ES2649020T3 - Vacuna inactivada del virus del dengue con adyuvante libre de aluminio - Google Patents

Abstract

Una composición inmunogénica para su uso en la administración a un ser humano que comprende al menos un virus del dengue inactivado completo y un adyuvante libre de aluminio, en el que el adyuvante es una emulsión de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol y monooleato de polioxietileno sorbitán, y en el que la emulsión de aceite en agua no contiene ningún inmunoestimulante adicional.

Description

DESCRIPCION

Vacuna inactivada del virus del dengue con adyuvante libre de aluminio Campo de la tecnica

5 La presente divulgacion se refiere a composiciones que dan lugar a una respuesta inmunitaria contra el virus del dengue. Mas espedficamente, la presente divulgacion se refiere a vacunas inactivadas del virus del dengue que incluyen un adyuvante.

Antecedentes

El dengue es una enfermedad vmca aguda del hombre que se transmite por mosquitos. Es endemica de los tropicos 10 y subtropicos, por todo el mundo, donde se producen anualmente una estimacion de 100.000.000 de casos. Aunque relativamente raros, la fiebre hemorragica del dengue (DHF) y el smdrome de choque por dengue (DSS) son causas significativas de muerte en ninos. Actualmente, no existe una vacuna para proteger contra el dengue y los intentos para prevenir la enfermedad controlando el mosquito vector han demostrado que son muy ineficaces. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de una vacuna segura y eficaz para proteger contra la enfermedad por el virus del 15 dengue. El documento US6254873 desvela una vacuna inactivada de virus del dengue para inmunizar y proteger seres humanos contra la fiebre del dengue.

Breve sumario

La presente invencion proporciona una composicion inmunogenica para su uso en la administracion a un ser humano que comprende al menos un virus del dengue completo inactivado y un adyuvante libre de aluminio, en el 20 que el adyuvante es una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol, y monooleato de polioxietileno sorbitan, y en el que la emulsion de aceite en agua no contiene ningun inmunoestimulante adicional. Tambien se describen procedimientos para su uso, por ejemplo, en la formulacion de medicamentos, para la prevencion o tratamiento de la enfermedad producida por el virus del Dengue.

Breve descripcion de los dibujos

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La FIG. 1 es un C57B1/6 intactos. grafico de barras que ilustra los tftulos de anticuerpo neutralizante Anti-Den-2 en ratones

La FIG. 2 es un C57B1/6 intactos. grafico de barras que ilustra los tftulos de anticuerpo neutralizante Anti-Den-2 en ratones

La FIG. 3 es un grafico de barras que ilustra los tftulos de anticuerpo neutralizante Anti-Den-2 en ratones

30 C57B1/6 intactos.

La FIG. 4 es un grafico de barras que ilustra una caracterizacion de la respuesta inmunitaria celular mediante tincion de citocinas intracelulares en celulas sangumeas perifericas.

Descripcion detallada

INTRODUCCION

35 La presente invencion se refiere a una vacuna que satisface la necesidad de una vacuna del dengue segura y eficaz. Las vacunas inactivadas purificadas del virus del dengue tienen una ventaja principal sobre el virus del dengue atenuado ya que los virus inactivados no son infecciosos, y por lo tanto, no pueden revertir la virulencia o producir la enfermedad. Un inconveniente potencial de la vacuna inactivada del virus del dengue purificado en comparacion con una viva atenuada es la capacidad reducida de inducir altos tftulos de anticuerpos neutralizantes espedficos del 40 dengue y la relativamente corta duracion de la respuesta inmunitaria protectora. Este inconveniente se supera por la formulacion del antfgeno del dengue inactivado purificado con un adyuvante apropiado.

Las composiciones inmunogenicas desveladas en el presente documento incluyen al menos uno (es decir, uno o mas de uno) virus del dengue completos inactivados, en combinacion con el adyuvante libre de aluminio. El virus del dengue completo inactivado se puede seleccionar de entre un virus del Dengue-1, un virus del Dengue-2, un virus 45 del Dengue-3 y un virus del Dengue-4. Por lo tanto, la composicion inmunogenica puede ser una composicion monovalente que incluye un unico virus del dengue completo inactivado de una unica cepa seleccionada de entre Dengue-1, Dengue-2, Dengue-3 o Dengue-4, o la composicion puede ser una composicion multivalente (por ejemplo, bivalente, trivalente, tetravalente) que contiene virus del dengue completo inactivado de mas de una de estas cepas de dengue. En una realizacion ejemplar, la composicion inmunogenica incluye un virus Dengue-2 50 completo inactivado. Por ejemplo, la composicion inmunogenica puede ser una composicion monovalente que contiene un antfgeno de Dengue-2 completo inactivado. De manera alternativa, la composicion inmunogenica puede ser una composicion bivalente, trivalente o tetravalente que contiene un virus del Dengue-2 completo inactivado en combinacion con uno, dos o tres virus del dengue completo inactivado. Por ejemplo, en una realizacion, la composicion es una composicion tetravalente que incluye un virus del Dengue-1 completo inactivado, un virus del

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dengue-2 completo inactivado, un antigeno del virus el Dengue-3 completo inactivado y un virus del Dengue-4 completo inactivado.

El uno o mas virus del dengue completo inactivado se formulan con el adyuvante que esta libre de aluminio o sales de aluminio y en el que el adyuvante es una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol, y monooleato de polioxietileno sorbitan, y en el que la emulsion de aceite en agua no contiene ningun inmunoestimulante adicional. La emulsion de aceite en agua tambien contiene un componente acuoso, tal como una solucion salina tampon (por ejemplo, solucion salina tampon de fosfato). En realizaciones ejemplares, la emulsion de aceite en agua contiene escualeno y alfa tocoferol en una relacion que es igual o menor a 1 (p/p).

En un ejemplo espedfico, la composicion inmunogenica incluye un sistema de adyuvante de emulsion de aceite en agua en una dosis que comprende: desde aproximadamente un 2% a aproximadamente un 10% de escualeno; desde aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 10 % de alfa-tocoferol; y desde aproximadamente un 0,3 % a aproximadamente un 3 % de monooleato de polioxietileno sorbitan. Por ejemplo la composicion inmunogenica puede incluir un adyuvante formulado en una dosis que comprende: desde aproximadamente 10 mg a aproximadamente 12 mg de escualeno; desde aproximadamente 10 mg a aproximadamente 12 mg de alfa-tocoferol; y desde aproximadamente 4 mg a aproximadamente 6 mg de monooleato de polioxietileno sorbitan. En un ejemplo espedfico, el adyuvante se incluye en una dosis (completa) unica: 10,68 mg de escualeno; 11,86 mg de tocoferol; 4,85 mg de monooleato de polioxietileno sorbitan. En otras realizaciones, la composicion inmunogenica se formula en una fraccion de la dosis (es decir, una dosis que es una fraccion de las formulaciones de dosis unica precedentes, tal como la mitad de la cantidad precedente de componentes, 1/4 de la cantidad precedente de componentes, u otra fraccion de la dosis, por ejemplo, 1/3, 1/6, etc.) de la cantidad precedente de componentes.

En otro aspecto, la presente divulgacion se refiere a un procedimiento para producir una vacuna de dengue que comprende las siguientes etapas: proporcionar al menos un virus del dengue completo inactivado purificado; y, formular el al menos un virus de dengue completo inactivado purificado con un adyuvante libre de aluminio, en el que el adyuvante es una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol y monooleato de polioxietileno sorbitan y en el que la emulsion de aceite en agua no contiene ningun estimulante adicional. Por ejemplo, la composicion inmunogenica se puede formular con un virus completo producido a partir de una cepa virulenta o atenuada, que se ha inactivado. Por ejemplo, el virus vivo (virulento o atenuado) se puede destruir, haciendolo incapaz para la replicacion, utilizando agentes qrnmicos, tales como el formaldehido, betapropiolactona (BPL), o peroxido de hidrogeno, o utilizando radiacion ultravioleta, o utilizando una combinacion de dos o mas etapas de inactivacion (que pueden ser la misma o diferentes, por ejemplo, formaldeddo y BPL, formaldeddo y radiacion UV, BPL y radiacion UV, peroxido de hidrogeno y BPL, peroxido de hidrogeno y radiacion UV, etc., en cualquier combinacion).

