CN1665834A - 新的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与合适佐剂联用的EBV膜抗原或其衍生物在生产用于预防传染性单核细胞增多症(IM)的疫苗中的用途以及适用于预防IM的疫苗组合物。

Description

新的疫苗
本发明涉及Epstein-Barr病毒(EBV)感染的预防，更具体地说，涉及EBV感染引起的传染性单核细胞增多症的预防。更具体地说，本发明涉及EBV抗原、特别是称为gp350的糖蛋白及其衍生物在用于预防EBV感染和/或传染性单核细胞增多症的疫苗中的用途。
EBV是疱疹病毒组的一员，并且是一种重要的病原体。它引起人类传染性单核细胞增多症(IM)，一种也称为腺热的疾病。据最新报道，在美国，与传染性单核细胞增多症相关的直接健康开支估计每年高达一千六百万美元之多。此外，传染性单核细胞增多症常导致病人长期不能工作或学习，该疾病由此而引起的间接费用也是非常庞大。
该病毒还与许多其它的临床疾病有关，其中所述疾病大多是恶性疾病。这些疾病包括免疫抑制患者的伯基特淋巴瘤、B细胞淋巴瘤和平滑肌瘤、一些T细胞淋巴瘤、霍奇金病、X-连锁淋巴细胞增殖综合症、鼻咽癌、胃癌和口腔毛状白斑病。
在西方国家，约85-90％的成人携带EBV病毒。在发展中国家，到两岁时的感染水平就接近100％。天然的初次感染发生在孩童时期并且一般无症状。同其它的疱疹病毒一样，EBV会建立起贯穿于一生的持续感染。
在发达国家，初次感染通常会迟几年。在青少年或青年时期初次感染后，约有一半的感染会发展为临床传染性单核细胞增多症。仅在美国估计每年就有超过100,000例新的病例。因此，即使忽略与该病毒有关的各种人类癌症，EBV也是疫苗的一个重要的目标。然而，迄今为止还没有EBV疫苗。
作为EBV疫苗的一种方法，减毒病毒由于病毒DNA被证实可能存在的致癌可能性而遭受冷落。因此，大多数开发EBV疫苗的方法集中在病毒的膜抗原上，它由至少三种分子量为约350,000道尔顿(gp350)、约220,000道尔顿(gp220)和约85,000道尔顿(gp85)的糖蛋白组成。在文献中，可能会用不同的分子量范围提及gp350和gp220，例如用gp340或gp300提及gp350和用gp200提及gp220。在本说明书中，被称为gp350和gp220的糖蛋白总称为gp350/gp220蛋白。
一个可变剪接的单基因编码gp350/gp220蛋白并导致产生gp350和gp220 mRNA转录物。该基因产生两种表达产物：gp350和gp220蛋白。gp350/gp220 DNA序列的可读框有2721bp，整个读框编码gp350的907个氨基酸(参见1987年授予Kieff的美国专利第4,707,358号)。该读框的剪接形式包含2130个碱基并翻译成gp220蛋白，即一个710个氨基酸的序列。
这些蛋白的重组生产常常会形成所产生的gp350和gp220蛋白的混合物。在本领域中，已知有经修饰的EBV gp350/gp220蛋白形式。例如，缺失跨膜序列的gp350/gp220基因的重组截短构建体。该构建体仍然产生这两种蛋白即gp350和gp220的混合物，只是这些构建体缺失了允许蛋白分泌的跨膜区。
部分纯化的gp350/gp220制剂早在七十年代就有描述，但未对它们作深入地鉴定并且不是所有的制剂都具有免疫原性(Boone CW等，J Natl Cancer Inst(1973)50：841)。稍后，获得了天然或重组来源的具有抗原活性的高度纯化的gp350蛋白制剂(Morgan AJ，North JR andEpstein MA.Purification and properties of the gp340 component ofEpstein-Barr Virus membrane antigen in an immunogenic form.J.Gen.Virol.(1983)64：455-460；Thorley-Lawson D and Poodry CA.Identification and isolation of the main component(gp350-gp220)ofEpstein-Barr Virus responsible for generating neutralizing antibodies invivo.J.Virol.(1982)43：730-736；Emini EA，Schleif WA，ArmstrongME，Silberklang M，等Virol(1988)166：387-393；Madej M，ConwayMJ，Morgan AJ等Vaccine(1992)10：777-782)。然而，这些纯化gp350/gp220的纯化方法大多不适合商品化制备疫苗(例如，纯度不够、产量很小)。
