CN105451764B - 用于制备灭活的轮状病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

公开的是用于由含有活性或感染性轮状病毒（例如牛轮状病毒）的细胞培养上清液直接产生灭活的轮状病毒的方法，而无需来自细胞培养上清液的轮状病毒的先前分离或纯化。在一些实施方案中，灭活的轮状病毒（例如牛轮状病毒）通过将一定体积的培养上清液加热至至少在其下轮状病毒被灭活的温度而产生。在一些实施方案中，一旦整个体积加热至至少在其下轮状病毒被灭活的温度，轮状病毒（例如牛轮状病毒）就被灭活。在一些实施方案中，细胞培养上清液的温度维持合适时间量，其可以使用本文描述的测试中的任一种进行确定。灭活的轮状病毒（例如牛轮状病毒）随后可以从培养上清液中分离。

Description

用于制备灭活的轮状病毒的方法
领域
本公开内容涉及由细胞培养上清液直接产生灭活的轮状病毒。还公开的是含有由细胞培养上清液直接产生的灭活的轮状病毒的组合物。
背景
一类病毒疫苗含有灭活的病毒。活性或感染性病毒可被灭活，使得它们不再是感染性的且不再能够复制以产生子代病毒。然而，为了在疫苗中有效，当施用于主体时，灭活的病毒仍必须保留其刺激免疫应答（即保留免疫原性）的能力。
存在用于灭活轮状病毒的不同方法。在一种方法中，轮状病毒可以使用化学品进行灭活。在一个例子中，β-丙内酯可以用作化学品。
在用于灭活轮状病毒的另一种方法中，可以使用加热轮状病毒（热灭活）。在用于加热灭活轮状病毒的已知方法中，在热灭活前，病毒从它们通常在其中发现的环境中分离或纯化。在一个例子中，在加热或热灭活之前，在培养的细胞上繁殖的轮状病毒从未受病毒感染的细胞已在其中生长的细胞培养基或上清液中分离（PCT公开号WO2009/032913）。在一个例子中，经分离的轮状病毒随后悬浮于水性缓冲液中，所述水性缓冲液具有特定摩尔渗透压浓度（例如200-500 mOsm）、特定浓度的二价阳离子盐（在约1 mM - 15 mM范围内）、以及特定量的糖和/或糖醇（在约1 - 20% w/v范围内）（PCT公开号WO2009/032913）。随后将在水性缓冲液中悬浮的经分离的轮状病毒热灭活，所述水性缓冲液具有特定摩尔渗透压浓度、二价阳离子浓度和糖/糖醇浓度。
概述
公开了通过加热细胞培养上清液，用于由含有活性或感染性轮状病毒的细胞培养上清液产生灭活的轮状病毒的方法。在一个例子中，轮状病毒是牛轮状病毒。在一个例子中，用于产生灭活的轮状病毒的方法包括将一定体积的含有活性轮状病毒的细胞培养上清液直接加热至在其下轮状病毒被灭活的温度。一般地，测试已直接加热的细胞培养上清液中的轮状病毒，以确保用于加热的温度和时间足够，并且活性或感染性病毒不再存在。在一个例子中，细胞培养上清液不含下述中的一种或多种：在200-500 mOsm范围内的摩尔渗透压浓度、在约1 mM - 15 mM范围内的二价阳离子盐浓度、以及在约1 - 20%重量/体积范围内的糖和/或糖醇。灭活的轮状病毒是免疫原性的。一般地，加热灭活的轮状病毒的免疫原性优于化学灭活，例如用β-丙内酯化学灭活的轮状病毒的免疫原性。在各个例子中，细胞培养上清液可以在加热前进行过滤。在热灭活后，灭活的轮状病毒可以从细胞培养上清液中分离。培养细胞上清液中的轮状病毒的热灭活可以通过在至少约60℃，或65℃、70℃、75℃或80℃中任一的温度下加热来完成。这些温度一般维持持续时间，在所述持续时间后，轮状病毒是灭活的。在各个例子中，这可以是15分钟、60分钟、120分钟、240分钟及其他持续时间。一般地，细胞培养上清液的基本上整个体积加热至该温度给定时间。在一个例子中，细胞培养上清液的整个体积加热至至该温度给定时间。在一个例子中，该方法还可以包括冷冻步骤。细胞培养上清液的冷冻可以进行至少约12小时或其他持续时间。在一些情况下，已加热随后冷冻的细胞培养上清液可以解冻且再次加热，在一个例子中，在与初始加热步骤相同的温度下和相同的持续时间。在一个例子中，细胞培养上清液的pH为7.6 + 0.1。
在另一个例子中，用于产生灭活的轮状病毒的方法包括从由轮状病毒感染的培养细胞中收集含有活性轮状病毒的细胞培养上清液，并且将一定体积的细胞培养上清液直接加热至在其下轮状病毒被灭活的温度。在各个例子中，可以包括一个或多个另外的步骤。例如，细胞培养上清液可以在直接加热前进行过滤，细胞培养上清液可以在它已直接加热后进行冷冻，和/或轮状病毒可以在它已直接加热后从细胞培养上清液中分离。一般地，轮状病毒在直接加热后进行测试，以确保不存在活性、感染性病毒。
还公开的是包含通过本文描述的方法灭活的轮状病毒的组合物。除通过公开的方法灭活的轮状病毒之外，所述组合物还可以含有一种或多种佐剂和/或药学可接受的载体。各种组合物还可以含有来自除了轮状病毒外的一种或多种感染剂的抗原。
还公开的是用于刺激主体中的免疫应答的方法，其包括给主体施用含有通过本文描述的方法灭活的轮状病毒的组合物。在一个例子中，主体是牛类动物。在一个例子中，组合物施用于主体至少两次。多重施用可以通过各种时间段分开，在一个例子中，在约二至十二周。在该方法中，组合物可以使用各种途径施用于主体，所述途径如皮下、静脉内、肌内、皮内、结节内、鼻内和经口。
还公开的是通过给主体施用由要求保护的组合物产生的抗体。所述抗体可以用于通过给动物施用抗体来中和轮状病毒的方法中。
详述
定义
