CN102395600A - 含有无铝佐剂的灭活的登革热病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于预防和/或治疗登革热病毒引起的疾病的免疫原性组合物。

Description

含有无铝佐剂的灭活的登革热病毒疫苗
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年2月17日提交的美国临时申请61/153,060的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
背景
登革热是通过蚊子传染的人类急性病毒性疾病。其为全球热带和亚热带的地方性疾病，每年估计有100,000,000例发生。虽然比较罕见，登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)在儿童中是主要的致死原因。目前，还没有抗登革热的疫苗，而试图通过控制蚊子媒介来防病也被证明基本无效。因此，需要安全和有效的疫苗来对抗由登革热病毒导致的疾病。
简述
本公开涉及引发抗登革热病毒的免疫反应的组合物。更具体地说，本公开涉及包含佐剂的灭活登革热病毒的疫苗。本文公开的组合物包括不含铝的佐剂，例如能够促进Th1免疫反应的不含铝的佐剂。还公开了它们的应用方法，例如用于制备预防或治疗由登革热病毒引起的疾病的药物。
附图简述
图1的条形图显示未接触过抗原的C57Bl/6小鼠中抗Den-2中和抗体的效价。
图2的条形图显示未接触过抗原的C57Bl/6小鼠中抗Den-2中和抗体的效价。
图3的条形图显示未接触过抗原的C57Bl/6小鼠中抗Den-2中和抗体的效价。
图4的条形图显示在外周血细胞中通过胞内细胞因子染色对细胞免疫反应进行的研究。
详述
介绍
本发明涉及满足对安全有效的登革热疫苗的需求的疫苗。纯化的灭活登革热病毒疫苗相对减活登革热病毒具有的优势在于灭活病毒没有传染性，因此不会恢复毒性或者引起疾病。纯化的灭活登革热病毒疫苗与减活病毒相比，潜在的缺点是引发高效价登革热特异性中和抗体的能力下降，并且保护性免疫反应持续时间较短。通过将纯化的灭活登革热抗原与合适的佐剂一起成剂可以克服这些缺点。如文中公开的，所述佐剂是能够有效引发高效价登革热特异性中和抗体的不含铝(无铝)佐剂(或佐剂系统)。在实施方案中，佐剂引发了Th1为主的反应或者平衡的Th1/Th2反应，特征在于产生干扰素γ(IFN-γ)。
本文公开的免疫原性组合物包含与无铝佐剂组合的至少一种(即一种或一种以上)灭活的登革热病毒抗原。灭活的登革热病毒抗原可以选自登革热-1病毒抗原、登革热-2病毒抗原、登革热-3病毒抗原和登革热-4病毒抗原。因此，免疫原性组合物可以是单价组合物，即所述组合物包含从选自登革热-1、登革热-2、登革热-3或登革热-4的单个病毒株得到的单个灭活登革热病毒抗原；或者组合物可以是多价(例如二价、三价、四价)组合物，即组合物含有一种以上这些登革热病毒株的灭活抗原。在一个示范性实施方案中，免疫原性组合物包含登革热-2病毒抗原。例如，免疫原性组合物可以是含有灭活的登革热-2抗原的单价组合物。替代地，免疫原性组合物可以是含有灭活的登革热-2病毒抗原并组合了一、二或三种其他灭活登革热病毒抗原的二价、三价或四价组合物。例如，在一个实施方案中，组合物是四价组合物，即包含灭活的登革热-1病毒抗原、灭活的登革热-2病毒抗原、灭活的登革热-3病毒抗原和灭活的登革热-4病毒抗原。
一或多种灭活的登革热病毒抗原与不含铝或铝盐的佐剂(即无铝佐剂或佐剂系统)一起成剂。在一个实施方案中，佐剂包括水包油乳剂。例如，水包油乳剂可以包含并入了可代谢油的油相，还任选包含其他的油相成分，比如母育酚(tocol)。水包油乳剂还含有水性成分，比如缓冲盐溶液(例如，磷酸盐缓冲液)。此外，水包油乳剂一般含有乳化剂。在一个实施方案中，可代谢油是角鲨烯。在一个实施方案中，母育酚是α-生育酚。在一个实施方案中，乳化剂是非离子型表面活性剂乳化剂(比如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯，TWEEN80TM)。在示范性实施方案中，水包油乳剂含有比率等于或低于1(w/w)的角鲨烯和α生育酚。
在一个具体实施例中，免疫原性组合物包含形成一个剂量含有：大约2％到大约10％角鲨烯；大约2％到大约10％α-生育酚；以及大约0.3％到大约3％聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯的水包油乳剂佐剂系统。例如，免疫原性组合物可以包含配制在一个剂量中含有大约10mg到大约12mg角鲨烯；大约10mg到大约12mg α-生育酚；以及大约4mg到大约6mg聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯的佐剂。在一个具体实施例中，佐剂在单个(整个)剂量中含有：10.68mg角鲨烯、11.86mg生育酚、4.85mg聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。在其他实施方案中，免疫原性组合物与以上用量成分的部分剂量(即是以上单个剂量制剂的一部分，比如以上成分用量的一半、1/4；或者另一种部分剂量，例如1/3、1/6等)一起成剂。
某些实施方案中，灭活的登革热病毒抗原与无铝佐剂系统一起成剂，所述佐剂系统包含3-脱酰单磷酸类脂A(3D-MPL)和/或QS21。在一个实施方案中，佐剂系统包含3D-MPL和QS21.例如，在一个实施方案中，佐剂在脂质体制剂中含有3D-MPL和QS21。任选地，佐剂系统还含有胆固醇。在一个特定实施方案中，佐剂包含QS21和胆固醇。任选地，佐剂系统含有1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)。例如，在与灭活的登革热病毒抗原一起成剂的一个具体佐剂系统中含有胆固醇、DOPC、3D-MPL和QS21。
在一个具体实施例中，免疫原性组合物包含配制在一个剂量中含有大约0.1到大约0.5mg胆固醇；大约0.25到大约2mg DOPC；大约10μg到大约100μg 3D-MPL；和大约10μg到大约100μg QS21的佐剂。在一个实施方案中，佐剂中胆固醇与QS21的比率是5∶1(w/w)。例如，佐剂中胆固醇与QS21的比率可以是大约或者正好1∶1(w/w)。在一个特定制剂中，佐剂配制成含有大约0.25mg胆固醇、大约1.0mg DOPC、大约50μg 3D-MPL和大约50μg QS21的单个剂量。在其他实施方案中，免疫原性组合物与以上用量成分的部分剂量(即是以上单个剂量制剂的一部分，比如以上成分(胆固醇、DOPC、3D-MPL和QS21)用量的一半、1/4；或者另一种部分剂量，例如1/3、1/6等)一起成剂。
本公开另一方面涉及制备登革热疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
提供至少一种灭活的登革热病毒抗原；以及将所述至少一种纯化的灭活登革热病毒抗原与不含铝的佐剂一起成剂。例如，免疫原性组合物可以与已被灭活或杀死的毒性株或者减毒株所产生的完整病毒抗原一起成剂。例如，可以利用化学试剂，比如甲醛、β-丙内酯(BPL)或过氧化氢或者利用紫外照射，或者两种或多种灭活步骤(可以是相同或不同的步骤，例如任何组合方式的甲醛和BPL、甲醛和UV照射、BPL和UV照射、过氧化氢和BPL、过氧化氢和UV照射等)联用将活的(毒性或减毒的)病毒杀死或灭活，使其不能复制。任选地，对灭活的登革热病毒还进行其他加工，比如裂解或抗原亚基的进一步纯化。
本公开另一方面涉及预防、缓解或治疗患者中由登革热病毒引起的疾病的方法，所述方法包括：与无铝佐剂(如文中所述)组合给予含有至少一种灭活登革热病毒抗原的免疫原性组合物(例如疫苗)。在一个实施方案中，方法涉及将免疫原性组合物给予儿童，比如小于5岁的儿童，或者小于1岁的儿童。在一个实施方案中，免疫原性组合物被给予小于1岁的未接触过抗原的患者。在其他实施方案中，免疫原性组合物被给予成年患者，比如60或65岁以上的老年患者。这些患者可以是以前接触过登革热病毒。
一般来说，疫苗是肠胃外给予的，例如肌内。另一方面，本公开涉及含有至少一种纯化的灭活登革热病毒抗原的免疫原性组合物与无铝佐剂组合用于例如预防、缓解或治疗登革热病毒感染和/或登革热病毒诱发疾病(比如出血热(DHF)和登革热休克综合征(DSS))的药物。
术语
为了便于审查本公开中的各种实施方案，特提供对术语的以下解释。其他术语和解释在本公开的上下文中有提供。
除非另作解释，本文使用的所有科技术语与本公开所属领域中普通技术人员通常理解的含义相同。分子生物学中常用术语的定义在BenjaminLewin，GenesV(Oxford University Press出版)，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew etal.(eds.)，The Encyclopedia of Molecular Biology(BlackwellScience Ltd.出版)，1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference (VCHPublishers，Inc.出版)，1995(ISBN1-56081-569-8)中可以找到。
单数术语“一个”(“a”、“an”和“the”)包括复数的指代对象，除非上下文清楚地另有说明。类似地，单词“或者”意图包括“和”，除非上下文清楚地表明不是这样。术语“复数”是指两个或多个。还应理解对核酸或多肽提供的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子重量或分子质量的数值都是近似值，仅用于描述的目的。此外，针对物质(比如抗原)浓度或水平给出的数字限制只是近似值。因此，当指出浓度至少(例如)200pg，这是希望理解浓度是至少近似(或者“大约”或者“～”)200pg。
