinação imunogênica estável para	profilaxia	e

tratamento contra quaisquer genótipos ou variantes antigênicas de rotavirus, poliomielite, coqueluche, hepatite B, Haemophilus influenzae, difteria e infecções tetânicas, em que nenhum dos antígenos componentes individuais é impedido pela presença de outros antígenos componentes, de forma a conferir título de anticorpo equivalente ou superior ao critério de soroproteção para cada componente antigênico.

A vacina de combinação de acordo com a presente invenção compreende uma mistura de antígenos para proteção contra doenças tais como difteria, tétano, coqueluche e infecções causadas por Haemophilus influenzae, hepatite B, vírus da pólio e rotavirus. A presente invenção refere-se

12/47 particularmente a uma composição de vacina heptavalente estável totalmente líquida inovadora adsorvida em fosfato de alumínio que compreende:

i. três tipos de vírus da pólio desativados (tipo 1, 2, 3) ;

ii. rotavirus desativado de fita simples (116E), adsorvido;

iii. conjugado de PRP de Haemophilus influenza tipo b conjugado a TT;

iv. vacina contra a hepatite B recombinante adsorvida;

v. toxoide de difteria (DT), adsorvido;

vi. toxoide do tétano (TT), adsorvido; e vii. Bortedella pertussis acelular (aP) adsorvido.

A vacina heptavalente de combinação de acordo com a presente invenção reduz a quantidade de injeções necessárias para imunização, aumenta a satisfação dos pais e das crianças, reduz a dor, é mais conveniente, aumenta o cumprimento com imunização única, melhora a manutenção de registros e é mais eficaz para seu custo.

Também é fornecida uma vacina de combinação inovadora de Sabin I, II e III desativado, antígenos de rotavirus desativados e um processo de sua fabricação. O processo de acordo com a presente invenção inclui a adição de estabilizante apropriado durante o processo de desativação de pólio e rotavirus.

Além disso, também é fornecido um método de imunização de crianças contra as doenças mencionadas acima por meio da injeção de todos os sete antígenos e/ou IPV-IRV em uma única composição líquida em uma aplicação de vacina. A presente

13/47 invenção refere-se adicionalmente a uma vacina de combinação que compreende uma série de componentes de vacina que são apropriados para a prevenção, melhoria e tratamento de diversos estados de doença que atendem ao critério de soroproteção para cada um dos mencionados componentes de vacina com menos interferência antigênica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

São descritas no presente realizações detalhadas da presente invenção; deve-se, entretanto, compreender que as realizações descritas são meros exemplos da presente invenção, que podem ser realizados de várias formas. Os detalhes funcionais e estruturais específicos descritos no presente não devem, portanto, ser interpretados como limitadores, mas meramente como base das reivindicações e como base representativa para ensinar aos técnicos no assunto os diversos empregos da presente invenção em virtualmente qualquer estrutura adequadamente detalhada. Além disso, os termos e frases utilizados no presente não se destinam a ser limitadores, mas sim a fornecer uma descrição compreensível da presente invenção.

Diversos antígenos empregados na vacina heptavalente de acordo com a presente invenção em conjunto com uma breve descrição do método de sua preparação serão agora descritos nos parágrafos a seguir em conjunto com as suas vantagens e aplicações sobre o estado da técnica.

i. Vacina contra a pólio desativada.

Vírus da pólio (família picrnavirídeos, gênero enterovirus) são vírus com RNA de fita positiva não envelopados e são o agente causador da poliomielite paralítica. Os enterovirus são habitantes transitórios do trato

14/47 gastrointestinal e são estáveis sob pH ácido. Virus da pólio possuem capsideos em forma de icosaedro que consistem de uma cópia do genoma de RNA e 60 cópias de cada uma das proteínas de capsideos virais VP1, VP2, VP3 e VP4.

vírus entra através da boca e ocorre multiplicação primária do virus no local de implante na faringe e no trato gastrointestinal. O período de incubação dura de 3 a 35 dias. A infecção entra em seguida em órgãos linfáticos por meio da infiltração de células de monócitos em placas de Peyer. As amídalas, nódulos linfáticos da cervical e nódulos linfáticos mesentéricos são locais típicos de reprodução secundária. O vírus é conduzido pelo fluxo sanguíneo para diversos órgãos internos e nódulos linfáticos regionais. Além disso, quando o vírus da pólio afeta o centro respiratório da medula, pode resultar morte por paralisia respiratória.

São utilizados dois tipos de vacina contra a pólio: vacina contra a pólio viva oral e vacina contra a pólio desativada. A vacina contra a pólio oral atenuada viva é altamente eficaz contra todos os três sorotipos de virus da pólio e vem sendo utilizada para interromper a transmissão do vírus da pólio do tipo selvagem para a iniciativa de erradicação global da pólio. Linhagens de vírus da pólio oral podem induzir efetivamente imunidades humoral e da mucosa contra o vírus da pólio, mas elas possuem desvantagens inerentes devido à sua instabilidade genética e rápida geração de reversores durante a reprodução do vírus em receptores de vacina. Para minimizar o risco potencial de surtos de pólio associados a vírus da pólio derivados de vacina circulante (cVDPV) e linhagens de poliomielite paralítica associada à vacina (VAPP) e para reduzir os encargos da doença relativos ao

15/47 uso de OPV, vacina da pólio desativada (IPV) é principalmente produzida utilizando as linhagens de vírus da pólio do tipo selvagem virulentas. A probabilidade de fuga de virus da pólio selvagem de locais de produção de IPV para a comunidade gera o possível risco de surtos na população não imunizada. Neste particular, o uso de linhagens de vírus da pólio atenuados vivos para a produção de IPV em vez das linhagens do tipo selvagem minimiza o risco de surtos de poliomielite devido à liberação de vírus para a comunidade durante a era póserradicação.

Uma vacina contra a pólio desativada que perdeu a sua capacidade de infecção por meio da desativação do vírus da pólio foi desativada com 0,020 a 0, 025% de formaline por duas semanas a 37 °C (Vaccine 17, 2059-206: 1999) .Os estudos de estabilidade e imunogenicidade de Salk e Sabin-IPV a 37 °C foram similares (Biologicals 34, 155-158: 2006).

Os vírus da pólio possuem dois tipos diferentes de antígenos, nomeadamente antígenos D-(N) e C-(H) . O antígeno D é expresso em partículas de vírus nativo e pode induzir anticorpos de neutralização protetores específicos de tipos em indivíduos após a infecção com vírus da pólio ou vacinação com OPV ou IPV. O antígeno D pode ser convertido em antígeno C não protetor por meio de aquecimento suave e, portanto, a medição do teor de antígeno D foi utilizada para o teste de potência {Vaccine 25, 7041-7046: 2007). Com relação à imunogenicidade, o teste de potência em ratos difere significativamentè. Para o tipo 1, a imunogenicidade foi significativamente mais alta para Sabin em comparação com IPV de Salk. Para tipo 2, foi observada redução importante da imunogenicidade para Sabin em comparação com IPV de Salk.Para tipo 3, foi observada imunogenicidade

16/47 similar para IPV de Salk e Sabin (Biologicals 34, 155-158: 2006) . As linhagens de vacina atenuada viva oral do presente desenvolveram-se por meio de réplica de Sabin no intestino humano e geram linhagens virais com maior neurovirulência que, em ocasiões muito raras, cerca de um caso a cada 2,5 milhões de doses, causam poliomielite paralítica associada à vacina.

Dois antígenos virais conhecidos como antígenos D e antígenos C geralmente estão presentes em mistura com uma linhagem de Sabin desativada de vírus da pólio. Os antígenos D são proteínas virais completas. Os anticorpos para antígenos D possuem a capacidade de neutralizar o vírus vivo infeccioso. Quando uma linhagem Sabin desativada de vírus da pólio for utilizada como vacina, portanto, são necessários os antígenos D.