EP 0 759 056描述了EBV gp350/gp220 DNA序列的非剪接变异体，它允许产生单一的重组gp350，即只产生重组gp350而不产生gp220。它是通过去除gp350基因中的某些或全部RNA剪接位点信号并让该基因在合适的宿主细胞中表达而获得。优选但非必需，EBV抗原是单一的gp350而不存在显著量的gp220。
有几种出版物回顾了EBV疫苗开发的理论基础和策略。Arrand(1992)在The Cancer Journal，5(4)“Prospects for a Vaccine againstEpstein-Barr virus”中声称：最近在模型系统中的结果是有前途的。Arrand对EBV疫苗进入临床应用的前景是乐观的。然而，自那时起十年过去了，根本就没有一种EBV疫苗甚至接近成为现实。从已出版的文献来看，大家的共识似乎是：由于EBV的流行和与其相关的疾病数量，该病毒呈现出对疫苗接种的特别的挑战。
Khanna等(1999)Immunol Rev 170，49-64回顾了一些临床前试验模型，这些临床前试验模型导致某些象Arrand等作者提出EBV疫苗的可行性。几个灵长类动物和/或啮齿动物的EBV感染模型也建立。不同的EBV疫苗的保护效力已在其中所述的一些模型中进行了评价，并且在不同的阶段取得了成功。该方面的大多数工作都集中在棉顶狨(Saguinus oedipus oedipus)上，在其体内接种高滴度的EBV之后会形成多种B细胞淋巴瘤。猫头鹰猴(Aotus trivirgatus)易患EBV诱导的淋巴瘤，而普通狨猴(Callithrix jaccus)在接种EBV后出现一过性淋巴细胞数升高。还观察到普通狨口腔中EBV的流出(Cox等(1996)J Gen Virol 77，1173-1180)。现有的鼠模型包括给SCID小鼠注射来自EBV-血清阳性供体的外周血单核细胞，这将导致发生B细胞淋巴瘤。
1995年报道了一例人体试验，它采用的是一株在11K牛痘启动子控制下表达gp220/350的活的重组牛痘株，这项试验宣称取得了填补空白的成功。该构建体在EBV阳性同时感染过牛痘病毒的成人、EBV阳性但未感染牛痘的青少年以及未感染EBV和牛痘病毒的婴孩中进行了试验(Gu等(1995)Dev Biol Stand.Basel，Karger，84，171-177)。然而，未对EBV相关的疾病进行研究，同时也不能推断与IM的关系，IM并不能影响到婴儿和儿童。
当用一种含有EBV膜抗原及适当的佐剂的亚单位疫苗在人体内进行疫苗接种试验时，我们发现了令人惊奇的结果。该疫苗在青少年和青年人群中能有效预防IM。而这些结果事前并未预料到。
在上述的EBV感染实验模型中，没有一个观察到传染性单核细胞增多症(IM)的特定症状，如过度疲劳、淋巴结病、发热。此外，IM疫苗的可能的保护机制与粘膜抗体的诱导及阻断EBV从口咽部(人的感染最早发生在这里)向外周血的扩散有关。在所述的动物模型中，当用胃肠外给予(通常为腹腔内注射)攻击试验和/或监测口咽部病毒的存在时，没有一个能评估疫苗阻止该病毒扩散的能力。此外，文献描述的唯一人体试验与传染性单核细胞增多症无关。
在本发明的第一方面，提供与合适佐剂联用的EBV膜抗原或其衍生物在生产用于预防传染性单核细胞增多症(IM)的疫苗中的用途。
本发明对年龄范围在11岁到25岁的青少年和青年人群特别有用，此年龄段最易患IM。
优选EBV抗原是gp350或gp220或其衍生物。衍生物包括gp350/220的截短形式、肽和其它修饰形式，例如那些在本文中公开的或本领域已知的。这些衍生物包括具有可被EBV中和抗体识别和/或与人CD12(也称为CR2)结合的gp350或gp220的线性序列中至少5个连续氨基酸的肽。优选衍生物包括gp350/220的残基21-24或25-27中的至少一种。