La administracion de la composicion inmunogenica puede ser a un nino, tal como un nino menor de 5 anos de edad, o menor de 1 ano de edad. La composicion inmunogenica se puede administrar a un sujeto intacto menor de 1 ano de edad. La composicion inmunogenica puede administrarse a un sujeto adulto, tal como un sujeto anciano mayor de aproximadamente 60 o 65 anos de edad. Dichos sujetos se pueden exponer previamente al virus del dengue. Normalmente, la vacuna se administra por via parenteral, por ejemplo intramuscular. La composicion inmunogenica se puede utilizar en medicina, por ejemplo, para la prevencion, mejora o tratamiento de la infeccion por el virus del dengue o la enfermedad inducida por el virus del dengue, tal como la fiebre hemorragica (DHF) y el smdrome de choque por dengue (DSS).

TERMINOS

Con el objetivo de facilitar la revision de distintas realizaciones de la presente divulgacion, se proporcionan las siguientes explicaciones de los terminos. Se pueden proporcionar terminos y explicaciones adicionales en el contexto de la presente divulgacion.

A menos de que se explique otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto habituado en la tecnica a la que pertenece la presente divulgacion. Las definiciones de los terminos comunes en biologfa molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew y col. (eds.), The Encyclopedic of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicada por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Los terminos “un”, “una” y “el” en singular incluyen los referentes en plural a menos de que el contexto indique claramente otra cosa. De manera similar, la palabra “o” tiene la intencion de incluir “y” a menos de que el contexto indique claramente otra cosa. El termino “pluralidad” se refiere a dos o mas. Se tiene que entender adicionalmente que todos los tamanos de bases o tamanos de aminoacidos, y todos los valores del peso molecular o masa molecular, que se dan para los acidos nucleicos o polipeptidos son aproximados, y se proporcionan como descripcion. De manera adicional, las limitaciones numericas que se dan con respecto a las concentraciones o niveles de una sustancia, tal como un antfgeno, tienen la intencion de ser aproximados. Por lo tanto, cuando una concentracion se indique que es al menos (por ejemplo) 200 pg, se tiene la intencion que se entienda que es al

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menos aproximadamente (o “aproximadamente” o “~”) 200 pg.

Aunque se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la practica o ensayo de la presente divulgacion, se describen posteriormente procedimientos y materiales adecuados. El termino “comprende”, y variaciones tales como “comprender” y “que comprende” se entendera que implica la inclusion de un compuesto o composicion establecida (por ejemplo, un acido nucleico, polipeptido, anftgeno) o etapa, o grupo de compuestos o etapas, pero no la exclusion de cualquier otro compuesto, composicion, etapas, o grupos de los mismos. La abreviatura, “e.g.” se deriva del latm exempli gratia, y se utiliza en el presente documento para indicar un ejemplo no limitante. Por lo tanto la abreviatura “e.g.” es sinonimo de la expresion “por ejemplo”.

Una “composicion inmunogenica” es una composicion de material adecuado para la administracion a un sujeto humano o animal (por ejemplo, en un cuadro experimental) que es capaz de dar lugar a una respuesta inmunitaria espedfica, por ejemplo, contra un agente patogeno, tal como un virus del dengue. Como tal, una composicion inmunogenica incluye uno o mas anftgenos (por ejemplo, un virus completo purificado o subunidades antigenicas, por ejemplo, polipeptidos, del mismo) o epftopos antigenicos. Una composicion inmunogenica puede incluir tambien uno o mas componentes adicionales capaces de dar lugar o aumentar una respuesta inmunitaria, tal como un excipiente, vehmulo, y/o adyuvante. En ciertos casos, las composiciones inmunogenicas se administran para dar lugar a una respuesta inmunitaria que protege al sujeto contra smtomas o afecciones inducidas por un agente patogeno. En algunos casos, los smtomas o enfermedad producida por un agente patogeno se evita (o se trata, por ejemplo, se reduce o mejora) inhibiendo la replicacion del agente patogeno (por ejemplo, el virus del dengue) a continuacion de la exposicion del sujeto al agente patogeno. En el contexto de esta divulgacion, la expresion composicion inmunogenica se entendera que engloba las composiciones que se tiene la intencion de administrar a un sujeto o poblacion de sujetos con el objetivo de dar lugar a una respuesta inmunitaria protectora o paliativa contra el dengue (es decir, composiciones vacunales o vacunas).

El termino “purificacion” (por ejemplo, con respecto a un agente patogeno o una composicion que contiene el agente patogeno) se refiere al procedimiento de eliminar componentes de una composicion, cuya presencia no se desea. La purificacion es un termino relativo, y no es necesario que se elimine toda traza de componente no deseable de la composicion. En el contexto de la produccion de una vacuna, la purificacion incluye procedimientos tales como centrifugacion, dialisis, cromatograffa de intercambio ionico, y cromatograffa de exclusion por tamano, purificacion de afinidad o precipitacion. Por lo tanto, el termino “purificado” no necesita una pureza absoluta; mas bien, se entiende como un termino relativo. Por lo tanto, por ejemplo, una preparacion vftica purificad es en la que el virus esta mas enriquecidos de lo que esta en su ambiente generativo, por ejemplo, en una celula o poblacion de celulas en la que se replica naturalmente o en un ambiente artificial. Se puede purificar una preparacion de virus sustancialmente puros de manera que el virus o componente vftico deseado representa al menos un 50 % del contenido proteico total de la preparacion. En ciertas realizaciones, un virus sustancialmente puro representara al menos un 50 % del contenido proteico total de la preparacion. En ciertas realizaciones, un virus sustancialmente puro representara al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % o mas del contenido proteico total de la preparacion.

Un componente biologico “aislado” (tal como un virus, molecula de acido nucleico, protema u organulo) se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biologicos de la celula y/u organismo en el que se encuentra o se produce el componente. Los virus y componentes vfticos, por ejemplo, protemas que se han “aislado” incluyen virus, y protemas purificados por procedimientos de purificacion convencionales. El termino tambien abarca virus y componentes vfticos (tales como protemas vfticas) preparados por expresion recombinante en una celula huesped.

Un “anffgeno” es un compuesto, composicion, o sustancia que puede estimular la produccion de anticuerpos y/o una respuesta de linfocitos T en un animal, incluyendo composiciones que se inyectan, absorben o se introducen de otra manera en un animal. El termino “anffgeno” incluye todos los epftopos antigenicos relacionados. El termino “epftopo” o “determinante antigenico” se refiere a un sitio en un anffgeno al que responden las celulas B y/o T. Los “epftopos antigenicos determinates” o “epftopo dominante” son los epftopos contra los que se produce una respuesta inmunitaria del huesped funcionalmente significativa, por ejemplo, una respuesta de anticuerpos o una respuesta de linfocitos T. Por lo tanto, con respecto a una respuesta inmunitaria protectora contra un agente patogeno, los epftopos antigenicos dominantes son los restos antigenicos que cuando se reconocen por el sistema inmunitario del huesped dan como resultado la proteccion de la enfermedad producida por el agente patogeno. La expresion “epftopo de linfocito T” se refiere a un epftopo que cuando se une a una molecula del MHC apropiado se une especfticamente a un linfocito T (mediante un receptor de linfocito T). Un “epftopo de linfocito B” es un epftopo que se une espedficamente a un anticuerpo (o molecula receptora de linfocito B).

En el contexto de la presente divulgacion, un virus del dengue es un virus completo inactivado.

Un “adyuvante” es un agente que aumenta la produccion de una respuesta inmunitaria espedfica de anffgeno en comparacion con la administracion del anffgeno en ausencia del agente. Los adyuvantes comunes incluyen adyuvantes que incluyen aluminio que incluyen una suspension de minerales (o sales minerales, tales como el hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio, hidroxifosfato de aluminio) en el que se adsorbe el anffgeno. En el

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contexto de la presente divulgacion los adyuvantes son adyuvantes libres de aluminio (alum), que se formulan en ausencia de algunas de dichas sales de aluminio. Los adyuvantes libres de alum incluyen emulsiones de aceite en agua, tales como de agua en aceite, y aceite en agua (y variantes de las mismas, que incluyen emulsiones dobles y emulsiones reversibles), oligosacaridos, lipopolisacaridos, acidos nucleicos inmunoestimulantes (tales como oligonucleotidos CpG), liposomas, agonistas de receptores tipo Toll (particularmente agonistas de TLR2, TLR4, TLR7/8, y TLR9), y distintas combinaciones de dichos componentes.