Existem três tipos de vírus da pólio (tipo I, tipo II e tipo III), todos os quais causam a doença pólio. Ao utilizarse uma linhagem Sabin desativada de vírus da pólio como vacina (vacina da pólio desativada), portanto, ela deve possuir imunogenicidade capaz de produzir anticorpos suficientes para neutralizar a linhagem selvagem de vírus da pólio de cada um dentre o tipo I, tipo II e tipo III.

Em populações com baixa cobertura de vacina e baixa supervisão, linhagens derivadas de vacina podem circular silenciosamente por longos períodos de tempo, gerando surtos de poliomielite.

A OMS observa a exportação de tecnologia do produção de Salk-IPV em larga escala, utilizando vírus da pólio do tipo selvagem para produção em países com recursos limitados e/ou ambientes de fraca regulagem da biossegurança, nos quais parcela significativa da população fica totalmente susceptível

17/47 a infecções pelo virus da pólio após o término do uso de OPV. A vacina da pólio desativada IPV de acordo com a presente invenção foi, portanto, desenvolvida a partir de linhagem Sabin atenuada viva. No presente relatório descritivo, a linhagem de vírus da pólio Sabin designa uma linhagem de vírus da pólio derivada da linhagem atenuada de vírus da pólio. Os vírus da pólio da linhagem Sabin incluem a linhagem Sabin tipo I de vírus da pólio, linhagem Sabin tipo II de vírus da pólio e a linhagem Sabin tipo III de vírus da pólio.

A desativação é apenas a eliminação da capacidade infecciosa do vírus utilizando substâncias. A substância utilizada para desativação do vírus é formaldeído ou betapropiolactona. A desativação do vírus da pólio pode ser conduzida por meio de um método químico. A desativação pode ser conduzida, por exemplo, por meio de tratamento do vírus da pólio com formalina.

ii. Vacina de rotavirus desativado:

Rotavirus permanece sendo causa importante de mortalidade infantil devido à diarréia, desidratação e má nutrição em países dos continentes africano e asiático. Vacinas comerciais não foram testadas sobre a população alvo nesses países pobres. A vacina viva existente não é suficiente para induzir a imunidade e não protege toda a população. Às vezes, ela também causa eventos adversos, como intussuscepções.

Quando ocorrem infecções misturadas com mais de uma linhagem de rotavirus, os segmentos genéticos dos vírus parentais podem recombinar-se independentemente devido à mudança genética, produzindo recombinações de pais misturados, uma fonte de diversidade viral.

A presente invenção fornece um método inovador de

18/47 desenvolvimento de antigeno de vacina de rotavirus injetável (IRV) desativado em combinação com outros antigenos, o que supera os problemas após a vacinação associados às vacinas de rotavirus orais conhecidas na técnica.

A linhagem de rotavirus 116E é uma recombinação em seres humanos/bovinos de ocorrência natural. 116E é um rotavirus humano obtido de recém-nascidos infectados assintomáticos que possuem composições antigênicas p[10]G9 e p[ll]G10. Essa vacina oral viva em testes clínicos foi segura e bem tolerada (Penélope H. Denneht, Rotavirus Vaccines: an Overview, Clinical Microbiology Reviews, 198-208 (2008) ou patente de rotavirus BBIL, como exemplo ou referência. Na presente invenção, a desativação do vírus designa a eliminação da capacidade infecciosa do vírus. Nos dois métodos de desativação (química e física), as substâncias mais comumente utilizadas são formaldeído e betapropiolactona. A desativação do rotavirus pode ser conduzida por meio de um método {Human Vaccines: Immunogenicity of a Thermally Inactivated Rotavirus Vaccine in Mice, 143-147: 2008. A desativação pode ser conduzida, por exemplo, por meio de tratamento do rotavirus com calor.

iii. Produção de antigeno protetor de Bordetella pertussis:

A linhagem utilizada para o desenvolvimento e produção de vacina contra coqueluche acelular foi Bortedella pertussis Tohama I e Bortedella bronchiseptica TY-178.

Bordetella pertussis Tohama I:

É coccobacilli gram negativo aeróbico móvel. Ele produz beta-hemólise sobre agar do sangue. É uma das linhagens utilizadas para isolamento e purificação de FHA e PRN com

19/47 acesso aos componentes principais de vaccinas contra coqueluche acelular.

Bordetella bronchiseptica TY-178:

É coccobacilli gram negativo aeróbico móvel. Ele produz beta-hemólise sobre agar do sangue. Esta linhagem é geneticamente modificada e é utilizada especialmente para isolamento e purificação de PT desintoxicado.

Preparação de toxoide da coqueluche e hemagulitina filamentosa:

Linhagem de B. pertussis Tohama I/B. bronchiseptica TY 178 inoculada sobre duas placas Agar B. G., incubadas a 37 + 0,5 °C por 48 horas em incubador. Observa-se o crescimento confluente. O cultivo é colhido em seguida em 5 ml de solução salina normal e inoculado em 2 x 10 ml de meio SS a 37 + 0,50 °C por 24 horas em um incubador agitador a 120 rpm. O crescimento observado (estágio I) de 5% do cultivo do estágio I é transferido para 2 x 50 ml de meio SS incubado a 37 + 0,5 °C por 24 horas em um incubador agitador a 150 rpm (estágio II). O cultivo do estágio II é transferido para 2 x 250 ml de meio SS incubado a 37 + 0,5 °C por 24 horas em um incubador agitador a 200 rpm (estágio III). Observa-se bom crescimento. A pureza foi verificada e o frasco foi reunido para 5% de inoculado de semente para 10 1 de meio fermentador de acordo com o protocolo.

B. P. Tohama I: A colheita do fermentador foi recolhida em um garrafão estéril de dez litros e centrifugada a 4200 rpm por 45 minutos. O sobrenadante coletado que contém antigeno FHA é filtrado por meio de filtragem de 0,45 pm e a pelota celular é processada para extração de pertactina.

B. bronchiseptica TY 178: a colheita do fermentador

20/47 foi recolhida em um garrafão estéril de dez litros e centrifugada a 4200 rpm por 45 minutos. 0 sobrenadante coletado contém filtro de antígeno P T por meio de filtragem de 0,45 pm. Descarte a pelota celular após a desativação.

A sopa filtrada de 0, 45 pm acima que contém FHA e PT é concentrada em cinco a seis vezes até o seu volume original com o auxílio do sistema TFF, seguido por sua diafiltragem com tampão de fosfato sob pH 8,0.

Cromatografia - 1 (purificação primária): a purificação primária é realizada com o auxílio de cromatografia de afinidade e as eluições são verificadas pela atividade de H A para determinar a presença de antígeno.

Cromatografia - 2 (purificação secundária): a purificação secundária é realizada com o auxílio de cromatografia de troca de ions e as eluições são verificadas pela atividade de Η A para determinar a presença de antígeno. A pureza foi verificada por meio de SDS PAGE (manchas de prata).

iv. Antígeno de toxoide de difteria:

Antígeno de toxoide de difteria foi obtido de um fabricante de produto a granel previamente qualificado pela OMS. Esse volume foi utilizado para a preparação de vacina de combinação. Vacina de combinação foi formulada de tal maneira que cada 0,5 ml deverão conter 25 LF de toxoide.

v. Antígeno de toxoide de tétano:

Antígeno de toxoide de tétano foi obtido de um fabricante de produto a granel previamente qualificado pela OMS. Esse volume foi utilizado para a preparação de vacina de combinação. Vacina de combinação foi formulada de tal maneira que cada 0,5 ml deverá conter 7,5 LF de toxoide.

vi. Vacina conjugada de Haemophilus influenza do

21/47

tipo b:
	A	preparação de vacina	conj ugada	de	Haemophilus
influenza	do	tipo b envolve as etapas	a seguir:
	1 .	Fermentação de	cultivo	de	Haemophilus
influenza	do	tipo b.