特别优选用于本发明的是一种纯的gp350制剂，该制剂是指未污染或基本未污染gp220的gp350制剂。该制剂可通过例如EP 0 769056描述的重组gp350的生产方法来获得。
用于本发明的合适佐剂包括无机盐例如铝盐或钙盐，特别是氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙。
优选佐剂还包含无毒的细菌脂多糖衍生物如3脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。
在本发明的另一方面，提供一种疫苗组合物，所述组合物包含纯的EBV gp350制剂、无机盐例如铝盐或钙盐和无毒的细菌脂多糖衍生物例如3D-MPL。
按照本发明的该方面，特别优选的疫苗包含纯的EBV gp350制剂、氢氧化铝和3D-MPL。
最优选gp350为例如EP 0 769 056中所描述的从表达gp350/220蛋白的DNA非剪接变异体制备的重组gp350。
另一种优选佐剂包含皂苷例如QS21，QS21为来源于皂树(Quillaja Saponaria Molina)皮经HPLC纯化的无毒性部分。它可以任选与3D-MPL混合，还可以任选加入载体。
QS21的生产方法已在美国专利第5,057,540号中公开。
WO 96/33739中描述了含有QS21的无反应原性的佐剂制剂。该制剂包含QS21和胆固醇，已有证据表明，当将它与抗原配制在一起时，它是一个能有效刺激TH1的佐剂。因此，本发明可采用一种含QS1与胆固醇组合的佐剂。
其它可用于本发明的合适的佐剂还包括免疫调节寡核苷酸例如WO 96/02555所公开的未甲基化CpG序列。
不同的佐剂的组合(例如上文所述的那些组合)也考虑用于本文所述的疫苗组合物中。例如，QS21可与3D-MPL配制在一起，这在上文中已述及。QS21∶3D-MPL的比例一般为1∶10至10∶1；优选为1∶5至5∶1而事实上常常为1∶1。最适组合的优选范围为2.5∶1至1∶1 3D-MPL∶QS21。
优选在依照本发明的疫苗组合物中也存在载体。该载体可以是水包油乳剂或者是无机盐例如钙盐或铝盐，例如磷酸钙、磷酸铝或氢氧化铝。
优选水包油乳剂含有例如角鲨烯、α-生育酚或吐温80等可代谢油。此外该水包油乳剂还可含有Span 85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。
通常，对于人类给药，疫苗中QS21和3D-MPL的含量范围为1μg/剂-200μg/剂，例如10-100μg/剂，优选为10μg/剂-50μg/剂。典型的水包油乳剂含2-10％角鲨烯、2-10％α-生育酚和0.3-3％吐温80。角鲨烯∶α-生育酚之比优选等于或小于1，因为这一比率提供了更为稳定的乳液。Span 85也可以1％的水平存在。在某些情况下，可能有利的是本发明的疫苗还含有稳定剂。
无毒水包油乳剂优选为在水性载体中含有无毒油例如角鲨烷或角鲨烯、乳化剂例如吐温80。该水性载体可以是例如磷酸缓冲盐溶液。
WO 95/17210中描述了一种有特别有效的佐剂制剂，它在水包油乳剂中加入了QS21、3D-MPL和生育酚。
肠细菌脂多糖(LPS)是免疫系统的一种有效的刺激物，虽然其在佐剂中的应用由于其毒性效应而一直被削减。Ribi等(1986，Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins，PlenumPubl.Corp.，NY，第407-419页)已经描述了通过从还原末端葡糖胺除去核心糖基团和除去磷酸酯而产生的LPS的一种无毒衍生物-单磷酰脂质A(MPL)，MPL具有以下结构：
一种进一步脱毒的MPL形式是通过除去二糖骨架的3位上的酰基链而获得的，称为3-O-脱酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。它可通过GB 2122204B所公开的方法纯化和制备，该文献还公开了二磷酰脂质A及其3-O-脱酰化变体的制备。3D-MPL的优选形式为一种乳化形式，具有小的粒度且直径小于0.2μm，其制备方法已在WO 94/21292中公开。优选3D-MPL颗粒应小到足够通过0.22微米薄膜进行过滤除菌(如欧洲专利号0 689 454所述)。
