CN101524537B - 流感口服含片疫苗、流感口服缓释疫苗以及二者制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种能大量生产制备高效且低成本的流感口服含片疫苗和流感口服缓释疫苗及二者制备方法，包括全病毒灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗的制备方法，涉及一种适合于口服的新型流感口服含片或口服缓释疫苗制剂及其制备工艺，包括毒种库的制备，疫苗原液生产与制备，保护剂和赋形剂的添加与冻干，口服含片或口服缓释制剂的组分及成形工艺等。流感口服疫苗可避免注射引起的疼痛和不适，模仿自然感染途径，能够保证大部分粘膜表面区域接触疫苗，引起黏膜免疫反应，也能引起系统免疫反应；无需在极其严格的条件下生产，成本较低，可相对减少因所需的抗原量增多而需要的费用；口服疫苗使用方便，无需专业人员进行接种，便于保存运输。

Description

流感口服含片疫苗、流感口服缓释疫苗以及二者制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地是涉及一种包括全病毒灭活苗、裂解苗和亚单位苗在内的流感口服含片或口服缓释制剂的制备。

背景技术

流行性感冒简称流感，是由甲、乙、丙三个型的流感病毒(influenza virus)分别引起的急性呼吸道传染病。甲型流感的流行通常会引起世界性的流感大流行，并能在家畜和家禽中引起流感流行；乙型常会引起流感局部爆发，但不引起世界性流感大流行；丙型以散发病例形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行。流感在流行病学上的特点是突然爆发，迅速蔓延，波及面广，发病率高，在年迈体衰和慢性病患者中死亡率较高。其流行具有一定的季节性，在温、寒带地区，通常在冬春季流行，但在热带和亚热带地区，则任何季节都可流行。流感患者是流感的主要传染源，人感染后的潜伏期为1～3天，从潜伏期末到发病的急性期(约7天)都有传染性。婴幼儿和年老者常易从单纯型转为肺炎型，少数则损害全身血液系统和神经系统，出现脑炎症状而呈中毒型。近百年已经出现了5次世界性流感大流行，给人类造成了大量人员死亡与财产损失。

流感病毒属于正粘病毒科，包括甲、乙、丙和动物的甲和丙型。流感病毒核衣壳为螺旋对称，包膜含有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，HA具有粘附和融合功能；核酸为单负链RNA，分8个节段；分节段基因组的易变性与疾病流行有关；血凝抑制抗体为中和抗体，具有保护作用。

世界上几乎所有的国家都在接种流感疫苗，但接种策略和接种率有很大差异。从最近发表的29个国家流感疫苗使用报告中看，目前流感疫苗接种率在美国最高，每1,000人中有270人使用，接种率27％。欧洲国家接种率在7.8％-17.7％不等。我国流感疫苗接种率平均不到1％。亚洲的日本、韩国、新加坡和我国的台湾和香港地区，流感疫苗接种率也普遍高于我们。目前中国的流感疫苗生产能力还远远低于预防大流行的需求。要预防大流行，国人的流感疫苗接种水平至少应该达到或超过目前发达国家的接种水平，即30％以上的接种率，对流感疫苗的需求应该达到4亿人份左右。但是，根据2006年SFDA等机构对中国流感疫苗生产企业的调查，总体生产能力为4500万人份左右。而实际每年生产2000万人份左右。加上进口2000万人份，中国每年接种也就在4000万人左右，不到总人口的3％。为此，提高流感疫苗的年生产量，开发低成本、使用方便且保存运输方便的流感疫苗是十分重要的。

我国用于预防流感的三种疫苗均为灭活疫苗，均含有流行的甲1、甲3及乙型3种流感病毒抗原成分。三种灭活疫苗分别为全病毒灭活苗、裂解疫苗和亚单位疫苗，这三种疫苗均为注射针剂型，对预防流感有一定局限性，因为其诱发的血液中的抗体水平很高，但流感病毒首先感染上呼吸道的上皮细胞，这才是需要的第一道免疫防御门户。现行的疫苗不能在此粘膜表面激发分泌型抗体(sIgA)或感染恢复所需要的细胞介导免疫应答，这是宿主对感染的典型应答，理想的疫苗应当激发这种免疫应答。