在本文中，“轮状病毒”意指来自呼肠病毒科（Reoviridae）的轮状病毒中的任一种。轮状病毒可以感染人或动物物种（例如A. B、C、D、E、F和/或G组轮状病毒中的任一种），包括其任何毒株、血清型、基因型和/或重配株（reassortant）。在一个例子中，轮状病毒感染牛类动物。可以使用本文描述的方法制备的用于人使用的示例性商购可得的疫苗可以包括Rotarix®（GlaxoSmithKline）、RotaTeq®（Merck Sharp & Dohme Corp.）和/或ROTOVAC（Bharat Biotech International）。可以使用本文描述的方法制备的用于人使用的示例性商购可得的疫苗可以包括Equine Rotavirus Vaccine（Pfizer）、Calf RotavirusDiarrhoea Vaccine（Inactivate）、Rotavec® Corona（Merck Sharp & Dohme AnimalHealth）、Calf-Guard（Pfizer Animal Health）等等。本文描述的方法还可以用于制备用于在非人动物例如牛类、马类和猪类个体/群体中使用的疫苗。
在本文中，“活性轮状病毒”或“活轮状病毒”意指其为感染性或能够繁殖以产生子代病毒的轮状病毒。
在本文中，“无活性轮状病毒”或“死轮状病毒”意指并非感染性或不能繁殖以产生子代病毒的轮状病毒。此类病毒有时可以被称为被杀死的或灭活的。在本文中，无活性轮状病毒通过加热处理由活性轮状病毒产生。
在本文中，“细胞培养上清液”或“培养上清液”意指已用于支持培养细胞生长的培养基。一般地，在本文中，细胞已由轮状病毒感染，并且细胞培养上清液含有通过受感染细胞产生的活性子代轮状病毒。
在本文中，就轮状病毒而言的“直接加热一定体积的细胞培养上清液”一般指将细胞培养上清液加热至温度和时间，以产生轮状病毒的完全灭活，而无需来自细胞培养上清液的轮状病毒的任何先前分离或纯化。因此，在细胞培养上清液中的病毒的热灭活之前，不发生来自细胞培养上清液的轮状病毒的分离或纯化。
在本文中，“经分离的轮状病毒”意指已与细胞培养上清液分离或纯化的轮状病毒。在一个例子中，轮状病毒可以通过高速离心（以使病毒形成团块）与细胞培养上清液分离开，并且随后可以悬浮于水性缓冲液中。含有轮状病毒的水性缓冲液随后可以加热，以热灭活其中的轮状病毒。本文描述的本发明方法不要求从细胞培养上清液中分离轮状病毒。
直接来自细胞培养上清液的轮状病毒
本文公开的是通过将一定体积的含有活性轮状病毒的培养上清液直接加热至在其下轮状病毒被灭活的温度（例如热灭活），用于产生灭活的轮状病毒的方法，以及含有以这种方式灭活的轮状病毒的组合物。“直接加热一定体积的包含活轮状病毒的细胞培养上清液”通常意指在应用加热用于灭活轮状病毒之前，除收集用于加工之外，含有活性（例如活的、感染性、能够繁殖以产生子代病毒）轮状病毒的培养上清液不进行处理或操作（例如，无“预处理”）。病毒在加热处理之前不从培养上清液中分离或纯化。灭活的轮状病毒一般指并非活性、并非感染性和不能繁殖以产生子代病毒（例如不是生产性的）的病毒。灭活的轮状病毒可以被称为被杀死的、死的和/或非生产性的。一般地，至少用于包括在疫苗中的目的，希望当施用于主体时，灭活的轮状病毒保留免疫原性（例如刺激免疫应答的能力）。一般地，本文描述的方法导致细胞培养上清液内含有的活性轮状病毒的完全灭活 - 不保留活性轮状病毒。
由所公开方法得到的灭活的轮状病毒是免疫原性的，意指它对主体的施用在主体中刺激或产生免疫应答。一般地，与施用相等量的化学（在一种情况下，使用β-丙内酯）灭活的轮状病毒相比较，使用本文描述的方法灭活的轮状病毒在主体中刺激更佳的免疫应答（即，热灭活的轮状病毒是更具免疫原性的）。因此，热灭活的轮状病毒的免疫原性优于化学灭活的轮状病毒的免疫原性。因此，热灭活的轮状病毒的免疫原性可以优于例如化学灭活的轮状病毒的免疫原性。主体中的免疫应答可以使用本领域已知的各种方法进行测量。
在直接加热一定体积的包含轮状病毒的细胞上清液（例如其还可以被称为培养细胞上清液）的一个例子中，在用于灭活的加工（例如加热等）之前，培养上清液可以进行过滤（例如使用70、1.0和/或0.45 μm注射器式滤器等等），但在某些实施方案中，这不视为培养上清液的预处理。过滤一般可以去除细胞碎片，但不从培养上清液中分离或纯化病毒。然而，通常地，如果执行过滤，则它在至少一个加热步骤后（例如，如实施例1中）。现有技术过程通常要求在灭活轮状病毒之前的某一些分离步骤、纯化或病毒浓缩步骤。本文描述的方法通常不要求在灭活前的分离步骤。因此，在本文公开的方法中，轮状病毒无需在加热灭活之前是“经分离的”（例如从它们通常在其中发现的环境例如培养细胞上清液中分开）。
在所公开方法的一个例子中，收集来自已由轮状病毒感染的培养细胞的培养基，并且任选去除细胞碎片（例如通过过滤或低速离心），但轮状病毒不从细胞培养基中分离或纯化。含有轮状病毒的培养基随后进行加热处理，以热灭活轮状病毒。
另外，本文描述的方法不要求轮状病毒在灭活前处于任何特定稀释剂缓冲液中。一般地，在加热处理之前，轮状病毒可以在其中病毒可以保持活性的任何液体环境中（例如不灭活病毒的条件）。例如，细胞培养上清液（或培养细胞上清液）不要求显示出任何特定摩尔渗透压浓度、盐类型和/或浓度（例如任何特定类型和/或量的二价阳离子盐诸如CaCl2、MgCl2和/或MgSO4）、糖或糖醇（例如山梨糖醇、甘露醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和/或海藻糖），以便使上清液充当适当的原材料（尽管取决于使用的细胞培养基类型，可以存在这些组分中的一种或多种）。本文描述的方法提供了轮状病毒的灭活，而无需首先在稀释剂缓冲液中制备轮状病毒，所述稀释剂缓冲液在其中具有预先确定的摩尔渗透压浓度、盐和/或盐浓度、糖或糖醇（尽管，再次，取决于使用的细胞培养基类型，可以存在这些组分中的一种或多种）。例如，在加热灭活之前，不要求，但可以存在稀释剂缓冲液例如水性缓冲液，如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、马来酸盐缓冲液、PIPES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、组氨酸缓冲液、和/或NaHCO3缓冲液，含或不含特定pH（例如pH 5-9）。另外，这些方法不要求任何特定氨基酸、维生素等等或其任何特定量的存在或不存在。随后，在一些实施方案中，本文描述的方法提供用于直接加热一定体积的包含活轮状病毒（例如牛轮状病毒）的任何类型的细胞培养上清液，而无需限定任何显示于和/或存在于细胞培养上清液中的特定摩尔渗透压浓度、盐或盐浓度、糖和/或糖醇、缓冲液、氨基酸和/或维生素、pH。因此，在各个实施方案中，待灭活的轮状病毒可以包含或存在于适合于培养哺乳动物细胞的任何细胞培养基（例如尤其是支持轮状病毒（例如牛轮状病毒）通过此类细胞感染和产生的那些）中。