Una “respuesta inmunitaria” es una respuesta de una celulas del sistema inmunitario, tal como un linfocito B, un linfocito T, o monocito, frente a un estfmulo. Una respuesta inmunitaria puede ser una respuesta de un linfocito B, que da como resultado la produccion de anticuerpos espedficos, tales como anticuerpos neutralizantes espedficos del antigeno. Una respuesta inmunitaria tambien puede ser una respuesta de linfocitos T, tal como una respuesta CD4+ o una respuesta CD8+. En algunos casos, la respuesta es espedfica para un antfgeno particular (es decir, una “respuesta espedfica del antigeno”). Se el antfgeno se deriva de un agente patogeno, la respuesta espedfica de antfgeno es una “respuesta espedfica del agente patogeno”. Una “respuesta inmunitaria protectora” es una respuesta inmunitaria que inhibe la funcion o actividad perjudicial de un agente patogeno, reduce la infeccion por un agente patogeno, o disminuye los smtomas (incluso la muerte) que resulta de la infeccion por un agente patogeno. Una respuesta inmunitaria protectora se puede medir, por ejemplo, por la inhibicion de la replicacion vmca o la formacion de placas en un ensayo de reduccion de placas o un ensayo ELISA de neutralizacion, o midiendo la resistencia a un desaffo con el agente patogeno in vivo.

Una respuesta inmunitaria con tendencia “Th1” se caracteriza por la presencia de linfocitos T auxiliares CD4+ que producen IL-2 e IFN-y, y por lo tanto, por la secrecion o presencia de IL-2 e IFN-y. Por el contrario una respuesta inmunitaria con tendencia “Th2” se caracteriza por una preponderancia de celulas auxiliares CD4+ que producen IL- 4, IL-5 e IL-3.

Un “sujeto” es un organismo vertebrado multicelular vivo. En el contexto de la presente divulgacion, el sujeto puede ser un sujeto experimental, tal como un animal no humano, por ejemplo, un raton, una rata algodon, o un primate no humano. De manera alternativa, el sujeto puede ser un sujeto humano.

Las composiciones inmunogenicas desveladas en el presente documento son adecuadas para prevenir, mejora y/o tratar la enfermedad producida por la infeccion con el virus del dengue.

Las composiciones inmunogenicas desveladas en el presente documento incluyen uno o mas virus del dengue completos inactivados purificados. Por ejemplo, las composiciones inmunogenicas pueden incluir una unica cepa del virus del dengue (es decir, una composicion monovalente), o pueden contener mas de una cepa del virus del dengue (es decir, una composicion multivalente). Normalmente, una composicion multivalente contiene cepas seleccionadas de entre diferentes serotipos. Debido a que hay cuatro serotipos de virus del dengue que pueden producir la enfermedad, es decir, el dengue tipo uno (DEN-1), dengue tipo dos (DEN-2), dengue tipo tres (DEN-3) y dengue tipo cuatro (DEN-4), y debido a que los anticuerpos no neutralizantes de reaccion cruzada predisponen a formas mas graves de la enfermedad del dengue, se puede seleccionar un representante de cada serotipo para incluirlo en la vacuna final con el fin de garantizar la proteccion contra la enfermedad de cualquiera de los cuatro serotipos. Por lo tanto, en una realizacion, la composicion inmunogenica es una composicion tetravalente que incluye cepas seleccionadas de cada uno de los cuatro serotipos de virus del dengue.

Los virus que se utilizan como antfgenos se pueden seleccionar a partir de esencialmente cualquier cepa (o cepas) del virus del dengue. Por ejemplo, se puede seleccionar una cepa vmca de cada serotipo, que se escoge basandose en su conformidad con respecto a una secuencia definida (por ejemplo, de consenso) para el serotipo, tal como una secuencia de consenso DEN-1, una secuencia de consenso DEN-2, una secuencia de consenso DEN-3, o una secuencia de consenso DEN-4. Dicho virus puede ser de origen natural o sintetico. De manera alternativa, se puede seleccionar una cepa vmca que se correlacione con la cepa prevalente en el area o poblacion en la que se pretende administrar la vacuna. Otra opcion es seleccionar cepas para cada tipo segun una cuestion de conveniencia basada en la disponibilidad o la experiencia anterior. Por ejemplo, se describen cepas ejemplares en la Patente de EE. UU N° 6.254.873, que se incorpora en el presente documento por referencia. Se desvelan cepas adicionales adecuadas, por ejemplo, en la Patente de EE. UU N° 7.226.602. Se pueden encontrar cepas adicionales, por ejemplo, en la base de datos de genomas vmcos VBRC (
http://athena.bioc.uvic.ca/organisms/Flaviviri-dae/Dengue/Curated genes), y la base de datos de virus del Dengue (
http://www.broad.mit.edu/annotation/viral/ Dengue/Pro-jectInfo.html).

En el contexto de una vacuna del virus de dengue completo inactivado purificado, se pueden utilizar cepas virulentas o atenuadas. Normalmente las cepas virulentas se propagan con un tftulo mayor en las celulas huesped, facilitando la produccion a escala comercial. Sin embargo, las cepas virulentas necesitan tener un especial cuidado en su manejo para evitar la infeccion en el personal implicado en la fabricacion. Las cepas atenuadas, por ejemplo, que se desarrollan por la adaptacion a la produccion en celulas cultivadas y la seleccion por la virulencia reducida y/o la replicacion reducida en los mosquitos vectores del dengue, necesitan menos precauciones de manejo pero pueden ser diffciles de producir, Las cepas atenuadas ejemplares adecuadas para su uso en el contexto de una composicion inmunogenica que contienen un virus del dengue inactivado y un adyuvante libre de aluminio se describen en el documento WO 00/57907 y la Patente de EE. UU N° 6.638.514, y los documentos WO 00/58444 y US 6.613.556, que se incorporan en el presente documento por referencia. Por lo tanto, las cepas seleccionadas se escogen

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normalmente de entre las numerosas cepas disponibles para replicarse en celulas que son adecuadas para la produccion de materiales concebidos para su uso en seres humanos (por ejemplo, celulas que se han certificado libres de agentes patogenos). Por ejemplo, se pueden explorar las cepas para identificar los virus que crecen con los tftulos mayores, por ejemplo de un tftulo de al menos 5 x 106 ufp/ml, preferentemente al menos 1 x 107 ufp/ml o mas en las lmeas celulares de eleccion; (ii) que se seleccionan de las cepas de virus del dengue que crecen con los tftulos mayores en las lmeas celulares de eleccion; y (iii) que mas se adaptan a las cepas seleccionadas por el aumento de crecimiento por pasajes adicionales desde una a vareas veces en las lmeas celulares de eleccion. Los virus seleccionados (por ejemplo, escogidos de entre los cuatro serotipos de virus del dengue) se pueden adaptar adicionalmente para crecer con tftulos altos por pasajes adicionales en cultivos celulares o por modificacion genetica para producir una muestra madre con alta titulacion y la produccion de lotes de semillas.

Las lmeas celulares para propagar el virus del dengue incluyen celulas de mairftfero, tales como celulas Vero, celulas AGMK, celulas BHK-21, celulas COS-1 o COS-7, celulas MDCK, celulas CV-1, celulas LLC-MK2, lmeas celulares primarias tales como celulas de pulmon de Rhesus fetal (FRhL-2), celulas BSC-1, y celulas MRC-5, o fibroblastos diploides humanos, asf como celulas aviares, lmeas celulares derivadas de embriones de pollo o pato, por ejemplo, celulas AGE-1, y fibroblastos embrionarios de pollo, primarias, y lmeas celulares de mosquito tales como C6/36. Preferentemente, las celulas escogidas se adaptan al crecimiento en ausencia de suero o protemas derivadas del suero, y pueden mantener la replicacion del virus del dengue con tftulos altos en condiciones de crecimiento libre de suero (y/o libre de protemas).