2. Extração e purificação de PRP.

3. Ativação de PRP com brometo de cianogênio e ligada a di-hidrazida de ácido adípico.

4 .	Acoplamento de	toxoide	de	tétano
purificado.
5 .	Purificação de	conj ugado	por	meio de
cromatograf ia	de exclusão de tamanho.
vi i .	Antígeno da superfície	de hepatite	B :
0 antígeno da superfície de	HBV é produzido	por meio

do cultivo de células de levedura geneticamente elaboradas que conduzem a codificação genética para o antígeno de superfície principal de HBV. HBS Ag é expresso em células de levedura e purificado por meio de tecnologia Himax.

viii. Vacinas combinadas:

Uma vacina combinada de acordo com a presente invenção contém linhagem rota desativada de 116E e linhagem Sabin desativada de vírus da pólio. Outra vacina combinada de acordo com a presente invenção que contém linhagem rota desativada de 116E, linhagem Sabin desativada de vírus da pólio do tipo I, II e III, antígeno protetor Bordetella pertussis (pertactina, toxoide da coqueluche, heniaglutina filamentosa) , antígeno da superfície de hepatite B) , antígeno conjugado de Haemphilius influenza tipo b PRP, toxoide da difteria e toxoide do tétano. A vacina combinada de acordo com a presente invenção pode, portanto, também ser preparada por meio da mistura de

22/47 rotavirus desativado e linhagem Sabin de virus da pólio em conjunto com toxoide de difteria, toxoide do tétano, coqueluche, antígeno conjugado de Heamophilis influenzae do tipo b PRP-TT e antígeno da superfície de hepatite B.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir são utilizados para ilustrar adicionalmente a presente invenção e suas vantagens. Os exemplos específicos a seguir são fornecidos com a compreensão de que se destinam a ser ilustrativos sem servir de limitação do escopo da presente invenção.

Exemplo 1

Desativação de rotavírus:

Na presente invenção, rotavírus vivos foram submetidos a desativação térmica em três temperaturas diferentes com e/ou sem um estabilizante sorbitol durante o processo de desativação.

Estudo cinético da desativação de vírus: durante o processo de desativação, foi retirada uma amostra de colheita viral e a partícula de vírus vivo residual foi testada por meio de teste de imunoperoxidase.

Tabela 1

Temp.	10 % sorbitol	Tempo de amostragem de vírus durante estudo cinético de desativação
	I^a h	2^a h	3^a h	4^a h	5^a h	6^a h
56 °C	Com açúcar	+ 4	+ +	+ +	+ +	—	—
Sem açúcar	++	4- 4-	+ +	+ +	—	.—
60 °C	Com açúca r	++	—	—	•—	—	—
Sem açúcar	+ 4“	—	—	—	—	—

23/47

70 °C	Com açúcar		--	—	—	—
Sem açúcar	—	—	—	—	—

++ : indica a presença de partícula de vírus residual em um ponto de amostragem específico por meio de teste de imunoperoxidase.

: indica a ausência de partícula de vírus residual em um ponto de amostragem específico por meio de teste de imunoperoxidase.

Exemplo 2

Concentração e purificação da partícula de rotavirus desativada:

A colheita de rotavirus desativada foi submetida a ultrafiltragem utilizando filtragem de fluxo tangencial. Os conjuntos de corte molecular utilizados para remover impurezas com peso molecular mais baixo são conjuntos de 100 kDa ou 300 kDa. O fluido de vírus passa através do conjunto por várias vezes utilizando sistema TFF até obter-se a concentração desejada. Durante o processo de ultrafiltragem, o volume de colheita será composto por tampão de fosfato (10 a 20 mM) ou tampão de fosfato (10 mM) com 100 mM a 136 mM de cloreto de sódio. 0 pH do tampão será neutro e, preferencialmente, o pH será de 7,2 ± 2.

A colheita viral concentrada foi adicionalmente purificada por meio de cromatografia de troca de ions seguida por cromatografia de permeação de gel. O material de vírus retido concentrado passou por cromatografia de troca de ânions fraca. O meio de cromatografia foi equilibrado com 25, 50 ou 100 mM de solução de cloreto de sódio contendo 10 mM de tampão de fosfato. O pH da solução tampão de equilíbrio varia de 7,0 a

24/47

7,4. Após o equilíbrio, o material de rotavirus concentrado passou através de meio de ânions fraco em velocidade de fluxo linear de 45 a 60 cm²/h. Preferencialmente, 60 cm²/h. O tampão lavado contendo 10 mM de cloreto de sódio contendo 10 mM de tampão de fosfato, pH 7,0 a 7,2, foi passado na velocidade de fluxo linear de 50 cm²/h para eluir as impurezas com peso molecular mais baixo.

Por meio de gradiente de sal, rotavirus delimitado foi eluído e as frações foram reunidas com valor OD superior a 280 nm. As frações reunidas sofreram diálise utilizando conjuntos de 100 kDa ou 10 kDa contra 140 mM de cloreto de sódio com 10 mM de tampão de fosfato com pH 7,0 a 7,4.

A pureza e a composição de proteína de partícula de rotavirus desativada foram determinadas por meio de SDS PAGE e análise Western Blot. A concentração de proteína de volume purificado foi quantificada por meio do método de Lowry.

Exemplo 3

Desativação do vírus da pólio:

A desativação dos vírus da pólio pode ser conduzida por meio de um método comumente empregado. Especificamente, o vírus da pólio pode ser desativado por meio da adição de um agente desativador químico ao fluido de vírus da pólio vivo e, portanto, fixação de proteína da superfície do vírus. O agente desativador é preferencialmente formalina. Formalina é utilizada como agente desativador e a quantidade de adição é preferencialmente de cerca de 0, 001 a cerca de 0, 1% p/v, de maior preferência cerca de 0,05% p/v e, de preferência superior, cerca de 0,04% p/v. O teor de unidade de antígeno D foi calculado após o processo de desativação na amostra a granel purificada tratada com ou sem glicina durante o processo

25/47 de desativação. A temperatura de desativação é, de preferência superior, de cerca de 37 °C. 0 período de desativação é, preferencialmente, de cerca de sete dias a quatorze dias.

Tabela 2

Teor de antígeno D no volume purificado preparado a partir da colheita viral tratada com ou sem glicina durante o processo de ativação:

Virus da pólio	Agente de desativação com concentração	Temperatura	Estabilizante utilizado durante o processo de desativação	Teor de antígeno D no volume purificado
Tipo I	Formalina (0,025%)	37 °C	Com 0,5% de glicina	118
Sem estabilizante	82
Tipo II	Formalina (0,025%)	37 °C	Com 0,5% de glicina	52
Sem estabilizante	31
Tipo III	Formalina (0,025%)	37 °C	Com 0,5% de glicina	128
Sem estabilizante	84

Tabela 3

Estudo Cinètico de Desativação do Vírus da Pólio

Tipo de vírus	Temperat ura	Partículas de vírus vivas residuais
Dia 0	1° dia	2 dia	3° dia	4^odia	5^odia	6^odia	7° dia	8^odia	9^odia
Tipo I	25	+ + +	++ +	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +	—	----
37	+ + +	++ +	+ 4- +	+ + +	+ + +	™ — —	—	—	—	—
Tipo II	25	+ + +	+ + +	++ +	+++	+ + +	+ + +	+ + + +	+ + +	+ + +	-----
37	++ +	+ + +	+++	+++	+ + +	+ + +	—	— — —	-	---—
Tipo III	25	+ + +	+ + +	+ + +	+++	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +	— — —	— — — —
37	+ + +	+ + +	+++	++ +	+++	+ + +	—	—	—	—

26/47

+ +	♦	indica a presença de partícula	de	vírus	residual
em um ponto	de	amostragem específico por meio	de	CCIDso.
	*	indica a ausência de partícula	de	vírus	residual
em um ponto	de	amostragem específico por meio	de	CCID₅₀.