这些LPS衍生物的实例描述如下。
本发明中配制的源自细菌脂多糖的佐剂可从细菌材料中纯化和加工，或者它们可以是合成的。例如，Ribi等1986(参见上文)中描述了纯化的单磷酰脂质A，而GB 2220211和US 4912094中描述了来源于沙门氏菌(Salmonella sp.)的3-O-脱酰化单磷酰脂质A或二磷酰脂质A。其它纯化的和合成的脂多糖也有描述(US 6,005,099和EP 0729 473 B1；Hilgers等，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4)：392-6；Hilgers等，1987，Immunology，60(1)：141-6；以及EP 0 549074 B1)。特别优选的细菌脂多糖佐剂为US 6,005,099和EP 0 729 473B1中描述的3D-MPL和β(1-6)葡糖胺二糖。
因此，可应用于本发明的LPS衍生物为那些在结构上与LPS或MPL或3D-MPL相似的免疫刺激剂。在本发明的另一方面，LPS衍生物可以是酰化单糖，它是上述LPS结构的一部分。
与CpG联用的优选二糖佐剂为具有以下结构式的纯化或合成的脂质A：
Figure A0381575100101
其中R2可以为H或PO3H2；R3可以为具有下式的酰基链或β-羟基肉豆蔻酰基或3-酰氧基酰基残基：
Figure A0381575100102
其中
Figure A0381575100103
其中X和Y的值为0至至多约20。
皂苷在文献Lacaille-Dubois，M and Wagner H.(1996.A review ofthe biological and pharmacological activities of saponins.Phytomedicine第2卷，第363-386页)中有讲到。皂苷是在植物界和海洋动物界广泛分布的类固醇或三萜类糖苷。皂苷以在水中形成振摇时可产生泡沫的胶状溶液以及沉淀胆固醇而著称。当皂苷接近细胞膜时，它们在膜上形成导致细胞膜破裂的孔状结构。红细胞的溶解是此种现象的一个实例，它是某些但不是所有皂苷的特性。
皂苷已知可作为系统给药用疫苗的佐剂。在本领域中，已经广泛地研究了某些皂苷的佐剂和溶血活性(Lacaille-Dubois和Wagner，参见上文)。例如，在下列文献中描述了Quil A(来自于南美皂树Quillaja Saponaria Molina的树皮)及其组分：US 5,057,540；“Saponinsas vaccine adjuvants”，Kensil，C.R.，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)：1-55；EP 0 362 279 B1。含有Quil A组分被称为免疫刺激复合物(ISCOMS)的颗粒结构具有溶血作用并已用于疫苗的生产(Morein，B.，EP 0 109 942 B1；WO 96/11711；WO 96/33739)。在美国专利第5,057,540号和EP 0 362 279 B1中公开了溶血皂苷QS21和QS17(经HPLC纯化的Quil A组分)被描述为有效的系统佐剂，其中所述专利文献也公开了它们的生产方法。其它已用于系统疫苗研究的皂苷还包括那些来源于其它种的植物例如丝石竹属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)的皂苷(Bomford等，Vaccine，10(9)：572-577，1992)。
本发明的疫苗包含免疫保护量的抗原，并且可以用常规技术来制备。
在Pharmaceutical Biotechnology，第61卷Vaccine Design-thesubunit and adjuvant approach，Powell和Newman编著，Plenurn Press，1995；New Trends and Developments in Vaccines，Voller等编著，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978中全面描述了疫苗的制备。例如Fullerton的美国专利4,235,877描述了脂质体包囊化。例如Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757公开了蛋白质与大分子的缀合。