虽然可以在本公开的实施或验证中使用与本文描述的类似或等同的方法和材料，以下描述了合适的方法和材料。术语“包含”意味着“包括”。因此，除非上下文另有要求，词语“包含”(“comprises”)及其各种变化(比如“comprise”和“comprising”)应理解为含有所述化合物或组合物(例如核酸、多肽、抗原)或步骤，或者一组化合物或步骤，但不排除任何其他化合物、组合物、步骤或它们的组。缩写“e.g.”来源于拉丁文exempli gratia，用在本文中表明非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如”是同义词。
“免疫原性组合物”是适合给予人或动物患者(例如在试验情景中)，能够引发特异免疫反应(例如抗诸如登革热病毒的病原)的物质的组合物。比如，免疫原性组合物包含一或多种抗原(例如，完整的纯化病毒或抗原亚基，例如其多肽)或抗原表位。免疫原性组合物还可以包含能够引发或增强免疫反应的一或多种其他成分，比如赋形剂、载体和/或佐剂。某些情况中，给予免疫原性组合物以引发帮助患者对抗病原所引起的症状或状况的免疫反应。某些情况中，在患者接触病原后，通过抑制病原(例如登革热病毒)的复制来预防(或治疗，例如减轻或缓解)病原所导致的症状或疾病。在本文语境中，术语免疫原性组合物应理解为涵盖为了引发抗登革热的保护性或缓解性免疫反应，给予患者或患者群体的组合物(即，疫苗组合物或疫苗)。
术语“纯化”(例如，针对病原或含有病原的组合物)是指从组合物中除去那些不希望有的成分的过程。纯化是一个相对的术语，不要求全部的不希望成分都从组合物中除去。就疫苗生产而言，纯化包括诸如离心、透析、离子交换层析和体积排阻层析、亲和纯化或沉淀的过程。因此，术语“纯化”不需要绝对的纯；而是一个相对术语。因此，例如纯化病毒制品是其中的病毒比它通常环境(例如它天然情况下在其中复制的细胞或细胞群或者人工环境)中更富集的制品。基本纯的病毒制品可以纯化成所需病毒或病毒成分代表制品中总蛋白含量的至少50％。某些实施方案中，基本纯的病毒代表制品中总蛋白含量的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％，或者至少95％或以上。
“分离的”生物成分(比如病毒、核酸分子、蛋白或细胞器)已被与存在或产生该成分的细胞和/或生物体中的其他生物成分基本分开或纯化出来。已被“分离的”病毒和病毒成分，例如蛋白质包括通过常规纯化技术纯化的病毒和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞内进行重组表达制备的病毒和病毒成分(比如病毒蛋白)。
“抗原”是能够刺激动物内抗体产生和/或T细胞反应的化合物、组合物或物质，包括注射到、吸收入或者其他方式导入动物的组合物。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。术语“表位”或“抗原决定簇”是指B和/或T细胞应答的抗原上的部位。“主要抗原表位”或“主要表位”是功能重要的宿主免疫反应(例如抗体反应或T细胞反应)在此进行的那些表位。因此，就抗病原的保护性免疫反应而言，主要抗原表位是当被宿主免疫系统识别时产生对病原引起的疾病的保护作用的那些抗原部分。术语“T-细胞表位”是指当与合适的MHC分子结合时，被T细胞(经由T细胞受体)特异结合的表位。“B-细胞表位”是被抗体(或B细胞受体分子)特异结合的表位。
在本文语境中，登革热病毒抗原一般是完整的被杀死或者灭活的病毒。术语“灭活的”在登革热病毒疫苗的语境中意味着抗原成分(例如病毒)不能在体内或体外复制。例如，术语“灭活的”涵盖已经在例如体外复制了，然后利用化学或物理手段杀死，从而再不能复制。该术语还可以包括通过进一步加工(例如裂解、分离等)产生的抗原以及通过重组手段在例如细胞培养中产生的成分。
“佐剂”是与没有它的情况下给予抗原相比，能够增强抗原特异性免疫反应的试剂。常见佐剂包括含有铝的佐剂，其包含抗原可以吸附其上的矿物质悬液(或矿物盐，比如氢氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝)。在本文语境中，佐剂是在没有任何所述铝盐的情况下配制的无铝佐剂。无铝佐剂包括油和水乳剂，比如油包水和水包油型(及其变体，包括复乳剂和可逆乳剂)、糖脂、脂多糖、免疫刺激核酸(比如CpG寡核苷酸)、脂质体、Toll样受体拮抗剂(特别是，TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9拮抗剂)和这些成分的各种组合。
“免疫反应”是免疫系统的细胞，比如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激的反应。免疫反应可以是B细胞反应，这种反应导致产生特异抗体，比如抗原特异性中和抗体。免疫反应也可以是T细胞反应，比如CD4+反应或CD8+反应。某些情况中，反应是对特定抗原特异的(即“抗原特异性反应”)。如果抗原来源于病原体，抗原特异性反应是“病原体特异性反应”。“保护性免疫反应”是抑制病原体的有害功能或活性、减轻病原感染或者减少病原体感染所导致的症状(包括死亡)的免疫反应。保护性免疫反应可以通过例如在噬斑减少分析或ELISA-中和检测中病毒复制或噬菌斑形成的抑制，或者通过体内测量对病原攻击的抗性来测量。
偏向“Th1”型免疫反应特征在于存在产生IL-2和IFN-γ的CD4+T辅助细胞，因此有IL-2和IFN-γ的分泌和存在。相反，偏向“Th2”型的免疫反应特征在于占优势的产生IL-4、IL-5和IL-13的CD4+辅助细胞。
“患者”是活的多细胞脊椎生物体。在本文语境中，患者可以是试验性患者，比如非人动物，例如小鼠、棉田鼠或非人灵长动物。替代地，患者可以是人患者。
本文公开的免疫原性组合物适用于登革热病毒感染所导致的疾病的预防、缓解和/或治疗。
本文公开的免疫原性组合物包括一或多种纯化的灭活登革热病毒抗原。例如，免疫原性组合物可以包含单个登革热病毒株(即单价组合物)，或者可以含有一种以上登革热病毒株(即多价组合物)。一般来说，多价组合物含有选自不同血清型的病毒株。因为有四种可以引起疾病的登革热病毒血清型，即登革热1型(DEN-1)、登革热2型(DEN-2)、登革热3型(DEN-3)和登革热4型(DEN-4)，而且因为交叉反应性非中和抗体倾向导致更严重形式的登革热疾病，为了保证抗四种血清型中任何一种引起的疾病，可以给每种血清型挑选一个代表包括到最终的疫苗中。因此，在一个实施方案中，免疫原性组合物是包含选自登革热病毒四种血清型的每一种的病毒株的四价组合物。
用作抗原的病毒可以选自几乎任何登革热病毒株。例如，可以基于与血清型给定(例如共有)序列的一致性给每个血清型挑选病毒株，所述给定序列是比如DEN-1共有序列、DEN-2共有序列、DEN-3共有序列或DEN-4共有序列。这种病毒可以是天然的或合成的。替代地，可以挑选与疫苗要使用的区域或群体中流行的病毒株有关的病毒株。另一个选择是根据可得性或以前的经验方便地挑选每个血清型的病毒株。例如，美国专利6,254,873中描述了示范性病毒株，该专利通过引入并入本文。其他合适的毒株在例如美国专利7,226,602中有描述。在例如VBRC病毒基因组数据库(http://athena.bioc.uvic.ca/organisms/Flaviviridae/Dengue/Curated genes)和登革热病毒数据库(http://www.broad.mit.edu/annotation/viral/Dengue/ProjectInfo.html)中可以找到其他病毒株。
纯化的灭活登革热病毒疫苗的情况中，可以使用毒性株或减毒株。通常毒性株在宿主细胞内可以繁殖到更高滴度，有助于商业规模生产。但是，毒性株需要在接触时特别注意以防止参与生产的人员被感染。减毒株，例如通过适应在培养细胞中产生、挑选减弱的毒性和/或在登革热病毒的蚊子媒介中复制下降而建立起来的减毒株，需要较少的预防措施但可能很难制备。适合用于含有灭活登革热病毒和无铝佐剂的免疫原性组合物中的示范性减毒株在WO 00/57907和美国专利6,638,514，以及WO 00/58444和US6,613,556中有描述，这些专利均通过引用并入本文。因此，所选毒株一般从可供在适合生产人使用材料的细胞(例如，认证为不含病原体的细胞)中复制的大量毒株中进行选择。例如，可以对毒株进行筛选来鉴定那些能够在所选细胞系中生长至最高滴度的病毒，例如至少大约5x106pfu/ml的滴度，优选至少1x107pfu/ml或以上；(ii)挑选登革热病毒中那些在所选细胞系中能够生长至最高滴度的毒株；和(iii)通过再在所选细胞系中传代一到几次使那些选中的毒株进一步提高生长。选中的病毒(例如，从登革热病毒四种血清型中挑选的)可以通过另外的细胞培养传代或者通过基因操纵使之适应生长至高滴度，从而制备高滴度主毒株和生产种子批次。
适合增殖登革热病毒的细胞系包括哺乳动物细胞，比如Vero细胞、AGMK细胞、BHK-21细胞、COS-1或COS-7细胞、MDCK细胞、CV-1细胞、LLC-MK2细胞、原代细胞系比如胎恒河猴肺(FRhL-2)细胞、BSC-1细胞和MRC-5细胞，或者人二倍体成纤维细胞以及禽类细胞，鸡或鸭胚胎源细胞系，例如AGE1细胞，和原代鸡胚胎成纤维细胞；以及蚊子细胞系，比如C6/36。优选地，所选细胞适应在没有血清或源于血清的蛋白的情况下生长，并且可以在无血清(和/或无蛋白)生长条件下维持登革热病毒的高滴度复制。