Exemplo 4

Concentração e purificação do vírus da pólio Sabin:

Linhagem Sabin individual de vírus da pólio do tipo I, tipo II e tipo III foi purificada separadamente sem nenhuma contaminação cruzada de antígeno de vírus. Fluido de colheita de vírus desativado foi concentrado até o volume necessário com uma membrana de ultrafiltragem (sartorius, PESU (polietersulfona) , 100 kDa, 0,7 m². A colheita concentrada foi diafiltrada contra a solução salina de tampão de fosfato para remover impurezas com peso molecular mais baixo para reduzir a concentração de cloreto de sódio de 117 mM para 25 mM. Após a etapa de concentração em um conjunto de 100 kDa, o conjunto necessita ser lavado para remover a partícula de vírus que se uniu ao conjunto de membrana. O fluido de vírus concentrado foi adicionalmente purificado com meios de cromatografia de troca de ions fracos. Neste ponto, o meio de troca de ânions fraco utilizado foi DEAE. 0 meio foi embalado e equilibrado com 0,1 mol/1 de tampão de fosfato contendo 25 mM de cloreto de sódio. Durante a embalagem, a velocidade de fluxo linear deverá ser o dobro da velocidade de carregamento de amostra. Após a etapa de equilíbrio, fluido de vírus concentrado foi carregado à velocidade de fluxo linear de 50 cm²/h.

A partícula de vírus foi eluída com concentração diferente de ions de cloreto de sódio de acordo com o princípio de gradiente de sal. Frações de pico foram reunidas e dialisadas contra tampão de fosfato. O volume purificado foi

27/47 filtrado através de filtro de 0,2 μ PES e armazenado a 2-8 °C. A purificação de fluido de vírus de linhagem Sabin do tipo II e do tipo III foi conduzida da mesma forma que o tipo I,

Quantificação de antígeno D em volume de vírus da pólio purificado:

A quantidade de antígeno D é medida por meio de um método ELISA indireto utilizando anticorpos que possuem alta especificidade para o tipo e o antígeno D. O método ELISA indireto começa pelo revestimento de uma microplaca com o anticorpo monoclonal (derivado de camundongo) específico para antígenos D do mesmo tipo do antígeno a ser testado, como o anticorpo primário. A placa foi incubada por uma noite e bloqueada com 1% de BSA. O antígeno a ser testado é diluído em seguida e incubado por uma hora a 37 °C. Em seguida, o anticorpo policlonal de coelho específico de tipo do mesmo tipo do antígeno a ser testado é colocado sobre ele como o anticorpo secundário, além do quê o anticorpo anti-IgG de coelho marcado com HRPO é ali colocado, efetuando uma reação. Após a reação, é conduzido o desenvolvimento de coloração utilizando uma solução de O-fenilenodiamina e a absorção a 492 nm é a absorção medida do anticorpo testado e a absorção medida para um antígeno de referência por meio de análise quantitativa de linha paralela.

Exemplo 5

O presente exemplo fornece a composição e o processo de fabricação da vacina viral desativada em combinação de acordo com uma realização da presente invenção.

A. Composição da vacina viral de combinação de acordo com a presente invenção fornecida na tabela mencionada abaixo.

Cada 0,5 ml de vacina compreende o seguinte:

28/47

Tabela 4

Componentes

Quantidade

Antígeno de rotavirus 5 microgramas desativado purificado

Vírus da pólio Sabin desativado (sIPV)

Pólio	tipo	1	40	unidades	D
Pólio	tipo	2	08	unidades	D
Pólio	tipo	3	32	unidades	D

Outros excipientes

Teor de alumínio 0,25 - 0,30 mg de Al⁺³ (como fosfato de alumínio)

2-Fenoxietanol 2,5 mg

Solução salina de tampão de fosfato q.s.

B. O processo de fabricação de vacina viral de combinação de acordo com a presente invenção é descrito abaixo.

1. Procedimento de formulação para o componente 1:

Adicionou-se gel de fosfato de alumínio a 1,5% ao recipiente, seguido por solução salina de tampão de fosfato e o conteúdo foi misturado. A mistura foi verificada e ajustada para encontrar-se na faixa de pH 6,5 a 7,00.0 componente 1 foi adicionado à mistura e o conteúdo foi agitado para adsorção de antígeno viral aos ions de alumínio. 0 volume necessário adicional de solução salina de tampão de fosfato e 2fenoxietanol foi adicionado à mistura acima.

2. Adição de volume de sIPV:

conteúdo do componente 1 foi misturado com a preparação de antígeno de IPV mediante agitação para obter uma

29/47 vacina viral divalente de combinação.Por fim pH foi verificado e ajustado para encontrar-se na faixa de pH 6,5 a

7,2.

Exemplo 6

Este

Exemplo fornece um resumo do teste de potência conduzido para antigeno de rotavirus desativado e antigeno de virus da pólio desativado e os dados de estabilidade.

A. Teste de potência conduzido para antigeno de rotavirus desativado e antigeno de vírus da pólio desativado:

1. Teste de potência para vacina rota:

Espécie de animal necessária camundongos

Número de animais necessários por lote 20 Via de administração da vacina subcutânea Volume de injeção 0,5 ml

Número e dias de abrigo dos animais 21 dias

Injeção subcutânea de vacina rota em camundongos albinos suíços: eles foram previamente sangrados e testados para determinação de anticorpo especifico de rotavirus em grupo de controle e de teste. Os camundongos em cada grupo de dez foram imunizados por via subcutânea por duas vezes com cinco microgramas no dia 0 e no dia 14. Camundongos de controle em grupos de dez receberam injeção de placebo no dia 0 e no 14° dia. Os animais foram sangrados no 21° dia (sangramento após a imunização). Antes do início, os animais de imunização foram verificados para garantir que o peso dos camundongos individuais não variasse em mais de 20% da média do grupo. Foi utilizado um inoculado de 0,5 ml de vacina rota contendo 5 pg

30/47 de antígeno com outros excipientes por dose.

Soro foi separado do grupo imunizado e do grupo controle. Títulos de anticorpos neutralizantes contra a vacina de vírus rota foram medidos por meio do teste de neutralização de soro. Cem unidades de foco fluorescente da linhagem de virus rota 116 E foram utilizadas de forma a neutralizar o soro diluído duas vezes e testadas em linhagem de células Mal04. O soro foi diluído em série em diluição por duas vezes e o anticorpo diluído foi misturado com rotavirus ativado. A mistura de antígeno e anticorpo foi incubada a 37 °C por uma hora. Após a incubação, a mistura de Ag e Ab foi adicionada a uma folha celular monocamada Mal04 em uma placa com múltiplas cavidades. A placa foi incubada por uma hora a 37 °C para adsorção de vírus. Na etapa seguinte, adicionou-se 100 μΐ de EMEM contendo 10% de FBS a cada cavidade e a placa foi incubada a 37 °C por 24 horas. Após a fixação com formalina, a placa foi lavada com PBS e, em seguida, células infectadas foram manchadas com anticorpo monoclonal diluído a 1:1000 dirigido contra proteína estrutural 116 E VP6 de rotavirus por uma hora a 37 °C. Um anticamundongo de cabra marcado com peróxido de hidrogênio diluído a 1:1000 foi utilizado como conjugado e OPD em 0,05 de tampão de acetato de sódio contendo 0,01% de peróxido de hidrogênio foi utilizado como substrato. O título de anticorpo neutralizante foi definido como o recíproco da diluição em soro exibindo 50% de redução do número de células infectadas.

2. Teste de potência de vacina contra a pólio (tipo I, tipo II e tipo III):

Espécie de animal necessária rato

31/47

Número de animais necessários por batelada 80

Via de administração de vacina intramuscular

Volume de injeção

0,5 ml

Número de dias de abrigo dos animais 21 dias

Vacina de teste e vacina de referência foram injetadas por via intramuscular nas patas traseiras de rato de quatro diluições (duas vezes) da vacina a ser examinada. 21 dias após a injeção, foi retirado sangue individualmente de cada animal, o soro foi separado e o complemento foi desativado em seguida por meio de aquecimento a 56 °C por trinta minutos em um banho de água com temperatura controlada. 0 soro de cada animal do grupo de vacina de teste e do grupo de vacina de referência foi colocado em pelo menos três cavidades para cada soro e diluído em série por duas vezes com meio EMEM. Aos soros diluídos em série, adicionou-se 100 CCID50 de vírus da pólio a cada cavidade e incubou-se por três horas a 37 °C para reação entre antígeno e anticorpo na presença de 5% de CO₂. Após incubação, foram adicionadas 10.000 células a cada cavidade e ela foi incubada por cinco dias. Após o término do cultivo, o CPE (efeito citopático) para cada cavidade foi examinado, foi calculada a razão de diluição em soro no momento de 50% de neutralização e a recíproca do fator de diluição foi calculada na forma de título de anticorpo de neutralização.