发明内容

本发明的第一个目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种覆盖人群广、免疫效率高、生产成本较低、保存运输方便、且无需专业人员就可进行接种的流感口服含片疫苗制剂。

本发明的另一个目的是提供一种覆盖人群广、免疫效率高、生产成本较低、保存运输方便、无需专业人员就可进行接种，且流感病毒免疫原可以在不同时间被释放，接种于不同粘膜部位的流感口服缓释疫苗制剂。

本发明的另一个目的是提供一种可大量生产制备高效且低成本的口服流感含片疫苗的制备方法。

本发明的另一个目的是提供一种可大量生产制备高效且低成本的口服流感缓释疫苗的制备方法。

为实现本发明的第一个目的，本发明的技术方案是，该疫苗为口服含片形式，且其含有流感免疫抗原以及赋形剂和保护剂。本发明所述的赋形剂和保护剂为本领域人员所熟知，可以为使用乳糖、麦芽糖或脱脂牛奶。将流感疫苗制成口服含片形式相比与传统的注射针剂具有许多吸引人的优点，包括：可避免注射引起的疼痛和不适，也可避免使用针头和针筒，减少了污染的可能性；模仿自然感染途径，能够保证大部分粘膜表面区域接触疫苗，开发了由sIgA介导的第一道防线；高效，即能引起黏膜免疫反应，也能引起系统免疫反应；可覆盖大量人群，特别适合老人和婴儿，因为粘膜免疫并不受与年龄相关的机能障碍的影响，而婴儿粘膜免疫系统的发育要早于全身免疫；其抗原提纯的要求相对不高，无需在极其严格的条件下生产，成本较低，可相对减少因所需的抗原量增多而需要的费用；口服疫苗使用方便，无需专业人员进行接种，便于保存运输。

进一步设置是所述的流感免疫抗原为流感全病毒灭活液、流感病毒裂解液、提取的流感病毒亚单位抗原三个中的一种或其组合。通过本设置选用不同类型流感免疫抗原及其组合以适应不同的接种群体，提高了本疫苗的覆盖群体面积。

进一步设置是本口服含片疫苗含有抗酸剂。抗酸剂溶于唾液并吞下时，可提高胃内含物PH，使疫苗抗原在胃内基本上不降解，保证流感疫苗抗原成分被咽下后仍能通过消化道和胃粘膜刺激免疫应答。适用于本发明口服疫苗含片的抗酸剂包括有机抗酸剂或无机抗酸剂，其中有机抗酸剂可选柠檬酸盐，包括柠檬酸钠或柠檬酸钾；适用的无机抗酸剂是不溶于水的无机盐碳酸钙，它能与抗原缔合，且抗原在与碳酸钙缔合期间能保持其抗原活性，本发明优选碳酸钙为抗酸剂。

进一步设置是所述的所述口服含片疫苗含有抗原药用载体，本发明所选用的药用载体包括本领域所熟知的适用于口服、尤其适用于婴儿的载体，这类抗原药用载体包括但不限于糖类、多羟基化合物、氨基酸、氢氧化铝或磷酸铝、氢氧化镁或磷酸镁、羟基磷灰石、滑石粉、氧化钛、氢氧化铁或磷酸铁、硬脂酸镁、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、明胶、植物胨、苍耳烷胶、角叉菜胶、阿拉伯胶、β-环状糊精。

进一步设置是所述口服含片含有免疫刺激剂，本发明所述的口服流感疫苗含片中所使用的免疫刺激剂可包含本领域内熟知的免疫刺激剂，这些免疫刺激剂包括但不限于细菌毒素，特别是全毒素(完整分子)形式或只是B链(CTB)的霍乱毒素(CT)，和热不稳定的E.coli肠毒素(LT)；或皂甙衍生物，如3-脱氧酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)，以及卡介菌多糖核酸，细菌细胞壁骨架。

