KR20110132379A

KR20110132379A - 알루미늄-비함유 아주반트를 포함하는 불활성화 뎅기 바이러스 백신

Info

Publication number: KR20110132379A
Application number: KR1020117021610A
Authority: KR
Inventors: 베누아 바라스; 덜크 게이센; 이사벨 솔랑에 루시 노트; 쟝-폴 프리엘스; 쟝-프랑소와즈 뚜상
Original assignee: 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 2009-02-17
Filing date: 2010-02-16
Publication date: 2011-12-07
Also published as: US9265821B2; US20110318407A1; EP2398821B1; BRPI1011224A2; TWI528972B; UY32457A; CA2752809A1; PH12015501637A1; IL214385A; NZ700477A; CO6551750A2; SG173194A1; ES2649020T3; PE20110992A1; IL214385A0; TW201517915A; SG2014014385A; CN102395600B; JP2012517979A; US20160120972A1

Abstract

본 개시내용은 뎅기 바이러스에 의해 유발되는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 면역원성 조성물을 제공한다.

Description

알루미늄-비함유 아주반트를 포함하는 불활성화 뎅기 바이러스 백신{INACTIVATED DENGUE VIRUS VACCINE WITH ALUMINIUM-FREE ADJUVANT}

<관련 출원에 대한 상호 참조>

본 출원은 2009년 2월 17일에 출원된 미국 가출원 제61/153,060호의 우선 출원일의 이점을 주장하고, 그의 개시내용은 본원에 참고로 도입된다.

뎅기는 모기에 의해 전파되는 인간의 급성 바이러스성 질환이다. 이는 열대 및 아열대지방에서 풍토성이고, 전세계적으로 매년 대략 100,000,000개의 사례가 발생한다. 상대적으로 드물지만, 뎅기 출혈성 열 (DHF) 및 뎅기 쇼크 증후군 (DSS)이 소아의 사망의 중요한 원인이다. 현재, 뎅기에 대해 보호하기 위한 백신이 존재하지 않으며, 모기 벡터를 제어함으로써 질환을 예방하기 위한 시도는 주로 효과가 없는 것으로 판명되었다. 따라서, 뎅기 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대해 보호하기 위한 안전하고 효과적인 백신이 여전히 요망되고 있다.

<간단한 개요>

본 개시내용은 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 도출하는 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 아주반트를 포함하는 불활성화 뎅기 바이러스 백신에 관한 것이다. 본원에 개시된 조성물은 알루미늄-비함유 아주반트, 예를 들어 Th1 면역 반응을 촉진할 수 있는 알루미늄-비함유 아주반트를 포함한다. 뎅기 바이러스에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료를 위한, 예를 들어 의약의 제제화에 있어서의, 이들의 사용 방법이 또한 기재된다.

도 1은 나이브(naive) C57Bl/6 마우스에서 항-Den-2 중화 항체 역가를 보여주는 막대 그래프이다.
도 2는 나이브 C57Bl/6 마우스에서 항-Den-2 중화 항체 역가를 보여주는 막대 그래프이다.
도 3은 나이브 C57Bl/6 마우스에서 항-Den-2 중화 항체 역가를 보여주는 막대 그래프이다.
도 4는 말초 혈액 세포에서 세포내 시토카인 염색에 의한 세포성 면역 반응의 특성화를 보여주는 막대 그래프이다.

도입부

본 발명은 안전하고 효과적인 뎅기 백신에 대한 필요를 충족시키는 백신에 관한 것이다. 정제된 불활성화 뎅기 바이러스 백신은 약독화 생 뎅기 바이러스에 비해 불활성화 바이러스가 감염성이 아니므로 다시 병독성이 되거나 또는 질환을 유발할 수 없다는 주요 장점을 갖는다. 생-약독화된 것과 비교하여 정제된 불활성화 뎅기 바이러스 백신의 한 잠재적인 결점은 뎅기 특이적 중화 항체의 높은 역가를 유도하는 능력의 감소 및 보호성 면역 반응의 상대적으로 짧은 지속 시간이다. 이러한 결점은 적절한 아주반트로의 정제된 불활성화 뎅기 항원의 제제화에 의해 극복된다. 본원에 개시된 바와 같이, 아주반트는 뎅기-특이적 중화 항체의 높은 역가를 효과적으로 도출하는 알루미늄-비함유 (알룸-비함유) 아주반트 (또는 아주반트 시스템)이다. 한 실시양태에서, 아주반트는 인터페론 감마 (IFN-γ)의 생성을 특징으로 하는 Th1 반응 또는 균형잡힌 Th1/Th2 반응을 우세하게 도출한다.

본원에 개시된 면역원성 조성물은 알루미늄-비함유 아주반트와 함께, 하나 이상 (즉, 하나 또는 하나 초과)의 불활성화 뎅기 바이러스 항원을 포함한다. 불활성화 뎅기 바이러스 항원은 뎅기-1 바이러스 항원, 뎅기-2 바이러스 항원, 뎅기-3 바이러스 항원 및 뎅기-4 바이러스 항원으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 면역원성 조성물은 뎅기-1, 뎅기-2, 뎅기-3 또는 뎅기-4로부터 선택된 단일 균주로부터의 단일 불활성화 뎅기 바이러스 항원을 포함하는 1가 조성물일 수 있거나, 또는 조성물은 이들 뎅기 균주 중 하나 초과의 불활성화 항원을 함유하는 다가 (예를 들어, 2가, 3가, 4가) 조성물일 수 있다. 하나의 예시적 실시양태에서, 면역원성 조성물은 뎅기-2 바이러스 항원을 포함한다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 불활성화 뎅기-2 항원을 함유하는 1가 조성물일 수 있다. 다르게는, 면역원성 조성물은 1, 2 또는 3개의 추가의 불활성화 뎅기 바이러스 항원과 함께 불활성화 뎅기-2 바이러스 항원을 함유하는 2가, 3가 또는 4가 조성물일 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 조성물은 불활성화 뎅기-1 바이러스 항원, 불활성화 뎅기-2 바이러스 항원, 불활성화 뎅기-3 바이러스 항원 및 불활성화 뎅기-4 바이러스 항원을 포함하는 4가 조성물이다.

하나 이상의 불활성화 뎅기 바이러스 항원은 알루미늄 또는 알루미늄 염이 없는 아주반트, 즉 알루미늄-비함유 아주반트 또는 아주반트 시스템으로 제제화된다. 한 실시양태에서, 아주반트는 수중유 에멀젼을 포함한다. 예를 들어, 수중유 에멀젼은 대사가능한 오일을 혼입시킨 오일 상을 포함할 수 있고, 임의로 추가의 오일-상 성분, 예컨대 토콜을 포함할 수 있다. 수중유 에멀젼은 또한 수성 성분, 예컨대 완충된 염수 용액 (예를 들어, 인산염 완충 염수)을 함유한다. 또한, 수중유 에멀젼은 전형적으로 유화제를 함유한다. 한 실시양태에서, 대사가능한 오일은 스쿠알렌이다. 한 실시양태에서, 토콜은 알파-토코페롤이다. 한 실시양태에서, 유화제는 비이온성 계면활성제 유화제 (예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 트윈(TWEEN) 80^TM)이다. 예시적 실시양태에서, 수중유 에멀젼은 1 (중량/중량) 이하의 비율로 스쿠알렌 및 알파 토코페롤을 함유한다.

한 구체적 예에서, 면역원성 조성물은 다음을 포함하는 용량으로 제제화된 수중유 에멀젼 아주반트 시스템을 포함한다: 약 2％ 내지 약 10％ 스쿠알렌; 약 2％ 내지 약 10％ 알파-토코페롤; 및 약 0.3％ 내지 약 3％ 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트. 예를 들어, 면역원성 조성물은 다음을 포함하는 용량으로 제제화된 아주반트를 포함할 수 있다: 약 10 mg 내지 약 12 mg 스쿠알렌; 약 10 mg 내지 약 12 mg 알파-토코페롤; 및 약 4 mg 내지 약 6 mg 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트. 한 구체적인 예에서, 아주반트는 단일 (전체) 용량에 10.68 mg 스쿠알렌; 11.86 mg 토코페롤; 4.85 mg 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 성분의 이전 양의 분할 용량으로 제제화된다 (즉, 이전 단일 용량 제제의 분할 용량, 예컨대 성분의 이전 양의 1/2, 성분의 이전 양의 1/4, 또는 다른 분할 용량, 예를 들어 1/3, 1/6 등).

특정 실시양태에서, 불활성화 뎅기 바이러스 항원은 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL) 및/또는 QS21을 포함하는 알룸-비함유 아주반트 시스템으로 제제화된다. 한 실시양태에서, 아주반트 시스템은 3D-MPL 및 QS21을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 아주반트는 리포좀 제제에 3D-MPL 및 QS21을 함유한다. 임의로는, 아주반트 시스템은 또한 콜레스테롤을 함유한다. 한 구체적인 실시양태에서, 아주반트는 QS21 및 콜레스테롤을 포함한다. 임의로는, 아주반트 시스템은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 함유한다. 예를 들어, 불활성화 뎅기 바이러스 항원으로 제제화될 한 특정 아주반트 시스템에서 콜레스테롤, DOPC, 3D-MPL 및 QS21을 함유한다.

한 구체적인 예에서, 면역원성 조성물은 다음을 포함하는 용량으로 제제화된 아주반트를 포함한다: 약 0.1 내지 약 0.5 mg 콜레스테롤; 약 0.25 내지 약 2 mg DOPC; 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍ 3D-MPL; 및 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍ QS21. 한 실시양태에서, 아주반트에서 콜레스테롤 대 QS21의 비율은 5:1 (중량/중량)이다. 예를 들어, 아주반트에서 콜레스테롤 대 QS21의 비율은 대략 또는 정확하게 1:1 (중량/중량)일 수 있다. 한 구체적인 제제에서, 아주반트는 약 0.25 mg 콜레스테롤; 약 1.0 mg DOPC; 약 50 ㎍ 3D-MPL; 및 약 50 ㎍ QS21을 함유하는 단일 용량으로 제제화된다. 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 성분의 이전 양의 분할 용량으로 제제화된다 (즉, 이전 단일 용량 제제의 분할 용량, 예컨대 성분 (콜레스테롤, DOPC, 3D-MPL 및 QS21)의 이전 양의 1/2, 성분의 이전 양의 1/4, 또는 다른 분할 용량, 예를 들어 1/3, 1/6 등).

다른 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 정제된 불활성화 뎅기 바이러스 항원을 제공하는 단계; 및 알루미늄-비함유 아주반트로 하나 이상의 정제된 불활성화 뎅기 바이러스 항원을 제제화하는 단계를 포함하는 뎅기 백신의 생산 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 불활성되거나 또는 살해된, 병독성 또는 약독화 균주로부터 생성된 온전한 바이러스 항원으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 생 (병독성 또는 약독화) 바이러스는 화학 작용제, 예컨대 포름알데히드, 베타프로피오락톤 (BPL) 또는 과산화수소를 사용하거나, 또는 자외선 조사를 사용하거나, 또는 둘 이상의 불활성화 단계의 조합 (임의의 조합에서 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 예를 들어 포름알데히드 및 BPL, 포름알데히드 및 UV 조사, BPL 및 UV 조사, 과산화수소 및 BPL, 과산화수소 및 UV 조사 등일 수 있음)을 이용하여 살해 또는 불활성화될 수 있으며, 이에 따라 이는 복제가 불가능하게 된다. 임의로는, 불활성화 뎅기 바이러스에 대해 추가의 처리, 예컨대 스플리팅(splitting) 또는 항원 서브유닛의 추가의 정제를 수행한다.