B.

Teste de estabilidade de vacina de vírus da pólio desativado e vacina de rotavirus desativado:

Os testes foram conduzidos conforme fornecido na tabela acima. A vacina viral combinada foi medida por meio da condução de um teste em armazenagem de vacina a 5 ± 3 °C. A estabilidade foi avaliada por meio de testes de potência sobre

32/47 cada um dos vírus.

Tabela 5

I. Teste de estabilidade a longo prazo de vacina de combinação (5 ± 3 °C) de vacina da pólio de linhagem 5 Sabin (Tipo I, II e III) e vacina de rotavirus desativado pelo período de doze meses.

Antigeno	Concentra ção de antigeno	Especificaç ão da potência	Valor de potência da vacina IRV de combinação	IPV-
dia 0	1° mês	2^omês 1, 15	3^o mês 1, 3	6° mês 1,2	9^omês 1.3	12° mês 1. 4
pólio tipo I^a pólio tipo II^a pólio tipo III^a	Unidade 40 D Unidade 8 D Unidade 32 D	Potência relativa maior ou igual à vacina de referência	1,5	1,4
acina rota desativada (5 pg/ml)^b	pg de antigeno purificad o	T ítulo de anticorpo neutralizan te	144 _	120	98	056	114	072	78

a. Para vacina da pólio desativada, o valor de potência da vacina de teste foi comparado com vacina de referência por unidade relativa.Caso o valor de potência 10 relativa da vacina de referência fosse 1, por exemplo, o valor de potência relativa da vacina de teste será de menos de 1 ou mais de 1.

b. Para a vacina de rotavirus desativada, o valor de potência foi baseado no título de anticorpo 15 neutralizante.

Tabela 6

II. Estabilidade a longo prazo (5+3 °C) de

33/41 componente individual de vacina rota desativada:

Antígeno	Concentra ção de antígeno	Especifica ção da potência	Valor dia 0	de potência	relativa	da vacina
1° mês	Ί 2 mês	PV 3^o mês	6^omês
9° mês	12° mês
pólio	unidade	Potência	1,25	1,12	1,4	1,4	1, 3	1,2	1,1
tipo I	40 D	relativa				5			5
pólio	unidade 8	maior ou
tipo II	D	igual à
pólio	unidade	vacina de
tipo III	32 D	referência

Tabela 7

III. Estabilidade em tempo real (5 ± 3 °C) de componente individual de vacina contra a pólio (Tipo I, II e

III).

Antígeno	Concentra ção de antígeno	Especifica ção da potência	Valor da potência de vacina IRV (titulo de anticorpo de neutralização)
dia 0	1° mês	2^omês	3^omês	6° mês	9° mês	12° mês
Vacina rota desativada (5 pg/ml)	5 pg de antígeno purificad o	Título de anticorpo neutraliza nte	1256	1020	1114	986	123 0	1096	121 8

Exemplo 7 presente exemplo fornece a composição e o processo de fabricação da vacina heptavalente de acordo com um aspecto da presente invenção.

A. A composição de vacina heptavalente de acordo com a presente invenção é conforme abaixo.

Cada 0,5 ml de vacina compreendem o seguinte:

Tabela 8

Componentes

Quantidade

34/47

Toxoide de difteria¹ (DT) 25 LF adsorvido

Toxoide de tétano¹ (DT) 7,5 LF adsorvido

Coqueluche acelular¹ (aP)

Toxoide de coqueluche (PT) 25 pg adsorvido

Hemaglutinina filamentosa (FHA) 25 pg adsorvido Antígeno da superfície de hepatite B¹ (HBsAg) 10 pg adsorvido

Haemophilias influenza (Hib)b 10 pg de antígeno de polissacarideo capsular

Antígeno de rotavirus desativado² (IRV) pg adsorvido

Vírus	da pólio desativado	(IPV)
Pólio	tipo 1	40 unidades D
Pólio	tipo 2	08 unidades D
Pólio	tipo 3	32 unidades D

Outros excipientes

Teor de alumínio 0,50 - 0,60 mg of Al⁺³ (como fosfato de alumínio)

0,2 5 - 0,30 mg de Al⁺³ (como hidróxido de alumínio) 2-Fenoxietanol 2,5 mg

Solução salina de tampão de fosfato q.s.

sobre fosfato de alumínio ² sobre hidróxido de alumínio

q.s. quantidade suficiente

B. O processo de fabricação de vacina heptavalente de acordo com a presente invenção é o seguinte:

35/47

1. Procedimento de formulação para o componente 1:

Adicionou-se a quantidade necessária de 1,5% de gel de fosfato de alumínio ao recipiente na concentração e cada 0,5 ml de vacina final deverá conter de 0,50 a 0,60 mg de Al⁺³ como fosfato de alumínio. A quantidade necessária de solução salina de tampão de fosfato com pH 7,2 ± 0,4 foi adicionada ao gel de fosfato de alumínio. O conteúdo foi verificado e o pH foi ajustado de tal forma que se enquadrasse em uma faixa de pH 6,0-6.5. Após a etapa acima, adicionou-se toxoide de difteria de tal forma que a formulação de vacina final contivesse 25 LF (limites de floculação) por 0,5 ml. Adicionou-se em seguida antígeno de toxoide de tétano à concentração; na formulação final, cada 0,5 ml de vacina deverá conter 7,5 LF (limites de floculação). Componentes de coqueluche acelular como toxoide de coqueluche e hemaglutinina filamentosa foram adicionados à mistura acima a 25 pg de cada componente em 0,5 ml. Por fim, adicionou-se antígeno da superfície de hepatite B à mistura acima em concentração apropriada. O conteúdo acima foi misturado e o pH foi ajustado para encontrar-se na faixa de 6,0 a 7,0. Além disso, adicionou-se solução salina de tampão de fosfato e o pH foi verificado e ajustado para encontrar-se na faixa de pH de 6,5 a 7,2.

2. Procedimento de formulação para o componente 11:

Gel de hidróxido de alumínio a 2,1% foi tomado em um recipiente e adicionou-se solução salina de tampão de fosfato. O conteúdo acima foi misturado e o pH foi ajustado para encontrar-se na faixa de 7,0 a 7.4. 0 antígeno de rotavírus desativado foi adicionado de tal forma que cada 0,5 ml de

36/47 vacina final contenha 5 pg de antígeno viral. Além disso, adicionou-se solução salina de tampão de fosfato e o pH foi verificado e ajustado para encontrar-se na faixa de pH de 6,5 a 7,2.

3. Mistura do componente I e do componente II.

Esta etapa foi conduzida por meio de transferência do conteúdo do componente II para o componente I para obter uma mi stura.

4. Adição de Hib tipo b e volume de IPV:

A mistura acima que compreende os componentes I e II foi misturada com o antígeno Hib.O conteúdo foi misturado sob agitação para obter uma vacina heptavalente. 2-Fenoxietanol adicional foi transferido para um recipiente e adicionou-se solução salina de tampão de fosfato para compor o volume até a quantidade necessária. 0 pH foi verificado e ajustado para encontrar-se na faixa de pH 6,5 a 7,2.

	Exemplo 8
	0	presente exemplo fornece um resumo	do teste	de
potência	in	vivo conduzido para difteria, tétano,	coqueluche,
hepatite	B,	Haemophilius influenza do tipo B,	antígeno	de
rotavirus	r	antígeno de vírus da pólio e o	s dados	de

estabilidade.