Para propagar el virus en un cultivo celular, la cepa de virus del dengue que se selecciona se utiliza para infectar la celula huesped (por ejemplo que se selecciona de entre los tipos celulares adecuados enumerados anteriormente). Tras la adsorcion del virus, se alimentan los cultivos con un medio capaz de soportar el crecimiento de las celulas. Preferentemente, el medio no contiene suero ni protemas derivadas del suero u otras protemas derivadas de animales, o se puede utilizar un medio libre de suero para remplazar el medio que contiene suero durante la produccion. Hay disponibles muchas formulaciones de medio libre de suero en el mercado. Una descripcion detallada de los procedimientos para producir virus en celulas mantenidas en condiciones libres de suero se puede encontrar, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de EE. UU publicada N° 20060183224, que se incorpora en el presente documento por referencia.

Las celulas huesped se mantienen en cultivo durante varios dfas hasta que se alcanza el tftulo de virus deseado. Opcionalmente, las celulas se mantienen en un sistema de perfusion continua a partir del cual se pueden obtener los virus de manera intermitente o continua en el curso de varios dfas o mas. En condiciones de cultivo no continuas, es deseable un tftulo de virus de al menos aproximadamente 106 o 107 UFP/ml a los 3-7 dfas despues de la infeccion. En algunas celulas huesped, el tftulo se mantiene alto durante varios dfas, y el virus se puede recuperar en multiples puntos de tiempo para maximizar el rendimiento. Por ejemplo, el virus se puede recolectar de estos cultivos diariamente, desde aproximadamente 3 a aproximadamente 13 dfas despues de la infeccion recolectando los sobrenadantes y realimentando las celulas. Opcionalmente, los sobrenadantes se pueden agrupar antes del procesamiento adicional. En otras celulas huesped el virus se puede cultivar hasta un tftulo mas alto, pero en un periodo de tiempo mas corto. En dicho caso, el virus se puede recolectar en un pico de tftulo como se determine empfticamente.

Por ejemplo, se pueden amplificar las celulas Vero en medio VPSFM con Ficina hasta el pasaje 141. Se puede llevar a cabo un pasaje adicional en presencia de tripsina porcina. Las celulas se pueden sembrar a aproximadamente 0,7 x 106 celulas/ml en el Biorreactor (4 l) y cultivarse en microportadores (cytodex-1) durante 5 dfas en VPSFM + Pluronic al 0,1 % en condiciones de perfusion (por ejemplo, el D0 ^ 0 volumenes/dfa; D1^ D2: 1 v/d durante los proximos 3 dfas). Las celulas a aproximadamente 3 x 106 celulas/ml se infectan entonces (a 35 °C) con virus del dengue, por ejemplo a una MOI de 0,01 en DMEM+Glutamina 4 mM + FBS al 2 % durante 2 h con un volumen reducido de medio (2 l) a 37 °C. El volumen del medio en el Biorreactor se ajusta entonces a 4 l. Despues de 3 dfas, se retira una gran parte del medio (alrededor de 3 l) y se repone con medio DMEM+Glutamina 4 mM. A los 7 dfas despues del a infeccion, se recolecta el virus.

Para recuperar el virus, se recolecta el virus por procedimientos comunes conocidos en la tecnica que incluyen la centrifugacion a baja velocidad (por ejemplo a 1500 x g durante 10 min), o por filtracion mediante un filtro con un tamano de poro de 0,45 pm. Los procedimientos para concentrar dichos virus estan en el ambito de un experto habituado en la tecnica e incluyen, por ejemplo, la ultrafiltracion (por ejemplo, con una membrana no mayor de 300 kDa de tamano de poro), o la precipitacion con polietilenglicol (PEG) 8000. Los procedimientos para purificar virus son conocidos por un experto habituado en la tecnica e incluye los gradientes de sacarosa continuos o multi-etapa, la purificacion por cromatograffa en columna utilizando columnas de exclusion por tamano, intercambio ionico, adsorcion, o de afinidad, o purificacion por particion en poftmeros de sistemas de dos fases o multi-fase, y cualquier combinacion de los mismos. Los procedimientos para ensayar las fracciones positivas de los virus incluyen el ensayo de placas, ensayo de hemoaglutinacion (HA), y/o ensayos de antfgenos tal como los inmunoensayos.

Por ejemplo, el virus del dengue se puede concentrar a partir del sobrenadante del cultivo por precipitacion en polietilenglicol (PEG), los fluidos del sobrenadante de las celulas infectadas se clarifica por centrifugacion (1.500 x g) durante 10 min. El sobrenadante clarificado se ajusta a un 6% de PEG 8000 (Sigma) y 0,5 M de NaCl y se mantienen a 4 °C con un ligero agitado durante 45 min. El precipitado se recolecta por suspension a 500 x g durante

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50 min y se re-suspende en tampon STE (0,1 M de NaCI, 10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH 7,6). La suspension vmca se puede clarificar por centrifugacion (12.000 x g durante 10 min a 4 °C). El aglomerado se desecho, y el sobrenadante se centrifugo entonces (170.000 x g, 80 min, 4 °C) para aglomerar el virus. El aglomerado vmco se re- suspende en tampon STE a la concentracion deseada.

De manera alternativa, o adicionalmente, el virus del dengue se puede concentrar a partir de los sobrenadantes por ultrafiltracion de flujo tangencial. Los fluidos del sobrenadante de las celulas infectadas se clarifican por centrifugacion a baja velocidad como se ha descrito anteriormente, entonces se filtra a traves de un filtro CN de 0,45 mm (Nalgene). El sobrenadante filtrado se concentra mediante ultrafiltracion de flujo tangencial utilizando una membrana de union a protemas inferiores con un corte de 100 kDa (por ejemplo, canal de pantalla omega 100 K, Filtron, Inc). La concentracion se lleva a cabo a 4 °C utilizando un caudal de 400 ml por min, una velocidad de filtracion de aproximadamente 100 ml por min y una presion de 20-30 psi.

Se puede conseguir una purificacion adicional utilizando una ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa. El virus del dengue se puede purificar en gradientes de sacarosa esencialmente como se habfa descrito previamente (Srivastava y col. Arch. Virol. 96: 97-107, 1987) con mmimas modificaciones. Se puede fabricar gradientes de sacarosa de quince ml en tubos de ultracentrifugacion de 40 ml (Ultra-clear. TM., Beckman Inc.) por la adicion poco a poco de las siguientes soluciones de sacarosa p/p en solucion salina tampon de fosfato, pH 7,4 (PBS, sin Ca ni Mg, Whittaker MA Bioproducts): 2 ml al 60 %, 2 ml al 55 %, 2 ml al 50 %, 2 ml al 45 %, 2 ml al 40 %, 2 ml al 35 %, 2 ml al 30 % y 1 ml al 15 %. Se forma un gradiente suave permitiendo que los tubos permanezcan durante 2-4 h a temperatura ambiente. Se aplican hasta 25 mm de virus concentrado en cada tubo. Entonces se lleva a cabo la ultracentrifugacion (por ejemplo, en un rotor SW28 (Beckman) a 17.000 rpm durante 18 h a 4 °C). A continuacion de la centrifugacion, se pueden recolectar fracciones de 1 a 2 ml del fondo de los tubos. Las fracciones se pueden ensayar en cuanto a protemas totales, virus HA, y antfgeno vmco segun se desee. Las fracciones de gradiente positivas se agrupan normalmente, y se diluyen hasta el 10 % o menos de sacarosa con el Medio 199 (M199, Gibco- BRL) o PBS. Opcionalmente, antes de la inactivacion, los agrupamientos vmcos se pueden filtrar a traves de un filtro proteica inferior de 0,22 mm (tipo GV, Millipore).

A continuacion de la purificacion, los virus recuperados se inactivan por un medio seleccionado para conservar su antigenicidad e inmunogenicidad a la vez que se elimina su infectividad. En un ejemplo, se anade al virus una cantidad eficaz de un agente, tal como formalina o beta-propiolactona, y la mezcla se incuba con el agente inactivador hasta que se inactiva. Por ejemplo, se diluye formalina (con un 37 % de formaldehndo) 1:40 en PBS, y se ajusta el pH a aproximadamente 7,4 con NaOH 1 N. La solucion se esteriliza entonces por pasaje a traves de un filtro CN de 0,22 mm (Nalgene). Esta solucion de formalina se anade al virus purificado (1:50) para una concentracion final de formalina del 0,05 %. La inactivacion se lleva a cabo a entre 15 y 25 °C, durante 48 h hasta 14 dfas (normalmente, 10 dfas o menos). Opcionalmente, el virus se filtra a traves de un filtro tipo GV de 0,22 um y se transfiere a un nuevo contenedor. Al terminar la inactivacion, se neutraliza la formalina libre en la masa de cultivo, por ejemplo, por adicion de una cantidad equimolar de un 10 % p/v de bisulfito sodico esteril.