每剂疫苗中的蛋白量根据在典型接种者体内诱导免疫保护性应答而没有明显毒副作用的剂量进行选择。本说明书中的免疫保护并不意味对感染的完全保护，它指的是对病毒相关性疾病即传染性单核细胞增多症的保护。抗原的量将根据使用何种特定免疫原而变化。一般而言，预期每剂将包含1-1000μg蛋白，优选2-100μg，最优选10-50μg。特定疫苗的最佳量可通过标准研究来确定，包括观察受试者的抗体效价和其它反应。在初次接种疫苗后，受试者可在约4周内接受一次加强免疫。
                             实施例
实施例1
材料与方法
研究群体
第一项研究在比利时列日大学进行，受试者为67名年龄在18-25岁之间的健康志愿者，他们的EBV感染的血清学标记为阳性或阴性，因此分别有或无EBV感染和传染性单核细胞增多症的风险。本项研究已获得研究中心当地道德委员会的批准和每一位受试者的书面知情同意书。孕龄妇女同意在本项研究的头七个月内采用适当的避孕措施。
排除标准包括研究开始时急性疾病的临床体征、传染性单核细胞增多症病史、主要的先天性缺陷或严重的慢性疾病、任何包括皮质类固醇在内的免疫抑制药的长期治疗、任何免疫抑制病症或免疫缺陷病症、长期饮酒和/或静脉药物滥用史、任何对疫苗组分的过敏史、同时参与任何其它的临床试验、怀孕或在哺乳期、同时给予任何其它疫苗、在研究期间或在第一剂疫苗前三个月内给予免疫球蛋白。
疫苗
疫苗由GlaxoSmithKline Biologicals(Rixensart，Belgium)配制。每0.5ml剂量的gp350疫苗(装在单剂量管形瓶中)含有50μg gp350和50μg 3D-MPL，所述gp350吸附至0.5mg氢氧化铝(Al(OH)3)上或与0.5mg氢氧化铝一起配制。gp350在中国仓鼠卵巢细胞中作为一种在培养基中表达的截短产物并且以不产生gp220同种型只产生gp350的突变形式产生(如Jackman等的EP 769 056所描述的)。所述贴壁生产细胞系的培养是在胎牛血清存在下进行的。然后按照Jackman等描述的方法从培养上清液中纯化gp350。
研究设计
本项研究是随机双盲法研究，其中这两种疫苗制剂按0-1-6月给药时间表给药。在每剂疫苗接种后直到第7天，受试者在日记卡上记录下请示征的和非请示征和症状，同时对受试者进行不良反应的随访观察直到28天后为止。在第0月、第1月、第2月、第6月和第7月时抽取血样，测定抗gp350抗体效价以及抗EBV抗体(抗非疫苗抗原的抗体，即EBV感染标记)。在第3年再组织一次就诊。然后晤谈受试者，问其在前次就诊后三年内是否得过传染性单核细胞增多症，同时抽取血样，以确定抗gp350免疫和EBV感染情况。
免疫学试验
对所有的样品采取盲法分析。抗gp350抗体用GlaxoSmithKlineBiologicals公司开发的ELISA进行测定。抗EBV(非疫苗抗原)抗体用一种专门用于检测病毒衣壳抗原(Viral Capsid Antigens)的商业ELISA试剂盒进行测定，同时用免疫荧光测定进行确认。ELISA和免疫荧光法之间的分歧通过重试以及通过在外部实验室(SwedishInstitute for Infectious Disease Control，Stockholm，Sweden)进行一组免疫荧光测定和ELISA测定(抗VCA、抗EA、抗EBNA、抗p107)进行进一步EBV试验来解决。血清的中和效价通过测量其抑制EBV引起的新鲜人淋巴细胞的无限增殖化的能力来测量。同样，可通过受试者的淋巴细胞抑制EBV感染后无限增殖化的能力来评价EBV特异性细胞介导免疫(生长晕抑制测定法)。
统计学方法
用二项检验法来比较接种过疫苗的EBV血清阴性受试者中的发病率与相仿年龄未接种过疫苗的血清阴性受试者中预期的发病率。用Unistat Statistical Package(Unistat Ltd.England)进行计算。
结果与讨论
EBV感染病例