为了在细胞培养物中繁殖病毒，利用选中的登革热病毒株感染宿主细胞(例如，从以上列举的合适细胞类型中挑选的)。病毒吸附后，给培养物提供能够支持所述细胞生长的培养基。优选地，培养基不含血清或源于血清的蛋白或其他源于动物的代表，或者在生产过程中用不含血清的培养基代替含有血清的培养基。有许多不含血清的培养基可供购买。在例如已公开的美国专利20060183224(通过引用并入本文)中可以找到关于在维持于无血清条件下的细胞中制备病毒的详细方法。
将宿主细胞在培养基中维持几天直至达到所需的病毒滴度。任选地，将细胞维持在持续灌注系统中，可以由此间歇地或者持续地在几天或更长时间内获得病毒。在非持续培养条件下，感染后3-7天需要至少大约106到107PFU/ml的病毒滴度。在某些宿主细胞中，滴度在几天内保持较高，并且可以在多个时间点回收病毒以最大化产量。例如，可以在感染后大约3到13天，通过收集上清并给细胞重新加料来每天从这些培养基中收获病毒。任选地，在其他加工之前将上清汇集到一起。在其他宿主细胞中，可以使病毒生长至更高滴度，但持续时间较短。这种情况中，可以在根据经验确定的滴度峰值处采集病毒。
例如，可以在含有Ficin的VPSFM培养基中扩增Vero细胞至141代。在有猪胰蛋白酶的情况下，再进行一次传代。将细胞以大约0.7x106细胞/ml接种到Bioreactor(4L)中，在VPSFM+Pluronic(普流尼克)0.1％中的微载体(cytodex-1)上于灌注条件(例如，D0-＞：0体积/天；D1-＞D2：1v/d；然后其余的3天中1.5v/d)培养5天。然后大约3x106细胞/ml的细胞于37℃在DMEM+谷氨酰胺4mM++FBS2％中以减小的培养基体积(2L)(于35℃)感染例如MOI0.01的登革热病毒。然后将Bioreactor中的培养基体积调节为4L。3天后，除去大部分的培养基(大约3L)，用DMEM培养基+谷氨酰胺4mM代替。感染后7天，可以采集病毒。
为了回收病毒，通过本领域已知的常用方法，包括低速离心(例如1500xg，10min)或者经孔径0.45μm的滤膜过滤来采集病毒。浓缩所述病毒的方法是本领域普通技术人员所掌握的，包括例如超滤(例如利用孔径不大于300kDa的膜)或者用聚乙二醇(PEG)8000进行沉淀。纯化病毒的方法是本领域技术人员已知的，包括连续或多步骤蔗糖梯度；通过使用大小排阻、离子交换、吸附或亲和柱的柱层析进行纯化；或者通过在聚合物双相或多相系统中分布进行纯化，以及它们的任意组合。检测病毒阳性级分的方法包括噬斑法、血凝(HA)法和/或抗原分析法，比如免疫分析法。
例如，登革热病毒可以通过聚乙二醇(PEG)沉淀从培养物上清中浓缩。来自感染细胞的上清液通过离心(1,500xg)10分钟进行澄清。澄清的上清加入6％PEG8000(Sigma)和0.5M NaCl，保持于4℃，温和搅拌45分钟。通过5000xg离心50分钟收集沉淀物，并重悬于STE缓冲液(0.1MNaCl、10mM tris、1mM EDTA、pH7.6)中。然后经离心(4℃，12,000xg离心10分钟)澄清病毒悬浮液。丢弃沉淀物，将上清离心(170,000xg，80分钟，4℃)得到病毒沉淀。将该病毒沉淀物以所需浓度重悬于STE缓冲液中。
替代地，或者另外，可以通过切面流超滤由细胞上清浓缩登革热病毒。来自感染细胞的上清液如上所述通过低速离心澄清，然后经0.45μm CN滤膜(Nalgene)过滤。利用低蛋白结合的100kDa-截留膜(例如omega 100K滤网通道，Filtron，Inc.)通过切面流超滤将滤过液浓缩。浓缩在4℃进行，所用流速为每分钟400ml，过滤速度约每分钟100ml，压力20-30psi。
进一步纯化可以利用蔗糖梯度超离心来实现。登革热病毒可以基本按照以前的描述(Srivastava et al.Arch.Virol.96：97-107，1987)，略作改动在蔗糖梯度上进行纯化。通过逐步添加以下溶于磷酸缓冲液(pH 7.4，(不含Ca和Mg的PBS，Whittaker MA Bioproducts))的w/w蔗糖溶液，可以在1″x3.5″(40ml)超滤管(Ultra-clear.TM.，Beckman，Inc.)中制备15ml蔗糖梯度：2ml60％、2ml 55％、2ml 50％、2ml 45％、2ml 40％、2ml 35％、2ml 30％和1ml 15％。将超滤管室温下直立2-4小时以形成平滑的梯度。每管中加入最多25ml浓缩的病毒。然后(在例如SW 28 rotor(Beckman)中，于4℃，17,000rpm，18小时)进行超滤。离心后，从管底收集1到2ml组分。按照需要对组分进行总蛋白、病毒HA和病毒抗原检测。阳性的梯度组分一般被汇集到一起，用培养基199(M199，Gibco-BRL)或PBS稀释至10％或以下的蔗糖。任选地，灭活前，将病毒集合经0.22μm低蛋白结合滤器(GV型，Millipore)过滤。
纯化后，将回收到的病毒灭活，所选择的灭活手段能够在破坏其感染性的同时保留病毒的抗原性和免疫原性。在一个实例中，向病毒中添加有效量的试剂，比如福尔马林或β-丙内酯，混合液与失活剂一起温育至病毒被灭活。例如，福尔马林(37％甲醛)1∶40稀释于PBS中，用1N NaOH将pH调节到大约7.4。然后通过流经0.22μm CN滤膜(Nalgene)将溶液灭菌。将该福尔马林溶液加入纯化好的病毒(1∶50)至最终的福尔马林浓度为0.05％。灭活在15到25℃之间进行48小时至14天(一般是10天或更短)。任选地，将病毒通过0.22um GV型滤膜过滤并转移到新的容器中。灭活完成时，通过例如加入等摩尔量的无菌10％w/v亚硫酸氢钠将大批培养物中的游离福尔马林中和。
替代地，可以通过用放射源照射病毒直至病毒被灭活来实现灭活。放射源的一个有利的例子是钴-60，所用剂量足够使病毒的感染性失活但抗原性基本保持完整。有用剂量的例子落在5.5到7.0Mrads的范围内。例如，在1.5ml无菌聚丙烯管中的50μl病毒液份被冷冻并在60Co源γ池中的干冰上放置足够递送所需照射的时间。
替代地，可以采用紫外照射来灭活登革热病毒。商业中用于紫外照射病毒的合适装置是本领域已知的，并且可以从例如Bayer购买，这类装置将上清(或者含有病毒的其他液体)在大约254nm的UV-C光源中暴露足够灭活病毒但能保留其免疫原性的一段时间。
替代地，可以利用过氧化氢按照例如已公开的美国专利20070031451(通过引用并入本文)中的描述将登革热病毒灭活。
如果需要，可以采用两个或者多个活化步骤。当采用两个或者多个灭活步骤时，所述步骤可以是相同或不同的。例如，在登革热病毒的纯化和灭活过程中，可以采用任何合适的灭活程序(比如任何以上灭活过程)的组合来配制用于给予人患者的免疫原性组合物。
病毒制品的质量可以通过本领域已知的多种方法监测。例如可以在噬斑滴定法灭活病毒前对其进行监测。将病毒在与用于制备的宿主细胞相同或不同的细胞中进行扩增，然后用于感染合适的细胞系，比如LLC-MK2细胞或Vero细胞单层，可以评估病毒噬斑的数量来确定所回收的病毒的感染活性(参见例如Sukhavachanaet al.WHO Bull.35：65-6，1966)。另一种评估所回收抗原的质和量的方法是通过病毒血凝(HA)和血凝抑制(HI)法。病毒HA和HI检测可以按照先前的描述(Clarke&Casals，Am.J.Trop.Med.Hyg.7：561-73，1958)来进行。总蛋白的确定基本按照Bradford的描述(Anal.Biochem.72：248，1976)，使用商品试剂盒(BioRad，Hercules，Calif.)并以牛血清白蛋白(BSA)或γ球蛋白作为标准。
替代地，可以在灭活后，例如在抗原点印迹分析中对抗原进行检测和/或定量。为了检测和定量灭活病毒制品中的抗原，病毒样品被系列稀释，一般是两倍稀释，并点到硝酸纤维素滤纸上。将滤纸风干，用溶于PBS的5％酪蛋白封闭，与特异抗体或抗血清一起温育，之后加入酶联二抗。病毒还可以通过western印迹来检测。简单来说，将抗原制品在含有1％SDS、66mM Tris-HCl(pH 6.8)、1％甘油和0.7％溴酚蓝的SDS-PAGE样品缓冲液中于22℃溶解10分钟，在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上电泳(例如，按照Feighny et al.Am.J.Trop.Med.Hyg.50(3)：322-8，1994描述的)。将分辨开的蛋白电泳转移到尼龙或硝酸纤维素膜上。然后可以通过用胶体金染色来检测蛋白，并利用改进的非同位素Western印迹程序对病毒抗原进行免疫鉴定。
免疫原性组合物及方法
为了引发高效价病毒中和抗体并给被免疫人提供对登革热病毒所导致疾病的保护作用，将灭活的登革热病毒与合适的无铝佐剂混合产生适合给人患者免疫接种的免疫原性组合物。通常，灭活的登革热病毒被配制在可药用载体或赋形剂中。
可药用载体和赋形剂是已知的，可以由本领域技术人员进行挑选。例如，载体或赋形剂可以有利地包含缓冲液。任选地，载体或赋形剂还含有稳定溶解性和/或稳定性的至少一种成分。助溶剂/稳定剂的例子包括去污剂，例如月桂酰肌氨酸和/或聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。替代的助溶剂/稳定剂包括精氨酸和玻璃形成多元醇(比如蔗糖、海藻糖等)。许多可药用载体和/或药物可接受赋形剂是本领域已知的，在例如Remington’sPharmaceutical Sciences，by E.W.Martin，Mack Publishing Co.，Easton，PA，5th Edition(975)中有描述。
相应地，本领域技术人员可以挑选合适的赋形剂和载体以便产生适合通过选定给药途径递送给患者的剂型。