다른 측면에서, 본 개시내용은 (본원에 개시된 바와 같이) 알룸-비함유 아주반트와 함께 하나 이상의 불활성화 뎅기 바이러스 항원을 함유하는 면역원성 조성물 (예를 들어, 백신)을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 뎅기 바이러스에 의해 유발되는 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 방법은 면역원성 조성물을 소아, 예컨대 5세 아래 또는 1세 아래의 소아에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 1세 아래의 나이브 대상체에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 성인 대상체, 예컨대 약 60세 또는 65세 위의 장년 대상체와 같은 성인 대상체에게 투여된다. 이러한 대상체는 이전에 뎅기 바이러스에 노출되었을 수 있다. 전형적으로, 백신은 비경구로, 예를 들어 근육내로 투여된다. 다른 측면에서, 본 개시내용은 예를 들어 뎅기 바이러스 감염 및/또는 뎅기 바이러스 유도된 질환, 예컨대 출혈성 열 (DHF) 및 뎅기 쇼크 증후군 (DSS)의 예방, 개선 또는 치료를 위한, 의약에 사용하기 위한, 알룸-비함유 아주반트와 함께 하나 이상의 정제된 불활성화 뎅기 바이러스 항원을 함유하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

용어

본 개시내용의 다양한 실시양태의 검토를 용이하게 하기 위해, 하기의 용어 설명이 제공된다. 추가의 용어 및 설명이 본 개시내용과 관련하여 제공될 수 있다.

달리 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서의 통상적인 용어의 정의를 문헌 [Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)]; [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]; 및 [Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 찾아볼 수 있다.

단수형 관사 ("a", "an", 및 "the")는 명확하게 문맥적으로 다르게 지시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 유사하게, "또는"이라는 단어는 명확하게 문맥적으로 다르게 지시되지 않는 한 "및"을 포함한다. 용어 "복수"는 2개 이상을 나타낸다. 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 제공된 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적이고, 설명을 위해 제공된다는 것을 추가로 이해하여야 한다. 추가로, 물질, 예컨대 항원의 농도 또는 수준과 관련하여 제공된 수치 한정은 대략적이도록 의도된다. 따라서, 농도가 (예를 들어) 200 pg 이상인 것으로 지시되는 경우, 농도는 대략 (또는 "약" 또는 "~") 200 pg 이상인 것으로 이해된다.

본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 용어 "포함하다(comprise)"는 "포함된다(include)"를 의미한다. 따라서, 문맥적으로 달리 요구되지 않는 한, "포함하다(comprise)"라는 단어, 및 변형물 예컨대 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 언급된 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 핵산, 폴리펩티드, 항원) 또는 단계, 또는 화합물들 또는 단계들의 군의 포함(inclusion)을 의미하지만, 임의의 다른 화합물, 조성물, 단계 또는 이들의 군의 배제를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다. 약어 "예를 들어(e.g.)"는 라틴어 <exempli gratia>로부터 유래되고, 비-제한적인 예를 지시하도록 본원에 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어(e.g.)"는 용어 "예를 들어(for example)"와 동의어이다.

"면역원성 조성물"은, 예를 들어 병원체, 예컨대 뎅기 바이러스에 대하여 특이적 면역 반응을 도출시킬 수 있는, 인간 또는 동물 대상체 (예를 들어, 실험적 설정에서의 상기 대상체)에게 투여하기에 적합한 물질의 조성물이다. 따라서, 면역원성 조성물은 하나 이상의 항원 (예를 들어, 온전한 정제된 바이러스 또는 그의 항원성 서브유닛, 예를 들어 폴리펩티드) 또는 항원성 에피토프를 포함한다. 면역원성 조성물은 면역 반응을 도출 또는 강화시킬 수 있는 하나 이상의 추가의 성분, 예컨대 부형제, 담체, 및/또는 아주반트를 또한 포함할 수 있다. 특정 예에서, 면역원성 조성물은 병원체에 의해 유도되는 증상 또는 상태에 대해 대상체를 보호하는 면역 반응을 도출하도록 투여된다. 일부 경우에, 병원체에 의해 유발되는 증상 또는 질환은 대상체가 병원체 (예를 들어, 뎅기 바이러스)에 노출된 후에 이 병원체의 복제를 억제함으로써 예방 (또는 치료, 예를 들어 감소 또는 개선)된다. 본 개시내용과 관련하여, 용어 면역원성 조성물은 뎅기에 대한 보호성 또는 경감성 면역 반응을 도출하려는 목적으로 대상체 또는 대상체들의 집단에게 투여되도록 의도되는 조성물 (즉, 백신 조성물 또는 백신)을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

용어 "정제" (예를 들어, 병원체 또는 병원체를 함유하는 조성물과 관련된 정제)는 존재가 바람직하지 않은 성분을 조성물로부터 제거하는 과정을 나타낸다. 정제는 상대적인 용어이고, 바람직하지 않는 성분의 모든 흔적이 조성물로부터 제거되는 것을 요구하지 않는다. 백신 생산과 관련하여, 정제는 원심분리, 투석, 이온-교환 크로마토그래피, 및 크기 배제 크로마토그래피, 친화도-정제 또는 침전과 같은 과정을 포함한다. 따라서, 용어 "정제된"은 절대 순도를 요구하지 않고, 오히려, 이는 상대적인 용어로서 의도된다. 따라서, 예를 들어 정제된 바이러스 제제는 바이러스가 그의 생성 환경, 예를 들어 바이러스가 자연적으로 또는 인공적인 환경에서 복제되는 세포 또는 세포들의 집단 내에 있을 때 보다 더 풍부한 것이다. 실질적으로 순수한 바이러스의 제제는 원하는 바이러스 또는 바이러스 성분이 제제의 전체 단백질 함량의 50％ 이상을 나타내도록 정제될 수 있다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 순수한 바이러스는 제제의 전체 단백질 함량의 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상 또는 이를 초과하는 값을 나타낼 것이다.

"단리된" 생물학적 성분 (예컨대, 바이러스, 핵산 분자, 단백질 또는 소기관)은 성분이 발생하거나 또는 생성되는 세포 및/또는 유기체에서 다른 생물학적 성분으로부터 떨어져 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 것이다. "단리된" 바이러스 및 바이러스 성분, 예를 들어 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 바이러스 및 단백질을 포함한다. 용어는 또한 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 바이러스 및 바이러스 성분 (예컨대, 바이러스 단백질)을 포함한다.

"항원"은 동물 내로 주사되거나, 흡수되거나 또는 다른 방식으로 도입되는 조성물을 포함하는, 동물에서 항체 생산 및/또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질이다. 용어 "항원"은 모든 관련된 항원성 에피토프를 포함한다. 용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 나타낸다. "우성 항원성 에피토프" 또는 "우성 에피토프"는 기능적으로 중요한 숙주 면역 반응, 예를 들어 항체 반응 또는 T-세포 반응이 만들어지는 에피토프이다. 따라서, 병원체에 대한 보호성 면역 반응과 관련하여, 우성 항원성 에피토프는 숙주 면역계에 의해 인식된 경우에 병원체에 의해 유발되는 질환으로부터의 보호를 가져다 주는 항원성 잔기이다. 용어 "T-세포 에피토프"는 적절한 MHC 분자에 결합되는 경우 T 세포에 의해 특이적으로 (T 세포 수용체를 통해) 결합되는 에피토프를 나타낸다. "B-세포 에피토프"는 항체 (또는 B 세포 수용체 분자)에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프이다.

본 개시내용과 관련하여, 뎅기 바이러스 항원은 전형적으로 온전한 죽은 또는 불활성화된 바이러스이다. 뎅기 바이러스 백신과 관련하여 용어 "불활성화"는 항원 성분 (예를 들어, 바이러스)이 생체내 또는 시험관내에서 복제될 수 없다는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 불활성화는 예를 들어 시험관내에서 복제된 후에 화학적 또는 물리적 수단을 사용하여 살해되어 더 이상 복제될 수 없게 된 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 추가의 처리 (예를 들어, 스플리팅, 분획화 등)에 의해 생성된 항원, 및 재조합 수단에 의해, 예를 들어 세포 배양물에서 생성된 성분을 포함할 수 있다.

"아주반트"는 작용제의 부재하의 항원의 투여와 비교하여 항원-특이적 면역 반응의 생성을 향상시키는 작용제이다. 통상적인 아주반트는 항원이 흡착된 미네랄 (또는 미네랄 염, 예컨대 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 히드록시포스페이트)의 현탁액을 포함하는 아주반트를 함유하는 알루미늄을 포함한다. 본 개시내용과 관련하여 아주반트는 임의의 이러한 알루미늄 염의 부재하에 제제화된 알루미늄- (알룸-)비함유 아주반트이다. 알룸-비함유 아주반트는 오일 및 물 에멀젼, 예컨대 유중수 및 수중유 에멀젼 (및 이중 에멀젼 및 가역적 에멀젼을 포함하는 이들의 변이체), 리포사카라이드, 리포폴리사카라이드, 면역자극성 핵산 (예컨대, CpG 올리고뉴클레오티드), 리포좀, 톨-유사 수용체 효능제 (특히, TLR2, TLR4, TLR7/8 및 TLR9 효능제) 및 이러한 성분의 다양한 조합을 포함한다.

"면역 반응"은 자극에 대한 면역계 세포, 예컨대 B 세포, T 세포, 또는 단핵구의 반응이다. 면역 반응은 특이적 항체, 예컨대 항원 특이적 중화 항체의 생산을 초래하는 B 세포 반응일 수 있다. 또한 면역 반응은 T 세포 반응, 예컨대 CD4+ 반응 또는 CD8+ 반응일 수 있다. 일부 경우에, 반응은 특정 항원에 대해 특이적이다 (즉, "항원-특이적 반응"). 항원이 병원체로부터 유래되는 경우, 항원-특이적 반응은 "병원체-특이적 반응"이다. "보호성 면역 반응"은 병원체의 해로운 기능 또는 활성을 억제하거나, 병원체에 의한 감염을 감소시키거나, 또는 병원체에 의한 감염으로부터 초래되는 증상 (사망 포함)을 감소시키는 면역 반응이다. 예를 들어, 플라크 감소 검정법 또는 ELISA-중화 검정법에서의 바이러스 복제 또는 플라크 형성의 억제에 의해, 또는 생체 내에서의 병원체 챌린지(challenge)에 대한 내성을 측정함으로써, 보호성 면역 반응을 측정할 수 있다.

"Th1" 편향된 면역 반응은 IL-2 및 IFN-γ를 생성하는 CD4+ T 헬퍼 세포의 존재를 특징으로 하므로, IL-2 및 IFN-γ의 분비 또는 존재를 특징으로 한다. 이와는 달리, "Th2" 편향된 면역 반응은 IL-4, IL-5 및 IL-13을 생성하는 CD4+ 헬퍼 세포의 수적 우세를 특징으로 한다.