进一步设置是所述口服含片含有粘结剂，为提高本发明口服含片疫苗的物理稳定性，可以使用类似葡聚糖的粘结剂。含片的物理稳定性随葡聚糖分子量增加而增加。可选的葡聚糖分子量有10,000、70,000、100,000和400,000。另外，β-环状糊精也可用作粘结剂。

进一步设置是所述口服含片含有使口服疫苗在储存期间稳定地形成玻璃状物的化合物，该化合物为多羟基化合物。为了使本口服含片疫苗在储存期间稳定的形成玻璃状物的化合物，例如有形成玻璃状物的多羟基化合物，如糖，包括单、二、三、或寡糖及其相应的糖醇。使用于本发明的糖是本领域所熟知的，包括海藻糖、蔗糖、乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖和乳酮糖、麦芽糖或葡萄糖和前面提及的糖的醇类，例如甘露糖醇、乳糖醇和麦芽糖醇。

此外本发明还可以添加有调味剂和抑菌剂，口服疫苗含片的口味对于疫苗接种者，特别是婴幼儿是十分重要的，若含片口味令人不快，则婴幼儿在含片含化之前将其吐出的可能性会增大，即无法达到接种流感疫苗的目的。

本发明所提供的流感口服含片疫苗所含特异免疫原量能诱导免疫保护应答又无明显副作用。每份含片所含特异免疫原量的不同则取决于该免疫原存在的形式以及是否能够引起适合的免疫应答。本发明所述口服流感疫苗含片所采取的固体制剂形式体积较小，易于放入口中或含服于舌下，每片含片含有理想的液体流感免疫抗原体积约为0.1-1ml，最理想的为分量在0.1-0.5ml范围内；若免疫原为蛋白(亚单位疫苗)，则每片含有的理想免疫原量为1-100ug，最为理想的为1-50ug。

为实现本发明的第二个目的，本发明的技术方案是，该疫苗包括疫苗核心以及包覆于疫苗核心外的包衣，所述疫苗核心包含有流感免疫抗原、保护剂以及赋形剂。通过将包含有流感免疫抗原及其佐剂的疫苗核心用包衣材料包衣后，口服一段时间后，包衣破裂，引起活性物质从疫苗核心中释放，可延迟疫苗有效成分的释放，例如在胃或消化道中接种。将包衣后的制剂与未包衣的可立即释放制剂混合于一粒胶囊中，则可造成流感病毒免疫原在不同时间被释放，接种于不同粘膜部位。

进一步设置是还包含有胶囊，该胶囊内包含有包衣后的疫苗核心和未包衣的可立即释放的疫苗核心。通过本设置可使流感病毒免疫抗原在不同时间被释放，接种于不同粘膜部位。

进一步设置是所述的流感免疫抗原为流感全病毒灭活液、流感病毒裂解液、提取的流感病毒亚单位抗原三种中的一种或其组合。通过本设置选用不同类型流感免疫抗原及其组合以适应不同的接种群体，提高了本疫苗的覆盖群体面积。

进一步设置是该口服含片疫苗含抗酸剂。抗酸剂溶于唾液并吞下时，可提高胃内含物PH，使疫苗抗原在胃内基本上不降解，保证流感疫苗抗原成分被咽下后仍能通过消化道和胃粘膜刺激免疫应答。适用于本发明口服疫苗含片的抗酸剂包括有机抗酸剂或无机抗酸剂，其中有机抗酸剂可选柠檬酸盐，包括柠檬酸钠或柠檬酸钾；适用的无机抗酸剂是不溶于水的无机盐碳酸钙，它能与抗原缔合，且抗原在与碳酸钙缔合期间能保持其抗原活性，本发明优选碳酸钙为抗酸剂。