A. Teste de potência conduzido para difteria, tétano, coqueluche, hepatite B, Haemophilius influenza do tipo b, antígeno de rotavirus e antígeno do vírus da pólio (antígeno IPV-IRV-DTaP-rHBsAg-Hib).

a. Teste de potência para IPV.

Espécie animal necessária rato

Número de animais necessários por batelada 80

37/47

Via de administração de vacina intramuscular

Volume da injeção 0,5 ml

Número de dias de abrigo dos animais 21 dias

Vacina de teste e vacina de referência foram injetadas por via intramuscular nas patas traseiras de rato de quatro diluições (duas vezes) da vacina a ser examinada.21 dias após a injeção, foi retirado sangue individualmente de cada animal e o soro foi separado, o complemento foi desativado em seguida por meio de aquecimento a 56 °C por trinta minutos em um banho de água com temperatura controlada. O soro de cada animal do grupo de vacina de teste e do grupo de vacina de referência foi colocado em pelo menos três cavidades para cada soro e diluído em série por duas vezes com meio EMEM. Aos soros diluídos em série, adicionou-se 100 CCID50 de vírus da pólio a cada cavidade e incubou-se por três horas a 37 °C para reação entre antígeno e anticorpo na presença de 5% de CCç.Após incubação, foram adicionadas 10.000 células a cada cavidade e ela foi incubada por cinco dias. Após o término do cultivo, o CPE (efeito citopático) para cada cavidade foi examinado, foi calculada a razão de diluição em soro no momento de 50% de neutralização e a recíproca do fator de diluição foi calculada na forma de titulo de anticorpo de neutralização.

b. Teste de potência para IRV.

Espécie animal necessária camundongo

Número de animais necessários por batelada 20 Via de administração da vacina subcutânea

Volume da injeção 0,5 ml

Número de dias de abrigo dos animais 21 dias

38/47

Injeção subcutânea de vacina rota em camundongos albinos suíços: Eles foram previamente sangrados e testados para determinação de anticorpo específico de rotavirus em grupo de controle e de teste. Os camundongos em cada grupo de dez foram imunizados por via subcutânea por duas vezes com cinco microgramas no dia 0 e no dia 14. Para controle, camundongos de controle em grupos de dez receberam injeção de placebo no dia 0 e no 14° dia. Os animais foram sangrados no 21° dia (sangramento após a imunização). Antes do início, os animais de imunização foram verificados para garantir que o peso dos camundongos individuais não variassem em mais de 20% da média do grupo. Foi utilizado um inoculado de 0,5 ml de vacina rota contendo 5 pg de antígeno com outros excipientes por dose.

Soro foi separado do grupo imunizado e do grupo controle. Títulos de anticorpos neutralizantes contra a vacina de rotavirus foram medidos por meio do teste de neutralização de soro.Cem unidades de foco fluorescente da linhagem de rotavirus 116 E foram utilizadas de forma a neutralizar o soro diluído duas vezes e testadas em linhagem de células Mal04. O soro foi diluído em série em diluição por duas vezes e o anticorpo diluído foi misturado com rotavirus ativado. A mistura de antígeno e anticorpo foi incubada a 37 °C por uma hora. Após a incubação, a mistura de Ag e Ab foi adicionada a uma folha celular monocamada Mal04 em uma placa com múltiplas cavidades. A placa foi incubada por uma hora a 37 °C para adsorção de vírus. Na etapa seguinte, adicionou~se 100 pl de EMEM contendo 10% de FBS a cada cavidade e a placa foi incubada a 37 °C por 24 horas. Após a fixação com formalina, a placa foi lavada com PBS e, em seguida, células infectadas foram manchadas com anticorpo monoclonal diluído a 1:1000 dirigido

39/47 contra proteína estrutural 116 E VP6 de rotavirus por uma hora a 37 °C.Um anticamundongo de cabra marcado com peróxido de hidrogênio diluído a 1:1000 foi utilizado como conjugado e OPD em 0,05 de tampão de acetato de sódio contendo 0,01% de peróxido de hidrogênio foi utilizado como substrato. O título de anticorpo neutralizante foi definido como o recíproco da diluição em soro exibindo 50% de redução do número de células infectadas.

c. Teste de potência para antigeno protetor de coqueluche:

Espécie animal necessária camundongo

Número de animais necessários por batelada 116 Via de administração de vacina intramuscular

Volume da injeção 0,5 ml

Número de dias de abrigo dos animais 28 dias

A vacina de teste e a vacina de referência são diluídas duas vezes em três diluições diferentes da vacina a ser testada em camundongos e cada diluição é injetada em um grupo de camundongos. A vacina de teste e a de referência foram injetadas por via intraperitoneal a cada camundongo em 0,5 ml da diluição. 0 animal foi sangrado após 21 dias de vacinação. Soros foram separados, o complemento foi desativado e anticorpo neutralizante foi titulado por meio de ELISA.

Placas de microtítulos são revestidas com o antigeno purificado em concentração de 100 ng de antigeno protetor por cavidade. Após a lavagem, locais não reagidos são bloqueados por BSA e lavados em seguida. Após incubação a 37 °C por uma hora, as placas são lavadas, adicionou-se conjugado anti-IgG de

40/47 camundongo a cada cavidade e incubou-se por uma hora a 37 °C. Após a lavagem, adicionou-se um substrato do qual o conjugado de enzima unido libera uma cor que foi quantificada pela medição da absorção. Com base nos valores de absorção, os títulos de anticorpo no soro de camundongos imunizados com referência e as vacinas de teste são calculadas e, a partir dos

valores,	foi calculada a potência	da	vacina	de teste com
relação à	vacina de referência.
	d. Teste de potência	de	toxoide	de difteria:

Espécie animal necessária cobaia

Número de animais necessários por batelada 125 Via de administração da vacina subcutânea

Volume da injeção 0,5 ml

Número de dias de abrigo dos animais 33 dias

A vacina de teste, vacina padrão e toxina são necessárias para o teste. A diluição da vacina de teste e da vacina padrão é conduzida com 0,9% de solução salina e a diluição da solução de toxina é conduzida com um tampão de 10 mM de fosfato contendo 137 mM de cloreto de sódio. A vacina de teste e a vacina padrão são diluídas em série em duas vezes (três diluições diferentes em vacina de teste e de referência). Utilizando um grupo de pelo menos vinte cobaias para cada diluição da vacina de teste e da referência, cada animal recebe uma única injeção subcutânea de 0,5 ml. No meio da quarta à quinta semana do desafio do teste, grupo de referência e de controle com toxina de difteria contendo 100 LD50.Duas vezes por dia por cinco dias, as cobaias foram observadas e o número de cobaias protegidas por cada diluição de vacina de teste e

41/47 vacina de referência foi registrado. A potência foi estimada por meio de comparação dos valores entre o teste e a referência por meio do método Probit.

e. Teste de potência para toxoide de tétano:

Espécie animal necessária camundongo

Volume da injeção 0,5 ml

Número de dias de abrigo dos animais 29 dias

A vacina de teste, vacina padrão e toxina são necessárias. A diluição da vacina de teste e da vacina de referência é conduzida com 0, 9% de solução salina e a diluição da solução de toxina é conduzida com um tampão de 10 mM de fosfato contendo 137 mM de cloreto de sódio. A vacina de teste e a referência são diluídas em série em quatro vezes. Utilizando um grupo de pelo menos vinte cobaias com 17 a 20 g para cada diluição da vacina de teste e de referência, cada animal recebeu uma única injeção subcutânea de 0,5 ml. Em 21 dias após a imunização, cada camundongo recebeu desafio de cerca de 100 DL50 de toxina e foi observado por sete dias. A potência foi calculada por meio de método estatístico por comparação entre a vacina de teste e de controle.

f. Teste de potência para antígeno da superfície de hepatite B:

Espécie animal necessária camundongo

Número de animais necessários por batelada 180 Via de administração da vacina intraperitoneal