"대상체"는 살아 있는 다세포 척추동물 유기체이다. 본 개시내용과 관련하여, 대상체는 실험용 대상체, 예컨대 비-인간 동물, 예를 들어 마우스, 코튼 래트, 또는 비-인간 영장류일 수 있다. 다르게는, 대상체는 인간 대상체일 수 있다.

본원에 개시된 면역원성 조성물은 뎅기 바이러스로의 감염에 의해 유발되는 질환을 예방, 개선 및/또는 치료하는데 적합하다.

본원에 개시된 면역원성 조성물은 하나 이상의 정제된 불활성화 뎅기 바이러스 항원을 포함한다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 뎅기 바이러스의 단일 균주를 포함 (즉, 1가 조성물)할 수 있거나 또는 이들은 뎅기 바이러스의 하나 초과의 균주를 함유 (즉, 다가 조성물)할 수 있다. 전형적으로, 다가 조성물은 상이한 혈청형으로부터 선택된 균주를 함유한다. 질환을 유발할 수 있는 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스, 즉 뎅기 유형 1 (DEN-1), 뎅기 유형 2 (DEN-2), 뎅기 유형 3 (DEN-3) 및 뎅기 유형 4 (DEN-4)가 존재하며, 교차-반응성 비-중화 항체가 보다 심각한 형태의 뎅기 질환에 걸리기 쉽게 하기 때문에, 4가지 혈청형 중 임의의 것으로부터의 질환에 대한 보호를 보장하기 위해 각각의 혈청형 중 하나의 대표적인 것을 최종 백신에 포함되도록 선택할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 뎅기 바이러스의 4가지 혈청형 중 각각으로부터 선택된 균주를 포함하는 4가 조성물이다.

항원으로 사용되는 바이러스는 본질적으로 뎅기 바이러스의 임의의 균주(들)로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 균주는 각각의 혈청형에 대해 선택될 수 있으며, 혈청형에 대해 규정된 (예를 들어, 컨센서스) 서열, 예컨대 DEN-1 컨센서스 서열, DEN-2 컨센서스 서열, DEN-3 컨센서스 서열 또는 DEN-4 컨센서스 서열에 대한 그의 적합성에 기초하여 선택된다. 그러한 바이러스는 자연 발생 또는 합성 바이러스일 수 있다. 다르게는, 바이러스 균주는 백신이 투여될 구역 또는 집단에서 보편적인 균주와 관련되도록 선택될 수 있다. 다른 선택사항은 편의상 유용성 또는 이전의 경험에 기초하여 각각의 혈청형에 대해 균주를 선택하는 것이다. 예를 들어, 예시적 균주는 미국 특허 제6,254,873호 (본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다. 추가의 적합한 균주는, 예를 들어 미국 특허 제7,226,602호에 개시되어 있다. 추가의 균주는, 예를 들어 VBRC 바이러스 게놈 데이터베이스 (http://athena.bioc.uvic.ca/organisms/Flaviviridae/Dengue/Curated_genes) 및 뎅기 바이러스 데이터베이스 (http://www.broad.mit.edu/annotation/viral/Dengue/ProjectInfo.html)에서 찾아볼 수 있다.

정제된 불활성화 뎅기 바이러스 백신과 관련하여, 병독성 또는 약독화 균주가 사용될 수 있다. 전형적으로, 병독성 균주는 숙주 세포에서 보다 높은 역가로 전파되어, 상업적인 규모로의 생산을 용이하게 한다. 그러나, 병독성 균주는 제조에 참여하는 인력의 감염을 예방하기 위해 취급시 특별한 주의가 요구된다. 예를 들어, 배양 세포에서 생성하고, 뎅기의 모기 벡터에서 감소된 병독성 및/또는 감소된 복제에 대해 선택되도록 변경시켜 생성된 약독화 균주는 보다 적은 취급 예방조치를 필요로 하지만 생성하기 어려울 수 있다. 불활성화 뎅기 바이러스 및 알루미늄-비함유 아주반트를 함유하는 면역원성 조성물과 관련하여 사용하기에 적합한 예시적 약독화 균주는 WO 00/57907 및 미국 특허 제6,638,514호, 및 WO 00/58444 및 미국 특허 제6,613,556호 (이들은 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다. 따라서, 선택된 균주(들)은 전형적으로 인간 사용을 위한 물질의 생성에 적합한 세포 (예를 들어, 병원체가 함유되어 있지 않음이 증명된 세포)에서 복제할 수 있는 다수의 균주 중에서 선택된다. 예를 들어, 균주는 선택의 세포주(들)에서 예를 들어 적어도 약 5x10⁶ pfu/ml, 바람직하게는 적어도 1x10⁷ pfu/ml 이상의 역가로부터 최고 역가로 성장하는 바이러스를 확인하기 위해 스크리닝할 수 있고, (ii) 선택의 세포주(들)에서 최고 역가로 성장하는 뎅기 바이러스의 균주를 선택하고, (iii) 추가로 선택의 세포주(들)에서 1회 내지 수회의 추가의 계대배양에 의한 향상된 성장을 위해 선택된 균주를 변경시킬 수 있다. 선택된 바이러스 (예를 들어, 뎅기 바이러스의 4가지 혈청형으로부터 선택됨)를 세포 배양물 계대배양에 의해 또는 고-역가의 마스터를 만들고 시드를 많이 생성하도록 하는 유전자 조작에 의해 높은 역가로 성장하도록 추가로 변경시킬 수 있다.

뎅기 바이러스를 전파하기에 적합한 세포주는 포유동물 세포, 예컨대 베로 세포, AGMK 세포, BHK-21 세포, COS-1 또는 COS-7 세포, MDCK 세포, CV-1 세포, LLC-MK2 세포, 주요 세포주, 예컨대 태아 레서스(Rhesus) 폐 (FRhL-2) 세포, BSC-1 세포 및 MRC-5 세포, 또는 인간 이배체 섬유모세포 뿐만 아니라, 조류 세포, 닭 또는 오리 배아 유래 세포주, 예를 들어 AGE1 세포 및 주요 닭 배아 섬유모세포, 및 모기 세포주, 예컨대 C6/36을 포함한다. 바람직하게는, 선택된 세포(들)은 혈청 또는 혈청-유래 단백질의 부재하에 성장하도록 변경시키고, 혈청-비함유 (및/또는 단백질-비함유) 성장 조건하에 뎅기 바이러스 복제를 높은 역가로 유지할 수 있다.

세포 배양물에서 바이러스를 전파하기 위해, 선택된 뎅기 바이러스 균주는 숙주 세포 (예를 들어, 상기에 열거된 적합한 세포형 중에서 선택됨)를 감염시키는데 사용된다. 바이러스 흡착 후에, 배양물에 세포의 성장을 지지할 수 있는 배지를 공급한다. 바람직하게는, 배지는 혈청 또는 혈청-유래 단백질 또는 다른 동물-유래 단백질을 함유하지 않거나, 또는 혈청-비함유 배지는 생성 동안 혈청-함유 배지를 대체하는데 사용될 수 있다. 다수의 혈청-비함유 배지의 제제는 시판되고 있다. 혈청-비함유 조건하에 유지되는 세포에서 바이러스를 생성하는 방법의 상세한 설명은 예를 들어 공개된 미국 특허 출원 제20060183224호 (본원에 참고로 도입됨)에서 찾아볼 수 있다.

숙주 세포는 원하는 바이러스 역가가 달성될 때까지 수일 동안 배양물에서 유지된다. 임의로는, 세포는 바이러스를 수일 이상의 과정에 걸쳐 간헐적으로 또는 연속적으로 수득할 수 있는 연속적인 관류 시스템에서 유지된다. 비-연속적인 배양 조건하에, 감염 3 내지 7일 후에 적어도 약 10⁶ 내지 10⁷ PFU/ml의 바이러스 역가가 바람직할 수 있다. 일부 숙주 세포에서, 역가는 수일 동안 높게 유지되고, 바이러스는 수율을 최대화하기 위해 여러 시점에서 회수할 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 상청액을 수집하고 세포를 재공급함으로써 감염후 약 3일에서 약 13일까지 매일 이들 배양물로부터 수확할 수 있다. 임의로는, 상청액은 추가의 처리 이전에 풀링할 수 있다. 다른 숙주 세포에서, 바이러스는 보다 높은 역가로, 그러나 보다 짧은 기간에 걸쳐 성장할 수 있다. 이러한 경우에, 바이러스는 경험에 의해 결정된 최고 역가에서 수확할 수 있다.

예를 들어, 베로 세포는 계대배양 141까지 피신(Ficin)을 포함하는 VPSFM 배지에서 증폭시킬 수 있다. 하나의 추가의 계대배양은 돼지 트립신의 존재하에 수행할 수 있다. 세포를 생물반응기 (4L)에 대략 0.7x10⁶개 세포/ml로 시딩하고, 관류 조건 (예를 들어, D0->: 0 부피/일; D1->D2: 1 v/d; 이어서 다음 3일 동안 1.5 v/d)하에 VPSFM+ 플루로닉(Pluronic) 0.1％에서 5일 동안 마이크로-캐리어 (사이토덱스-1) 상에서 배양할 수 있다. 이어서, 대략 3x10⁶개 세포/ml의 세포를 예를 들어 37℃에서 배지 부피를 감소시키면서 (2L), 2시간 동안 DMEM+글루타민 4 mM++FBS 2％에서 MOI 0.01로 뎅기 바이러스에 의해 감염 (35℃)시킨다. 이어서, 생물반응기의 배지 부피를 4L로 조정한다. 3일 후에, 배지의 대부분 (약 3L)을 제거하고, DMEM 배지+글루타민 4 mM으로 대체한다. 감염 7일 후에, 바이러스를 수확할 수 있다.

바이러스를 회수하기 위해, 바이러스를 저속 원심분리 (예를 들어, 10분 동안 1500xg)를 비롯한 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 또는 0.45 ㎛의 기공 크기의 필터을 통한 여과에 의해 수확한다. 상기 바이러스(들)을 농축하는 방법은 당업자의 기술 범위내에 속하고, 예를 들어 한외여과 (예를 들어, 300 kDa 이하의 기공 크기의 막을 사용함) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 8000을 사용하는 침전을 포함한다. 바이러스를 정제하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 연속적 또는 다단계 수크로스 구배, 크기 배제, 이온 교환, 흡착 또는 친화도 칼럼을 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제, 또는 중합체 2-상 또는 다중-상 시스템에서의 분획화에 의한 정제, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 바이러스 양성 분획을 검정하는 방법은 플라크 검정, 적혈구응집 (HA) 검정 및/또는 항원 검정, 예컨대 면역검정을 포함한다.

예를 들어, 뎅기 바이러스는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전에 의해 배양 상청액으로부터 농축할 수 있다. 감염된 세포로부터의 상청액 유체는 10분 동안 원심분리 (1,500xg)에 의해 정화한다. 맑아진 상청액은 6％ PEG 8000 (시그마(Sigma)) 및 0.5 M NaCl로 조정하고, 45분 동안 부드럽게 교반하면서 4℃에서 유지시켰다. 침전물은 50분 동안 5000xg에서 원심분리에 의해 수집하고, STE 완충액 (0.1 M NaCl, 10 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 7.6)에 다시 현탁시킨다. 이어서, 바이러스 현탁액은 원심분리 (4℃에서 10분 동안 12,000xg)에 의해 정화할 수 있다. 펠릿을 제거한 후에, 상청액을 원심분리 (170,000xg, 80분, 4℃)하여 바이러스를 펠릿화한다. 이 바이러스 펠릿을 원하는 농도에서 STE 완충액에 다시 현탁시킨다.