De manera alternativa, se puede conseguir la inactivacion radiando el virus con una fuente radioactiva hasta que el virus se inactiva. Un ejemplo favorable de una fuente radioactiva es el cobalto-60, a una dosis suficiente para inactivar la infectividad de los virus mientras se conserva la antigenicidad esencialmente intacta. Ejemplos de dosis utiles son las que se encuentran en el intervalo de desde 5,5 a 7,0 Mrads. Por ejemplo, se congelan almuotas de virus de 50 ml en 1,5 ml de tubos de polipropileno esteriles y se colocan en hielo seco en la celda gamma de una fuente de 60Co, durante un periodo suficiente para suministrar la radiacion deseada.

De manera alternativa, se puede emplear radiacion ultravioleta para inactivar el virus del dengue. Los dispositivos adecuados para la radiacion ultravioleta de virus en un contexto comercial son bien conocidos en la tecnica, y los dispositivos estan disponibles en el mercado, por ejemplo, en Bayer, que exponen el sobrenadante (u otro fluido que contiene el virus) a una fuente de luz UV-C a aproximadamente 254 nm, durante un tiempo suficiente para inactivar el virus mientras se conserva la inmunogenicidad.

De manera alternativa, el virus del dengue se puede inactivar utilizando peroxido de hidrogeno, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de EE. UU. publicada N° 20070031451, que se incorpora en el presente documento por referencia.

51 se desea, se pueden emplear dos o mas etapas de inactivacion. Cuando se emplean dos o mas etapas de inactivacion, las etapas pueden ser las mismas o diferentes. Por ejemplo, una combinacion de cualquier procedimiento de inactivacion adecuado, tal como cualquiera de los procedimientos de inactivacion precedentes, se pueden emplear durante la purificacion e inactivacion del virus del dengue para la formulacion en una composicion inmunogenica para la administracion a un sujeto humano.

La calidad de la preparacion del virus se puede controlar por una variedad de procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se puede controlar el virus antes de la inactivacion en un ensayo de titulacion de placas. El virus se amplifica en la misma o una celula huesped diferente que se utiliza para la produccion, y se utiliza para infectar una lmea celular adecuada, tal como monocapas de celulas LLC-MK2 o celulas Vero, y se puede evaluar el numero de placas vmcas para determinar la infectividad del virus recuperado (vease, por ejemplo, Sukhavachana y

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col. WHO Bull. 35: 65-6, 1966). Otro procedimiento para evaluar la cantidad y calidad del antigeno recuperado es por hemoaglutinacion vmica (HA) y ensayos de inhibicion de la hemoaglutinacion (HI). Los ensayos de HA y HI vmca se puede llevar a cabo como se hada descrito previamente (Clarke & Casals, Am. J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-73, 1958). La protema total se determina esencialmente como describio Bradford (Anal. Biochem. 72: 248, 1976), utilizando un kit disponible en el mercado (BioRad, Hercules, Calif.) y la seroalbumina bovina (BSA) o gammaglobulina como referencias.

De manera alternativa el antigeno se puede detectar y/o cuantificar despues de la inactivacion, por ejemplo, en un ensayo de transferencia puntual de antigeno. Para detectar y cuantificar el antigeno en las preparaciones de virus inactivados, las muestras de virus se diluyeron en serie, normalmente por una dilucion de dos veces, y se punteo en papel de nitrocelulosa. Los papeles se secaron al aire, se bloquearon con un 5 % de casema en PBS, y se incubaron con un anticuerpo espedfico o antisuero seguido por un anticuerpo secundario unido a una enzima. El virus se puede detectar tambien por transferencia de Western. En resumen, las preparaciones de antigeno se solubilizaron en tampon de muestra SDS-PAGE que contema un 1 % de SDS, 66 mM de Tris-HCl, pH 6,8, un 1 % de glicerol y un 0,7% de bromofenol azul a 22 °C durante 10 minutos y se hizo una electroforesis en geles de un 12,5% de poliacrilamida (por ejemplo, como se describe en Feighny y col. Am. J. Trop. Med. Hyg. 50(3): 322-8, 1994). Las protemas re-disueltas se transfirieron de manera electroforetica a una membrana de nitrocelulosa o nilon. Las protemas se pueden detectar entonces por tincion con oro coloidal y los antfgenos vmcos se pueden identificar inmunologicamente utilizando una modificacion no isotopica del procedimiento de transferencia de Western.

COMPOSICIONES INMUNOGENICAS Y PROCEDIMIENTOS

El virus de dengue inactivado completo se mezcla con el adyuvante libre de aluminio para producir una composicion inmunogenica adecuada para inmunizar sujetos humanos con el fin de dar lugar a tftulos altos de anticuerpos neutralizantes del virus y proteger al ser humano inmunizado del a enfermedad producida por el virus del dengue. Normalmente, los virus de dengue inactivados completos se formulan en un vehmulo o excipiente farmaceuticamente aceptable.

Los vedculos y excipientes farmaceuticamente aceptables se conocen bien y se pueden seleccionar por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, el vedculo o excipiente puede incluir favorablemente un tampon. Opcionalmente, el vedculo o excipiente puede contener tambien al menos un componente que estabiliza la solubilidad y/o estabilidad. Ejemplos de agentes solubilizantes/estabilizantes incluyen los detergentes, por ejemplo, la sarcosina de laurel y/o monooleato de polioxietileno sorbitan. Los agentes solubilizantes/estabilizantes alternativos incluyen arginina, y polioles formadores de cristales (tales como sacarosa, trealosa, y similares). Se conocen muchos vedculos farmaceuticamente aceptables y/o excipientes farmaceuticamente aceptables en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Remihgtoh's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 5a Edicion (975).

En consecuencia, se pueden seleccionar excipientes y vedculos adecuados por los expertos en la tecnica para producir una formulacion adecuada para el suministro a un sujeto por una via de administracion seleccionada.

Los excipientes adecuados incluyen sin limitacion: glicerol, polietilenglicol (PEG), sorbitol, trealosa, sal sodica de la N-lauroilsarcosina, L-prolina, sulfobetama no detergente, hidrocloruro de guanidina, urea, oxido de trimetilamina, KCl, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ y otras sales relacionadas con cationes divalentes, ditiotreitol, ditioeritrol y p- mercaptoetanol. Otros excipientes pueden ser detergentes (incluyendo: monooleato de polioxietileno sorbitan, Triton X-100, NP-40, Empigen BB, Octilglucosido, lauroil maltosido, Zwittergente 3-0, Zwittergente 3-2, Zwittergente 3-4, Zwittergente 3-6, CHAPS, desoxicolato sodico, dodecil sulfato sodico, bromuro de cetiltrimetilamonio).

Las composiciones inmunogenicas desveladas en el presente documento tambien incluyen un adyuvante. En el contexto de una composicion inmunogenica adecuada para la administracion a un sujeto con el fin de dar lugar a una respuesta inmunitaria protectora contra el dengue, el adyuvante es una adyuvante libre de aluminio, en el que el adyuvante es una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol y monooleato de polioxietileno sorbitan, y en el que la emulsion de aceite en agua no contiene ningun inmunoestimulante adicional.

El vedculo acuoso puede ser por ejemplo, solucion salina tampon de fosfato.

Una composicion inmunogenica contiene normalmente una cantidad inmunoprotectora (o una fraccion de la dosis de la misma) del antfgeno y se puede preparar por tecnicas convencionales. La preparacion de composiciones inmunogenicas, incluyendo las que se administran a sujetos humanos, se describen en general en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, editado por Powell y Newman, Plenurn Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller y col., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. La encapsulacion en liposomas se describe, por ejemplo, por Fullerton, Patente de EE. UU. 4.235.877. La conjugacion de protemas a macromoleculas se desvela, por ejemplo, por Likhite, Patente de EE. UU. 4.372.945 y por Armor y col., Patente de EE. UU. 4.474.757.