合适的赋形剂包括，但不限于：甘油、聚乙二醇(PEG)、山梨醇、海藻糖、N-月桂酰肌氨酸钠盐、L-脯氨酸、非去污的甜菜碱磺酸、盐酸胍、脲、三甲胺氧化物、KCl、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+和其他二价阳离子相关盐、二硫苏糖醇、二硫赤藓醇和β-羟基乙醇。其他赋形剂可以是去污剂(包括：聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、Triton X-00、NP-40、Empigen BB、辛基葡糖苷、月桂酰麦芽糖苷、Zwittergent 3-08、Zwittergent 3-0、Zwittergent3-2、Zwittergent 3-4、Zwittergent 3-6、CHAPS、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、溴棕三甲胺)。
本文公开的免疫原性组合物还包含佐剂。就适合给予患者用于引发抗登革热的保护性免疫反应的免疫原性组合物而言，佐剂是选择用于引发平衡的Th1/Th2反应或偏向Th1的免疫反应的无铝佐剂。这类免疫反应特征在于γ-IFN的产生。
佐剂通常选择能够增强组合物要给予的患者或患者群体中平衡的Th1/Th2反应或偏向Th1型免疫反应。例如，当免疫原性组合物是要给予对登革热感染易感(或者风险增加)的特定年龄组患者时，要选择在所述患者或患者群体中安全并有效的佐剂。因此，当配制用于给予新生儿或婴儿个体(比如从出生到一岁的个体)或者儿童(例如从出生到5岁的个体)的含有灭活登革热病毒抗原的免疫原性组合物时，要选择在新生儿和婴儿和/或儿童中安全有效的佐剂。
此外，通常选择在经由免疫原性组合物的给药途径时能够增强Th1免疫反应的佐剂。例如，当免疫原性组合物制备为肌内给药的剂型时，优选包含3D-MPL、角鲨烯(例如，QS21)、脂质体和/或油和水乳剂中的一或多种的佐剂。
一种适合与灭活的登革热抗原联用的佐剂是无毒的细菌脂多糖衍生物。合适的脂质A的无毒衍生物的例子是单磷酰脂质A或更具体地是3-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。GlaxoSmithKline Biologicals N.A.生产的3D-MPL以MPL的名字出售，在文献中称作MPL或3D-MPL。参见例如，美国专利4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进CD4+T细胞反应，产生IFN-γ(Th1)表现型。3D-MPL可以根据GB2220211A中公开的方法来制备。从化学上来说，它是带有3、4、5或6个酰基化链的3-脱酰单磷酸类脂A的混合物。本发明的组合物中可以使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的颗粒大小使得它能够经0.22μm滤膜过滤除菌。这类制品在WO94/21292中有描述。
脂多糖(如3D-MPL)的用量可以是1-100μg/人用剂量(human dose)的免疫原性组合物。这种3D-MPL可以以大约50μg的水平使用，例如40-60μg之间，合适的是45-55μg之间，或者46和54μg之间，或者47和53μg之间，或者48和52μg之间，或者49和51μg之间，或者50μg。另一个实施方案中，例如用于给予婴儿或儿童，免疫原性组合物的剂量包含的3D-MPL的分数剂量(fractional dose)水平是大约25μg/人用剂量免疫原性组合物。这种3D-MPL可以以大约25μg的水平使用，例如20-30μg之间，合适的是21-29μg之间，或者22和28μg之间，或者23和27μg之间，或者24和26μg之间，或者25μg。在其他实施方案中(例如，适合给予非常小的婴儿)，免疫原性组合物的人用剂量包含分数剂量，该分数剂量含有更低量的大约10μg水平的3D-MPL，例如5和15μg之间，合适的是6和14μg之间，例如7和13μg之间，或者8和12μg之间，或者9和11μg之间，或者10μg。再一个实施方案中，免疫原性组合物的人用剂量包含大约5μg水平的3D-MPL，例如1和9μg之间，或者2和8μg之间，或者合适的是3和7μg之间，或者4和μg之间，或者5μg。
在其他实施方案中，脂多糖可以是如美国专利6,005,099和EP专利0729473B1中描述的(1-6)氨基葡糖苷二糖。根据这些参考文献的教导，本领域技术人员能够容易地制备出各种脂多糖，比如3D-MPL。尽管如此，仍然将这些参考文献每个都通过引用并入本文。除了以上提及的免疫刺激剂(与LPS或MPL或3D-MPL结构类似的)，是以上MPL结构的次级部分的酰基化单糖和二糖衍生物也是合适的佐剂。在其他实施方案中，佐剂是脂质A的合成衍生物，其中某些被描述为TLR-4拮抗剂，包括但不限于：OM174(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰oxytetra-癸酰氨基]-4-o-磷酰--D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羟基四癸酰氨基]--D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢盐)，(WO 95/14026)；OM 294DP(3S，9R)-3--[(R)-十二烷酰氧四癸酰氨基]-4-氧-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基四癸酰氨基]癸烷-1，10-二醇，1，10-双(磷酸二氢盐)(WO 99/64301和WO 00/0462)；以及OM 197MP-Ac DP(3S-，9R)-3-(R)-十二烷酰oxytetra癸酰氨基]-4-氧-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基四癸酰氨基]癸烷-1，10-二醇，1-磷酸二氢盐10-(6-氨基己酸)(WO 01/46127)。
可以使用的其他TLR4配体是烷基氨基葡糖苷磷酸盐(alkylGlucosaminide phosphates，AGPs)，比如WO 98/50399或美国专利6,303,347(还公开了制备AGPs的过程)中公开的那些，合适的是美国专利6,764,840中公开的RC527或RC529或者AGPs的药物可接受盐。某些AGPs是TLR4激动剂，某些是TLR4拮抗剂，均被认为可以作为佐剂。
其他合适的能够通过TLR-4引起信号传导反应(Sabroe et al，JI 2003p1630-5)的TLR-4配体是例如来自革兰氏阴性细菌的脂多糖及其衍生物，或者它们的片段，尤其是LPS的无毒衍生物(比如3D-MPL)。其他合适的TLR激动剂是：热休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性蛋白A；透明质酸寡糖；硫酸肝素片段；纤连蛋白片段；纤维蛋白原肽和b-防御素-2以及胞壁酰二肽(MDP)。在一个实施方案中，TLR激动剂是HSP60、70或90。其他合适的TLR-4配体如WO 2003/011223和WO2003/099195中所述，比如WO 2003/011223中第4-5页或者WO 2003/099195中第3-4页公开的化合物I、化合物II和化合物III，特别是WO 2003/011223中公开的ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764。例如，一个合适的TLR-4配体是ER804057。
其他可以与灭活登革热病毒抗原一起用于免疫原性组合物的佐剂，例如替代3D-MPL或者本文描述的另一种佐剂，或者与它们联用的佐剂是皂苷，比如QS21。
皂苷在Lacaille-Dubois，M and Wagner H.(1996.A review of thebiological and pharmacological activities of saponins.Phytomedicine vol 2 pp363-386)中教导。皂苷是在植物和海洋动物中广泛存在的类固醇或者三萜甙。皂苷特点在于能够在水中形成胶质溶液，摇动时产生泡沫，并且能够沉淀胆固醇。当皂苷靠近细胞膜时，它们在膜中产生类似小孔的结构，导致细胞膜破裂。红细胞溶血是这一现象的一个例子，它是某些但并非所有皂苷的特性。
已知皂苷可以作为用于系统给药的疫苗中的佐剂。现有技术对各种皂苷的佐剂和溶血活性已有广泛的研究(Lacaille-Dubois and Wagner，同前)。例如，Quil A(来源于南美树种智利皂荚树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮)及其组分在美国专利5,057,540和“Saponins as vaccine adjuvants”，Kensil，C.R.，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)：1-55以及EP 0362279B1中有描述。包含Quil A组分被命名为免疫刺激复合体(Immune StimulatingComplexes，ISCOMS)的颗粒结构是溶血性的，已被用于疫苗的制造(Morein，B.，EP 0109942B1；WO 96/11711；WO 96/33739和美国专利6,846,489)。溶血性皂苷QS21和QS17(Quil A的HPLC纯化组分)已被描述为强力的系统佐剂，美国专利5,057,540和EP 0362279B1(通过引用并入本文)中公开了它们的制备方法。这种皂苷或其部分可以单独或者联合使用，并且任选配制成ISCOMS。其他曾被用于系统接种疫苗研究中的皂苷包括来源于其他植物物种，比如丝石竹属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)的那些(Bomford etal.，Vaccine，10(9)：572-577，1992)。