다르게는 또는 추가로, 뎅기 바이러스는 접선 흐름 한외여과에 의해 세포 상청액으로부터 농축시킬 수 있다. 감염된 세포로부터의 상청액 유체는 상기 기재된 바와 같이 저속에서 원심분리에 의해 정화한 후에, 0.45 ㎛ CN 필터 (날젠(Nalgene))를 통해 여과한다. 여과된 상청액은 낮은-단백질-결합 100 kDa-컷오프(cutoff) 막 (예를 들어, 오메가 100K 스크린 채널, 필트론, 인크.(Filtron, Inc.))을 사용하는 접선 흐름 한외여과에 의해 농축시켰다. 농축은 4℃에서 400 ml/분의 유량, 대략 100 ml/분의 여과율 및 20 내지 30 psi의 압력을 사용하여 수행한다.

추가의 정제는 수크로스 구배 한외여과를 이용하여 달성할 수 있다. 뎅기 바이러스는 약간 변형된 본질적으로 이전에 기재된 바와 같은 수크로스 구배 상에서 정제될 수 있다 (문헌 [Srivastava et al. Arch. Virol. 96: 97-107, 1987]). 15 ml 수크로스 구배는 1"x3.5" (40 ml) 한외여과 튜브 (울트라-클리어(Ultra-clear).TM., 베크만, 인크.(Beckman, Inc.))에서 인산염 완충 염수 (pH 7.4) (PBS, Ca 및 Mg 비함유, 휘태커 엠에이 바이오프로덕츠(Whittaker MA Bioproducts)) 중 하기 중량/중량 수크로스 용액의 단계식 첨가에 의해 만들 수 있다: 2 ml 60％, 2 ml 55％, 2 ml 50％, 2 ml 45％, 2 ml 40％, 2 ml 35％, 2 ml 30％ 및 1 ml 15％. 튜브를 실온에 2 내지 4시간 동안 정치시켜 완만한 구배가 형성된다. 25 ml 이하의 농축된 바이러스를 각각의 튜브에 적용한다. 이어서, 한외여과를 (예를 들어, 4℃에서 18시간 동안 17,000 rpm에서 SW 28 로터 (베크만)에서) 수행한다. 원심분리 후에, 1 내지 2 ml 분획을 튜브의 하부로부터 수집할 수 있다. 분획은 경우에 따라 전체 단백질, 바이러스 HA, 및 바이러스 항원에 대해 검정될 수 있다. 전형적으로 양성 구배 분획을 풀링하고, 배지 199 (M199, 깁코(Gibco)-BRL) 또는 PBS를 포함하는 10％ 이하의 수크로스로 희석한다. 임의로는, 불활성화 이전에, 바이러스 풀을 0.22 ㎛ 낮은-단백질-결합 필터 (GV 유형, 밀리포어(Millipore))를 통해 여과할 수 있다.

정제 후에, 회수된 바이러스는 그의 감염성을 파괴하면서 그의 항원성 및 면역원성을 보존하기 위해 선택된 수단에 의해 불활성화된다. 한 예에서, 작용제, 예컨대 포르말린 또는 베타-프로피오락톤의 유효량을 바이러스에 첨가하고, 혼합물은 불활성화될 때까지 불활성화제와 인큐베이션한다. 예를 들어, 포르말린 (37％ 포름알데히드)을 PBS 중에서 1:40 희석하고, pH를 1 N NaOH로 대략 7.4로 조정한다. 이어서, 용액을 0.22 ㎛ CN 필터 (날젠)를 통과시킴으로써 멸균시킨다. 이 포르말린 용액을 0.05％의 최종 포르말린 농도로 정제된 바이러스 (1:50)에 첨가한다. 불활성화는 48시간에서 14일까지 (전형적으로, 10일 이하) 동안 15 내지 25℃에서 수행한다. 임의로는, 바이러스를 0.22 um GV 유형 필터를 통해 여과하고, 새로운 용기로 옮긴다. 불활성화 완료시, 벌크 배양물의 유리 포르말린을, 예를 들어 등몰량의 멸균 10％ 중량/부피 중아황산나트륨을 첨가하여 중화시킨다.

다르게는, 불활성화는 바이러스가 불활성화될 때까지 방사성 공급원으로 바이러스를 조사함으로써 달성할 수 있다. 방사성 공급원의 한 바람직한 예는 항원성을 본질적으로 무손상 상태로 보존하면서 바이러스의 감염성을 불활성화시키기에 충분한 용량의 코발트-60이다. 유용한 용량의 예는 5.5 내지 7.0 Mrad 범위 내에 속하는 것이다. 예를 들어, 1.5 ml 멸균 폴리프로필렌 튜브 중 50 ㎕의 바이러스 분취액을 냉동시키고, 원하는 조사량을 전달하기에 충분한 기간 동안 ⁶⁰Co 공급원의 감마 조사실에서 드라이 아이스 상에 놓는다.

다르게는, 자외선 조사를 이용하여 뎅기 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 상용성 설정에서 바이러스의 자외선 조사에 적합한 장치는 당업계에 잘 알려져 있고, 장치는 예를 들어 바이엘(Bayer)에서 시판되고, 이는 면역원성을 보존하면서 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 상청액 (또는 바이러스를 함유하는 다른 유체)을 대략 254 nm에서 UV-C 광원에 노출시킨다.

다르게는, 뎅기 바이러스는, 예를 들어 공개된 미국 특허 출원 제20070031451호 (본원에 참고로 도입됨)에 기재된 바와 같이 과산화수소를 사용하여 불활성화시킬 수 있다.

경우에 따라, 2개 이상의 활성화 단계를 사용할 수 있다. 2개 이상의 불활성화 단계가 사용되는 경우, 단계는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, 임의의 적합한 불활성화 과정, 예컨대 임의의 앞선 불활성화 과정의 조합을, 인간 대상체에게 투여하기 위한 면역원성 조성물로의 제제화를 위한 뎅기 바이러스의 정제 및 불활성화 동안 사용할 수 있다.

바이러스 제제의 품질은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 플라크 적정 검정에서 불활성화 이전에 모니터링할 수 있다. 바이러스는 생산에 사용된 것과 동일하거나 또는 상이한 숙주 세포 상에서 증폭시키고, 적합한 세포주, 예컨대 LLC-MK2 세포 또는 베로 세포 단층을 감염시키는데 사용하며, 바이러스 플라크의 수는 회수된 바이러스의 감염성을 결정하기 위해 평가할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sukhavachana et al. WHO Bull. 35: 65-6, 1966] 참조). 회수된 항원의 양 및 품질을 평가하기 위한 다른 방법은 바이러스 적혈구응집 (HA) 및 적혈구응집-억제 (HI) 검정에 의한 것이다. 바이러스 HA 및 HI 검정은 이전에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다 (문헌 [Clarke & Casals, Am. J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-73, 1958]). 전체 단백질은 본질적으로 브래드포드 (문헌 [Anal. Biochem. 72: 248, 1976])에 의해 기재된 바와 같이, 시판되는 키트 (바이오라드(BioRad), 미국 캘리포니아 허큘레스) 및 표준물로서 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 감마 글로불린을 사용하여 결정한다.

다르게는, 항원은 불활성화 후에, 예를 들어 항원 스폿 블롯 검정에서, 검출 및/또는 정량할 수 있다. 불활성화 바이러스 제제 중의 항원을 검출 및 정량하기 위해 바이러스 샘플을 전형적으로 2-배 희석에 의해 연속적으로 희석하고, 니트로셀룰로스 종이 상에 스폿팅한다. 종이를 공기-건조시키고, PBS 중에서 5％ 카세인으로 차단하고, 특정 항체 또는 항혈청에 이어 효소-연결된 2차 항체와 인큐베이션한다. 또한, 바이러스는 웨스턴 블롯팅에 의해 검출할 수 있다. 간략하게, 항원 제제를 10분 동안 22℃에서 1％ SDS, 66 mM 트리스-HCl, pH 6.8, 1％ 글리세롤 및 0.7％ 브롬페놀 블루를 함유하는 SDS-PAGE 샘플 완충액에 용해시키고, 12.5％ 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동시킨다 (예를 들어, 문헌 [Feighny et al. Am. J. Trop. Med. Hyg. 50(3): 322-8, 1994]에 기재된 바와 같음). 분할된 단백질을 나일론 또는 니트로셀룰로스 막으로 전기영동에 의해 옮긴다. 이어서, 단백질을 콜로이드성 금으로 염색하여 검출할 수 있고, 바이러스 항원은 웨스턴 블롯 절차의 비-동위원소 변형을 이용하여 면역학적으로 확인할 수 있다.

면역원성 조성물 및 방법

불활성화 뎅기 바이러스(들)은 바이러스 중화 항체의 높은 역가를 도출하고 뎅기 바이러스에 의해 유발되는 질환으로부터 면역화된 인간을 보호하기 위해 인간 대상체를 면역화시키는데 적합한 면역원성 조성물을 생산하기 위해 적합한 알루미늄-비함유 아주반트와 혼합된다. 전형적으로, 불활성화 뎅기 바이러스(들)은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제로 제제화된다.

제약상 허용되는 담체 및 부형제는 잘 알려져 있고, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 담체 또는 부형제는 바람직하게는 완충액을 포함할 수 있다. 임의로는, 담체 또는 부형제는 또한 용해도 및/또는 안정성을 안정화시키는 하나 이상의 성분을 함유한다. 가용화제/안정화제의 예는 세정제, 예를 들어 라우렐 사르코신 및/또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 포함한다. 다른 가용화제/안정화제는 아르기닌, 및 유리 형성 폴리올 (예컨대, 수크로스, 트레할로스 등)을 포함한다. 다수의 제약상 허용되는 담체 및/또는 제약상 허용되는 부형제는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 5th Edition (975)]에 기재되어 있다.

따라서, 선택된 투여 경로에 의해 대상체에게 전달하기에 적합한 제제가 생산되도록 당업자가 적합한 부형제 및 담체를 선택할 수 있다.

적합한 부형제는 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 소르비톨, 트레할로스, N-라우로일사르코신 나트륨 염, L-프롤린, 비 세정제 술포베타인, 구아니딘 히드로클로라이드, 우레아, 트리메틸아민 옥시드, KCl, Ca²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ 및 다른 2가 양이온 관련 염, 디티오트레이톨, 디티오에리트롤 및 β-메르캅토에탄올을 비제한적으로 포함한다. 다른 부형제는 세정제 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 트리톤 (Triton) X-00, NP-40, 엠피겐 (Empigen) BB, 옥틸글루코시드, 라우로일 말토시드, 쯔비터젠트(Zwittergent) 3-08, 쯔비터젠트 3-0, 쯔비터젠트 3-2, 쯔비터젠트 3-4, 쯔비터젠트 3-6, CHAPS, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 도데실 술페이트, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 포함)일 수 있다.