总共有17名受试者参与了第3年的就诊，他们或接种过gp350/Alum制剂或接种过gp350/Alum+3D-MPL制剂和gp350制剂并且在第7个月对于EBV感染标记为血清阴性。其中有9名接受的是Alum配制疫苗，有8名接受的是Alum+3D-MPL制剂。对他们所有人在这两次就诊间3年内的EBV感染进行了评价。结果示于下表1。
表1.试验n°1接种过疫苗的受试者中的EBV感染病例
    接受的疫苗   数目 第3年EBV感染数   第3年感染百分率(95％置信区间)
  gp350/Alum     9     3   33.3％(7.49-70.07)
  gp350/Alum+3D-MPL     8     1   12.5％(0.32-52.65)
  无     17     4   23.5％(6.81-49.90)
3年内17名接种过疫苗的受试者中共有4名感染了EBV。更准确地说，在共达636月·人的随访期中仅观察到4个病例。所有的接种过疫苗的受试者在第7个月都有gp350抗体，因此，这些数据表明：尽管在接种过疫苗的受试者体内诱导了抗gp350免疫，但是仍有可能发生EBV感染。
据报道，在未接种过疫苗的EBV血清阴性的青年人群中，EBV感染的年发病率至少达到12％(Evans和Niederman的综述，Epstein-Barr virus，in Viral Infections of Humans，epidemiology and control.1991：第265-292页.Plenum medical book company)。为获取对此发病率更准确的估计，我们在比利时的这所参与过本次临床试验相同的大学人群中另外进行了血清流行病学研究。我们从年龄从17岁到46岁的受试者中获取了800多份血清样品并用抗VCA ELISA试验和免疫荧光法对他们的EBV血清学状况进行了测定。然后，将数据输入计算机中，以建立EBV血清阴性受试者比例随年龄分布的模型。假定血清阴性青少年/青年人中EBV感染的恒定率，然后计算出拟合这些数据的指数回归曲线。获得了下式：
                   y＝161.14e-0.1269x
其中y＝年龄x时血清阴性受试者百分率，x为以年计的年龄。根据此式可计算出我们的青少年/青年易感人群中预期EBV感染的年发病率，发现等于11.9％，取整为12％。
EBV感染的12％年发病率相当于在随访观察的血清阴性未接种疫苗的受试者中每100月·人有一例预期感染例。在试验n°1接种过疫苗的受试者中所观察到的病例比例(4/636月·人)与预期的未接种疫苗的受试者中的比例(1/100月·人)之间没有观察到显著性差异。因此，这些数据表明在我们接种过gp350/Alum或是gp350/Alum+3D-MPL的研究群体中没有产生对EBV感染的保护。
传染性单核细胞增多症病例
如上所述，总共有17名受试者参与了第3年的就诊，他们或接种过gp350/Alum制剂，或接种过gp350/Alum+3D-MPL制剂，并且在第7个月他们的EBV感染标记为血清阴性。他们中仅有一名报告了与传染性单核细胞增多症一致的症状(在第38个月，发烧、身体不适/疲劳、咽炎、淋巴肿大，持续时间在1周至1月之间)。然而该受试者的免疫学概况并不能确认他曾经患有EBV相关传染性单核细胞增多症(病毒衣壳抗原IgG和IgM ELISA阴性、EBV免疫荧光阴性、gp350 ELISA阴性、EBV中和阴性以及EBV细胞介导免疫阴性)。因此可以得出这样的结论：17名受试者在3年内没有一名得过由EBV感染引起的传染性单核细胞增多症。更准确地说，在总计636人·月的随访观察中没有检测到一例传染性单核细胞增多症。
几乎没有进行过确定传染性单核细胞增多症在未接种疫苗EBV血清阴性青年人群中的年发病率的研究。从现有的流行病学数据(Evans和Niederman的综述，1993；以及与D.Crawford的私人通讯)可以预期在易感人群中传染性单核细胞增多症的年发病率为7％。然而发表的数据是从仅在美国和英国进行的调查中获得的。因此我们着手进行一次回顾性流行病学调查来估计该疾病在比利时的年发病率。问卷调查分发到3个不同的人群(GlaxoSmithKline Biologicals公司的职员、列日大学兽医系的学生、从布鲁塞尔的法语中学中所选班级的学生)。共得到3597份回复。这些答卷对应的受试者的年龄在13至66岁之间(平均年龄27.9岁)，男女比例为0.82。他们中几乎有五分之一的人报告有传染性单核细胞增多症病史。