QS21是从智利皂荚树的树皮中HPLC纯化的无毒组分。美国专利5,057,540中公开了制备QS21的方法。WO 96/33739中描述了含有QS21的非反应原性佐剂制品。以上提及的参考文献通过引用并入本文。所述免疫活性皂苷，比如QS21，可以以1和50μg之间的量用于免疫原性组合物的每个人用剂量。有利地，QS21在免疫原性组合物的每个人用剂量中使用水平大约1到100μg。例如，QS21可以以大约50μg的水平使用，例如40-60μg之间，合适的是45-55μg之间或者46和54μg之间或者47和53μg之间或者48和52μg之间，或者49和5μg之间，或者50μg。另一个实施方案中，例如用于给予婴儿或儿童，免疫原性组合物的剂量包含分数剂量25μg，例如20-30μg之间，合适的是21-29μg之间或者22-28μg之间或者23-27μg之间或者24-26μg之间，或者25μg。另一个实施方案中，免疫原性组合物的人用剂量包含大约10μg水平的QS21，例如5和15μg之间，合适的是6-14μg之间，例如7-13μg之间或者8-12μg之间或者9-11μg之间，或者10μg。再一个实施方案中，免疫原性组合物的人用剂量包含大约5μg水平的QS21，例如1-9μg之间，或者2-8μg之间或者合适的是3-7μg或4-6μg之间，或者5μg。这种包含QS21并且包含胆固醇的制剂当与抗原配制在一起时，已被证实是成功的Th1刺激佐剂。因此，例如，灭活的登革热病毒抗原可以顺利地与包含QS21和胆固醇组合的佐剂一起应用在免疫原性组合物中。任选地，所述佐剂还含有1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)。皂苷，比如QS21，还可以与一或多种其他免疫刺激剂(比如文中讨论的3D-MPL，或者例如CpG寡核苷酸，或其他TLR拮抗剂)一起成剂。
诸如上文提及的那些不同佐剂的组合，也可以用于含有灭活登革热病毒抗原的组合物中。例如，正如已经指出的，QS21可以与3D-MPL一起成剂。QS21：3D-MPL的比率通常在1∶10到10∶1的量，比如1∶5到5∶1，经常基本是1∶1。一般来说，比率在2.5∶1到1∶13D-MPL：QS21的范围。任选地，QS21和3D-MPL的组合还含有胆固醇和DOPC中的一种或两种都含有。在WO 2007068907和US 20080279926(通过引用并入本文)中可以找到关于这类组合的配方和剂量的其他细节，特别是适合给予婴儿和儿童的剂量(分数剂量)。当联合配制时，这一组合可以增强抗原特异性Th1免疫反应。
某些情况中，佐剂配方包括水包油乳剂。
水包油乳剂的一个实例包含在水性载体中的可代谢油，比如角鲨烯；诸如生育酚的母育酚，例如α-生育酚；和表面活性剂，比如聚山梨酸酯80或Tween80，并且不含其他免疫刺激剂。水性载体可以是例如磷酸缓冲液。这种水包油乳剂的一个优选例子在文中命名为AS03。此外，所述水包油乳剂可以含有失水山梨醇三油酸酯(SPAN 85TM)和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。水包油乳剂的另一个例子是MF59，该物质是由Novartis Vaccine andDiagnostics销售的基于角鲨烯的乳剂系统。
发明的另一个实施方案中提供了包含抗原或抗原组合物以及佐剂组合物的疫苗组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳剂，其中所述水包油乳剂包含0.25-10mg可代谢油(合适的是角鲨烯)、0.25-11mg母育酚(合适的是生育酚，比如α-生育酚)和0.125-4mg乳化剂。某些情况中，例如用于给予儿童的情况，水包油乳剂以标准成人剂量的1/2、1/4或1/8的分数剂量存在。在WO 2008043774和USSN 12/445,090(通过引用并入本文)中可以找到关于适合与灭活登革热病毒疫苗组合使用的水包油乳剂分数剂量的更多细节。
在使用水包油乳剂的特定制剂中，这类乳剂可以包含其他成分，例如，比如胆固醇、角鲨烯、α生育酚和/或诸如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯
Figure BDA0000099278810000171
或失水山梨醇三油酸酯的去污剂。示范性制剂中，这些成分可以按照以下量存在：大约1-50mg胆固醇、2-10％角鲨烯、2-10％α生育酚和0.3-3％聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(全部为体积/体积)。一般来说，角鲨烯：α生育酚的比率等于或小于1，因为这样能够得到更稳定的乳剂。某些情况中，制剂还可以含有稳定剂。
任选地，油和水乳剂佐剂包含一或多种其他免疫刺激剂。在一个具体实施方案中，佐剂中包含制备成乳剂形式，比如水包油乳剂的3D-MPL。某些情况中，如WO 94/21292中公开的，乳剂中的小颗粒直径低于0.2μm。例如，3D-MPL的颗粒可以小到能够通过0.22μm膜过滤除菌(如欧洲专利0689454所述)。替代地，3D-MPL可以制备成脂质体制剂。任选地，含有3D-MPL(或其衍生物)的佐剂还包含其他免疫刺激成分。
例如，当含有灭活登革热病毒抗原的免疫原性组合物被配制用于婴儿给药时，要确定佐剂的剂量在婴儿个体中是有效并且比较非反应原性的。通常，婴儿制剂中的佐剂剂量低于给成人(例如，65岁及以上的成人)用药设计的制剂中的用量。例如，每剂中的3D-MPL的量一般在1μg-200μg的范围内，比如10-100μg，或者10μg-50μg。婴儿剂量一般是所述范围的下限，例如大约1μg到大约50μg，比如大约2μg或大约5μg或大约10μg到大约25μg，或大约50μg。一般来说，制剂中使用QS21的情况，范围(与以上指出的比率)与此相当。对于成人和老年群体，制剂通常比一般婴儿制剂包含更多的佐剂成分。
免疫原性组合物一般含有免疫保护性含量(或其分数剂量)的抗原，可以通过常规技术制备。免疫原性组合物，包括用于人患者给药的那些在Pharmaceutical Biotechnology，Vol.61 Vaccine Design-the subunit andadjuvant approach(Powell and Newman编辑，Plenurn Press，1995)和NewTrends and Developments in Vaccines(Voller等编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978)中有概括的描述。例如Fullerton的美国专利4,235,877中描述了脂质体包囊。例如Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757中公开了蛋白与大分子的偶联。
一般来说，每剂免疫原性组合物中的抗原含量要选择在典型患者中能够诱发免疫保护性反应，但没有明显有害副作用的量。这里的免疫保护性不需要是抗感染的完全保护，它表示对抗症状或疾病，尤其是与病毒相关的严重疾病的保护作用。抗原的量可以根据所采用的特定免疫原而变化。通常，可以预期每个人用剂量包含0.05-100μg灭活病毒，比如每个灭活登革热病毒株大约0.1μg(例如0.1、0.2、0.3、0.4或0.5μg)到大约50μg，例如大约0.5μg到大约30μg，比如约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约10μg、约15μg、约20μg或约25μg。基于对象群体(例如婴儿)选择免疫原性组合物中使用的量。特定组合物中的最佳用量可以通过标准研究来确定，包括观察个体中的抗体效价和其他反应。首次接种疫苗后，患者可以在合适的间隔后(例如大约4周后)接受加强剂量。
应当注意的是，无论所选的佐剂为何，最终制剂中的浓度要计算对目标群体是安全有效的。例如，用于在人体引发抗登革热病毒的免疫反应的免疫原性组合物优选给予婴儿(例如，出生到1岁，比如0到6个月的婴儿，在给予首次剂量的年龄)。用于引发抗登革热的免疫反应的免疫原性组合物也可以给予成人(例如，单独或者在“旅行者”疫苗的意义上与其他病原抗原联合)。可以理解在不同应用中佐剂的选择可能是不同的，本领域技术人员可以根据经验确定每种情况的最佳佐剂和浓度。
在患者中引发抗登革热的免疫反应的方法也是本公开的特征。所述方法包括将免疫有效量的组合物给予诸如人个体的患者，其中所述组合物包含灭活的登革热病毒抗原和无铝佐剂。例如，组合物包含能够引发Th1偏向型免疫反应的佐剂。所述组合物配制成能够引发登革热特异性免疫反应，即组合物被配制成并且导致Th1偏向型免疫反应，所述免疫反应能够减少或者预防登革热病毒的感染和/或减少或预防感染了登革热病毒后的病理反应。
一般，疫苗制备为可注射的液态溶液或悬浮液；也可以制备成适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。虽然组合物可以通过多种不同途径给予，最常用的是将免疫原性组合物经肌内、皮下或皮内给药途径进行递送。通过，可以经皮下、皮内或者肌内以足够产生中和抗体和保护作用的剂量给予疫苗。疫苗的给药方式与剂量剂型相容，用量是预防和/或治疗有效的。给药的量通常在每剂量每株灭活病毒0.05-100μg范围内，取决于要治疗的患者、患者的免疫系统合成抗体的能力，以及希望达到的保护程度。疫苗给药的准确用量可能取决于医务人员的判断，对每个患者可能是独特的。
疫苗可以以单个剂量方案给予，或者优选以多个剂量方案给予，即疫苗接种的主要过程是1-10个独立的剂量，之后根据维持和/或加强免疫反应的需要在随后的时间间隔给予其他剂量，例如1-4个月给予第二个剂量，并且如果需要，在几个月或几年后给予随后的剂量。用药方案还至少部分由个体的需要决定并取决于医务人员的判断。合适的免疫接种方案的例子包括：第一剂量，之后在第7天到6个月之间给予第二剂量，以及任选在首次接种后1个月到2年之间给予第三剂量；或者其他足够引发赋予保护性免疫力所期望的病毒中和抗体效价的方案，例如对应已建立的儿科疫苗接种方案。可以合理地预期在包含1到3次接种的主要免疫过程后，灭活病毒疫苗导致产生抗登革热的保护性免疫力。可以补充以特定间隔(例如每两年)给予的加强剂量来维持满意的保护性免疫力。