在所公开方法的一个例子中，含有待热灭活的轮状病毒的培养细胞上清液不具有下述中的一种或多种：在200-500 mOsm范围内的摩尔渗透压浓度、在约1 mM - 15 mM范围内的二价阳离子盐浓度、以及在约1 - 20% w/v范围内的糖和/或糖醇。二价阳离子的示例盐可以包括但不限于CaCl2、MgCl2和MgSO4。糖可以是单糖或二糖。示例糖和糖醇可以包括但不限于山梨糖醇、甘露醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖。
因此，本文描述的过程的优点在于技术人员可以简单地获得细胞培养上清液，并且开始对其加工，而无需任何初始预处理和/或纯化步骤。此类步骤当然可以在加热灭活步骤之后和/或之间执行，以最终提供经分离的、灭活的轮状病毒和/或其免疫原性抗原。
轮状病毒的热灭活
灭活可以通过获得包含活性轮状病毒的细胞培养上清液，且将其加热至在其下轮状病毒变得无活性的温度来完成。活的、感染性和/或生产性感染的轮状病毒通常为能够感染细胞且在其中产生子代的轮状病毒。非感染性和/或非生产性感染的轮状病毒是不能感染细胞和/或不能在其中产生子代的轮状病毒。在一些实施方案中，细胞培养上清液加热至其和/或在其下的温度是在其下轮状病毒被灭活的温度（“灭活温度”，例如约70℃，诸如65℃、67℃、69℃、70℃、72.5℃、75℃、77.5℃或80℃）。加热步骤通常在容器（例如管或烧瓶）内发生。在加热后，细胞培养上清液可以转移至新容器。在一些实施方案中，使用多个加热步骤。在此类实施方案中，第一个加热步骤可以被称为初始加热步骤。初始加热步骤可以任选随后为冷冻步骤，其中细胞培养上清液在合适温度（例如约-80℃）下冷冻合适时间段（例如一小时至过夜（例如八小时）或更久）。任选的冷冻步骤通常在新容器中执行。该冷冻步骤随后可以是第二个加热步骤，例如使用与初始加热步骤大约相同的条件（例如灭活温度），以产生灭活的轮状病毒制剂。灭活的轮状病毒制剂随后可以冷冻直至需要时（例如用于测试和/或用于疫苗中）。
在一些实施方案中，初始加热步骤可以是灭活轮状病毒所需的唯一加热步骤（例如第二个加热步骤可以是不需要的）。在这样的实施方案中，初始加热步骤可以通过将培养上清液的整个体积的温度升高至灭活温度且立即进行下一步（例如冷冻）而进行。因此，在这样的实施方案中，整个体积一达到灭活温度，细胞培养上清液就进一步加工（例如进行下一步）。在其他实施方案中，在进一步加工（例如进行下一步）之前，培养上清液可以在灭活温度下维持合适时间量（例如约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150分钟中的任一种）。第二个加热步骤可以如对于初始加热步骤所述的进行（例如整个体积一达到灭活温度就进一步加工或在灭活温度维持合适时间段之后）。冷冻步骤通常将第一个和第二个加热步骤分开。冷冻还可以用于贮存已加热的培养上清液，使得其中的轮状病毒被灭活。
在某些实施方案中，过程可以包括将细胞培养上清液的温度升高至适当温度（例如约70℃）适当时间量（例如约两小时），任选随后在加热合适时间段（例如约八小时）后冷冻细胞培养上清液，并且随后任选将细胞培养上清液再加热至适当温度（例如约70℃）适当时间量（例如约两小时）。培养上清液随后可以通过适当滤器（例如10或70 μm滤器）进行过滤。
测试加热的轮状病毒以确保灭活
通常，测试已进行处理以灭活病毒的轮状病毒制剂，以确保活性病毒不存在于制剂中（即，确保制剂仅含灭活的病毒）。使用的测试一般会检测活性病毒（例如活的、感染性、能够繁殖以产生子代病毒）。在测试的一个例子中，已进行处理以灭活病毒的制剂或部分制剂用于感染允许通过轮状病毒感染的任何细胞。制剂中的活性病毒的存在可以通过例如固定细胞且用试剂染色进行测定，所述试剂用于鉴定细胞中的轮状病毒，如上所述。其他检测活性病毒的方法可以通过使用一种或多种感染中心测定，以确定子代病毒是否通过细胞产生。可以使用各种方法。
例如，来自细胞培养上清液可以由其获得的细胞可以包括允许通过轮状病毒感染和轮状病毒复制的任何细胞（例如MA104、MDBK、VERO及其他细胞）。细胞可以例如在板上、在滚瓶中、在生物反应器中、或使用本领域已知的任何方法进行生长。为了产生合适的细胞培养上清液，细胞可以在合适量（例如0.003的MOI）的活牛轮状病毒的存在下，在适当条件下（例如37℃、5% CO2）培养合适时间量（例如两小时）。每种样品随后可以进行过滤（例如使用注射器式滤器（例如1.0 μm））并且沉积到新容器内。样品随后可以通过例如如本文描述的加热进行处理，并且任选转移至新容器。因为样品通常在处理后进行冷冻，所以各自可以连同非灭活样品（例如阳性对照样品）一起解冻。测试样品随后可以进行浓缩（例如10X）。随后可以制备每种测试样品的系列稀释（例如十倍系列稀释）。建立的测试细胞（三天培养物、单层、100%汇合（例如MA104细胞）随后可以进行洗涤，并且将培养基替换为适当培养基（例如0% DME（HyClone））。测试样品随后可以加入含有测试细胞的每个孔/生物反应器（例如GEHollow Fiber，RFP-50-C-3MA）中，随后为适当的温育期（例如在37℃、5% CO2下两小时），以允许轮状病毒吸附至细胞。细胞随后可以进行洗涤，且用培养基（例如，含有20 ml/L L-谷氨酰胺（ASL 31012）和2 ml/L胰蛋白酶的DME（HyClone））再补料。在适当的时间量（例如三天）后，细胞可以进行固定（例如使用80%丙酮）且由用于鉴定轮状病毒的试剂（例如牛轮状病毒单克隆抗体，随后为检测试剂（例如二级抗体））进行染色，并且分析在细胞上的抗轮状病毒抗体的存在。通常，在任何阴性对照或其中轮状病毒已灭活的样品中无法检测到轮状病毒。相比之下，阳性对照样品以及其中轮状病毒未被灭活的那些将被阳性染色。