为确定该疾病在血清阴性受试者中相应的发病率，我们使用了从上述的血清流行病学研究中计算到的公式。对于在16-25岁的每一年龄，我们通过将该年龄或以上年龄受试者的回复人数乘以该年龄的血清阴性受试者的比例(从公式中得到)，得到该年龄估计的血清阴性受试者的人数。于是计算出该年龄报告的传染性单核细胞增多症病例的百分率。总之，我们发现在受调查的比利时人群中，年龄在16岁至25岁之间的血清阴性受试者的计算的传染性单核细胞增多症的年发病率达到9.2％。这些病例中约有10％可认为与巨细胞病毒感染有关而不是Epstein-Barr感染。因此，可以预期，在具有与参与n°1试验的可比性的未接种疫苗人群中，EBV相关传染性单核细胞增多症的年发病率为8％。
8％的年发病率相当于在随访的未接种疫苗的受试者中每150月·人有一例预期的传染性单核细胞增多症病例。在接种过疫苗的受试者中观察到的病例比例(0/17人)与未接种疫苗的受试者中的预测病例数(1/150月·人，在我们的试验中相当于4例)之间的差异相当接近于统计学显著性(p＜0.12)。因此这些数据表明该疫苗可有效保护人们免患传染性单核细胞增多症。当与实施例2(参见下文)的结果结合在一起来看时，这样便可产生一个更大的和更现实的人群样本以便对其进行统计学分析，结果发现具有统计学显著性。
实施例2
材料与方法
研究群体
第二项研究在两个中心—比利时的列日大学和鲁汶天主教大学进行，受试者为81名年龄在18-45岁之间的健康志愿者，他们的EBV感染的血清学标记全部为阴性，因此有EBV感染和传染性单核细胞增多症的风险。本项研究已获得当地道德委员会的批准和每一位受试者的书面知情同意书。孕龄妇女同意在本项研究期间采用适当的避孕措施。
排除标准包括研究开始时急性疾病的临床体征、传染性单核细胞增多症病史、主要的先天性缺陷或严重的慢性疾病、任何包括皮质类固醇在内的免疫抑制药的长期治疗、任何免疫抑制病症或免疫缺陷病症、长期饮酒和/或静脉药物滥用史、任何对疫苗组分的过敏史、同时参与任何其它的临床试验、怀孕或在哺乳期、同时给予任何其它疫苗、在研究期间或在第一剂疫苗注射前三个月内给予免疫球蛋白。
疫苗
在试验n°2中评价这三种不同的疫苗制剂。每0.5ml剂量的gp350疫苗(装在单剂量管形瓶中)含有50μg gp350和50μg 3D-MPL，所述gp350中未加佐剂、吸附至0.5mg氢氧化铝(Al(OH)3)上或与0.5mg氢氧化铝一起配制。gp350在中国仓鼠卵巢细胞中作为一种在培养基中表达的截短产物并且以不产生gp220同种型只产生gp350的突变形式产生(参见EP 769 056，Jackman等)。所述生产细胞系的培养是在无血清培养基的悬液中进行的。然后从培养上清液中纯化gp350。
研究设计
本项研究是随机双盲法试验，其中这三种疫苗制剂按0-1-6月给药时间表给药。在每剂疫苗接种后直到第7天，受试者在日记卡上记录下请示征的和非请示征和症状，同时对受试者进行不良反应的随访观察直到28天后为止。在第0月、第1月、第2月、第6月和第7月时抽取血样，测定抗gp350抗体效价以及抗EBV抗体(抗非疫苗抗原的抗体，即EBV感染标记)。
免疫学试验
对所有的样品进行盲法分析。抗gp350抗体用自制的ELISA测定。抗EBV(非疫苗抗原)抗体用一种专门用于检测病毒衣壳抗原(ViralCapsid Antigens)的商业ELISA试剂盒进行测定，同时用免疫荧光测定进行确认。血清的中和效价通过测量其抑制EBV相关新鲜人B淋巴细胞的无限增殖化的能力来测量。同样，EBV特异性细胞介导免疫可通过受试者的淋巴细胞抑制EBV感染引起的无限增殖化的能力来评价(生长晕抑制测定法)。
统计学方法
用二项检验法来比较接种过疫苗的EBV血清阴性受试者中的发病率与相仿年龄未接种过疫苗的血清阴性受试者中预期发病率。用Unistat Statistical Package(Unistat Ltd.England)进行计算。
结果与讨论
EBV感染病例
在试验n°2的7个月试验期间检测到的EBV感染病例数列于下表2。
                     表2.试验n°2期间EBV感染病例
    接受的疫苗   数目   EBV感染数   EBV感染百分率   95％置信区间