Normalmente, la cantidad de antfgeno de cada dosis de la composicion inmunogenica se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos adversos significativos en el sujeto tfpico. Inmunoprotector en este contexto no significa necesariamente completamente protector contra la infeccion; significa

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proteccion contra los smtomas de la enfermedad, especialmente de la enfermedad asociada con el virus. La cantidad de antigeno puede variar dependiendo del inmunogeno espedfico que se emplee. En general, se espera que cada dosis para un ser humano comprendera 0,05-100 |jg de virus inactivado, tal como desde aproximadamente 0,1 jg (por ejemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 o 0,5 jg) a aproximadamente 50 jg, por ejemplo, desde aproximadamente 0,5 jg a aproximadamente 30 jg, tal como aproximadamente 1 jg, aproximadamente 2 jg, aproximadamente 3 jg, aproximadamente 4 jg, aproximadamente 5 jg, aproximadamente 10 jg, aproximadamente 15 jg, aproximadamente 20 jg, o aproximadamente 25 jg, de cada cepa de virus del dengue inactivado. La cantidad utilizada en una composicion inmunogenica se selecciona basandose en la poblacion del sujeto (por ejemplo, ninos). Una cantidad optima para una composicion particular se puede establecer por estudios convencionales que implican la observacion de los tftulos de anticuerpo y otras respuestas en los sujetos. Despues de una vacunacion inicial, los sujetos pueden recibir un refuerzo tras un intervalo adecuado (por ejemplo, en aproximadamente 4 semanas).

Se debena senalar que independientemente del adyuvante seleccionado, la concentracion de la formulacion final se calcula para ser segura y eficaz en la poblacion diana. Por ejemplo, las composiciones inmunogenicas para dar lugar a una respuesta inmunitaria contra el virus del dengue en seres humanos se administran favorablemente en ninos (por ejemplo, en ninos entre el nacimiento y 1 ano, tal como entre 0 y 6 meses, a la edad de la dosis inicial). Las composiciones inmunogenicas para dar lugar a una respuesta inmunitaria contra el dengue tambien se administran favorablemente a seres humanos adultos (por ejemplo, solas o en combinacion con antfgenos de otros agentes patogenos, por ejemplo, en el contexto de las vacunas del “viajero”). Se apreciara que la eleccion del adyuvante puede ser diferente en estas aplicaciones diferentes, y que el adyuvante optimo y su concentracion para cada situacion se determinaran empmcamente por los expertos en la tecnica.

Normalmente, las vacunas se preparan como inyectables, sea como soluciones o suspensiones ftquidas; tambien se pueden preparar en forma solida adecuada para hacer una solucion o suspension en un ftquido antes de la inyeccion. Aunque la composicion se puede administrar por una variedad de diferentes vfas, mas comunmente, las composiciones inmunogenicas se suministran por una via de administracion intramuscular, subcutanea o intradermica. En general, la vacuna se puede administrar por via subcutanea, intradermica, o intramuscular en una dosis eficaz para la produccion de anticuerpos neutralizantes y la proteccion. Las vacunas se administran de una manera compatible con la formulacion de dosificacion, y en una cantidad tal que sea eficaz profilactica y/o terapeuticamente. La cantidad que se va a administrar, es esta en general en el intervalo de 0,05-100 jg de cada cepa de virus inactivado por dosis, depende del sujeto que se va a tratar, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para sintetizar anticuerpos, y el grado de proteccion deseada. Las cantidades de vacuna precisas que se va a administrar pueden depender del juicio del medico y puede ser peculiar para cada sujeto.

La vacuna se puede dar en un programa de dosis unica, o preferentemente en una programacion de dosis multiple en el que un primer curso de vacunacion puede ser con 1-10 dosis separadas, seguidas por otras dosis que se dan en intervalos de tiempo posteriores necesarios para mantener y/o reforzar la respuesta inmunitaria, por ejemplo, a los 1-4 meses de una segunda dosis, y si fuera necesario, dosis posteriores despues de varios meses o anos. El regimen de dosificacion tambien se determinara, al menos en parte, por las necesidades del individuo y dependera del juicio del medico. Ejemplos de programaciones adecuadas de inmunizacion incluyen: una primera dosis, seguida por una segunda dosis entre 7 dfas y 6 meses, y una tercera dosis opcional entre 1 mes y dos anos despues de la inmunizacion inicial, u otras programaciones suficientes para dar lugar a tftulos de anticuerpos neutralizantes del virus que se espera que confieran una inmunidad protectora, por ejemplo que se seleccionan para que correspondan con un calendario vacunal pediatrico establecido. Puede esperarse razonablemente la generacion de una inmunidad protectora contra el dengue con una vacuna de virus inactivado tras un curso primario de inmunizacion que consiste en 1 a 3 inoculaciones. Estas se podnan suplementar por refuerzos a intervalos (por ejemplo, cada dos anos) disenados para mantener un nivel satisfactorio de inmunidad protectora.

Ejemplos

Ejemplo I - Inmunogenicidad de composiciones inmunogenicas ejemplares que contienen virus del dengue inactivados purificados (1 pg y 10 pg) y un adyuvante libre de aluminio

Se vacunaron por via intramuscular grupos de 15 ratones C57B1/6 hembras adultas intactas con dos dosis de un candidato vacunal ejemplar que contema virus inactivado purificado (PIV) de una cepa Dengue-2 (Den-2). La vacuna se administro con un volumen total de 50 ml. Los ratones se inmunizaron con formulaciones que conteman PIV del dengue solo o formulaciones que conteman una vacuna PIV del dengue adyuvantada con aluminio (hidroxido de aluminio), monofosforil ftpido A 3-Desacetilado (3D-MPL) adsorbido en hidroxido de aluminio (AS04D), una emulsion de aceite en agua (AS03A) y 3D-MPL y QS21 en una formulacion liposomica (AS01B) (vease los grupos en la Tabla 1 posterior). AS03A y AS01B eran dos ejemplos no limitantes de adyuvantes libres de aluminio (alum). El antfgeno PIV del dengue se utilizo para la formulacion era un volumen purificado obtenido esencialmente como se describe en el presente documento a partir de un cultivo de virus Den-2 tipo silvestre, inactivado con 0,185% de formalina durante 7 dfas a 22 °C.

A lo largo de los ejemplos descritos en el presente documento, se llevaron a cabo analisis estadfsticos sobre la frecuencia de CD4+ despues de la vacunacion y los tftulos neutralizantes por UNISTAT. El protocolo aplicado para el analisis de la varianza se puede describir brevemente de la siguiente manera: □ transformacion log de los datos;

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ensayo Shapiro-Wilk de cada poblacion (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribucion de los grupos; ensayo de Cochran con el fin de verificar la homogeneidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos); Analisis de la varianza en los datos seleccionados; ensayo para la interaccion de ANOVA de una via; Ensayo de Tukey-HSD para las comparaciones multiples.

Tabla 1

Gr

Antfgeno / Formulacion PIV Den-2 (Conc Total prot/dosis) Otro tratamiento

1

PIV Den-2 normal (no-adyuvantado) 10 pg Dfas 0 y 21

2

PIV Den-2 + AS22A (Al(OH)3) 10 pg Dfas 0 y 21

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PIV Den-2 + AS04D 10 pg Dfas 0 y 21

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PIV Den-2 + AS03A 10 pg Dfas 0 y 21

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PIV Den-2 + AS01B 10 pg Dfas 0 y 21

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PIV Den-2 + normal (no-adyuvantado) 1 pg Dfas 0 y 21

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PIV Den-2 + AS22A (Al(OH)3) 1 pg Dfas 0 y 21

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PIV Den-2 + AS04D 1 pg Dfas 0 y 21

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PIV Den-2 + AS03A 1 pg Dfas 0 y 21

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PIV Den-2 + AS01B 1 pg Dfas 0 y 21

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PBS Dfas 0 y 21

La respuesta inmunitaria humoral se midio 21 dfas despues de la primera inmunizacion (fijado como D^a 0) y la segunda inmunizacion (Dfa 21), es decir, los dfas 21 y 42, despues de la inmunizacion. Se ensayaron las muestras de suero utilizando un ensayo de neutralizacion anti-dengue. En resumen, para medir los tftulos neutralizantes en el suero del raton contra el virus del dengue, se incubaron diluciones en serie de suero inactivado por calor y filtrado con una cantidad fija de virus del dengue monoespedfico (Dengue-2). Entonces se anadio la mezcla de suero y virus a una monocapa de celulas Vero (de un banco celular de la OMS) y se incubo durante 4 dfas. Se midio la inhibicion de la infeccion vftica por las muestras de suero utilizando un ELISA que detecta los antfgenos vfticos asociados a las celulas en las celulas Vero adheridas a una microplaca de 96 pocillos. Las lecturas de densidad optica resultantes se procesaron automaticamente en una hoja de calculo de Excel que utiliza un modelo de programa de regresion lineal del punto medio log para derivar un porcentaje de la reduccion vmca de infeccion (al que se hace referencia como reduccion del 50 por ciento de microneutralizacion, o MN50). El tftulo de neutralizacion del virus (MN50) se define como el redproco de la dilucion de suero que da un 50 % de reduccion en la lectura de la absorbancia del ensayo cuando se compara con la dosis de virus de control sin suero (TV).