42/47

Volume da injeção ml

Número de dias de abrigo dos animais 28 dias

Ά potência da vacina de teste foi comparada com a vacina padrão por meio de determinação dos anticorpos antiHBsAg específicos em camundongos. A vacina de teste e a vacina padrão foram injetadas por via intraperitoneal em camundongos pesando de 15 a 20 gramas em quatro diluições (quatro vezes). Um grupo de animais controle permanece sem vacinar, mas recebe injeção intraperitoneal com o mesmo volume do diluente isolado. 0 animal foi sangrado no 28° dia após a vacinação e o soro foi separado. 0 soro individual foi testado para determinar a concentração de anticorpo HBsAg específica por meio do método ELISA. Os resultados do teste foram analisados por meio de método estatístico padrão. O percentual de animais que exibem soroconversão em cada grupo é transformado e um modelo de linha

paralela utiliza a	curva de	reação	à dosagem	logaritmica. A
potência da vacina	de teste	foi comparada	com a	preparação de
referência.
g·	Teste de potência	para	vacina	conjugada de
PRP de Haemophilias	influenza	do tipo	b:

Espécie animal necessária camundongo

Número de animais necessários por batelada 16

Via de administração da vacina intraperitoneal

Volume da injeção 0,5 ml

Número de dias de abrigo dos animais 21 dias

Este método é a quantificação dos anticorpos induzidos em camundongos pela vacina de teste por meio do teste

43/47 de imunogenicidade em camundongos. A imunização de camundongos é realizada tomando-se diluições isoladas de quatro vezes a dose humana preparadas em solução salina estéril. Duas doses de diluição em quatro vezes de vacina foram injetadas por via intraperitoneal com 0,5 ml (8 camundongos cada pesando de 15 a 20 gramas) no dia 0 e no 14° dia. Um grupo controle de oito camundongos cada foi inoculado por via intraperitoneal com 0,5

ml	de	solução salina	estéril no	dia 0 e no 14° dia	•
		0 grupo	de	teste e	o grupo controle	são sangrados
no	21°	dia e o soro	foi	separado	para titulação de	anticorpo.	0
teste	foi conduzido	por	meio do	método ELISA para	determinar	a

quantidade de elevação do titulo de anticorpo dobrado. O titulo de anticorpo não deverá ser um aumento de menos de quatro vezes do título de anticorpo no grupo vacinado em comparação com o grupo controle.

B. Estabilidade de IPV-IRV-Hib-HBsAg-DaPT:

A vacina combinada foi medida por meio da condução de um teste em armazenagem de vacina a 5 ± 3 °C. A estabilidade foi avaliada por meio de testes de potência sobre cada um dos vírus, vacina bacteriana subunitária e vacina recombinante.

Tabela 9

I. Estabilidade a longo prazo da vacina de combinação (5+3 °C) de IPV-IRV-Hib-HBsAg-DaPT.

Antígeno	Concentr ação de antígeno	Especificação da potência	Valor de potência da vacina IPV-IRV-Hib-HBsAg-DaPT
dia 0	1 ° h mes	2° mês	3° mês	6° mês	9° mês	12° mês
pólio tipo I^a pólio tipo II^a pólio	Unidade 40 D Unidade 8 D Unidade	Potência relativa maior ou igual à vacina de referência	1, 4	1,1 2	1, 1 5	1, 3	1,2 5	1, 4	1,2

44/47

tipo III^a	32 D
Vacina rota desativad a^b	5 pg de antígeno purifica do	Titulo de anticorpo neutralizante	112 4		111 4	105 6	100 6	1078
102 0	95 6
Toxoide de difteria adsorvido^c	25 LF	Unidades NLT 30 por dose em comparação com a vacina de referência	52	48	51	47	44	46	43
Toxoide de tétano^c	7,5 LF	Unidades NLT 60 85 por dose em	87	89	84	79	75	81
comparaçao com a vacina de referência
Toxoide da coqueluch e Hemagluti na filamento _ a sa	25 pg cada	Potência relativa maior ou igual à vacina de referência	1, 5	1,4	1,5	1,2	1,4	1, 1 5	1,6
Antígeno conjugado Hib tipo ! b PRP-T	10 pg	Aumento de não menos de quatro vezes do título de anticorpo no grupo vacinado em comparação com o grupo controle	8, 8	9,0	8, 5	8,2	7,5	7,7	7,4 _
Antígeno da superfiei e de hepatite B^a	10 pg	Potência relativa maior ou igual à vacina de referência	1,7	1, 9	1, 4 5	1,6	1,4 ⁰	1, 6	1,5

a. Para vacina contra a pólio desativada, vacina contra a coqueluche acelular e vacina contra a hepatite, o valor de potência da vacina de teste foi comparado com vacina de referência por unidade relativa. Caso o valor de potência

45/47 relativa da vacina de referência fosse 1, por exemplo, o valor de potência relativa da vacina de teste será de menos de 1 ou mais de 1.

b.	Para a	vacina	de	rotavirus	desativada, o
5 valor de potência	foi	baseado	no	título	de	anticorpo
neutralizante.
c.	Para a	vacina	de	toxoide	de	tétano e

difteria, o valor da potência depende da comparação de unidades obtidas da vacina de referência por meio de ED₅₀.

10	d.	Para antígeno	conjugado de	Hib	tipo	b PRP-
	T, o valor de	potência depende da	quantidade de	aumento	dobrado
	de anticorpos	no grupo vacinado em comparação	com	o grupo não
	vacinado.
		Tabela	10
15	II	Estabilidade a	longo prazo	5 ±	3 °C	de
	vacina DapT de	combinação:

Antígeno	Concentra ção de antígeno	Especifica ção da potência	Valor de potência de vacina DapT
dia 0	1° mês	2° mês	3° mês	6° mês	9° mês	12° mês
Toxoide de difteria adsorvido	25 LF	Unidades NLT 30 por dose em comparação com a vacina de referência	55	52	48	46	52	56	51



Toxoide de tétano	7, 5 LF	Unidades NLT 60 por dose em comparação com a vacina de referência	85	79	90	78	85	84	82

46/47

Toxoide da	25 pg	Potência	1,2 1,12	1,3	1,4	1, 5	1,3	1, 12
coqueluche	cada	relativa
Hemaglutin		maior ou	1
a		igual à
filamentos		vacina de
a		referência

Tabela 11

1. Estabilidade a longo prazo (5 ± 3 °C) de componente individual de vacina Hib.

Antigeno	Concent ração de antigen 0	Especificação da potência	Valor de	potência de vacina Hib
dia 0	1° mês	2^omês	3^omês	6° mês	9° mês	12° mês
Antigeno conjugado Hib tipo b PRP-TT	10 pg	Aumento de não menos de quatro vezes do titulo de anticorpo no grupo vacinado em comparação com o grupo controle	8, 5	8,8	7,5	7,2	7,9	8, 2	7, 4

Tabela 12

2. Estabilidade a longo prazo {5 ± 3 °C) de componente individual de vacina rHBsAg.

Antigeno	Concentr ação de antigeno	Especificaç ão da potência	Valor de	potência de vacina rHBsAg
dia 0	1° mês	2° mês	3° mês	6^omês	9° mês	12° mês
Antigeno da superfície de hepatite B	10 pg	Potência relativa maior ou igual à vacina de referência	1, 4	1,12	1, 4	1,5	1, 15	1,2	1,4

Pode-se observar, portanto, que o valor de potência da vacina heptavalente é maior ou igual à vacina de componentes individuais que foi testada e também que a vacina foi estável

47/47 por mais de um ano.

Claims

1. COMPOSIÇÃO COMBINADA HEPTAVALENTE ESTÁVEL, caracterizada por compreender:

a) variedade de rotavírus inativo 116E;

b) vírus da pólio sabin inativo dos tipos I, II e III;

c) antígeno de Bordatella pertussis acelular

d) antígeno da superfície de hepatite B (HBsAg);

e) antígeno conjugado haemophilus influenzae do tipo b (Hib) para uma proteína carreadora;

f) toxoide da difteria (DT);

g) toxoide do tétano (TT); e

h) um ou mais excipientes;

em que qualquer um de cada antígeno componente individual mencionado acima não é afetado pela presença de outros antígenos componentes;

em que o valor de potência da composição combinada heptavalente é igual ou superior que a composição componente individual; e em que a composição combinada heptavalente permanece estável por pelo menos um ano.