또한 본원에 개시된 면역원성 조성물은 아주반트를 포함한다. 뎅기에 대하여 보호성 면역 반응을 도출하기 위한 목적으로 대상체에게 투여하기에 적합한 면역원성 조성물과 관련하여, 아주반트는 균형잡힌 Th1/Th2 반응 또는 Th1 편향된 면역 반응을 도출하도록 선택된 알루미늄-비함유 아주반트이다. 이러한 면역 반응은 γ-IFN의 생성을 특징으로 한다.

전형적으로는, 아주반트는 조성물이 투여되는 대상체 또는 대상체 집단에서 균형잡힌 Th1/Th2 반응 또는 Th1 편향된 면역 반응을 향상시키도록 선택된다. 예를 들어, 면역원성 조성물을 뎅기 감염에 걸리기 쉬운 (또는 뎅기 감염의 위험이 증가된) 특정 연령 군의 대상체에게 투여해야 하는 경우, 아주반트는 이러한 대상체 또는 대상체 집단에서 안전하고 효과적이도록 선택된다. 따라서, 신생아 또는 유아 대상체 (예컨대 출생일 내지 1세의 대상체) 또는 소아 (예를 들어, 출생일 내지 5세의 대상체)에서 투여하기 위한 불활성화 뎅기 바이러스 항원을 함유하는 면역원성 조성물을 제제화하는 경우, 아주반트는 신생아 및 유아 및/또는 소아에서 안전하고 효과적이도록 선택된다.

추가로, 아주반트는 전형적으로 면역원성 조성물이 투여되는 경로를 통해 투여되는 경우에, Th1 면역 반응을 향상시키도록 선택된다. 예를 들어, 면역원성 조성물이 근육내 투여를 위해 제제화되는 경우, 3D-MPL, 스쿠알렌 (예를 들어, QS21), 리포좀 및/또는 오일 및 물 에멀젼 중 하나 이상을 포함하는 아주반트를 선택하는 것이 바람직하다.

불활성화 뎅기 항원과 함께 사용하기에 적합한 한 아주반트는 비-독성 박테리아 리포폴리사카라이드 유도체이다. 지질 A의 적합한 비-독성 유도체의 예는 모노포스포릴 지질 A, 더욱 특히 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)이다. 3D-MPL은 글락소스미스클라인 바이올로지칼스 엔.에이.(GlaxoSmithKline Biologicals N.A.)에서 MPL이라는 명칭으로 시판되고, 본 문서 전반에 걸쳐 MPL 또는 3D-MPL로 지칭된다. 예를 들어, 미국 특허 제4,436,727호; 제4,877,611호; 제4,866,034호 및 제4,912,094호를 참조한다. 3D-MPL은 주로 IFN-γ (Th1) 표현형으로 CD4+ T 세포 반응을 촉진시킨다. GB2220211 A에 개시된 방법에 따라 3D-MPL을 생산할 수 있다. 화학적으로 이는 3, 4, 5 또는 6 아실화된 쇄와 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A의 혼합물이다. 본 발명의 조성물에서, 소형 입자 3D-MPL이 사용될 수 있다. 소형 입자 3D-MPL은 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균-여과될 수 있도록 하는 입자 크기를 갖는다. 이러한 제제가 WO94/21292에 기재되어 있다.

리포폴리사카라이드, 예컨대 3D-MPL은 면역원성 조성물의 인간 용량 당 1 내지 100 ㎍의 양으로 사용될 수 있다. 이러한 3D-MPL은 약 50 ㎍, 예를 들어 40 내지 60 ㎍, 적합하게는 45 내지 55 ㎍ 또는 46 내지 54 ㎍ 또는 47 내지 53 ㎍ 또는 48 내지 52 ㎍, 또는 49 내지 51 ㎍, 또는 50 ㎍의 수준으로 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 유아 또는 소아에게 투여하는 경우, 면역원성 조성물의 용량은 면역원성 조성물의 인간 용량 당 약 25 ㎍의 수준으로 3D-MPL의 분할 용량을 포함한다. 이러한 3D-MPL은 약 25 ㎍, 예를 들어 20 내지 30 ㎍, 적합하게는 21 내지 29 ㎍ 또는 22 내지 28 ㎍ 또는 23 내지 27 ㎍ 또는 24 내지 26 ㎍, 또는 25 ㎍의 수준으로 사용될 수 있다. (예를 들어, 매우 어린 유아에게 투여하기에 적합한) 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 약 10 ㎍, 예를 들어 5 내지 15 ㎍, 적합하게는 6 내지 14 ㎍, 예를 들어 7 내지 13 ㎍ 또는 8 내지 12 ㎍ 또는 9 내지 11 ㎍, 또는 10 ㎍의 수준으로 3D-MPL의 훨씬 더 적은 양을 함유하는 분할 용량을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 약 5 ㎍, 예를 들어 1 내지 9 ㎍, 또는 2 내지 8 ㎍ 또는 적합하게는 3 내지 7 ㎍ 또는 4 내지 ㎍, 또는 5 ㎍의 수준으로 3D-MPL을 포함한다.

다른 실시양태에서, 리포폴리사카라이드는 미국 특허 제6,005,099호 및 EP 특허 제0 729 473 B1호에 기재된 바와 같은 β(1-6) 글루코사민 이당류일 수 있다. 당업자는 이러한 참조문헌의 교시에 기초하여 다양한 리포폴리사카라이드, 예컨대 3D-MPL을 쉽게 생산할 수 있을 것이다. 그럼에도 불구하고, 각각의 이러한 참조문헌은 본원에 참고로 도입된다. 상기 언급된 면역자극제 (구조 면에서 LPS 또는 MPL 또는 3D-MPL과 유사함)에 더하여, 상기 MPL 구조에 대해 하위-일부분(sub-portion)인 아실화 단당류 및 이당류 유도체가 또한 적합한 아주반트이다. 다른 실시양태에서, 아주반트는 지질 A의 합성 유도체이고, 그의 일부는 TLR-4 효능제로 기재되고, 하기의 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: OM174 (2-데옥시-6-o-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스포노-β-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]-β-D-글루코피라노실디히드로겐포스페이트), (WO 95/14026); OM 294 DP (3S,9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1,10-비스(디히드로게노포스페이트) (WO 99/64301 및 WO 00/0462); 및 OM 197 MP-Ac DP (3S-,9R)-3-β(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1-디히드로게노포스페이트 10-(6-아미노헥사노에이트) (WO 01/46127).

사용될 수 있는 다른 TLR4 리간드는 알킬 글루코사미니드 포스페이트 (AGP), 예컨대 WO 98/50399 또는 미국 특허 제6,303,347호에 개시된 것 (AGP의 제조를 위한 과정이 또한 개시되어 있음), 적합하게는 RC527 또는 RC529 또는 미국 특허 제6,764,840호에 개시된 AGP의 제약상 허용되는 염이다. 일부 AGP는 TLR4 효능제이고, 일부는 TLR4 길항제이다. 둘 모두 아주반트로서 유용할 것으로 생각된다.

TLR-4 (문헌 [Sabroe et al., JI 2003 p1630-5])를 통한 신호전달 반응을 야기할 수 있는 다른 적합한 TLR-4 리간드는, 예를 들어 감마-음성 박테리아로부터의 리포폴리사카라이드 및 그의 유도체, 또는 이들의 단편, 특히 LPS (예컨대 3D-MPL)의 비-독성 유도체이다. 다른 적합한 TLR 효능제는 열 충격(heat shock) 단백질 (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 또는 90; 계면활성제 단백질 A, 히알루로난 올리고당류, 헤파란 술페이트 단편, 피브로넥틴 단편, 피브리노겐 펩티드 및 b-데펜신-2, 및 뮤라밀 디펩티드 (MDP)이다. 한 실시양태에서, TLR 효능제는 HSP 60, 70 또는 90이다. 다른 적합한 TLR-4 리간드는 WO 2003/011223 및 WO 2003/099195에 개시된 바와 같고, 예컨대 WO2003/011223의 4-5면 또는 WO2003/099195의 3-4면에 개시된 화합물 I, 화합물 II 및 화합물 III, 특히 WO2003/011223에 ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680 및 ER804764로 개시된 화합물이다. 예를 들어, 한 적합한 TLR-4 리간드는 ER804057이다.

예를 들어 3D-MPL 또는 본원에 기재된 다른 아주반트에 대한 대안으로 또는 이와 함께, 불활성화 뎅기 바이러스 항원을 갖는 면역원성 조성물에 사용될 수 있는 다른 아주반트는 사포닌, 예컨대 QS21이다.

사포닌은 문헌 [Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)]에 교시되어 있다. 사포닌은 식물 및 해양 동물 계에 광범위하게 분포되어 있는 스테로이드 또는 트리테르펜 글리코시드이다. 진탕 시 발포되는 수중 콜로이드 용액을 형성하고, 콜레스테롤을 침전시키는 것에 대해 사포닌이 주목된다. 사포닌이 세포막 주변에 있을 때, 이는 막이 파열되도록 하는 기공-유사 구조를 막 내에 생성시킨다. 적혈구 용혈이 이러한 현상의 예이고, 이는 전체는 아니지만 특정 사포닌의 성질이다.

사포닌은 전신 투여용 백신에서 아주반트로 공지되어 있다. 개별적인 사포닌의 아주반트 및 용혈 활성이 당업계에서 광범위하게 연구되었다 ([Lacaille-Dubois and Wagner, 상기 문헌]). 예를 들어, Quil A (남아메리카산 나무인 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 나무껍질로부터 유래됨), 및 그의 분획이 US 5,057,540 및 문헌 ["Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55]; 및 EP 0 362 279 B1에 기재되어 있다. 면역 자극 복합체 (ISCOMS: Immune Stimulating Complex)로 명명된, Quil A의 분획을 포함하는 미립자 구조물이 용혈성이고, 백신 제작에 사용되었다 (Morein, B., EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739, 및 미국 특허 제6,846,489호). 용혈성 사포닌 QS21 및 QS17 (Quil A의 HPLC 정제 분획)이 강력한 전신 아주반트로서 기재되었고, 이들의 제조 방법이 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,057,540호 및 EP 0 362 279 B1에 개시되어 있다. 이러한 사포닌 또는 그의 분획은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있고, 임의로는 ISCOMS로 제제화될 수 있다. 전신 백신접종 연구에서 사용된 다른 사포닌은 깁소필라(Gypsophila) 및 사포나리아(Saponaria)와 같은 다른 식물 종으로부터 유래된 것들을 포함한다 (문헌 [Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992]).