进一步设置是所述包衣为水不溶性包衣材料制备，例如乙基纤维素，其他水不溶性纤维素衍生物和聚甲基丙烯酸酯。其中，乙基纤维素为首选包衣材料。包衣还可含有2-20％水溶性增塑剂和有效量的脆性诱导剂。影响包衣裂开的因素有：(1)增厚包衣，会增加溶解和漏出水溶性增塑剂的时间，包衣裂开时间也会增加；(2)脆性诱导物质增多，包衣将裂开更早；(3)增塑剂量增大后，也会增加滞后时间。水溶性增塑剂可选柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、丙二醇、聚乙二醇、甘油三乙酸酯和月桂基硫酸钠；首选的增塑剂是柠檬酸三乙酯，浓度为包衣材料总干物质的10％-20％之间。脆性诱导剂又被称为定型剂，它可降低形成包衣的膜的弹性，可选脆性诱导剂有滑石、二氧化硅气凝胶、硬脂酸镁。

进一步设置是所述胶囊为明胶或淀粉衍生物制备。

进一步设置是所述的所述口服含片疫苗含有抗原药用载体，该抗原药用载体包括但不限于糖类、多羟基化合物、氨基酸、氢氧化铝或磷酸铝、氢氧化镁或磷酸镁、羟基磷灰石、滑石粉、氧化钛、氢氧化铁或磷酸铁、硬脂酸镁、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、明胶、植物胨、苍耳烷胶、角叉菜胶、阿拉伯胶、β-环状糊精。

进一步设置是所述口服含片含有免疫刺激剂，该免疫刺激剂包括但不限于B链的霍乱毒素，E.coli肠毒素，3-脱氧酰化单磷酰基脂质A、卡介菌多糖核酸、细菌细胞壁骨架。

进一步设置是所述口服含片含有粘结剂，该粘结剂为葡聚糖。

进一步设置是所述口服含片含有使口服疫苗在储存期间稳定地形成玻璃状物的化合物，该化合物为多羟基化合物。

本发明的核心为一种包含了流感免疫抗原的能迅速溶解于口腔或能在呼吸道或消化道缓释的流感口服缓释疫苗。该疫苗与现有的注射用流感疫苗制剂相比，有以下优势：

(1)采用口服含片或口服缓释制剂形式的流感疫苗，能在粘膜表面接种流感免疫原，模拟自然感染途径，诱导宿主对感染的典型应答，可达到理想的免疫效果。

(2)口服含片使用方便，可比注射剂覆盖更广泛人群。

(3)口服含片特别适合老人和婴儿，因为粘膜免疫并不受与年龄相关的机能障碍的影响，而婴儿粘膜免疫系统的发育要早于全身免疫；

(4)口服流感疫苗的抗原提纯的要求相对不高，无需在极其严格的条件下生产，成本较低，可相对减少因所需的抗原量增多而需要的费用。

(5)口服疫苗使用方便，无需专业人员进行接种，便于保存运输。

下面通过具体实施方式对本发明内容作进一步描述。

具体实施方式

实施例1

本发明所涉及的口服流感疫苗含片包括现有的流感全病毒灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗三种，其制备流程如下：

(1)疫苗种子库的制备：和其它各种剂型的流感疫苗一样，要建立原代、主代、工作代三级种子库，三级种子库须经检定：血凝滴度、病毒滴度、无菌试验，支原体、鉴别试验、外源因子(禽腺病毒、白血病毒检测)等项目。

(2)病毒液的制备：工作种子接种鸡胚，经培养、收获病毒液、澄清过滤处理后灭活，制成全病毒液，经须经检定：血凝滴度、无菌试验，灭活试验、鉴别试验等项目。之后再进行裂解或亚单位疫苗原液制备。

(3)片剂的制备：经检定的疫苗原液加保护剂赋形剂冻干，按片剂制造工艺及崩解技术，压片成形后经包装后即为流感口服含片疫苗。口服含片组分配比如下：

流感免疫原(HA)：30-40μg/片

保护剂、添加剂和调味剂：蔗糖1-2％，山梨醇1.5-3％，葡聚糖T40 2-4％，氨基酸1-2％，碳酸钙60-80mg，苍耳烷0.3％或淀粉2％

佐剂：LT 25μg/片或MPL 5μg/片

本发明的流感口服含片疫苗，其特点是含有流感疫苗抗原冻干成分，添加适当的添加剂和赋型剂保护剂后放入口内即迅速溶于唾液中，能保证疫苗分散入唾液内，通过粘膜细胞刺激免疫应答。