实施例
实施例I-含有纯化的灭活登革热病毒(1μg和10μg)和无铝佐剂的示范性免疫原性组合物的免疫原性。
15只一组的未接触过抗原的成年雌性C57Bl/6小鼠肌内接种两个剂量的示范性候选疫苗，所述疫苗含有登革热-2(Den-2)株的纯化灭活病毒(PIV)。疫苗以50μl的总体积给予。小鼠接种的制剂仅含有登革热PIV；或者含有辅以Alum(氢氧化铝)、吸附在氢氧化铝上的3-脱酰单磷酸类脂A(3D-MPL)(AS04D)、水包油乳剂(AS03A)、以及在脂质体制剂中的3D-MPL和QS21(AS01B)(参见下表1中的组)的登革热PIV疫苗。AS03A和AS01B是无铝佐剂的两个非限制性实例。成剂使用的登革热PIV抗原是基本按照本文描述从野生型Den-2病毒培养物获得的纯化批次，并用0.185％福尔马林于22℃灭活7天。
本文描述的所有实施例中，通过UNISTAT对免疫后CD4+频数和中和效价进行了统计分析。用于方差分析的方法可以简单描述如下：对数据进行log转换；为了证实组的常态分布，对每个群体(组)进行Shapiro-Wilk检验；为了验证不同群体(组)间的方差均匀进行Cochran检验；对选定数据进行方差分析；单因子ANOVA交互作用的检验；多重比较的Tukey-HSD检验。
表1
Figure BDA0000099278810000201
第一次免疫接种(设为第0天)和第二次免疫接种(第21天)后21天测量体液免疫反应，即免疫接种后第21和42天。利用抗登革热中和分析法检验血清样品。简单地说，为了测量小鼠抗登革热病毒的血清中和滴度，将过滤并热灭活的血清系列稀释液与固定量的单特异性登革热病毒(登革热-2)一起温育。然后将血清和病毒的混合液加入Vero细胞(来自WHO细胞库)单层并温育4天。利用ELISA检测附着96孔微量板的Vero细胞上的细胞相关病毒抗原，从而测量血清样品对病毒感染的抑制。得到的光密度读数自动处理到Excel表格中，该表格利用log中点线性回归程序模型得出病毒感染百分比下降(称为微量中和百分之50下降或者MN50)。病毒中和滴度(MN50)定义为与没有血清的病毒剂量对照(TV)相比，检测中吸光度读数下降50％的血清稀释的倒数。
第21天给每组汇集的血清、第42天给单独每个血清确定中和抗体效价。结果显示在图1中。所测试的两个剂量(1和10μg总蛋白)观察到相同的免疫学特性。与给予单个剂量组合物后的反应相比，两次给予1μg或10μg登革热PIV疫苗后中和抗体效价增强。对于测试的两种登革热PIV疫苗剂量，与含佐剂的登革热PIV疫苗相比，没有佐剂的疫苗观察到显著较低的中和抗体反应(p＜0.00001)。在10μg的总蛋白剂量，含佐剂AS04D的登革热PIV疫苗与只有铝佐剂(AS22A)的登革热PIV疫苗相比，诱发了明显更高的中和抗体反应(p＝0.0027)。在1μg总蛋白剂量时，没有观察到这两种佐剂的差异(p＞0.05)。如图1所示，含无铝佐剂的组合物比含有AS04D或AS22A的组合物诱发了明显更高的中和抗体反应(AS03A(p＜0.0173)或AS01B(p＜0.0001))。含AS03A和AS01B的登革热PIV疫苗诱发了类似水平的中和抗体效价(p＞0.05)。
这些结果显示，在1或10μg的登革热PIV总蛋白剂量，在用含有无铝佐剂系统(正如这里显示的AS03A或AS01B所示范的)的组合物免疫过的小鼠中观察到了比用组合了含铝佐剂(例如AS22A或AS04D)的相同抗原诱发的反应更高的中和抗体效价。
实施例II-含有纯化的灭活登革热病毒(1μg和10μg)和稀释度不同的无铝佐剂的示范性免疫原性组合物的免疫原性。
15只一组的成年雌性C57Bl/6小鼠经肌内给予总体积50μl的两种剂量的示范性登革热PIV疫苗。小鼠接种的制剂仅含有登革热PIV；或者含有辅以Alum(AS22A，氢氧化铝)、不同佐剂系统的稀释液，例如比如1/2标准剂量的AS04D(AS04D/2)、AS03B(含有5.93mg生育酚的基于水包油乳剂的佐剂系统)、以及AS01E(AS01B的一半剂量)(详情见表2)。成剂使用的PIV是从野生型Den-2病毒培养物获得的纯化批次，并用0.185％福尔马林于22℃灭活7天。
表2
Figure BDA0000099278810000221
第一次和第二次免疫接种后21天测量15小鼠/组对免疫的体液免疫反应(分别是第21和42天)。通过以上描述的中和分析检测血清样品。
第21天每组汇合血清的中和抗体效价和第42天每组单个血清的中和抗体效价如图2所示。所检测的两个剂量(1和10μg总蛋白)观察到相同的免疫特性。与给予单个1μg或10μg登革热PIV抗原后引发的反应相比，两次给予免疫原性组合物后观察到更高的中和抗体效价。对于测试的两种登革热PIV疫苗剂量，与含佐剂的登革热PIV制剂相比，没有佐剂的疫苗观察到显著较低的中和抗体反应(p＜0.00001)。在1μg的总蛋白剂量，含佐剂AS04D/2的登革热PIV疫苗与只有铝佐剂的登革热PIV疫苗相比，诱发了类似的中和抗体反应(p＞0.05)。如图1所示，含无铝佐剂的组合物比含有AS04D或AS22A的组合物诱发了明显更高的中和抗体反应(AS03A(p＜0.0173)或AS01B(p＜0.0001))。含AS03A和AS01B的登革热PIV疫苗诱发了类似水平的中和抗体效价(p＞0.05)。对于相同的测试疫苗剂量，含AS03B或AS01E佐剂的登革热PIV疫苗比含有AS04D(对于AS03B，p≤0.029；对于AS01E，p≤0.00001)或铝(对于AS03B，p≤0.0035；对于AS01E，p≤0.00001)的疫苗诱发了明显更高的中和抗体效价。
总之，对于1或10μg的登革热PIV抗原总蛋白剂量，在用不含铝佐剂系统(AS03B或AS01E)稀释液的组合物免疫过的小鼠中观察到了比用组合了含铝佐剂(AS22A或AS04D/2)的相同抗原诱发的反应更高的中和抗体效价。
实施例III-含有纯化的灭活登革热病毒(2μg和200ng)和稀释度不同的无铝佐剂的示范性免疫原性组合物的免疫原性.
25只一组的成年雌性C57Bl/6小鼠经肌内给予总体积50μl的两种剂量的示范性登革热PIV疫苗。小鼠接种的制剂仅含有登革热PIV；或者含有辅以Alum(AS22A，氢氧化铝)或不同佐剂系统的稀释液，例如AS04D(AS04D/2)、AS03B(含有5.93mg生育酚的基于水包油乳剂的佐剂系统)和AS01E(AS01B的一半剂量)(详情见表3)。成剂使用的PIV抗原是从野生型Den-2病毒培养物获得的纯化批次，并用0.185％福尔马林于22℃灭活7天。
表3
Figure BDA0000099278810000231
第一次和第二次免疫接种后14天测量15小鼠/组对免疫的体液免疫反应(分别是第14和28天)。通过以上描述的中和分析检测血清样品。
免疫接种后7天每组取10只小鼠处死，利用每集合2个脾脏的5个集合经ICS评估细胞免疫反应。只对用辅以AS04D/2、AS03B、AS01E的2μg登革热PIV疫苗免疫的小鼠组和用200ng无佐剂疫苗或者辅以AS22A的疫苗免疫的小鼠组(组1到5)以及接受PBS的小鼠(组9)进行CMI评估。第一次免疫和第二次免疫后14天(分别是第14天和第28天)收集另外15只小鼠的血清。
第14天确定每组汇合血清的中和抗体效价，第28天确定每组单个血清的中和抗体效价。图3给出了结果。与单次给药后的效价相比，两次给予2μg或200ng登革热PIV疫苗后观察到更高的中和抗体效价。与不含佐剂的制剂相比，含有佐剂的登革热PIV制剂观察到明显更高的中和抗体反应(p＜0.0089)。对于200ng的登革热PIV剂量，含有AS03A和AS01E佐剂的制剂，比用AS22A或AS04D/2与相同抗原配制的制剂诱发了显著更高的中和抗体反应。对于较低的抗原剂量，辅以佐剂AS22A和AS04D/2的登革热PIV诱发了与200ng总蛋白剂量相当的中和抗体反应(p＞0.05)。对于较高的2μg总蛋白剂量，含有AS04D/2的制剂与含有AS03B的疫苗相比，诱发了类似的中和抗体反应(p＞0.05)。但是，对于较低的抗原剂量(200ng)，含有AS03B的制剂比含有AS04D/2的引发了明显更高的中和抗体效价(p＝0.0012)。有趣的是，含有AS01E佐剂的登革热PIV与所有其他组相比，诱发了明显更高的中和抗体效价(p≤0.0028)。
两次给予登革热PIV联合以上提及的佐剂稀释液后，还评估了细胞免疫反应。第二次免疫后7天(第21天)通过ICS评估了CD4+T细胞细胞因子反应(图4)。
与所有其他组相比，不含佐剂的登革热PIV疫苗诱发了较低的CD4+T细胞反应(p≤0.001)。用含有AS01E佐剂的登革热PIV疫苗免疫的小鼠相比其他所有组中的小鼠诱发了最高的CD4+T细胞反应(p≤0.00001)。含有AS22A、AS04D/2和AS03B佐剂的登革热PIV疫苗得到的CD4+T细胞反应没有统计学差异(p＞0.05)。
总之，用辅以无铝佐剂系统(AS03B或AS01E)的登革热PIV疫苗免疫的小鼠相比用含有氢氧化铝佐剂(AS22A)的该疫苗诱发的反应，观察到更高的中和抗体效价。值得一提的是，含有AS01E佐剂的登革热PIV疫苗与辅以含铝佐剂AS04D/2的疫苗相比，诱发了更高的中和抗体反应和更高的CD4T细胞反应。
概括起来，与用含铝佐剂(AS22A、AS04D或AS04D/2)配制的登革热PIV免疫的小鼠相比，用无铝佐剂系统(例如不含铝的AS01B或AS01E)配制的疫苗免疫过的小鼠引发了显著更高的中和抗体反应和CD4+T细胞反应。这些结果展示了用无铝佐剂配制的登革热PIV疫苗的有利的免疫原属性。