QS21은 퀼라자 사포나리아 몰리나의 나무껍질로부터 유래된, Hplc로 정제된 비-독성 분획이다. QS21의 생성 방법이 미국 특허 제5,057,540호에 개시되어 있다. QS21을 함유하는 비-반응발생성 아주반트 제제가 WO 96/33739에 기재되어 있다. 상기 언급된 참고문헌들은 본원에 참고로 도입된다. 상기의 면역학적으로 활성인 사포닌, 예컨대 QS21은 면역원성 조성물의 인간 용량 당 1 내지 50 ㎍의 양으로 사용될 수 있다. 유리하게는, QS21은 면역원성 조성물의 인간 용량 당 약 1 및 100 ㎍의 수준으로 사용된다. 예를 들어, QS21은 약 50 ㎍, 예를 들어 40 내지 60 ㎍, 적합하게는 45 내지 55 ㎍ 또는 46 내지 54 ㎍ 또는 47 내지 53 ㎍ 또는 48 내지 52 ㎍, 또는 49 내지 51 ㎍, 또는 50 ㎍의 수준으로 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 유아 또는 소아에게 투여하는 경우, 면역원성 조성물의 용량은 분할 용량 25 ㎍, 예를 들어 20 내지 30 ㎍, 적합하게는 21 내지 29 ㎍ 또는 22 내지 28 ㎍ 또는 23 내지 27 ㎍ 또는 24 내지 26 ㎍, 또는 25 ㎍을 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 QS21을 약 10 ㎍, 예를 들어 5 내지 15 ㎍, 적합하게는 6 내지 14 ㎍, 예를 들어 7 내지 13 ㎍ 또는 8 내지 12 ㎍ 또는 9 내지 11 ㎍, 또는 10 ㎍의 수준으로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 QS21을 약 5 ㎍, 예를 들어 1 내지 9 ㎍, 또는 2 내지 8 ㎍ 또는 적합하게는 3 내지 7 ㎍ 또는 4 내지 6 ㎍, 또는 5 ㎍의 수준으로 포함한다. (적합하게는 리포좀 제제에) QS21을 포함하고 콜레스테롤을 추가로 포함하는 이러한 제제는 항원과 함께 제제화되는 경우에 성공적인 Th1 자극 아주반트인 것으로 나타났다. 따라서, 예를 들어 불활성화 뎅기 바이러스 항원이 QS21 및 콜레스테롤의 조합물을 포함하는 아주반트와 함께 면역원성 조성물에서 유리하게 사용될 수 있다. 임의로 이러한 아주반트는 또한 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 함유한다. QS21과 같은 사포닌은 또한 하나 이상의 추가의 면역자극제 (예컨대, 본원에 논의된 바와 같은 3D-MPL, 또는 예를 들어 CpG 올리고뉴클레오티드 또는 다른 TLR 효능제)로 제제화될 수 있다.

또한, 본원에 상기 언급된 것과 같은, 상이한 아주반트의 조합물을 불활성화 뎅기 바이러스 항원과 함께 조성물에 사용할 수 있다. 예를 들어, 앞서 언급된 바와 같이, QS21이 3D-MPL과 함께 제제화될 수 있다. 전형적으로 QS21:3D-MPL의 비율은 대략 1:10 내지 10:1, 예컨대 1:5 내지 5:1, 종종 실질적으로 1:1일 것이다. 전형적으로, 비율은 2.5:1 내지 1:1 3D-MPL:QS21의 범위이다. 임의로는, QS21 및 3D-MPL의 조합물은 또한 콜레스테롤 및 DOPC 중 하나 또는 둘다를 함유한다. 이러한 조합물의 제제 및 투여량, 특히 유아 및 소아에게 투여하기에 적합한 용량 (분할 용량)에 대한 추가의 상세한 내용은 WO2007068907 및 US 20080279926 (본원에 참고로 도입됨)에서 찾아볼 수 있다. 조합되어 제제화되는 경우, 이러한 조합물은 항원-특이적 Th1 면역 반응을 향상시킬 수 있다.

일부 경우에, 아주반트 제제는 수중유 에멀젼을 포함한다.

수중유 에멀젼의 한 가지 예는 수성 담체 내에 대사가능한 오일, 예컨대 스쿠알렌, 토콜, 예컨대 토코페롤, 예를 들어 알파-토코페롤, 및 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 80 또는 트윈 80을 포함하고, 어떠한 추가의 면역자극제(들)도 함유하지 않는다. 수성 담체는, 예를 들어 인산염 완충 염수일 수 있다. 이러한 수중유 에멀젼의 한 가지 바람직한 예는 본원에 지정된 AS03이다. 추가로, 수중유 에멀젼은 소르비탄 트리올레에이트 (SPAN 85^TM) 및/또는 레시틴 및/또는 트리카프릴린을 함유할 수 있다. 수중유 에멀젼의 다른 예는 노파르티스 백신(Novartis Vaccine) 및 디아그노스틱스(Diagnostics)에 의해 시판되는 스쿠알렌 기재 에멀젼 시스템인 MF59이다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 항원 또는 항원 조성물 및 수중유 에멀젼을 포함하는 아주반트 조성물을 포함하는 백신 조성물이 제공되고, 여기서 상기 수중유 에멀젼은 0.25 내지 10 mg 대사가능한 오일 (적합하게는 스쿠알렌), 0.25 내지 11 mg 토콜 (적합하게는 토코페롤, 예컨대 알파-토코페롤) 및 0.125 내지 4 mg 유화제를 포함한다. 일부 경우에, 예를 들어 소아에게 투여하기 위해, 수중유 에멀젼은 표준 성인 용량의 1/2, 1/4 또는 1/8의 분할 용량으로 존재한다. 불활성화 뎅기 바이러스 백신과 함께 사용하기에 적합한 수중유 에멀젼의 분할 용량에 대한 추가의 상세한 내용은 WO 2008043774, USSN 12/445,090 (본원에 참고로 도입됨)에서 찾아볼 수 있다.

수중유 에멀젼을 사용하는 특정 제제에서, 이러한 에멀젼은 추가의 성분, 예를 들어 콜레스테롤, 스쿠알렌, 알파 토코페롤 및/또는 세제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (트윈 80®) 또는 소르비탄 트리올레에이트를 포함할 수 있다. 예시적 제제에서, 이러한 성분은 하기 양으로 존재할 수 있다: 약 1 내지 50 mg 콜레스테롤, 2％ 내지 10％ 스쿠알렌, 2％ 내지 10％ 알파 토코페롤 및 0.3％ 내지 3％ 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (모두 부피/부피). 전형적으로, 스쿠알렌:알파 토코페롤의 비율은 1 이하인데, 이것이 보다 안정한 에멀젼을 제공하기 때문이다. 일부 경우에, 제제는 또한 안정화제를 함유할 수 있다.

임의로는, 오일 및 물 에멀젼 아주반트는 하나 이상의 추가의 면역자극제를 포함한다. 한 구체적인 실시양태에서, 아주반트 제제는 에멀젼, 예컨대 수중유 에멀젼의 형태로 제조된 3D-MPL을 포함한다. 일부 경우에, 에멀젼은 WO 94/21292에 개시된 바와 같이 직경 0.2 ㎛ 미만의 작은 입자 크기를 갖는다. 예를 들어, 3D-MPL의 입자는 0.22 ㎛ 막을 통해 멸균 여과되기에 충분히 작을 수 있다 (유럽 특허 제0 689 454호에 기재된 바와 같음). 다르게는, 3D-MPL은 리포좀 제제로 제조될 수 있다. 임의로는, 3D-MPL (또는 그의 유도체)을 함유하는 아주반트는 추가의 면역자극 성분을 또한 포함한다.

예를 들어, 불활성화 뎅기 바이러스 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 유아에게 투여하기 위해 제제화되는 경우, 아주반트의 투여량은 유아 대상체에서 효과적이고 비교적 비-반응발생성이도록 결정된다. 일반적으로, 유아 제제에서의 아주반트의 투여량은 성인 (예를 들어, 65세 이상의 성인)에게 투여하기 위해 고안된 제제에서 사용되는 것보다 더 낮다. 예를 들어, 3D-MPL의 양은 전형적으로 용량 당 1 ㎍ 내지 200 ㎍, 예컨대 10 ㎍ 내지 100 ㎍, 또는 10 ㎍ 내지 50 ㎍ 범위이다. 전형적으로 유아 용량은 이러한 범위에서 한계가 더 낮고, 예를 들어 약 1 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 예컨대 약 2 ㎍ 또는 약 5 ㎍ 또는 약 10 ㎍ 내지 약 25 ㎍ 또는 약 50 ㎍이다. 전형적으로, QS21이 제제에서 사용되는 경우, 범위가 유사하다 (그리고, 상기 지시된 비율에 따름). 성인 및 노인 집단에 대해, 제제는 전형적으로 유아 제제에서 전형적으로 발견되는 것보다 많은 아주반트 성분을 포함한다.

면역원성 조성물은 전형적으로 면역보호성인 양 (또는 그의 분할 용량)의 항원을 함유하고, 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 면역원성 조성물 (인간 대상체에게 투여하기 위한 것 포함)의 제조가 문헌 [Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenurn Press, 1995], [New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978]에 일반적으로 기재되어 있다. 리포좀 내의 캡슐화가, 예를 들어 풀러톤(Fullerton)의 미국 특허 제4,235,877호에 기재되어 있다. 거대분자에 대한 단백질의 접합은, 예를 들어 릭히트(Likhite)의 미국 특허 제4,372,945호 및 아모르(Armor) 등의 미국 특허 제4,474,757호에 개시되어 있다.

전형적으로, 면역원성 조성물의 각각의 용량 내의 항원의 양은 전형적인 대상체에서 유의한 불리한 부작용 없이 면역보호성 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 이와 관련하여 면역보호성은 반드시 감염에 대해 완전하게 보호성인 것을 의미하는 것은 아니며; 이는 증상 또는 질환, 특히 바이러스와 관련된 중증 질환에 대한 보호를 의미한다. 항원의 양은 어떠한 특이적 면역원이 사용되는지에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 각각의 인간 용량이 0.05 내지 100 ㎍의 불활성화 바이러스, 예컨대 약 0.1 ㎍ (예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 또는 0.5 ㎍) 내지 약 50 ㎍, 예를 들어 약 0.5 ㎍ 내지 약 30 ㎍, 예컨대 약 1 ㎍, 약 2 ㎍, 약 3 ㎍, 약 4 ㎍, 약 5 ㎍, 약 10 ㎍, 약 15 ㎍, 약 20 ㎍ 또는 약 25 ㎍의 불활성화 뎅기 바이러스의 각각의 균주를 포함할 것으로 예상된다. 면역원성 조성물에서 사용되는 양은 대상체 집단 (예를 들어, 유아)에 기초하여 선택된다. 대상체에서의 항체 역가 및 다른 반응의 관찰을 수반하는 표준 연구에 의해 특정 조성물에 대한 최적의 양을 확인할 수 있다. 최초의 백신접종 후, 적합한 간격 후에 (예를 들어, 약 4주 내에) 대상체에게 추가접종을 제공할 수 있다.

선택된 아주반트에 상관없이, 최종 제제 중의 농도는 표적 집단에게 안전하고 효과적이도록 계산한다는 것을 인지해야 한다. 예를 들어, 인간에서 뎅기 바이러스에 대하여 면역 반응을 도출하기 위한 면역원성 조성물은 유아 (예를 들어, 초기 투여 연령이 출생일 내지 생후 1년, 예를 들어 0 내지 6개월인 유아)에게 투여하는 것이 바람직하다. 뎅기에 대하여 면역 반응을 도출하기 위한 면역원성 조성물은 또한, 성인에게 투여하는 것이 바람직하다 (예를 들어, 단독으로 투여하거나, 또는 예를 들어 "트래블러(traveler)" 백신과 관련하여 다른 병원체의 항원과 조합하여 투여함). 아주반트의 선택은 이러한 상이한 적용에 있어서 상이할 수 있고, 각 상황에 대한 최적의 아주반트 및 농도는 당업자에 의해 실험적으로 결정할 수 있다는 것을 인지할 것이다.