理想的冻干口服含片疫苗有足够的强度以能承受生产时的处理和给药时的操作；在给药时，该制剂应不受手的潮湿度影响；该制剂应很轻，便于将其放入口中时能即刻溶解。应根据具体实际添加各类佐剂。

本发明中采用的甲1、甲3及乙型三种病毒株均为WHO专家推荐毒种，按《生物制品生产检定用菌毒种管理规程》规程建立疫苗种子库并进行检定后备生产使用。

本实施例所述的流感全病毒灭活疫苗原液生产用毒种为H1N1型IVR-148株、H3N2型NYMC X-175C株、以及B型B/Florida/4/2006株。选择健康鸡群的9～11日龄无畸形、血管清晰、活动的鸡胚。3-4lgEID₅₀、0.2ml接种，33℃培养48～72h。之后筛选活胚置2℃-8℃冷却后收获尿囊液，合并后加β-丙内酯(终浓度1∶4000)置2℃-8℃，24-48h灭活病毒，之后37℃水解2h，得疫苗原液。用截留50万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗液，之后用8倍体积的0.01mol/LPBS(PH7.2)进行衡滤。浓缩疫苗液经Sepharose 4FF凝胶柱层析或超速区带离心纯化后，得到纯化流感全病毒添加灭活疫苗添加液。

本实施例所述流感裂解疫苗原液生产用毒种为H1N1型IVR-148株、H3N2型NYMC X-175C株、以及B型B/Florida/4/2006株。选择健康鸡群的9～11日龄无畸形、血管清晰、活动的鸡胚。100EID₅₀ 3-4lg EID₅₀、0.2ml接种，33℃培养48～72h。之后筛选活胚置2℃-8℃冷却后收获尿囊液，将收获的尿囊液病毒经澄清和透析(去尿酸盐)，再经截留50万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗液后，使用凝胶过滤柱Sepharose 4FF或超速区带离心纯化病毒后，再使用0.5％的Triton X-100为裂解剂室温放置2小时使病毒裂解，再经10万分子量的超滤器超滤，采用的超滤缓冲液为8倍体积的0.01mol/LPBS(PH7.2)去除Triton X-100；加入β-丙内酯(终浓度1∶4000)置2℃-8℃，24-48h灭活病毒，之后37℃水解2h，最后0.22μm孔径滤器除菌过滤后得裂解疫苗液。

本实施例所述流感病毒亚单位抗原的制备，第三种亚单位疫苗的病毒培养方法也与全病毒灭活疫苗相同，在裂解疫苗基础上，提取病毒亚单位(HA、NA)，主要工艺包括病毒灭活、病毒裂解和有效抗原(亚单位)纯化三个过程，这种疫苗原液只含有高度纯化的流感病毒表抗原(HA、NA)，完全去除病毒脂质体和内部抗原。

【试验对照】

设置流感口服组、普通裂解流感疫苗组和空白对照组三个免疫组，每组使用6周龄洁净级雌性体重18～20g的BALB/c小鼠8只，首先通过鼻内输入5μg/只完整的失活抗原HA以激活其免疫细胞，然后在28天后，使用含有2ug/只和4ug/只HA的口服流感疫苗进行口服免疫，含有同样HA的普通裂解流感疫苗进行腹腔注射免疫小鼠，收集免疫之前、14、42和56天之后的血清。对采集到的血清进行检测，用血凝抑制方法检测特异性抗体(抗血凝素抗体)，用间接ELISA方法检测血清中IgG抗体水平。