热灭活的轮状病毒的使用
本文描述的方法可以用于产生用于施用于主体的疫苗。如本文使用的，“主体”或“宿主”通常意指个体。主体或宿主可以包括驯养动物，例如猫和犬、家畜（例如，牛、马、猪、绵羊和山羊）、实验室动物（例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠）和鸟类。在一些实施方案中，主体或宿主可以是哺乳动物例如灵长类动物或人。
因此，本公开内容还描述了通过给其施用包含如本文描述的灭活的轮状病毒的组合物，用于在主体中刺激对于轮状病毒特异性的免疫应答和/或针对轮状病毒使主体免疫接种的方法。本公开内容还描述了在施用中使用的灭活的轮状病毒和含有轮状病毒的组合物。此类方法和组合物可以包括此类灭活的轮状病毒（或包含灭活轮状病毒的制剂）与一种或多种药学可接受的载体的组合，以产生适合于对其施用的制剂。示例性合适的药学载体及其配制可以在例如Remington’s: The Science and Practice of Pharmacy，第21版，David B. Troy，编辑，Lippicott Williams & Wilkins（2005）中描述。适当量的药学可接受的盐可以用于制剂中，以致使制剂等渗。药学可接受的载体的例子包括但不限于无菌水、盐水、缓冲溶液如林格氏溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH一般为约5至约8或约7至约7.5。药物组合物还可以包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性试剂、佐剂、免疫刺激剂。对于本领域技术人员显而易见的是，取决于例如施用途径和待施用的组合物的浓度，某些载体可以是更优选的。
药物组合物还可以包括一种或多种活性成分诸如抗微生物剂、抗炎剂和麻醉剂。除了灭活的轮状病毒外，药物组合物还可以包括来自其他介质的另外抗原。含有来自多种介质的抗原的此类组合物可以被称为组合疫苗。
还可以包括佐剂以刺激或增强免疫应答。合适类别的佐剂的非限制性例子包括尤其是下述的那些：凝胶型（即，氢氧化铝/磷酸铝（“铝佐剂”））、 磷酸钙、微生物来源（胞壁酰二肽（MDP））、细菌外毒素（霍乱毒素（CT）、天然霍乱毒素B亚基（CTB）、大肠杆菌（E. coli）不耐热毒素（LT）、百日咳毒素（PT）、CpG寡核苷酸、BCG序列、破伤风类毒素，例如大肠杆菌、明尼苏达沙门氏菌（Salmonella minnesota）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、或Shigella exseri的单磷酰脂A（MPLA））、微粒佐剂（生物可降解的聚合物微球体）、免疫刺激复合物（ISCOM））、油乳剂和基于表面活性剂的佐剂（弗氏不完全佐剂（FIA）、微流体化乳剂（MF59、SAF）、皂苷（QS-21）、Emusligen®（例如，Emulsigen® D））、合成（胞壁酰二肽衍生物（莫拉丁酯、threony-MDP）、非离子型嵌段共聚物（L121）、聚磷腈（PCCP）、合成多核苷酸（聚A:U、聚I:C）、沙利度胺衍生物（CC-4407/ ACTIMID））、RH3-配体、或聚丙交酯乙交酯（PLGA）微球体、3-脱-O-酰化单磷酰脂质A（3D-MPL）。这些毒素中任一种的片段、同系物、衍生物和融合物也是合适的，条件是它们保留佐剂活性。
免疫原性组合物可以例如是药物组合物和/或制剂，其在施用于宿主（例如动物）后，诱导或增强针对组合物（例如灭活的轮状病毒）内包含的轮状病毒抗原（例如免疫原）的免疫应答。此类应答可以包括抗体（例如通过刺激B细胞）或基于T细胞的应答（例如细胞裂解性应答）的生成，如上所述，其可以是保护性或中和性的（例如或不是）。保护性或中和性免疫应答可以是对轮状病毒有害（例如包含其的细胞）且对宿主有益（例如通过诱导或预防感染）的免疫应答。如本文使用的，保护性或中和性抗体和/或细胞应答可以与如本文所述制备的轮状病毒和/或容纳其的细胞反应。当在动物中测试时，这些抗体和/或细胞应答可以减少或抑制轮状病毒感染的严重性、时间和/或致命性。免疫学组合物可以是在施用于宿主后，导致治疗（例如通常在活性感染期间施用）和/或保护性（例如通常在活性感染之前或之后施用）和/或中和性免疫应答的组合物。此类免疫学组合物还可以视为疫苗。
因此，在一些实施方案中，还提供了用于治疗和/或预防轮状病毒感染的方法。还提供了用于治疗哺乳动物宿主中通过轮状病毒引起或涉及轮状病毒的一种或多种疾病状况的方法，其包括给哺乳动物施用至少一个或多个有效剂量的如本文所述制备的灭活的轮状病毒（例如和/或含有其的一种或多种组合物和/或制剂）。一般地，给主体施用灭活的轮状病毒刺激对于主体中的轮状病毒特异性的免疫应答。灭活的轮状病毒可以以适当的剂量量施用。灭活的轮状病毒可以施用一次或多次；当施用发生超过一次时，各自可以是相同或不同剂量中。在某些实施方案中，灭活的轮状病毒和/或其抗原可以通过任何途径和在合适的剂量量中施用于主体约一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多次。合适的施用途径可以包括例如皮下、静脉内、肌内、皮内、结节内、鼻内和/或经口。剂量还可以通过相同或不同间隔在时间中彼此分开。例如，剂量可以通过下述中的任一分开：约6、12、24、36、48、60、72、84或96小时，一周，二周，三周，一个月，两个月，三个月，四个月，五个月，六个月，七个月，八个月，九个月，10个月，11个月，12个月，1.5年，2年，3年，4年，5年，或这些时间段中任一之前、之后和/或之间的任何时间段。在一些实施方案中，灭活的轮状病毒可以单独或与其他试剂（例如抗生素、其他疫苗、营养素等）结合施用。此类其他试剂可以约同时和/或在不同时间和/或以不同频率施用。此类方法的其他实施方案还可以是适当的，如可以通过普通技术人员任意确定的。