    gp350/Alum     27     3     11.11     2.35-29.16
    gp350/Alum+3D-MPL     27     2     7.41     0.91-24.29
    gp350     27     1     3.70     0.09-18.97
    无     81     6     7.41     2.77-15.54
在第7个月，81名接种过疫苗的受试者中共有6名已发生血清转变。更精确地说，在共达551月·人的随访期中仅观察到6个病例。这6个感染例中的5个的感染是在第二次疫苗注射后超过1个月时发生的，而此时，除两名受试者(来自于未加佐剂的疫苗免疫组)外，其他的所有人都产生了抗gp350抗体，因此预期此时开始产生保护。
如前所述，在未接种过疫苗的EBV血清阴性的青年人群中，EBV感染的年发病率预期为至少12％。这相当于在随访观察的未接种疫苗的受试者中每100月·人预期有一例感染。在接种过疫苗的受试者中所观察到的病例比例(6/81人或6/551月·人)与未接种疫苗的受试者中的预期比例(1/100月·人)之间没有发现有差异。因此这些数据不能证明在我们接种过gp350/Alum或是接种过gp350/Alum+3D-MPL或是接种过单独的gp350的研究群体中能防止EBV感染。
传染性单核细胞增多症病例
如上所述，总共有81名受试者或接种过gp350/Alum，或是接种过gp350/Alum+3D-MPL，或是接种过单独的gp350。在试验期间，他们中没有一名报告过与传染性单核细胞增多症相同的症状。换言之，在总计551月·人的随访观察中没有检测到一例传染性单核细胞增多症。如上所述，在比利时，在未接种疫苗的EBV血清阴性的青年人群中预期的传染性单核细胞增多症的年发病率等于8％或者在随访观察的血清阴性未接种疫苗的受试者中每150月·人有一例传染性单核细胞增多症病例。在接种过疫苗的受试者中观察到的病例比例(0/81人)与未接种疫苗的受试者中的预测病例数(1/150月·人＝4例，对于81名受试者，在7个月内)之间的差异是明显的，虽然未完全达到统计学显著性(p＜0.2)。由于研究设计(受试者人数相对较小以及随访观察的时间很短)缺乏统计效力，因此不能对病例比例的差异得出任何统计学结论。但是，尽管如此，这些数据仍然认为可提供该疫苗可有效保护人们免患传染性单核细胞增多症的支持性证据。
实施例1和实施例2的数据合并
当将试验1和2的EBV疫苗接种受试者的结果结合在一起时，则总共对98名受试者进行了平均12个月的随访观察，他们中没有一名患过传染性单核细胞增多症。此数字与未接种疫苗的EBV血清阴性的受试者中预期的8％的年发病率相比具有显著性差异(p＜0.02)。因此，我们可以得出这样的结论：EBV gp350疫苗可有效保护青少年/青年人免患传染性单核细胞增多症。

Claims (10)

1.一种与合适佐剂联用的EBV膜抗原或其衍生物在生产用于预防传染性单核细胞增多症(IM)的疫苗中的用途。
2.权利要求1的用途，其用于在年龄范围为11岁到25岁的青少年和青年人群体中预防IM。
3.权利要求1或权利要求2的用途，其中所述EBV抗原是gp350或其衍生物。
4.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述gp350是纯的gp350制剂。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述佐剂包含无机盐，例如铝盐或钙盐。
6.权利要求5的用途，其中所述无机盐选自氢氧化铝、磷酸铝或磷酸钙。
7.权利要求5或权利要求6的用途，其中所述佐剂还包含无毒的细菌脂多糖衍生物，例如3D-MPL。
8.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含纯的EBV gp350制剂、无机盐和无毒的细菌脂多糖衍生物。
9.权利要求8的疫苗，所述疫苗包含纯的gp350制剂、氢氧化铝和3D-MPL。
10.权利要求8或权利要求9的疫苗，其中所述gp350是从表达gp350/220蛋白的DNA非剪接变异体中制备的重组gp350。
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