Claims (32)

1.免疫原性组合物，所述组合物包含至少一种灭活的登革热病毒抗原和无铝佐剂。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述至少一种灭活的登革热病毒抗原选自登革热-1病毒抗原、登革热-2病毒抗原、登革热-3病毒抗原和登革热-4病毒抗原。
3.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中所述至少一种灭活的登革热病毒抗原是登革热-2病毒抗原。
4.权利要求1-3中任一项的免疫原性组合物，其中所述至少一种灭活的登革热病毒抗原是完整的杀灭病毒。
5.权利要求1-4中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含水包油乳剂。
6.权利要求1-5中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含水包油乳剂载体，该载体含有可代谢油、母育酚和乳化剂。
7.权利要求5或6的免疫原性组合物，其中所述可代谢油是角鲨烯。
8.权利要求6或7中任一项的免疫原性组合物，其中所述母育酚是α-生育酚。
9.权利要求5-8中任一项的免疫原性组合物，其中所述乳剂包含非离子型表面活性剂乳化剂。
10.权利要求9的免疫原性组合物，其中所述非离子型表面活性剂是聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。
11.权利要求1-10中任一项的免疫原性组合物，其包含比率等于或低于1的角鲨烯和α生育酚。
12.权利要求1-11中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂配制成的剂量包含：
大约2％-大约10％角鲨烯，
大约2％-大约10％α-生育酚，
大约0.3％-大约3％聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。
13.权利要求12的免疫原性组合物，其中所述佐剂配制成的剂量包含：
大约10mg-大约12mg角鲨烯，
大约10mg-大约12mg α-生育酚，
大约4mg-大约6mg聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。
14.权利要求12或13的免疫原性组合物，其中所述佐剂配制成的剂量包含：
10.68mg角鲨烯，
11.86mg生育酚，
4.85mg聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。
15.权利要求13的免疫原性组合物，其中所述佐剂配制成分数剂量。
16.权利要求1-15中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含3-脱酰单磷酸类脂A(3D-MPL)和QS21的组合。
17.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述佐剂在脂质体制剂中包含3D-MPL和QS21。
18.权利要求16的免疫原性组合物，其中所述佐剂还包含胆固醇。
19.权利要求16-18中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂还包含1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)。
20.权利要求16-19中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含胆固醇、DOPC、3D-MPL和QS21。
21.权利要求20的免疫原性组合物，其中所述佐剂配制成的剂量包含：
大约0.1-大约0.5mg胆固醇，
大约0.25-大约2mg DOPC，
大约10μg-大约100μg 3D-MPL，和
大约10μg-大约100μg QS21。
22.权利要求16-21中任一项的免疫原性组合物，其中胆固醇与QS21的比率是5∶1(w/w)。
23.权利要求16-21中任一项的免疫原性组合物，其中胆固醇与QS21的比率是1∶1(w/w)。
24.权利要求21的免疫原性组合物，其中所述佐剂配制成的剂量包含：
大约0.25mg胆固醇，
大约1.0mg DOPC，
大约50μg 3D-MPL，和
大约50μg QS21。
25.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含QS21和胆固醇。
26.制备登革热疫苗的方法，所述方法包括
提供至少一种纯化的灭活登革热病毒抗原；和
将所述至少一种纯化的灭活登革热病毒抗原与无铝佐剂一起成剂。
27.权利要求26的方法，其中所述至少一种纯化的灭活登革热病毒抗原是完整的杀灭病毒，其是通过一或多步将活病毒接触或暴露给选自甲醛、β丙内酯(BPL)、过氧化氢、紫外照射和γ放射的试剂的步骤被灭活。
28.预防、缓解或治疗患者中登革热病毒引起的疾病的方法，所述方法包括：将权利要求1-25中任一项所述的免疫原性组合物给予所述患者。
29.权利要求27的方法，其中所述患者小于5岁。
30.权利要求28的方法，其中所述患者小于1岁。
31.权利要求27或29的方法，其中所述疫苗经肠胃外给药。
32.用于药物的权利要求1-25中任一项所述的免疫原性组合物。
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ZA (1) ZA201105656B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111150849A (zh) * 2020-04-02 2020-05-15 广州隽沐生物科技股份有限公司 一种组合物及其制备方法及其应用
CN114377122A (zh) * 2022-01-18 2022-04-22 四川大学 一种基于四面体框架核酸的复合佐剂、mRNA疫苗及其制备方法和用途

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2459216T3 (da) 2009-09-02 2013-12-09 Novartis Ag Immunogene sammensætninger omfattende tlr-aktivitetsmodulatorer
WO2012031140A1 (en) 2010-09-01 2012-03-08 Novartis Ag Adsorption of immunopotentiators to insoluble metal salts
ES2681698T3 (es) * 2011-03-02 2018-09-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vacunas de combinación con menores dosis de antígeno y/o adyuvante
BR112013030236A2 (pt) * 2011-05-26 2016-12-06 Glaxosmithkline Biolog Sa preparação em massa de vírus da dengue inativado ou uma composição imunogênica, e, preparação liofilizada de vírus da dengue inativado
CA2866406A1 (en) 2012-03-08 2013-09-12 Novartis Ag Adjuvanted formulations of booster vaccines
WO2017109698A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic formulation
WO2017197034A1 (en) * 2016-05-10 2017-11-16 Najit Technologies, Inc. Inorganic polyatomic oxyanions for protecting against antigenic damage during pathogen inactivation for vaccine production
JP7195147B2 (ja) * 2016-05-16 2022-12-23 アクセス ツー アドバンスト ヘルス インスティチュート Ｐｅｇ化リポソームおよび使用方法
PL3558351T3 (pl) * 2016-12-23 2022-03-21 Intervet International B.V. Szczepionka skojarzona dla świń
US20200276299A1 (en) * 2017-09-08 2020-09-03 Infectious Disease Research Institute Liposomal formulations comprising saponin and methods of use
CN112601815A (zh) * 2018-08-27 2021-04-02 迈凯恩技术有限公司 使用永生化单核细胞和诱导细胞的抗感染药物、疫苗等的评价方法
WO2023147337A2 (en) * 2022-01-25 2023-08-03 Takeda Vaccines, Inc. Large-scale flaviviral vaccine production and manufacture

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1138298A (zh) * 1993-12-23 1996-12-18 史密斯克莱·比奇曼生物公司 疫苗