还提供的是用于引发抗体产生的方法，所述抗体对如本文所述制备的灭活的轮状病毒可以是保护性和/或中和性的，和/或可以是反应性的。本文还提供了使用此类抗体的组合物和方法。制备且利用各种类型的抗体的方法是本领域技术人员众所周知的，并且将适合于使用（参见例如Harlow，等人Antibodies: A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，1988；Harlow，等人Using Antibodies: A Laboratory Manual， Portable Protocol No. 1，1998；Kohler和Milstein，Nature，256:495（1975））；Jones等人Nature，321:522-525（1986）；Riechmann等人Nature，332:323-329（1988）；Presta（Curr.Op. Struct. Biol.，2:593-596（1992）；Verhoeyen等人（Science，239:1534-1536（1988）；Hoogenboom等人，J. Mol. Biol.，227:381（1991）；Marks等人，J. Mol. Biol.，222:581（1991）；Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，第77页（1985）；Boerner等人，J. Immunol.，147（1）:86-95（1991）；Marks等人，Bio/Technology10，779-783（1992）；Lonberg等人，Nature 368 856-859（1994）；Morrison，Nature 368812-13（1994）；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14，845-51（1996）；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826（1996）；Lonberg和Huszar，Intern. Rev. Immunol. 1365-93（1995）；以及美国专利号4,816,567；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016）。在某些应用中，抗体可以包含在杂交瘤上清液或腹水内，并且直接像这样利用或在使用标准技术浓缩后利用。在其他应用中，抗体可以使用例如盐分馏和离子交换层析，或使用与固体支持物诸如琼脂糖珠共价偶联的蛋白A、蛋白G、蛋白A/G和/或蛋白L配体的亲和层析，或这些技术的组合进一步纯化。抗体可以以任何合适形式贮存，包括作为冷冻制剂（例如约-20℃或-70℃），以冻干形式，或在正常冷藏条件下（例如约4℃）。当以液体形式贮存时，优选利用合适缓冲液诸如Tris缓冲盐水（TBS）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）。抗体及其衍生物可以掺入本文描述的组合物内，用于在体外或体内使用。在一些实施方案中，一种抗体、多种抗体和/或抗体混合物可以与轮状病毒反应，并且可以用于预防和/或治疗轮状病毒感染（例如通过被动免疫接种）。制备和使用抗体的其他方法（例如用于检测轮状病毒）是本领域技术人员可用的，并且还可以是适合使用的，如由本领域普通技术人员容易确定的。
本文描述的材料中的任一种的有用性（例如免疫原性）可以通过本领域技术人员已知的各种方法中的任一种进行测定，包括本文描述的那些（例如使用哺乳动物细胞的病毒血清中和测定）。本文描述的任何一种或多种测定，或者任何其他一种或多种合适测定，可以用于确定本文描述的材料中的任一种用于预期目的的适合性。应当理解这些方法是示例性和非限制性的；其他测定也可以是合适的。在某些实施方案中，优选包含如本文所述灭活的轮状病毒的组合物和/或制剂显示出免疫原性特性（例如在施用于宿主后，诱导可检测和/或中和性和/或保护性免疫应答）。中和性和/或保护性免疫应答的存在可以通过下述加以证实：与材料未施用于其的主体相比较，显示经由轮状病毒的感染在灭活的轮状病毒已施用于其的个体（例如人类或其他动物）受到影响（例如减少）。可以用于作出此类确定的合适动物模型可以包括例如如本文实施例中描述的兔和/或牛。例如，一种或多种测试动物（例如兔、牛或相似模型）可以施用（例如皮下、肌内、皮内、鼻内）如本文所述制备的灭活的轮状病毒，并且随后在合适的时间量（例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周）后，进行测定以鉴定抗轮状病毒抗体和/或免疫细胞（例如T细胞）的产物，和/或通过活轮状病毒进行攻击以确定动物是否免于感染和/或感染严重性是否减少。在施用和/或攻击后，使用标准技术（例如病毒中和测定、ELISA），动物可以就免疫功能（例如T细胞活性、抗体生产）进行监控。可以就总抗体应答和/或特定亚型的存在对血清进行分析。可以对所得到的数据执行统计分析（例如费氏精确检验、Wilcoxon检验、曼怀二氏检验或其他检验）。因此，如本文所述制备的灭活的轮状病毒和/或包含其的组合物和/或制剂（例如免疫原性组合物），可以用于预防和/或治疗通过轮状病毒引起的疾病。
