JP6089150B2 - 不活化ロタウイルスの調製方法 - Google Patents
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Description
本明細書中、「ロタウイルス」は、レオウイルス科(Reoviridae)ファミリーに属するロタウイルスのいずれかを意味する。ロタウイルスは、ヒトまたは動物種に感染することができ(例えば、A、B、C、D、E、F、および/またはGロタウイルスのグループのいずれか)、ロタウイルスとして、それらのあらゆる株、血清型、遺伝子型、および/または合併結合変異ウイルスが挙げられる。1つの例において、ロタウイルスは、ウシ属動物に感染する。本明細書に記載される方法を用いて調製することができる、市販されているヒト用ワクチンの例として、Rotarix(登録商標)(GlaxoSmithKline)、RotaTeq(登録商標)(Merck Sharp & Dohme Corp.)、および/またはROTOVAC(Bharat Biotech International)を挙げることができる。本明細書に記載される方法を用いて調製することができる、市販されているヒト用ワクチンの例として、ウマロタウイルスワクチン(Pfizer)、仔ウシロタウイルス下痢ワクチン(不活化)、Rotavec(登録商標)Corona(Merck Sharp & Dohme Animal Health)、Calf−Guard(Pfizer Animal Health)などを挙げることができる。本明細書に記載される方法はまた、ウシ、ウマ、およびブタの個体/集団など、非ヒト動物用ワクチンを調製するのにも使用することができる。
本明細書に開示されるのは、活性ロタウイルスを含有するある体積の培養物上清を、ロタウイルスが不活化する温度に直接加熱することにより(例えば、熱的不活化)不活化ロタウイルスを製造する方法、およびそのようにして不活化したロタウイルスを含有する組成物である。「生ロタウイルスを含むある体積の細胞培養物上清を直接加熱する工程」は、典型的には、活性(例えば、生きた、感染性の、複製により子孫ウイルスを産生することができる)ロタウイルスを含有する培養物上清に、ロタウイルスを不活化するため熱を加える前、処理用に収集する以外は、処理も操作も行わないこと(例えば、「前処理」無し)を意味する。ウイルスは、加熱処理前に、培養物上清から単離も精製もされていない。不活化ロタウイルスは、通常、活性がなく、感染性がなく、複製して子孫ウイルスを産生することができない(例えば、非増殖性)ウイルスを示す。不活化ロタウイルスは、死滅させられた、死、および/または非増殖性であると示すことができる。通常、少なくともワクチンに含ませるという目的のためには、不活化ロタウイルスは、対象に投与される時点で、免疫原性(例えば、免疫応答を刺激する能力)を保持していることが望ましい。通常、本明細書に記載される方法は、細胞培養物上清に含有される活性ロタウイルスの完全不活化をもたらす−活性ロタウイルスは残存しない。
不活化は、活性ロタウイルスを含む細胞培養物上清を得て、これをロタウイルスが不活化する温度に加熱することにより、達成することができる。生きた、感染性および/または増殖性感染性ロタウイルスは、典型的には、細胞に感染してその中で子孫を産生することができるものである。非感染性および/または非増殖性感染性ロタウイルスは、細胞に感染することができないおよび/または細胞中で子孫を産生することができないロタウイルスである。いくつかの実施形態において、細胞培養物上清の加熱に用いられるおよび/または加熱で到達する温度は、ロタウイルスが不活化する温度(「不活化温度」、例えば、約70℃、例えば、65℃、67℃、69℃、70℃、72.5℃、75℃、77.5℃、または80℃など)である。加熱工程は、典型的には、容器(例えば、管またはフラスコ)内で行われる。加熱後、細胞培養物上清を新たな容器に移すことができる。いくつかの実施形態において、複数回の加熱工程が用いられる。そのような実施形態において、第一の加熱工程は、最初の加熱工程と称することができる。最初の加熱工程には、随意に、凍結工程が続いてもよく、凍結工程では、細胞培養物上清は、適切な温度(例えば、約−80℃)で、適切な長さの時間(例えば、1時間〜一晩(例えば、8時間)またはそれ以上)凍結される。随意の凍結工程は、典型的には、新たな容器で行われる。次いで、この凍結工程に、第二の加熱工程が続いてもよく、例えば、第二の加熱工程は、最初の加熱工程とほぼ同じ条件(例えば、不活化温度)を用いて不活化ロタウイルス調製物を製造する。次いで、不活化ロタウイルス調製物を、必要になる(例えば、検査用および/またはワクチンに使用する)まで凍結しておくことができる。