表1 小鼠免疫后的血清HI结果

小鼠血清样的HI效价大于等于40则认为该血清样抗体水平为阳性。从表1中可看到，试验组中各组的HI平均值均大于40，都可判为产生特异性血凝素抗体。而实验结果表明接种量2ug的HI滴度明显低于4ug剂量接种的小鼠，而通过口服免疫的HI滴度也明显高于裂解流感疫苗，基本为裂解苗的2倍。

表2 小鼠免疫后血清中IgG抗体的ELISA结果

进行ELISA试验所测样品均为10x稀释后的血清样品。利用spss11.5对结果进行统计学分析，试验各组与阴性血清组相同时间内试样与阴性之比大于2.1可判为阳性，有抗体产生。测定的结果应用spss11.5软件统计分析：裂解流感疫苗、口服流感疫苗以及对照组同一时间血清两两相比P小于0.01，组间存在显著性差异，且口服流感疫苗组ELISA结果最高。

【保护效果评价】

流感病毒感染几乎不会造成动物个体死亡，其疫苗保护效率只能通过疫苗对感染小鼠的肺部的保护率来体现。所以采用0.02ml流感病毒鸡胚尿囊液8.0lgEID₅₀/ml对口服免疫后12周的小鼠进行鼻腔攻击，6天后处死小鼠，无菌取肺，观察其病灶的多少，没有肺部病灶的小鼠认为受到保护，用MDCK细胞检测小鼠肺部的流感病毒滴度(肺部病毒滴度定义为能够引起CPE的肺内容物的最大稀释倍数)。

表1 口服流感疫苗对免疫后12周小鼠的保护效力

从表中结果可看出，口服流感疫苗组保护率最高，肺部内容物流感病毒滴度最低。表明口服流感疫苗对集体的保护效果要高于非脂质体流感疫苗。

实施例2

制备冻干的口服疫苗核心，先将达到疫苗检定要求的流感疫苗液(全病毒灭活液、裂解液或亚单位疫苗液)加入佐剂或抗酸剂，本实例中选择碳酸钙，使其终浓度达到60-80mg/剂；之后加入冻干稳定剂将疫苗原液适当稀释，例如稀释至30-40μg/剂或0.3-0.4ml/剂可使用的稳定剂包括蔗糖、葡聚糖或4％氨基酸，采用无菌装填操作，按0.5-0.6ml的剂量转移至塑料的水泡样洞孔终，将组合物冻干后，用热封方法将水泡样洞孔密封。冻干制剂中除上述的试剂之外，还可包括以下标准组分，已达到在口中迅速溶解的目的，包括：硬脂酸镁、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素，以及硅氧烷聚合物和调味剂。

本实施例制备的流感口服疫苗核心含有30μg或0.3ml流感免疫原、蔗糖2％、山梨醇3％、葡聚糖T40 4％、氨基酸2％、碳酸钙80mg、苍耳烷0.3％，除此之外选用LT 25μg或MPL 5μg作为佐剂。

将上述制备的冻干流感疫苗核心进行包衣，操作如下：将所需比例的乙基纤维素、增塑剂和脆性诱导剂与水混合，制备包衣混悬液，直至得到干物质含量为20-22％的混悬液。在包衣锅或流体床中，将实施例2中的疫苗核心用上述混悬液包衣，直至得到所需重量片剂。参考的包衣成分占包衣片剂总重量的百分比为乙基纤维素7％、CitroflexR22％、滑石5.4％。经测试其介质释放时间均在210-240分钟之间。

Claims (1)

1.一种流感口服含片疫苗，其特征在于：该疫苗为口服含片形式，且其含有流感免疫抗原以及赋形剂和保护剂，其组分为：流感免疫抗原含量：30-40μg/片；

保护剂、添加剂和调味剂：蔗糖1-2％，山梨醇1.5-3％，葡聚糖T40 2-4％，氨基酸1-2％，碳酸钙60-80mg，苍耳烷0.3％或淀粉2％；

佐剂：LT25μg/片或MPL5μg/片；

所述的流感免疫抗原为流感全病毒灭活液、流感病毒裂解液、提取的流感病毒亚单位抗原三个中的一种或其组合。