本公开内容提供了通过将一定体积的包含活性轮状病毒的培养上清液直接加热至在其下轮状病毒被灭活的温度，用于产生灭活的轮状病毒的一种或多种方法。细胞培养上清液可以包括或显示出或缺乏任何特定缓冲液、摩尔渗透压浓度、盐浓度、糖、糖醇、pH、氨基酸和/或维生素。细胞培养上清液无需显示出预先确定的缓冲液、摩尔渗透压浓度、盐浓度、糖、糖醇、pH、氨基酸和/或维生素，以便适用于本文描述的方法中。细胞培养上清液通常包含和/或衍生自细胞培养基，其允许由哺乳动物细胞产生活的牛轮状病毒。如上文说明的，“直接加热一定体积的包含活轮状病毒的细胞培养上清液”通常意指在应用加热用于灭活轮状病毒之前，包含活性（例如活）轮状病毒的培养上清液不进行处理（例如，无“预处理”），除收集用于加工外，或至少以可以导致轮状病毒灭活的任何方式。在一些方法中，灭活的轮状病毒在灭活后从细胞培养上清液中分离。在一些实施方案中，培养上清液的基本上整个体积（例如70、80、90、95或99%）可以加热至该温度，并且在一些实施方案中，培养上清液的整个体积加热至该温度。在某些实施方案中，温度为至少约60℃至约80℃（例如约60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、65℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃中的任一种）。在一些实施方案中，培养上清液（例如基本上整个体积或整个体积）的温度维持至少约15分钟至至少约一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二小时中的任一种。某些实施方案进一步包括在加热后冷冻培养上清液，尽管这是任选的。某些实施方案进一步包括随后将培养上清液再加热至少一次（例如在初始加热和/或冷冻步骤后）。初始和后续加热的温度可以为大约相同的。在一些实施方案中，培养上清液的pH为7.6 + 0.1。本公开内容还提供了包含通过本文描述的方法中任一种制备的灭活的轮状病毒（例如牛轮状病毒）和/或轮状病毒（例如牛轮状病毒）抗原的组合物。还提供的是用此类组合物将动物免疫接种的方法。在一些实施方案中，动物是牛。在一些实施方案中，组合物可以施用于动物至少两次，并且此类施用可以通过时间分开（例如约一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一和/或十二周中的任一种）。组合物可以经由任何合适途径施用于动物，所述途径例如皮下、静脉内、肌内、皮内、结节内、鼻内和/或经口。本公开内容还提供了用于产生抗体的方法，通过此类方法产生的一种或多种抗体（例如进一步包含分离一种或多种抗体），以及包含此类抗体的组合物。还提供了使用此类抗体的方法（例如在体外或体内用于中和轮状病毒（例如牛轮状病毒）的方法（例如通过给动物（例如牛）施用此类一种或多种抗体）。
当在数值列表或范围之前时，术语“约”、“大约”等等独立地指列表或范围中的每个个别值，如同列表或范围内的每个个别值紧跟该术语。术语意指它指的值确切、接近于或类似于其。例如，在一些实施方案中，“约”或“大约”特定值可以指示该值99%、95%或90%的值。例如，当培养上清液的体积为1L时，“约”或“大约”1L可以等于0.99、0.95或0.9 L。作为另一个例子，当温度为70℃时，“约”或“大约” 70℃可以等于69℃、66℃或63℃。应当理解这些仅是示例。
任选的或任选地意指随后描述的事件或环境可以发生或不发生，并且描述包括其中事件或环境发生的情况以及它不发生的情况。例如，短语任选的组合物可以包含组合，意指组合物可以包含不同分子的组合，或可以不包括组合，使得描述包括组合以及不存在组合（即，组合的个别成员）。
范围在本文中可以表示为从约一个特定值和/或到约另一个特定值。当此类范围表达时，另一个方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当值表示为近似值时，通过使用先行词约或大约，应当理解特定值构成另一个方面。应进一步理解范围的终点各自在与另一个终点有关和不依赖于另一个终点两者方面是显著的。范围（例如90-100%）意欲包括范围本身以及范围内的每个独立值，如果每个值独立列出一样。
当术语预防（prevent）、预防（preventing）和预防（prevention）在本文中与用于给定状况的给定治疗结合使用时（例如预防感染），它意欲传达被治疗的患者完全不发展临床上可观察水平的状况，或比他/她不存在治疗更缓慢地发展和/或发展至更低程度。这些术语并不仅限于其中患者完全不经历状况方面的情况。例如，治疗被说成已预防状况，如果它在患者暴露于刺激期间给予，所述刺激预期产生状况的给定表现，并且导致患者经历比另外预期更少和/或更轻微的状况症状。治疗可以通过导致患者仅展示感染的轻微明显症状来“预防”感染；它并非暗示必须不存在任何细胞通过感染微生物的穿透。
类似地，如本文与用给定治疗的感染危险结合使用的降低（reduce）、降低（reducing）和降低（reduction）（例如降低轮状病毒感染的危险），通常指与在不存在治疗（例如使用所公开多肽的施用或疫苗接种）的情况下发展感染的对照或基础水平相比较，主体更缓慢地发展感染或发展至更少程度。感染危险的降低可以导致患者仅展示感染的轻微明显症状或延迟的感染症状；它并非暗示必须不存在任何细胞通过感染微生物的穿透。
本公开内容内引用的所有参考文献在此通过引用以其整体并入。某些实施方案在下述实施例中进一步描述。这些实施方案仅提供作为例子，并且不预期以任何方式限制权利要求的范围。
实施例
实施例1：轮状病毒的加热灭活