典型的には、ウイルスが不活化するように処理されたロタウイルスの調製物は、検査により、調製物に活性ウイルスが存在しないことを確認する(すなわち、調製物が不活化ウイルスのみを含有することを確認する)。用いられる検査は、通常、活性ウイルス(例えば、生きた、感染性の、複製して子孫ウイルスを産生することができるもの)を検出するものである。検査の一例において、ウイルスを不活化するように処理された調製物または調製物の一部分を用いて、ロタウイルスによる感染を許容する任意の細胞を感染させる。調製物に活性ウイルスが存在するかどうかは、例えば、上記のとおり、細胞を固定し、細胞中のロタウイルスを同定する試薬で染色することにより、判定することができる。活性ウイルスを検出する他の方法として、感染中心アッセイまたは子孫ウイルスが細胞により産生されているかどうかを判定するアッセイの使用を考えることができる。様々な方法を用いることができる。
本明細書に記載される方法を用いて、対象に投与するためのワクチンを製造することができる。本明細書に使用される場合、「対象」または「宿主」は、典型的には個体を意味する。対象または宿主として、家畜動物、例えばネコおよびイヌ、牧畜動物(例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、およびヤギ)、実験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット)、および鳥類を挙げることができる。いくつかの実施形態において、対象または宿主は、霊長類またはヒトなどの哺乳類が可能である。
ロタウイルスを調製するため、MA104(サル腎臓細胞)を、バイオリアクター中、4.0g/LにてCytodex−3マイクロキャリアを用いて培養した。バイオリアクターには、細胞1.5×105個/mlを15Lの作業体積で播種した。3〜7日後、またはマイクロキャリアビーズが95%超のコンフルエンスに達した時点で、各バイオリアクターを、0.003(核数の計数により測定)の感染多重度(MOI)でウシロタウイルス(BRV)に感染させる準備をした。細胞を感染させる前に、BRVを、新鮮なDMEM培地(14.85L)中で、1〜3時間、37℃でインキュベートした。この培地は、IX型トリプシン(IX型トリプシン原液を22.5ml、L−グルタミンおよびゲンタマイシン/アンホテリシンBも含む)を含ませることで、BRV培地とした。BRV培地をバイオリアクターに加える前に、最短でも5分間、マイクロキャリアビーズを沈降させて、使用済み培地の約90%を除去した。次いで、加温した新鮮な培地(12.5LのDMEM培地、IX型トリプシンを含む)をポンプでバイオリアクターに入れた。次いで、BRV培地2.5Lをそこに加えた。いったん感染が完了したら(例えば、PO2が、回復することなく20%のセットポイントを超えるまで移動した後、24時間以内)、約15〜20分間、約75rpmでの振盪撹拌を行ってから、収穫した。
A.ウサギでの実験
この実験は、従来のβ−プロピオラクトン不活化プロトコルを用いて調製したBR(BPL−BR)または実施例1に記載の加熱不活化手順を用いて調製したBR(「HI−BR」と名付ける)で免疫を与えたウサギ(これまでにウシロタウイルス抗原(BR)に曝露したことがない)の血清学的応答を比較した。Emulsigenで免疫賦活した6種のワクチン(30% Emulsigen D)で検査した。抗原を投与する前に、ウサギを出血させて、ベースラインとなる幾何平均力価(GMT)を得た。ウサギには、0(±2)日目に、1.25mlの初回抗原刺激用量を皮下投与し、20(±2)日目に追加免疫用量を皮下投与した。処置群は、表1に示すとおりに体系化された:
この実験は、これまでにロタウイルスでワクチン接種されたことがないウシ属動物(天然のBRV宿主)に、従来のβ−プロピオラクトン不活化プロトコル(BPL−BR)を用いて調製したウシロタウイルス抗原(BR)または実施例1に記載の加熱不活化手順(HI−BR)を用いて調製したウシロタウイルス抗原(BR)を投与して、血清学的応答を比較した。Emulsigenで免疫賦活した6種のワクチン(30% Emulsigen D)で検査した(表3)。動物には、0日目に5mlの初回抗原刺激用量を筋肉内(IM)投与(頚部にて)し、検査84日目(免疫化から12週間後)に追加免疫用量を投与(同じくIM)した。検査0日目(出血前;動物は、初乳受動導入のため、典型的には、いくらかの抗BRV抗体を有する)、14、28、56、84、98、および112日目に採取した血清試料から、抗体レベルを測定した。いったん採取したら、血清を−20℃で貯蔵した。ウイルス中和アッセイは、基本的に上記に記載のとおりに行ったが、ただしウイルス溶液は、希釈培地で、1:2、次いで10−1、10−2、10−3、10−4、および10−5と系列的に希釈した。処置群は、表3に示すとおりに体系化された:
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1] 不活化ロタウイルスを製造する方法であって、活性ロタウイルスを含有するある体積の細胞培養物上清を、前記ロタウイルスが不活化する温度に直接加熱することを含む、方法。
[2] 前記細胞培養物上清は、200〜500mOsmの範囲のオスモル濃度、約1mM〜15mMの範囲の二価カチオン塩濃度、ならびに約1〜20重量/体積%の範囲の糖および/または糖アルコールの1つ以上を有さない、[1]に記載の方法。