또한, 대상체에서 뎅기에 대하여 면역 반응을 도출하는 방법이 본 개시내용의 특징이다. 이러한 방법은 인간 대상체와 같은 대상체에게 불활성화 뎅기 바이러스 항원 및 알루미늄-비함유 아주반트를 포함하는 조성물을 면역학상 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 Th1 편향된 면역 반응을 도출하는 아주반트를 포함한다. 조성물은 뎅기에 특이적인 면역 반응을 도출하도록 제제화되고, 즉 조성물은 뎅기 바이러스로의 감염을 감소 또는 예방하고/거나 뎅기 바이러스로 감염된 후의 병리학적 반응을 감소 또는 예방하는 Th1 편향된 면역 반응을 도출하도록 제제화되어 이러한 반응을 나타낸다.

전형적으로, 백신은 액상 용액 또는 현탁액으로서 주사제로 제조되고; 주사되기 이전에 액상의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로 또한 제조될 수 있다. 조성물은 여러 상이한 경로에 의해 투여될 수 있으나, 가장 통상적으로 면역원성 조성물은 근육내, 피하 또는 피내 투여 경로에 의해 전달된다. 일반적으로, 백신은 중화 항체의 생성 및 보호에 효과적인 용량으로 피하, 피내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 백신은 투여 제제와 호환가능한 방식으로, 및 예방상 및/또는 치료상 효과적이게 될 양으로 투여된다. 투여되는 양 (일반적으로 용량 당 각각의 균주의 불활성화 바이러스 0.05 내지 100 ㎍의 범위임)은 치료할 대상체, 항체를 합성하는 대상체의 면역계의 능력, 및 원하는 보호 정도에 따라 달라진다. 투여할 백신의 정확한 양은 진료의의 판단에 따라 달라질 수 있으며, 각각의 대상체에 대해 고유할 수 있다.

백신은 단일 투여 스케줄, 또는 바람직하게는 백신접종의 주요 과정이 1 내지 10회 개별적인 투여 후에, 면역 반응을 유지 및/또는 강화시키기 위해 필요한 이후의 시간 간격 (예를 들어, 제2 투여의 경우 1 내지 4개월)에 주어지는 다른 투여, 및 필요한 경우 수개월 또는 수년 후의 후속 투여(들)일 수 있는 다중 투여 스케줄로 주어질 수 있다. 투여 처방은 또한 적어도 부분적으로 개체의 필요에 의해 결정되고, 진료의의 판단에 의존할 것이다. 적합한 면역화 스케줄의 예는 제1 투여에 후에, 7일과 6개월 사이의 제2 투여, 및 최초 면역화 이후 1개월과 2년 사이의 임의의 제3 투여, 또는 보호성 면역성을 부여하는 것으로 예상되는 바이러스-중화 항체의 역가를 도출하기에 충분한 다른 스케줄, 예를 들어 확립된 소아과 백신 스케줄에 상응하도록 선택된 것을 포함한다. 불활성화 바이러스 백신으로 뎅기에 대해 보호성 면역성이 생성되는 것은 합리적으로 1 내지 3회 접종으로 구성되는 면역화의 주요 과정 후에 예상할 수 있다. 이들은 보호성 면역성의 만족스러운 수준을 유지하기 위해 고안된 간격으로 (예를 들어, 매 2년마다) 추가접종에 의해 보충될 수 있다.

실시예

실시예 I - 뎅기 정제된 불활성화 바이러스 (1 ㎍ 및 10 ㎍) 및 알루미늄-비함유 아주반트를 함유하는 예시적 면역원성 조성물의 면역원성.

15마리 나이브 성숙한 암컷 C57Bl/6 마우스의 그룹에게 뎅기-2 (Den-2) 균주의 정제된 불활성화 바이러스 (PIV)를 함유하는 예시적 백신 후보의 두 용량으로 백신을 근육내로 투여하였다. 백신은 50 ㎕의 전체 부피로 투여하였다. 마우스를 뎅기 PIV를 단독으로 함유하는 제제 또는 알룸 (알룸 히드록시드), 알루미늄 히드록시드 상으로 흡착된 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL) (AS04D), 수중유 에멀젼 (AS03A) 및 리포좀 제제 중의 3D-MPL 및 QS21 (AS01B)로 보강된 뎅기 PIV 백신을 함유하는 제제로 면역화시켰다 (하기 표 1의 그룹 참조). AS03A 및 AS01B는 알루미늄 (알룸)-비함유 아주반트의 2가지 비-제한적 예이다. 제제에 사용된 뎅기 PIV 항원은 22℃에서 7일 동안 0.185％의 포르말린으로 불활성화된, 야생형 Den-2 바이러스의 배양물로부터 본질적으로 본원에 기재된 바와 같이 수득한 정제된 벌크이다.

본원에 개시된 예의 전반에 걸쳐, 통계학적 분석은 UNISTAT에 의해 백신접종후 CD4+ 빈도 및 중화 역가에 대해 수행하였다. 분산 분석에 대해 적용된 프로토콜은 간략하게 다음과 같이 기재할 수 있다: 데이터의 로그 변형; 그룹 분포의 정규성을 검증하기 위한, 각각의 집단 (그룹)에 대한 사피로-윌크(Shapiro-Wilk) 시험; 상이한 집단 (그룹) 사이의 분산의 균일성을 검증하기 위한 코크란(Cochran) 시험; 선택된 데이터에 대한 분산 분석; 일원 ANOVA의 상호작용을 위한 시험; 다중 비교를 위한 튜키(Tukey)-HSD 시험.

체액성 면역 반응은 제1 면역화 (제0일로 설정) 및 제2 면역화 (제21일) 21일 후에, 즉 면역화후 제21일 및 제42일에 측정하였다. 혈청 샘플을 항-뎅기 중화 검정을 이용하여 시험하였다. 간략하게, 뎅기 바이러스에 대한 마우스 혈청 중화 역가를 측정하기 위해, 여과되고 열 불활성화된 혈청의 연속적 희석액을 고정된 양의 단일특이적 뎅기 바이러스 (뎅기-2)와 인큐베이션하였다. 이어서, 혈청 및 바이러스의 혼합물을 (WHO 세포 은행으로부터의) 베로 세포의 단층에 첨가하고, 4일 동안 인큐베이션하였다. 혈청 샘플에 의한 바이러스 감염 억제를 96-웰 마이크로플레이트에 부착된 베로 세포 상에서 세포-관련 바이러스 항원을 검출하는 ELISA를 이용하여 측정하였다. 생성된 광학 밀도 판독값은 로그 중간-지점 선형 회귀 프로그램 모델을 사용하는 엑셀 스프레드시트로 자동적으로 처리하여 감염의 바이러스 백분율(％) 감소 결과를 얻었다 (미세중화 50％ 감소 또는 MN50으로 언급됨). 바이러스 중화 역가 (MN50)는 혈청 (TV)이 없는 바이러스 투여 대조군과 비교할 때 검정의 흡광도 판독 결과의 50％ 감소를 제공하는 혈청 희석 농도의 역수로 규정된다.

중화 항체 역가를 제21일에 각각의 그룹에 대해 풀링된 혈청에 대해, 및 제42일에 개별 혈청에 대해 결정하였다. 결과는 도 1에 나타낸다. 동일한 면역학적 프로파일이 시험된 두 용량 (1 및 10 ㎍ 전체 단백질)에서 관찰되었다. 중화 항체 역가는 조성물의 단일 투여 후의 반응과 비교하여 뎅기 PIV 백신의 1 ㎍ 또는 10 ㎍의 두 가지 투여 후에 향상되었다. 시험된 뎅기 PIV 백신의 두 용량에서, 보강된 뎅기 PIV 백신과 비교하여 유의하게 보다 낮은 중화 항체 반응이 비-보강된 백신에서 관찰되었다 (p<0.00001). 전체 단백질의 10 ㎍ 용량에서, AS04D로 보강된 뎅기 PIV 백신은 알룸 단독 (AS22A)으로 보강된 뎅기 PIV 백신에 의해 유도된 반응과 비교하여 유의하게 보다 높은 중화 항체 반응을 유도하였다 (p=0.0027). 1 ㎍ 전체 단백질의 용량에서 이들 2가지 아주반트 사이에 어떠한 차이도 관찰되지 않았다 (p>0.05). 도 1에 나타난 바와 같이, 각각의 알룸-비함유 아주반트로 보강된 조성물은 AS04D 또는 AS22A를 갖는 조성물이 유도하는 것보다 유의하게 보다 높은 중화 항체 반응을 유도하였다 (AS03A (p<0.0173) 또는 AS01B (p<0.0001)). AS03A와 AS01B로 보강된 뎅기 PIV 백신은 유사한 수준의 중화 항체 역가를 유도하였다 (p>0.05).

이러한 결과는 뎅기 PIV의 1 또는 10 ㎍ 전체 단백질의 용량에서, 보다 높은 중화 항체 역가가 알룸-함유 아주반트 (예를 들어, AS22A 또는 AS04D)와 조합된 동일한 항원에 의해 유도된 반응과 비교하여 알룸을 함유하지 않은 아주반트 시스템 (본원에 나타낸 AS03A 또는 AS01B로 예시됨)을 함유하는 조성물로 면역화된 마우스에서 관찰되었다는 것을 증명한다.

실시예 II - 뎅기 정제된 불활성화 바이러스 (1 ㎍ 및 10 ㎍) 및 알루미늄-비함유 아주반트를 아주반트의 상이한 희석액으로 함유하는 예시적 면역원성 조성물의 면역원성.

15마리의 성숙한 암컷 C57Bl/6 마우스의 그룹에게 50 ㎕의 전체 부피의 예시적 뎅기 PIV 백신의 두 용량을 근육내로 투여하였다. 마우스를 뎅기 PIV를 단독으로 함유하는 제제 또는 알룸 (AS22A, 알룸 히드록시드) 또는 상이한 아주반트 시스템의 희석액, 예를 들어 표준 용량의 1/2의 AS04D (AS04D/2), AS03B (5.93 mg 토코페롤을 포함하는 수중유 에멀젼-기재 아주반트 시스템) 및 AS01E (AS01B의 절반 용량)로 보강된 뎅기 PIV 항원을 함유하는 제제로 면역화시켰다 (표 2에 상세히 기재되어 있음). 제제에 사용된 PIV는 22℃에서 7일 동안 0.185％의 포르말린으로 불활성화된, 야생형 Den-2 바이러스의 배양물로부터 수득한 정제된 벌크이다.

면역화에 대한 체액성 면역 반응을 15마리 마우스/그룹에 대해 제1 및 제2 면역화 21일 후 (각각 제21일 및 제42일)에 측정하였다. 혈청 샘플을 상기 기재된 중화 검정에 의해 시험하였다.