为了制备轮状病毒，使用以4.0 g/L的Cytodex-3微载体，在生物反应器中培养MA104（猴肾细胞）。生物反应器用1.5 x 105细胞/ml以15 L工作体积进行培养。在三至七天后，或当微载体珠达到大于95%汇合时，每个生物反应器被制备用于通过牛轮状病毒（BRV）以0.003的感染复数（MOI）（通过进行核计数确定）感染。在感染细胞之前，BRV在37℃下在新鲜的DMEM培养基（14.85 L）中温育一至三小时，所述培养基包括IX型胰蛋白酶（22.5 ml IX型胰蛋白酶原液，还包括L-谷氨酰胺和庆大霉素/两性霉素B），以产生BRV培养基。在将BRV培养基加入生物反应器之前，允许微载体珠沉降最少五分钟，并且去除约90%的耗尽的培养基。随后将加温的新鲜培养基（12.5 L包括IX型胰蛋白酶的DMEM培养基）抽泵到生物反应器内。随后向其中加入二点五升（2.5 L）BRV培养基。一旦感染完成（例如在PO2在20%设定点上漂浮后24小时内，而不回收），以约75 rpm的搅拌就在收获前执行约15至25分钟。
收获的病毒随后用于加热灭活研究。在这些研究中，将收获的材料加热至70℃，并且经过八小时，每15分钟回收10 ml样品。在四小时后，将加热的材料转移至另一个容器，以完成在70℃下的第二次四小时温育。每种样品通过1.0 μm注射器式滤器进行过滤，并且沉积到新容器内。每个过滤的样品随后置于70℃循环水浴内两小时（伴随在两小时时期过程中振荡两次），并且转移至新容器（10 ml无菌小瓶）。在这些实验中，每个样品随后置于-80℃冷库内过夜。样品随后置于70℃循环水浴内两小时（伴随在两小时时期过程中振荡两次），并且转移至新容器。这些样品随后贮存于-80℃冷库内直至测试时。
BRV还使用β-丙内酯（BPL）进行化学灭活。制备大约500 ml BRV感染的MA104细胞培养上清液。在这种方法中，对于每一升待灭活的含有轮状病毒的细胞培养上清液，将2 mlBPL溶液（10%）加入18 ml冷却的无菌水中。混合物随后在4℃下混合最多24小时。混合物随后在4℃下贮存（通常提供小于52小时的总灭活时间）。取出1-2ml用于测试，以确定轮状病毒是否使用与使用的或加热灭活的样品相同的方法灭活。
为了测试样品，各自连同非灭活样品（例如阳性对照样品）一起解冻。随后制备每种样品的十倍系列稀释。洗涤建立的测试MA104细胞（三天培养物、单层、100%汇合），并且将培养基替换为不含血清的DME（HyClone）。随后将1 ml每种测试样品加入含有测试细胞的每个孔，随后为两小时温育期（37℃、5% CO2），以允许吸附。随后加入2 ml不含血清且含有20ml/L L-谷氨酰胺（ASL 31012）和2 ml/L胰蛋白酶）的再补料培养基DME。在三天培养后，细胞使用80%丙酮进行固定，并且用对于BRV特异性的单克隆抗体染色（在PBS中1:1000稀释的82x100 NAH，在37℃下两小时，用在PBS中1:1000稀释的FITC山羊抗小鼠#55493在37℃下染色两小时），并且通过检测荧光进行分析。轮状病毒在阴性对照孔的任一个中未检测到，并且仅在含有加热灭活样品的稀释物的孔中很少检测到。阳性对照样品孔对于轮状病毒均为阳性的。仅将完全灭活的病毒用于进一步实验中。
在另一种测试中，如对于先前测试描述的，制备MA104细胞的1-2天培养物（>70%汇合）（例如去除培养基且替换为不含血清的DME。轮状病毒测试样品通过下述进行制备：将含有活轮状病毒的培养上清液加热至70℃1或2小时，随后在-80℃下冷冻直至测试灭活时（例如单步灭活过程）。其他轮状病毒测试样品通过下述进行制备：将含有活轮状病毒的培养上清液加热至70℃1或2小时，随后在-80℃下冷冻，随后为在70℃下1或2小时的第二个加热灭活步骤，并且在-80℃下冷冻直至测试灭活时（例如两步灭活过程）。测试MA104细胞随后与各种轮状病毒测试样品温育最少三天，并且观察致细胞病变效应（CPE）。在阴性对照或加热灭活样品的任一（一小时、两小时、单步或两步灭活过程）中未观察到CPE，指示每种过程完全灭活细胞培养基中存在的轮状病毒。相比之下，CPE在所有阳性对照样品中均观察到。
实施例2：加热灭活的轮状病毒的免疫原性
A. 兔研究
该研究比较用BR免疫接种的兔（先前未暴露于牛轮状病毒抗原（BR））的血清学应答，所述BR使用常规β-丙内酯（BPL-BR）灭活方案或实施例1中所述的加热灭活操作（称为“HI-BR”）进行制备。测试六种Emulsigen佐剂化的疫苗（30% Emulsigen D）。在施用抗原前，使兔放血，以获得基线几何平均滴度（GMT）。兔在第0（+2）天时接受1.25 ml皮下引发剂量，和在第20（+2）天时的皮下加强剂量。处理组如表1中所示进行组织：
表1
组 抗原 兔数目
1 3X HI-BR* 10
2 1X HI-BR 10
3 0.5X HI-BR 10
4 3X BPL-BR 10
5 1X BPL-BR 10
6 0.5X BPL-BR 10
*X=商业产品中的标准BRV剂量。
测试血清在第35天时（例如在疫苗接种后大约14天（DPV））获得。使用病毒中和测定（VNA）和ELISA，就抗轮状病毒抗体含量测定第35天血清的GMT。VNA通过在56-58℃水浴中加热灭活测试血清样品30-60分钟来进行。MA104细胞（4-6天单层）与测试血清在稀释培养基（DMEM、2% L-谷氨酰胺、5% FBS、0.2ml/L庆大霉素、0.2ml/L两性霉素B）中的系列稀释物接触。原种轮状病毒在病毒稀释培养基（DMEM、2% L-谷氨酰胺、700 ml/L IX型胰蛋白酶、0.2ml/L庆大霉素、0.2ml/L两性霉素B）中进行制备，以含有50-500 FAID50/ml病毒（FAID50/ml= 50%荧光抗体感染剂量/ml），并且在室温下混合45-60分钟。这种病毒溶液随后在稀释培养基中系列稀释至1:20,000-25,000，并且系列稀释物与血清样品一起温育50-70分钟。病毒-血清混合物（连同阳性和阴性对照）随后应用于MA104细胞，并且细胞在37℃下（5%CO2培养箱）培养2-3天。随后洗涤细胞，使用80%丙酮（30+5分钟）固定，并且与抗BRV一级抗体随后为二级荧光抗体一起温育。滴度使用Spearman-Karber方法进行计算，并且报告为在超过50%的给定稀释物的指示剂孔中抑制病毒生长的血清稀释度的倒数。ELISA使用标准程序实施。这些研究的结果概括于表2中：