Los tftulos de anticuerpos neutralizantes se determinaron en los sueros agrupados de cada grupo el dfa 21, y en sueros individuales el dfa 42. Los resultados se ilustran en la FIG. 1. El mismo perfil inmunologico se observo con las dos dosis ensayadas (1 y 10 pg de protema total). Los tftulos de anticuerpos neutralizantes estaban aumentados despues de dos administraciones de 1 pg o 10 pg de la vacuna PIV de dengue en comparacion con la respuesta despues de una unica dosis de la composicion. Para ambas dosis de la vacuna PIV de dengue, se observaron respuesta de anticuerpo neutralizantes significativamente menores con la vacuna no adyuvantada en comparacion con la vacuna de PIV de dengue adyuvantada (p<0,00001). Con la dosis de 10 pg de protema total, la vacuna PIV de dengue adyuvantada con AS04D induda una respuesta de anticuerpos neutralizantes significativamente mayor en comparacion con la respuesta inducida por la vacuna PIV de dengue adyuvantada con aluminio solo (AS22A) (p = 0,0027). No se observo diferencia entre estos dos adyuvantes a la dosis de 1 pg de protema total (p>0,05). Como se muestra en la FIG. 1, las composiciones adyuvantadas con un adyuvante libre de aluminio induda respuestas de anticuerpo neutralizante mas altas (AS03A (p<0.0173) o AS01B (p<0.0001)) que las composiciones con AS04D o AS22A. La vacuna PIV de dengue adyuvantada con AS03A y AS01B induda niveles similares de tftulos de anticuerpo neutralizante (p > 0,05).

Estos resultados demuestran que con una dosis de 1 o 10 pg de protema total de PIV de dengue, se observaban tftulos de anticuerpo neutralizante mas altos en ratones inmunizados con composiciones que conteman un sistema adyuvante que no contiene aluminio (como se ejemplifica con AS03A o AS01B mostrados en el presente documento) en comparacion con la respuesta inducida por el mismo antfgeno en combinacion con un adyuvante que contema aluminio (por ejemplo, AS22A o AS04D).

Ejemplo II - Inmunogenicidad de composiciones inmunogenicas ejemplares que contienen un virus inactivado purificado del dengue (1 pg y 10 pg) y un adyuvante libre de aluminio con diferentes diluciones de adyuvante

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Se administraron a grupos de 15 ratones C57B1/6 hembras adultas dos dosis de la vacuna ejemplar PIV de dengue por via intramuscular con un volumen total de 50 ml. Los ratones se inmunizaron con formulaciones que conteman el PIV de dengue solo o formulaciones que conteman el antigeno PIV de dengue adyuvantado con Aluminio (AS22A, hidroxido de aluminio), o la dilucion de diferentes sistemas de adyuvante, por ejemplo, tal como 1/2 dosis convencional de AS04D (AS04D/2), AS03B (sistema Adyuvante basado en una emulsion de aceite en agua que contema 5,93 mg de tocoferol), y AS01E (media dosis de AS01B) (detallado en la Tabla 2). El PIV utilizado para la formulacion era un volumen purificado de un cultivo de un virus Den-2 de tipo silvestre, inactivado con un 0,185 % de formalina durante 7 dfas a 22 °C.

Tabla 2

Gr

Antfgeno / Formulacion PIV Den-2 Conc Total prot/raton Otro tratamiento

1

PIV Den-2 normal (no-adyuvantado) 1 jg Dfas 0 y 21

2

PIV Den-2 + AS22A (Al(OH)3) 1 jg Dfas 0 y 21

5

PIV Den-2 + AS04D/2 10 jg Dfas 0 y 21

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PIV Den-2 + AS03B 10 jg Dfas 0 y 21

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PIV Den-2 + AS01E 10 jg Dfas 0 y 21

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PIV Den-2 + AS04D/2 1 jg Dfas 0 y 21

9

PIV Den-2 + AS03B 1 jg Dfas 0 y 21

10

PIV Den-2 + AS01E 1 jg Dfas 0 y 21

11

PBS Dfas 0 y 21

La respuesta inmunitaria humoral a la inmunizacion se midio 21 dfas despues de la primera y segunda inmunizaciones (Dfas 21 y 42, respectivamente) en los 15 ratones/grupo. Las muestras de suero se ensayaron por el ensayo de neutralizacion descrito anteriormente.

Los tftulos de anticuerpos neutralizantes en los sueros agrupados por grupos el dfa 21, y en sueros individuales por grupos el dfa 42, se presentan en la FIG. 2. Se observo el mismo perfil inmunologico en ambas dosis ensayadas (1 y 10 |jg de protema total). Se observaron tftulos de anticuerpos neutralizantes mayores despues de dos administraciones de la composicion inmunogenica en comparacion con la respuesta inducida despues de solo una unica administracion de 1 jg o 10 jg de antfgeno PIV de dengue. Para ambas dosis de la vacuna PIV de dengue ensayadas, se observaron respuestas de anticuerpos neutralizantes menores con la vacuna no adyuvantada en comparacion con las formulaciones de PIV de dengue adyuvantadas (p < 0,00001). A la dosis de 1 jg de protema total, vacuna PIV de dengue adyuvantada con AS04D/2 inducfa una respuesta de anticuerpos neutralizantes similar en comparacion con la respuesta inducida por la vacuna de PIV de dengue adyuvantada con aluminio solo (p > 0,05). Para la misma dosis de vacuna ensayada, la vacuna de PIV de dengue adyuvantada con AS03B o AS01E inducfa tftulos de anticuerpos neutralizantes mas altos en comparacion con la vacuna adyuvantada con AS04D (p < 0,029 para AS03B y p < 0,00001 para AS01E) o aluminio (p < 0,0035 para AS03B y p < 0,00001 para AS01E).

En conclusion, a una dosis de 1 o 10 jg de protema total de antfgeno de PIV del dengue, se observaron tftulos de anticuerpos neutralizantes mas altos en ratones inmunizados con las composiciones adyuvantadas con una dilucion del sistema adyuvante que no contiene aluminio (AS03B o AS01E) en comparacion con la respuesta inducida por el mismo antfgeno adyuvantado con un adyuvante que contiene aluminio (AS22A o AS04D/2).

Ejemplo III - Inmunogenicidad de composiciones inmunogenicas ejemplares que contienen un virus del dengue inactivado purificado (2 pg y 200 ng) y una adyuvante libre de aluminio a diferentes diluciones de adyuvante

Se inmunizaron grupos de 25 ratones C57B1/6 hembras adultas por via intramuscular con dos dosis de una vacuna de PIV de dengue ejemplar en un volumen total de 50 ml Los ratones se inmunizaron con formulaciones que conteman antfgeno de PIV de dengue solo o formulaciones que conteman el antfgeno de PIV de dengue adyuvantadas con Aluminio (AS22A, hidroxido de aluminio) o las dilucion de diferentes adyuvantes, por ejemplo, AS04D (AS04D/2), AS03B (sistema de adyuvante basado en una emulsion de aceite en agua que contema 5,93 mg de tocoferol), y AS01E (media dosis de AS01B) (los grupos se detallan en la Tabla 3). El antfgeno PIV utilizado para la formulacion era un volumen purificado obtenido de un cultivo de virus Den-2 de tipo silvestre, inactivado con 0,185 % de formalina durante 7 dfas a 22 °C.