US6254873B1 (en) * 1995-04-17 2001-07-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Inactivated dengue virus vaccine
CN1111071C (zh) * 1995-04-25 2003-06-11 史密斯克莱·比奇曼生物公司 含有皂苷和固醇的疫苗

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
CA1331443C (en) 1987-05-29 1994-08-16 Charlotte A. Kensil Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
ATE157882T1 (de) 1993-03-23 1997-09-15 Smithkline Beecham Biolog 3-0-deazylierte monophosphoryl lipid a enthaltende impfstoff-zusammensetzungen
ES2149340T3 (es) 1993-11-17 2000-11-01 Om Pharma Disacaridos de glucosamina, metodo para su preparacion, composicion farmaceutica que los comprende, y su uso.
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
US6846489B1 (en) 1995-04-25 2005-01-25 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines containing a saponin and a sterol
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
CA2302554C (en) * 1997-09-05 2007-04-10 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
GB9718901D0 (en) * 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
SK18602000A3 (sk) 1998-06-08 2001-07-10 Sca Emballage France Obal umožňujúci rýchle vyrovnanie
EP1091928B1 (fr) 1998-06-30 2007-02-28 OM Pharma Nouveaux pseudodipeptides acyles, leur mode de preparation et les compositions pharmaceutiques en renfermant
CN100558401C (zh) * 1998-10-16 2009-11-11 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 佐剂系统及疫苗
US20040006242A1 (en) 1999-02-01 2004-01-08 Hawkins Lynn D. Immunomodulatory compounds and method of use thereof
US6551600B2 (en) 1999-02-01 2003-04-22 Eisai Co., Ltd. Immunological adjuvant compounds compositions and methods of use thereof
EP1165127B1 (en) 1999-03-26 2008-12-31 Walter Reed Army Institute of Research Multivalent dengue virus vaccine
CA2365415A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Bruce L. Innis Adaptation of virus to vertebrate cells
EP2322210A1 (en) * 1999-04-19 2011-05-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Adjuvant composition comprising saponin and an immunostimulatory oligonucleotide
AU1581400A (en) 1999-12-22 2001-07-03 Om Pharma Acyl pseudopeptides bearing a functionalised auxiliary spacer
CA3060687C (en) 2001-05-22 2021-05-04 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Development of mutations useful for attenuating dengue viruses and chimeric dengue viruses
GB0304799D0 (en) 2003-03-03 2003-04-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel method
US8124397B2 (en) 2005-08-08 2012-02-28 Oregon Health & Science University Inactivating pathogens with oxidizing agents for vaccine production
JP4828189B2 (ja) * 2005-09-14 2011-11-30 雅美 森山 分泌型ＩｇＡ及びＩｇＧ抗体誘導剤
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
FR2896162B1 (fr) * 2006-01-13 2008-02-15 Sanofi Pasteur Sa Emulsion huile dans eau thermoreversible
MX2009003325A (es) 2006-10-12 2009-04-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna que comprende un adyuvante de emulsion de aceite en agua.
US20110150914A1 (en) * 2008-06-09 2011-06-23 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Compositions and methods for dengue virus (dv) treatment and vaccination

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1138298A (zh) * 1993-12-23 1996-12-18 史密斯克莱·比奇曼生物公司 疫苗
US6254873B1 (en) * 1995-04-17 2001-07-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Inactivated dengue virus vaccine
CN1111071C (zh) * 1995-04-25 2003-06-11 史密斯克莱·比奇曼生物公司 含有皂苷和固醇的疫苗

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111150849A (zh) * 2020-04-02 2020-05-15 广州隽沐生物科技股份有限公司 一种组合物及其制备方法及其应用
CN114377122A (zh) * 2022-01-18 2022-04-22 四川大学 一种基于四面体框架核酸的复合佐剂、mRNA疫苗及其制备方法和用途
CN114377122B (zh) * 2022-01-18 2023-04-07 四川大学 一种基于四面体框架核酸的复合佐剂、mRNA疫苗及其制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
US9265821B2 (en) 2016-02-23
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US20160120972A1 (en) 2016-05-05
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ZA201105656B (en) 2012-04-25
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AU2010215595A1 (en) 2011-08-25
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CL2011001993A1 (es) 2012-04-09
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