2/6 compreender de um variante antigênico selecionado de P[10]G9 e P[11]G10.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo antígeno de rotavírus inativo, o antígeno de Bordetella pertussis acelular, o antígeno da superfície de hepatite B (HBsAg), o antígeno conjugado de Haemophilius influenza tipo b (Hib) e, o antígeno de toxoide da difteria (DT) e antígeno de toxoide do tétano (TT) serem todos adsorvidos a um adjuvante selecionado de fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio.

3/6 (PRP) e a proteína carreadora ser toxoide do tétano (tt).

11. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo(s) (a) antígeno de rotavírus inativo (IRV) encontrar-se presente na quantidade de 2,5 a 15 pg/0,5 ml;

(b) antígenos D de vírus da pólio sabin inativo (IPV) do tipo I, tipo II e tipo III estarem presentes na razão de 40:8:32 unidades por 0,5 ml;

(c) antígeno de bordatella pertussis acelular consistir de Hemaglutinina filamentosa FHA e pertactina (P69 ou PRN) , em que FHA está presente na quantidade de 5 a 30 pg cada por 0,5 ml, e pertactina está presente na quantidade de 8-10 pg/0,5 ml;

(d) antígeno da superfície de hepatite B (HBsAg) estar presente na quantidade de 5 a 15 pg/0,5 ml;

(e) antígeno do tipo b haemophilus influenza (Hib) ser fosfato de polirribosilribitol de polissacarídeo capsular (PRP) e a proteína carreadora ser toxoide do tétano (tt), em que o

conjugado PRP-tt está presente na quantidade de 8-15 pg/0,5 ml; uma (f) toxoide de difteria (DT) estar presente em quantidade de 15-30 LF/0,5 ml; e (g) toxoide do tétano (tt) estar presente em uma quantidade de 5-15 LF/0,5 ml. 12. COMPOSIÇÃO, de acordo < om a reivindicação 1,

caracterizada pelo(s):

(a) antígeno de rotavírus inativo (IRV) encontrar-se presente na quantidade de 2,5 a 15 pg/0,5 ml;

(b) antígenos D do vírus da pólio sabin inativo do tipo

I, tipo II e tipo III estarem presentes na razão de 40:8:32 unidades por 0,5 ml;

Petição 870190077863, de

12/08/2019, pág. 10/16

3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela variedade de rotavírus inativo 116E

Petição 870190077863, de 12/08/2019, pág. 8/16

4/6 (c) antígeno bordatella pertussis acelular consistir de toxoide da coqueluche (PT) e pertactina (P69 ou PRN), em que PT está presente na quantidade de 5 a 30 pg por 0,5 ml, e pertactina está presente na quantidade de 8 a 10 pg por 0,5 ml;

(e) antígeno do tipo b haemophilus influenza (Hib) ser fosfato de polirribosilribitol de polissacarídeo capsular (PRP) e a proteína carreadora ser toxoide do tétano (tt), em que o conjugado PRP-tt está presente na quantidade de 8-15 pg/0,5 ml;

(f) o toxoide da difteria (DT) estar presente em uma quantidade de 15-30 LF/0,5 ml;

(g) a toxoide do tétano (tt) estar presente em uma quantidade de 5-15 LF/0,5 ml.

13. COMPOSIÇÃO COMBINADA HEPTAVALENTE ESTÁVEL, caracterizada por compreender:

a) variedade de rotavírus inativo 116E, em que o rotavírus compreende um variante selecionado de P[10]G9 e P[11]g10;

b) antígenos D de vírus da pólio sabin inativos tipos I, II e III;

c) pelo menos um antígeno de Bordatella pertussis acelular selecionado do grupo de antígenos consistindo de hemaglutinina filamentosa (FHA), toxoide da coqueluche (PT) e pertactina (P69 ou PRN);

(d) antígeno da superfície de hepatite B (HBsAg);

(e) antígeno conjugado haemophilus influenzae do tipo b (Hib) para uma proteína carreadora, em que o antígeno conjugado haemophilus influenzae do tipo b (Hib) é fosfato de polirribosilribitol de polissacarídeo capsular (PRP) e a proteína

Petição 870190077863, de 12/08/2019, pág. 11/16

4. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo antígeno do vírus da pólio sabin inativo do tipo I, II, III consistir de antígenos do vírus da pólio sabín D e C do tipo I, II, III.

5/6 carreadora ser toxoide do tétano (tt);

f) toxoide da difteria (DT);

g) toxoide do tétano (TT); e

h) um ou mais excipientes;

em que qualquer um de cada antígeno componente individual mencionado acima não é afetado pela presença de outro antígeno componente;

14. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo:

(a) antígeno de rotavírus inativo (IRV) estar presente na quantidade de 2,5 a 15 pg por 0,5 ml;

(b) antígeno D do vírus da pólio sabin inativo do tipo I, tipo II e tipo III estar presente na razão de 40:8:32 unidades por 0,5 ml;

(c) antígeno de Bordatella pertussis acelular consistindo de hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina (P69 ou PRN), em que FHA está presente na quantidade de 5 a 30 pg por 0,5 ml, e pertactina está presente na quantidade de 8 a 10 pg por 0,5 ml;

(d) antígeno da superfície de hepatite B (HBsAg) estar presente na quantidade de 5 a 15 pg por 0,5 ml;

(e) antígeno conjugado haemophilus influenzae do tipo b (Hib) ser fosfato de polirribosilribitol de polissacarídeo capsular (PRP) e a proteína carreadora ser toxoide do tétano (tt), em que o conjugado PRP-tt está presente na quantidade de 8

Petição 870190077863, de 12/08/2019, pág. 12/16

5. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo antígeno do vírus da pólio sabín inativo do tipo I, II, III consistir de antígenos do vírus da pólio sabín D do tipo I, II, III.

6. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo antígeno de Bordatella pertussis acelular consistir de um ou mais antígenos selecionados do grupo consistindo de hemaglutinina filamentosa (FHA), toxoide da coqueluche (PT), pertactina (P69 ou PRN).

7. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo antígeno de Bordatella pertussis acelular consistir de hemaglutinina filamentosa (FHA) e pertactina (P69 ou PRN).

8. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo antígeno de Bordatella pertussis acelular consistir de toxoide da coqueluche (PT) e pertactina (P69 ou PRN) .

9. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo antígeno do tipo b haemophilus influenza (Hib) ser fosfato de polirribosilribitol de polissacarídeo capsular (PRP).

10. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo antígeno do tipo b haemophilus influenza (Hib) ser fosfato de polirribosilribitol de polissacarídeo capsular

Petição 870190077863, de 12/08/2019, pág. 9/16

6/6

a 15 pg por 0,5 ml; (f) a toxoide da difteria (DT) estar presente na quantidade de 15-30 LF por 0,5 ml; e g) a toxoide do tétano (TT) estar presente na quantidade de 5-15 LF por 0,5 ml. 15. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 13,

caracterizada pelo:

(a) antígeno de rotavirus inativo (IRV) estar presente na quantidade de 2,5 a 15 pg por 0,5 ml;

(c) antígeno de Bordatella pertussis acelular consistir de toxoide da coqueluche (PT) e pertactina (P69 ou PRN) , em que FHA está presente na quantidade de 5 a 30 pg por 0,5 ml, e pertactina está presente na quantidade de 8 a 10 pg por 0,5 ml;

(e) antígeno conjugado haemophilus influenzae do tipo b (Hib) ser fosfato de polirribosilribitol de polissacarídeo capsular (PRP) e a proteína carreadora ser toxoide do tétano (tt), em que o conjugado PRP-tt está presente na quantidade de 8 a 15 pg por 0,5 ml;

(f) toxoide da difteria (DT) estar presente na quantidade de 15-30 LF por 0,5 ml; e (g) toxoide do tétano (TT) estar presente na quantidade de 5-15 LF por 0,5 ml.