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Tabla 3

Gr

Antfgeno / Formulacion PIV Den-2 Conc Total prot/raton Otro tratamiento

1

PIV Den-2 normal (no-adyuvantado) 200 ng Dfas 0 y 14

2

PIV Den-2 + AS22A (Al(OH)3) 200 ng Dfas 0 y 14

3

PIV Den-2 + AS04D/2 2 jg Dfas 0 y 14

4

PIV Den-2 + AS03B 2 jg Dfas 0 y 14

5

PIV Den-2 + AS01E 2 jg Dfas 0 y 14

6

PIV Den-2 + AS04D/2 200 ng Dfas 0 y 14

7

PIV Den-2 + AS03B 200 ng Dfas 0 y 14

8

PIV Den-2 + AS01E 200 ng Dfas 0 y 14

9

PBS Dfas 0 y 14

La respuesta inmunitaria humoral a la administracion de la composicion inmunogenica se midio 14 dfas despues de la primera y segunda inmunizaciones ^as 14 y 28, respectivamente) en los 15 ratones/grupo. Las muestras de suero se evaluaron por el ensayo de neutralizacion descrito anteriormente.

Se sacrificaron diez ratones de cada grupo a los 7 dfas despues de la inmunizacion con el fin de evaluar la respuesta inmunitaria celular por ICS utilizando 5 agrupamientos de 2 bazos cada uno. El CMI solo se evaluo en los grupos de ratones inmunizados con 2 |jg de vacuna de PIV del dengue adyuvantada con AS04D/2, AS03B, AS01E y en ratones inmunizados con 200 ng de la vacuna no adyuvantada o la vacuna adyuvantada con AS22A (grupos 1 a 5) y los ratones que recibfan PBS (grupo 9). Los sueros de otros 15 ratones se recolectaron 14 dfas despues de la primer inmunizacion (dfa 14) y la segunda inmunizacion (dfa 28).

Se determinaron los tttulos de anticuerpos neutralizantes en los sueros agrupados por grupos el dfa 14, y en suero individuales por grupo en el dfa 28. Los resultados se proporcionan en la FIG. 3. Se observaron tttulos de anticuerpos neutralizantes mas altos despues de dos administraciones de 2 jg o 200 ng de vacuna de PIV del dengue en comparacion con los tftulos despues de una unica administracion. Se observaron respuesta de anticuerpos neutralizantes significativamente mas altos con las formulaciones de PIV de dengue adyuvantadas en comparacion con la formulacion no adyuvantada (p < 0,0089). A la dosis de 200 ng de PIV de dengue, las formulaciones adyuvantadas con AS03B y AS01E daban lugar a una respuesta de anticuerpos neutralizantes sustancialmente mayor en comparacion con la respuesta que da lugar el mismo antfgeno formulado con AS22A o AS04D/2. A la dosis menor de antfgeno, el PIV de dengue adyuvantado con AS22A y AS04D/2 induda una respuesta de anticuerpos neutralizantes comparable a la dosis de 200 ng de protema total (p > 0,05). A la dosis de antfgeno mas alta de 2 jg de protema total, la formulacion con AS04D/2 induda una respuesta de anticuerpos neutralizantes en comparacion con la vacuna adyuvantada con AS03B (p > 0,05). Sin embargo, a la dosis menor de antfgeno (200 ng), la formulacion con AS03B daba lugar a tftulos de anticuerpos neutralizantes mas altos que con AS04D/2 (p = 0,0012). De manera interesante, el PIV de dengue adyuvantado con AS01E induda tftulos de anticuerpos neutralizantes significativamente mas altos en comparacion con el resto de grupos (p < 0,0028).

La respuesta inmunitaria celular tambien se evaluo despues de dos administraciones de PIV de dengue en combinacion con las diluciones de adyuvante mencionadas anteriormente. Se evaluaron las respuestas de citocinas de linfocitos T CD4+ 7 dfas despues de la segunda inmunizacion (Dfa 21) por ICS (FIG. 4).

Se induda una respuesta de linfocitos T CD4+ menor por la vacuna de PIV de dengue no adyuvantada en comparacion con el resto de grupos (p < 0,001). Los ratones inmunizados con la vacuna de PIV de dengue adyuvantada con AS01E induda las respuestas mas altas de linfocitos T CD4+ en comparacion con los ratones del resto de grupos (p < 0,00001). La respuesta de linfocitos T CD4+ obtenida con la vacuna de PIV de dengue adyuvantada con As22A, AS04D/2 y AS03B no eran estadfsticamente diferentes (p > 0,05).

En conclusion, se observaron tftulos de anticuerpos neutralizantes mas altos en ratones inmunizados con la vacuna PIV de dengue adyuvantada con un sistema de adyuvante que no contema aluminio (AS03B o AS01E) en comparacion con la respuesta inducida por esta vacuna adyuvantada con hidroxido de aluminio (AS22A). Hay que senalar que la vacuna de PIV de dengue adyuvantada con AS01E induda una respuesta de anticuerpos neutralizantes mas alta y una respuesta de linfocitos T CD4 mas alta en comparacion con la vacuna adyuvantada con el adyuvante que contema aluminio, AS04D/2.

En resumen, en comparacion con los ratones inmunizados con el PIV de dengue formulado con adyuvantes que contienen aluminio (AS22A, AS04D, o AS04D/2), los ratones inmunizados con una vacuna formulada con sistemas de adyuvante libres de aluminio (por ejemplo, AS01B o AS01E, que no conteman aluminio), daban lugar a una

respuesta de anticuerpos neutralizantes y respuesta de linfocitos T CD4+ mayores. Estos resultados demuestran los atributos inmunogenicos favorables de las vacunas de PIV de dengue formuladas con adyuvantes libres de aluminio.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion inmunogenica para su uso en la administracion a un ser humano que comprende al menos un virus del dengue inactivado completo y un adyuvante libre de aluminio, en el que el adyuvante es una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol y monooleato de polioxietileno sorbitan, y en el que la emulsion de aceite en agua no contiene ningun inmunoestimulante adicional.
2. 2. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que al menos un virus de dengue inactivado completo se selecciona de entre el grupo que consiste en un virus Dengue-1, un virus Dengue-2, un virus Dengue-3 y un virus Dengue-4.
3. 3. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en la que al menos un virus de dengue inactivado completo es un virus Dengue-2.
4. 4. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende escualeno y alfa tocoferol en una relacion que es igual a, o menor que, 1.
5. 5. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el adyuvante se formula en una dosis que comprende:

   desde aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 10 % de escualeno, desde aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 10 % de alfa-tocoferol,

   desde aproximadamente un 0,3 % a aproximadamente un 3 % de monooleato de polioxietileno sorbitan.
6. 6. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que el adyuvante se formula en una dosis que comprende:

   desde aproximadamente 10 mg a aproximadamente 12 mg de escualeno,

   desde aproximadamente 10 mg a aproximadamente 12 mg de alfa-tocoferol,

   desde aproximadamente 4 mg a aproximadamente 6 mg de monooleato de polioxietileno sorbitan.
7. 7. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6, en la que el adyuvante se formula en una dosis que comprende:

   10,68 mg de escualeno,

   11,86 mg de tocoferol,

   4,85 mg de monooleato de polioxietileno sorbitan.
8. 8. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que el adyuvante se formula en una fraccion de la dosis.
9. 9. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la composicion inmunogenica comprende un virus Dengue-1, un virus Dengue-2, un virus Dengue-3 y un virus Dengue-4.
10. 10. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha composicion inmunogenica es una composicion vacunal contra el dengue.
11. 11. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso en la prevencion, mejora o tratamiento de la enfermedad producida por el virus del dengue en un sujeto.
12. 12. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que dicho sujeto es menor de cinco anos de edad.
13. 13. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que dicho sujeto es menor de un ano de edad.
14. 14. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 o 13, en la que dicha enfermedad producida por el virus del dengue es la fiebre hemorragica (DHF) o el smdrome de choque por dengue (DSS).
15. 15. Un procedimiento de produccion de una vacuna de dengue para su uso en la administracion a un ser humano que comprende:

    proporcionar al menos un virus de dengue inactivado completo purificado; y

    formular el al menos un virus de dengue inactivado completo purificado con un adyuvante libre de aluminio, en el que el adyuvante es una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol y monooleato de polioxietileno sorbitan y en el que la emulsion de aceite en agua no contiene ningun inmunoestimulante adicional.