[3] 前記不活化ロタウイルスは、免疫原性である、[1]に記載の方法。
[4] 前記不活化ロタウイルスの免疫原性は、化学的に不活化されたロタウイルスの免疫原性より優れている、[3]に記載の方法。
[5] 前記化学的に不活化されたロタウイルスは、β−プロピオラクトンを用いて不活化されたものである、[4]に記載の方法。
[6] 前記細胞培養物上清は、加熱の前に濾過される、[1]に記載の方法。
[7] 前記不活化ロタウイルスは、前記ロタウイルスが不活化された後に、前記細胞培養物上清から単離される、[1]に記載の方法。
[8] 前記ロタウイルスは、ウシロタウイルスである、[1]に記載の方法。
[9] 前記温度は、少なくとも約60℃である、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10] 前記温度は、約60〜80℃である、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[11] 前記温度は、約65℃、70℃、75℃、および80℃のいずれかからなる群より選択される、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[12] 前記培養物上清の前記温度は、少なくとも約15分間維持される、[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[13] 前記培養物上清の前記温度は、少なくとも約60分間維持される、[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[14] 前記培養物上清の前記温度は、少なくとも約120分間維持される、[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[15] 前記培養物上清の前記温度は、少なくとも約240分間維持される、[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[16] 前記細胞培養物上清は、実質的に全体積が前記温度に加熱される、[1]〜[15]のいずれかに記載の方法。
[17] 前記培養物上清は、全体積が前記温度に加熱される、[16]に記載の方法。
[18] 前記細胞培養物上清を凍結することをさらに含む、[1]〜[17]のいずれかに記載の方法。
[19] 前記凍結する工程は、少なくとも約12時間行われる、[18]に記載の方法。
[20] 前記細胞培養物上清を、少なくとも2つの別個の工程で後から加熱することをさらに含む、[18]または[19]に記載の方法。
[21] 最初の加熱および後からの加熱の温度は、略同一である、[20]に記載の方法。
[22] 前記細胞培養物上清のpHは、7.6±0.1である、[1]〜[21]のいずれかに記載の方法。
[23] 不活化ロタウイルスを製造する方法であって、
ロタウイルスに感染した培養細胞から、活性ロタウイルスを含有する細胞培養物上清を収集することと、
ある体積の前記細胞培養物上清を、前記ロタウイルスが不活化する温度に直接加熱することと
を含む、方法。
[24] 前記細胞培養物上清は、200〜500mOsmの範囲のオスモル濃度、約1mM〜15mMの範囲の二価カチオン塩濃度、ならびに約1〜20重量/体積%の範囲の糖および/または糖アルコールの1つ以上を有さない、[23]に記載の方法。
[25] 前記不活化ロタウイルスは、免疫原性である、[23]に記載の方法。
[26] 前記不活化ロタウイルスの免疫原性は、化学的に不活化されたロタウイルスの免疫原性より優れている、[25]に記載の方法。
[27] 前記化学的に不活化されたロタウイルスは、β−プロピオラクトンを用いて不活化されたものである、[26]に記載の方法。
[28] 活性ウイルスが存在しないことを確実にするために、直接加熱された前記細胞培養物上清中の前記ロタウイルスを検査する工程をさらに含む、[23]に記載の方法。
[29] 直接加熱する工程の前に、前記細胞培養物上清を濾過する工程をさらに含む、[23]に記載の方法。
[30] 直接加熱された前記細胞培養物上清から前記不活化ロタウイルスを単離する工程をさらに含む、[23]に記載の方法。
[31] 直接加熱された前記細胞培養物上清を凍結する工程をさらに含む、[23]に記載の方法。
[32] [1]〜[31]のいずれかに記載の方法により不活化されたロタウイルスを含む、組成物。
[33] アジュバントをさらに含む、[32]に記載の組成物。
[34] 1種以上の薬学的に許容可能な担体をさらに含む、[32]に記載の組成物。
[35] ロタウイルス以外の1種以上の感染因子に由来する1種以上の抗原をさらに含む、[32]に記載の組成物。
[36] 対象における免疫応答を刺激する方法であって、[32]〜[35]のいずれかに記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
[37] 前記対象は、ウシ属動物である、[36]に記載の方法。