제21일에 그룹 당 풀 혈청에 대한 중화 항체 역가 및 제42일에 그룹 당 개별 혈청에 대한 중화 항체 역가를 도 2에 나타낸다. 동일한 면역학적 프로파일이 시험된 두 용량 (1 및 10 ㎍ 전체 단백질)에서 관찰되었다. 면역원성 조성물의 두 가지 투여 후에 단지 뎅기 PIV 항원 1 ㎍ 또는 10 ㎍의 단일 투여 후에 유도된 반응과 비교하여 보다 높은 중화 항체 역가가 관찰되었다. 시험된 뎅기 PIV 백신의 두 용량에서, 보강된 뎅기 PIV 제제와 비교하여 유의하게 보다 낮은 중화 항체 반응이 비-보강된 백신에서 관찰되었다 (p<0.00001). 1 ㎍ 전체 단백질 용량에서, AS04D/2로 보강된 뎅기 PIV 백신은 알룸 단독으로 보강된 뎅기 PIV 백신에 의해 유도된 반응과 비교하여 유사한 중화 항체 반응을 유도하였다 (p>0.05). 시험된 동일한 백신 용량에서, AS03B 또는 AS01E로 보강된 뎅기 PIV 백신은 AS04D (AS03B의 경우 p≤0.029 및 AS01E의 경우 p≤0.00001) 또는 알룸 (AS03B의 경우 p≤0.0035 및 AS01E의 경우 p≤0.00001)으로 보강된 백신과 비교하여 유의하게 보다 높은 중화 항체 역가를 유도하였다.

결론적으로, 뎅기 PIV 항원의 1 또는 10 ㎍ 전체 단백질의 용량에서, 알룸-함유 아주반트 (AS22A 또는 AS04D/2)로 보강된 동일한 항원에 의해 유도된 반응과 비교하여 보다 높은 중화 항체 역가가 알룸을 함유하지 않은 아주반트 시스템 (AS03B 또는 AS01E)의 희석액으로 보강된 조성물로 면역화된 마우스에서 관찰되었다.

실시예 III - 뎅기 정제된 불활성화 바이러스 (2 ㎍ 및 200 ng) 및 알루미늄-비함유 아주반트를 아주반트의 상이한 희석액으로 함유하는 예시적 면역원성 조성물의 면역원성.

25마리 성숙한 암컷 C57Bl/6 마우스의 그룹을 50 ㎕의 전체 부피의 예시적 뎅기 PIV 백신의 두 용량으로 근육내로 면역화시켰다. 마우스를 뎅기 PIV 항원을 단독으로 함유하는 제제 또는 알룸 (AS22A, 알룸 히드록시드) 또는 상이한 아주반트의 희석액, 예를 들어 AS04D (AS04D/2), AS03B (5.93 mg 토코페롤을 함유하는 수중유 에멀젼-기재 아주반트 시스템) 및 AS01E (AS01B의 절반 용량)로 보강된 뎅기 PIV 항원을 함유하는 제제로 면역화시켰다 (그룹은 표 3에 상세히 기재되어 있음). 제제에 사용된 PIV 항원은 22℃에서 7일 동안 0.185％의 포르말린으로 불활성화된, 야생형 Den-2 바이러스의 배양물로부터 수득한 정제된 벌크이다.

면역원성 조성물의 투여에 대한 체액성 면역 반응은 15마리 마우스/그룹에 대해 제1 및 제2 면역화 14일 후 (각각 제14일 및 제28일)에 측정하였다. 혈청 샘플을 상기 기재된 중화 검정에 의해 평가하였다.

각각 두 비장의 5개 풀을 사용하여 ICS에 의해 세포성 면역 반응을 평가하기 위해 각각의 그룹으로부터 10마리 마우스를 면역화 7일 후에 희생시켰다. CMI는 단지 AS04D/2, AS03B, AS01E로 보강된 뎅기 PIV 백신 2 ㎍으로 면역화된 마우스의 그룹에 대해 및 비-보강된 백신 또는 AS22A로 보강된 백신 200 ng으로 면역화된 마우스 (그룹 1 내지 5) 및 PBS를 투여한 마우스 (그룹 9)에서 평가하였다. 다른 15마리 마우스의 혈청을 제1 면역화 14일 후 (제14일) 및 제2 면역화 14일 후 (제28일)에 수집하였다.

중화 항체 역가를 제14일에 그룹 당 풀링된 혈청에 대해, 및 제28일에 그룹 당 개별 혈청에 대해 결정하였다. 결과는 도 3에 제공된다. 보다 높은 중화 항체 역가는 단일 투여 후의 역가와 비교하여 뎅기 PIV 백신 2 ㎍ 또는 200 ng의 두 가지 투여 후에 관찰되었다. 비-보강된 제제와 비교하여 유의하게 보다 높은 중화 항체 반응은 보강된 뎅기 PIV 제제에서 관찰되었다 (p<0.0089). 뎅기 PIV 200 ng의 용량에서, AS03B 및 AS01E로 보강된 제제는 AS22A 또는 AS04D/2로 제제화된 동일한 항원에 의해 도출된 반응과 비교하여 실질적으로 보다 높은 중화 항체 반응을 도출하였다. 항원의 보다 낮은 용량에서, AS22A 및 AS04D/2로 보강된 뎅기 PIV는 200 ng 전체 단백질의 용량에서와 대등한 중화 항체 반응을 유도하였다 (p>0.05). 2 ㎍ 전체 단백질의 보다 높은 항원 용량에서, AS04D/2와의 제제는 AS03B로 보강된 백신과 비교하여 유사한 중화 항체 반응을 유도하였다 (p>0.05). 그러나, 항원의 보다 낮은 용량 (200 ng)에서, AS03B와의 제제는 AS04D/2보다 유의하게 보다 높은 중화 항체 역가를 도출하였다 (p=0.0012). 흥미롭게도, AS01E로 보강된 뎅기 PIV는 다른 모든 그룹과 비교하여 유의하게 보다 높은 중화 항체 역가를 유도하였다 (p≤0.0028).

세포성 면역 반응은 또한 아주반트의 상기 언급한 희석액과 조합된 뎅기 PIV의 두 가지 투여 후에 평가하였다. CD4+ T 세포 시토카인 반응은 ICS에 의해 제2 면역화 7일 후 (제21일)에 평가하였다 (도 4).

보다 낮은 CD4+ T 세포 반응은 다른 모든 그룹과 비교하여 비-보강된 뎅기 PIV 백신에 의해 유도되었다 (p≤0.001). AS01E로 보강된 뎅기 PIV 백신으로 면역화된 마우스는 다른 모든 그룹의 마우스와 비교하여 최고 CD4+ T 세포 반응을 유도하였다 (p≤0.00001). AS22A, AS04D/2 및 AS03B로 보강된 뎅기 PIV 백신으로 수득한 CD4+ T 세포 반응은 통계학적으로 상이하지 않았다 (p>0.05).

결론적으로, 알룸을 함유하지 않은 아주반트 시스템 (AS03B 또는 AS01E)으로 보강된 뎅기 PIV 백신으로 면역화된 마우스에서 알룸 히드록시드 (AS22A)로 보강된 이 백신에 의해 유도되는 반응과 비교하여 보다 높은 중화 항체 역가가 관찰되었다. 중요하게는, AS01E로 보강된 뎅기 PIV 백신은 알룸-함유 아주반트, AS04D/2로 보강된 백신과 비교하여 보다 높은 중화 항체 반응 및 보다 높은 CD4 T 세포 반응을 유도하였다.

요컨대, 알룸-함유 아주반트 (AS22A, AS04D 또는 AS04D/2)로 제제화된 뎅기 PIV로 면역화된 마우스와 비교하여, 알룸-비함유 아주반트 시스템 (예를 들어, 알룸을 함유하지 않은 AS01B 또는 AS01E)으로 제제화된 백신으로 면역화된 마우스는 실질적으로 보다 높은 중화 항체 반응 및 CD4+ T 세포 반응을 도출하였다. 이러한 결과는 알룸-비함유 아주반트로 제제화된 뎅기 PIV 백신의 바람직한 면역원성 특성을 증명한다.

Claims

하나 이상의 불활성화 뎅기 바이러스 항원 및 알루미늄-비함유 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물.
제1항에 있어서, 하나 이상의 불활성화 뎅기 바이러스 항원이 뎅기-1 바이러스 항원, 뎅기-2 바이러스 항원, 뎅기-3 바이러스 항원 및 뎅기-4 바이러스 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 불활성화 뎅기 바이러스 항원이 뎅기-2 바이러스 항원인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 불활성화 뎅기 바이러스 항원이 온전한 죽은 바이러스인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 수중유 에멀젼을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 대사가능한 오일, 토콜 및 유화제를 포함하는 수중유 에멀젼 담체를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제5항 또는 제6항에 있어서, 대사가능한 오일이 스쿠알렌인 면역원성 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서, 토콜이 알파-토코페롤인 면역원성 조성물.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 에멀젼이 비이온성 계면활성제 유화제를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제9항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 스쿠알렌 및 알파 토코페롤을 1 이하의 비율로 포함하는 면역원성 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가
약 2％ 내지 약 10％ 스쿠알렌,
약 2％ 내지 약 10％ 알파-토코페롤,
약 0.3％ 내지 약 3％ 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트
를 포함하는 용량으로 제제화되는 것인 면역원성 조성물.
제12항에 있어서, 아주반트가
약 10 mg 내지 약 12 mg 스쿠알렌,
약 10 mg 내지 약 12 mg 알파-토코페롤,
약 4 mg 내지 약 6 mg 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트
를 포함하는 용량으로 제제화되는 것인 면역원성 조성물.
제12항 또는 제13항에 있어서, 아주반트가
10.68 mg 스쿠알렌,
11.86 mg 토코페롤,
4.85 mg 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트
를 포함하는 용량으로 제제화되는 것인 면역원성 조성물.
제13항에 있어서, 아주반트가 분할 용량으로 제제화되는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL) 및 QS21의 조합을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제1항에 있어서, 아주반트가 리포좀 제제에 3D-MPL 및 QS21을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제16항에 있어서, 아주반트가 콜레스테롤을 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 콜레스테롤, DOPC, 3D-MPL 및 QS21을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제20항에 있어서, 아주반트가
약 0.1 내지 약 0.5 mg 콜레스테롤,
약 0.25 내지 약 2 mg DOPC,
약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍ 3D-MPL, 및
약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍ QS21
을 포함하는 용량으로 제제화되는 것인 면역원성 조성물.
제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤 대 QS21의 비율이 5:1 (중량/중량)인 면역원성 조성물.
제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤 대 QS21의 비율이 1:1 (중량/중량)인 면역원성 조성물.
제21항에 있어서, 아주반트가
약 0.25 mg 콜레스테롤,
약 1.0 mg DOPC,
약 50 ㎍ 3D-MPL, 및
약 50 ㎍ QS21
을 포함하는 용량으로 제제화되는 것인 면역원성 조성물.
제1항에 있어서, 아주반트가 QS21 및 콜레스테롤을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
하나 이상의 정제된 불활성화 뎅기 바이러스 항원을 제공하는 것; 및
하나 이상의 정제된 불활성화 뎅기 바이러스 항원을 알루미늄-비함유 아주반트로 제제화하는 것
을 포함하는, 뎅기 백신의 생산 방법.
제26항에 있어서, 하나 이상의 정제된 불활성화 뎅기 바이러스 항원이 포름알데히드, 베타프로피오락톤 (BPL), 과산화수소, 자외선 조사 및 감마선 조사의 군으로부터 선택된 제제에 살아있는 바이러스를 접촉 또는 노출시키는 하나 이상의 단계에 의해 불활성화된 온전한 죽은 바이러스인 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 뎅기 바이러스에 의해 유발되는 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 방법.
제27항에 있어서, 대상체가 5세 아래인 방법.
제29항에 있어서, 대상체가 1세 아래인 방법.
제27항 또는 제29항에 있어서, 상기 백신을 비경구로 투여하는 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 면역원성 조성물.