表2
组 平均GMT（第0天） 平均GMT VNA（第35天/+14DPV2（=第14天）） 范围GMT VNA （第35天/+14DPV2 （=第14天）） 平均ELISA （第35天/+14DPV2 （=第14天）） 范围ELISA （第35天/+14DPV2（=第14天））
1（3X HI-BR） 2 3520 1218-19484 609 512-1024
2（1X HI-BR） 2 3189 1218-5793 323 128-1024
3（0.5X HI-BR） 2 4240 1722-8192 416 256-512
4（3X BPL-BR） 2 11 3-64 2 2
5（1X BPL-BR） 2 9 6-45 2 2-4
6（0.5X BPL-BR） 2 5 3-10 3 2-32
如表2中所示，如通过病毒中和测定或ELISA测量的，加热灭活的BR提供了比BPL灭活的BR强得多的抗体应答。
B. 牛研究
该研究比较牛类动物（天然BRV宿主）对牛轮状病毒抗原（BR）施用的血清学应答，所述牛类动物先前未针对轮状病毒进行疫苗接种，所述BR使用常规β-丙内酯（BPL-BR）灭活方案或实施例1中所述的加热灭活程序（HI-BR）进行制备。测试六种Emulsigen佐剂化的疫苗（30% Emulsigen D）（表3）。动物接受在第0天时的5 ml肌内（IM）引发剂量（在颈中），以及在研究第84天（免疫接种后12周）时的加强剂量。由在研究第0（放血前；由于初乳被动转移，动物通常具有一些抗BRV抗体）、14、28、56、84、98和112天时获得的血清样品测定抗体水平。一旦收集，将血清贮存于-20℃下。病毒中和测定基本上如上所述执行，除了病毒溶液在稀释培养基中1:2系列稀释且随后至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5之外。处理组如表3中所示进行组织：
表3
组 抗原 动物数目
1 3X HI-BR* 10-15
2 1X HI-BR 10-15
3 0.5X HI-BR 10-15
4 3X BPL-BR 10-15
*X=商业产品中的标准BR剂量。
该研究的结果显示于表4中：
表4
组 平均GMT（第0天） 范围GMT（第0天） 平均GMT VNA （第98天/+14DPV2（=第112天）） 范围GMT VNA（第98天/+14DPV2（=第112天））
1（3X HI-BR） 225 32-1448 9255 2263-30444
2（1X HI-BR） 175 45-861 11536 3805-25600
3（0.5X HI-BR） 193 91-1448 6321 1131-18102
4（3X BPL-BR） 186 91-1448 162 71-566
如表4中所示，如通过病毒中和测定测量的，加热灭活的BR提供了比BPL灭活的BR强得多的抗体应答。
虽然某些实施方案已根据优选实施方案进行描述，但应当理解技术人员将想到变化和修改。因此，预期所附权利要求涵盖在下述权利要求范围内的所有此类等价变化。

Claims (15)

1.一种用于产生灭活的轮状病毒的方法，其包括将一定体积的含有活性轮状病毒的细胞培养上清液直接加热至在其下所述轮状病毒被灭活的温度，其中所述温度为60-80℃，所述直接加热是指在应用加热用于灭活轮状病毒之前，除收集用于加工之外，含有活性轮状病毒的培养上清液不进行处理或操作。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞培养上清液不具有下述中的一种或多种：
在200-500 mOsm范围内的摩尔渗透压浓度、在1 mM - 15 mM范围内的二价阳离子盐浓度、以及在1 - 20%重量/体积范围内的糖和/或糖醇。
3.权利要求1的方法，其中所述灭活的轮状病毒是免疫原性的。
4.权利要求3的方法，其中所述灭活的轮状病毒的免疫原性优于化学灭活的轮状病毒的免疫原性。
5.权利要求1的方法，其中所述轮状病毒是牛轮状病毒。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述温度为70℃。
7.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述培养上清液的温度维持15分钟至240分钟。
8.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述培养上清液的温度维持15分钟至60分钟。
9.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述培养上清液的温度维持60分钟。
10.权利要求1-5中任一项的方法，其进一步包括冷冻所述细胞培养上清液，其中所述冷冻发生在所述加热之后。
11.权利要求1-5中任一项的方法，其包括在至少两个分开步骤中加热所述细胞培养上清液。
12.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述细胞培养上清液的pH为7.6 + 0.1。
13.权利要求1-5中任一项的方法，其中在应用加热用于灭活轮状病毒之前，从所述细胞培养上清液除去细胞碎片，但不从细胞上清液分离或纯化轮状病毒。
14.权利要求13的方法，其中所述细胞培养上清液在加热处理之前进行过滤，以除去细胞碎片。
15.权利要求13的方法，其中所述细胞培养上清液在加热处理之前进行低速离心，以除去细胞碎片。
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