[38] 前記組成物は、前記対象に、少なくとも2回投与される、[36]に記載の方法。
[39] 前記2回の投与は、時間間隔をおいて行われる、[38]に記載の方法。
[40] 前記時間は、約2〜12週間である、[39]に記載の方法。
[41] 前記組成物は、前記対象に、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、結節内、鼻腔内、および経口からなる群より選択される経路を介して投与される、[36]〜[40]のいずれかに記載の方法。
[42] [32]〜[35]のいずれかに記載の組成物を、対象に投与することにより産生される、1種または複数の抗体。
[43] [36]〜[41]のいずれかに記載の方法を用いて産生される、[42]に記載の1種または複数の抗体。
[44] [42]に記載の1種または複数の抗体を動物に投与することにより、ロタウイルスを中和する方法。
[45] 前記動物は、ウシ属である、[44]に記載の方法。
Claims (25)
- 不活化ロタウイルスを製造する方法であって、活性ロタウイルスを含有するある体積の細胞培養物上清を、前記ロタウイルスが不活化する温度に直接加熱することを含み、前記細胞培養物上清は、200〜500mOsmの範囲のオスモル濃度、1mM〜15mMの範囲の二価カチオン塩濃度、ならびに1〜20重量/体積%の範囲の糖および/または糖アルコールの1つ以上を有さない、方法。
- 前記不活化ロタウイルスは、免疫原性である、請求項1に記載の方法。
- 前記不活化ロタウイルスの免疫原性は、化学的に不活化されたロタウイルスの免疫原性より優れている、請求項2に記載の方法。
- 前記ロタウイルスは、ウシロタウイルスである、請求項1に記載の方法。
- 前記温度は60〜80℃である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記温度は70℃である、請求項5に記載の方法。
- 前記培養物上清の前記温度は15分〜240分間維持される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養物上清の前記温度は15分〜60分間維持される、請求項7に記載の方法。
- 前記培養物上清の前記温度は60分間維持される、請求項8に記載の方法。
- 前記細胞培養物上清を凍結することをさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養物上清を、少なくとも2つの別個の工程で加熱することを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養物上清のpHは、7.6±0.1である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法により不活化されたロタウイルスを含む、組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項13に記載の組成物。
- 1種以上の薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項13または14に記載の組成物。
- ロタウイルス以外の1種以上の感染因子に由来する1種以上の抗原をさらに含む、請求項13〜15のいずれか一項に記載の組成物。
- 非ヒト対象における免疫応答を刺激する方法であって、請求項13〜16のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記対象は、ウシ属動物である、請求項17に記載の方法。
- 前記組成物は、前記対象に、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、結節内、鼻腔内、および経口からなる群より選択される経路を介して投与される、請求項17または18に記載の方法。
- 非ヒト対象における免疫応答を刺激するための、請求項13〜16のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 前記対象は、ウシ属動物である、請求項20に記載の使用。
- 前記組成物は、前記対象に、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、結節内、鼻腔内、および経口からなる群より選択される経路を介して投与される、請求項20または21に記載の使用。
- 非ヒト対象における免疫応答を刺激するための医薬の製造における、請求項13〜17のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 前記対象は、ウシ属動物である、請求項23に記載の使用。
- 前記組成物は、前記対象に、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、結節内、鼻腔内、および経口からなる群より選択される経路を介して投与される、請求項23または24に記載の使用。
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