CN101130076A - 一种活菌多价疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种活菌多价疫苗的制备方法，与传统的方法相比，其可以通过吸入和/或口服表达传染性支气管炎、马立克氏病、法氏囊病、新城疫和禽流感病毒相关抗原的减毒鼠伤寒杆菌，达到经一次免疫为上述5种病毒感染提供保护的目的。

Description

一种活菌多价疫苗的制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，公开了一种活菌多价疫苗的制备方法，与传统的方法相比，其可以通过吸入和/或口服表达传染性支气管炎、马立克氏病、法氏囊病、新城疫和禽流感病毒相关抗原的减毒鼠伤寒杆菌，达到经一次免疫为上述5种病毒感染提供保护的目的。

背景技术

禽类，特别是肉鸡，由于生产周期短，鸡肉的营养价值较高，受到了西方一些发达国家消费者的喜爱。与我国消费观念不同的是，西方消费者除了食用分割鸡外，也特别喜欢整鸡的消费。因此，对整鸡的外观有相当的要求。目前我国鸡用疫苗大部分均采取注射的方法，注射后均存在不同程度的炎性反应，会在皮肤上留下疤痕，因此会影响到肉鸡的出口。

我国目前使用的禽用疫苗，除二联苗外，绝大部分为单价疫苗。单价疫苗的注射不仅会引起局部的炎性反应，在皮肤上留下疤痕外，因我国的肉鸡饲养数量巨大，疫苗注射也是一种繁重的人工作业。单价疫苗不仅增加了生产成本，同时因需要使用多种疫苗，也增加了肉鸡的成本。

因我国与西方发达国家的人工饲养条件不同，我国的肉鸡因抗生素残留，接种某些疫苗而使出口受阻。我国肉鸡的饲养量占全世界第二位，仅次于美国，而世界市场的占有率不足百分之一。

鼠伤寒杆菌因可以与肠壁和鼻腔的上皮细胞特异性结合，进而感染巨噬细胞并在巨噬细胞内增殖，而巨噬细胞作为特异性的抗原加工和呈递细胞，可以刺激机体的免疫系统，使机体产生体液和细胞免疫反应。这样通过在鼠伤寒杆菌体内特异性的表达病毒抗原，并给动物喂服和/或吸入这种基因工程改造的细菌，可以刺激产生针对病毒的保护性体液和细胞免疫反应，进而使宿主不再受野生病毒株的感染。

本发明专利以对人、畜无毒的鼠伤寒杆菌为载体，将传染性支气管炎，马立克氏病，法氏囊病，新城疫和禽流感病毒的相关抗原的表达基因，整合在鼠伤寒杆菌的染色体中，这样不仅可以降低疫苗的生产成本，通过用一种疫苗预防上述5种疾病，同时通过使用减毒的鼠伤寒杆菌，可以使鸡产生针对鼠伤寒杆菌的抗体，降低野生型鼠伤寒杆菌引起人类腹泻的可能性，达到一举六得，为我国肉鸡的出口提供较高的技术优势；通过删除国外用于检测我国疫苗接种反应所对应的抗原片断，这样我们仍然可以在提供对相应病原保护的同时，避开国外为我国设置的技术壁垒，促进我国的肉鸡出口；表达上述六种病毒的减毒鼠伤寒杆菌可以通过口服或吸入途径免疫，大大降低了生产成本和接种的劳动强度，消除了疫苗经注射接种后的皮肤疤痕，有助于提高我国肉鸡在国际市场上的竞争力。

发明的内容

发明的目的：通过吸入和/或口服表达传染性支气管炎、马立克氏病、法氏囊病、新城疫和禽流感病毒相关抗原的减毒鼠伤寒杆菌，达到经一次免疫为上述5种病毒感染提供保护的目的。

为了达到上述目的，特采取下列方法：

1、用同源重组方法，将编码传染性支气管炎、传染性喉支气管炎、马立克氏病、法氏囊病、新城疫和禽流感病毒的相关抗原的基因片断，定向插入到鼠伤寒杆菌染色体的特异性位点，通过抗原编码基因的表达，经接种动物后诱导产生特异性的免疫保护反应。

2、权力要求书1所述，同源重组方法是将在所要插入基因位点两侧的核酸序列通过聚合酶连反应和/或分步克隆的方法，分别连接到病毒抗原编码基因的5’和3’端，作为同源序列将病毒抗原编码基因整合到鼠伤寒杆菌的染色体中。

3、如权利要求书1所述，病毒抗原编码基因通过同源重组的方法整合到鼠伤寒杆菌染色体中，可以通过将相关的基因片断直接射入到细菌中和/或通过细菌之间的杂交来完成。

4、如权利要求书2所述，位于病毒抗原编码基因两侧的同源序列可以是与鼠伤寒杆菌的毒性相关的蛋白的编码基因和/或调控序列，通过在毒性相关的基因的编码序列或调控序列中插入病毒抗原编码基因，使毒性相关基因和/或调控灭活，而使鼠伤寒杆菌减毒。

5、如权力要求书1所述，病毒相关抗原编码基因的表达，可以通过只有在鼠伤寒杆菌进入巨噬细胞后才诱导的促进子所控制，通过定时诱导抗原基因的表达，增加鼠伤寒杆菌的稳定性。

6、如权利要求书1所述，病毒相关抗原编码基因可以融合到鼠伤寒杆菌III型分泌系统效应蛋白基因的羧基端，使病毒相关抗原在鼠伤寒杆菌入侵巨噬细胞后，分泌到巨噬细胞的胞浆中，使诱导产生的免疫反应更加倾向于细胞毒免疫，有利于对病毒感染的保护。

7、如权利要求书1所述，病毒相关抗原的编码基因可以通过重叠聚合酶连反应和/或分步克隆的方式连接在一起。

8、如权力要求书7所述，每一个病毒相关抗原的编码基因可以带有各自的促进子和核糖体结合位点，和/或几个病毒相关抗原的编码基因由一个共同的促进子和核糖体结合位点控制。

9、如权力要求书1所述，每一种病毒可以有一种或多种或全部的抗原编码基因完整的和/或部分的编码序列。

10、如权利要求书1-9所述的方法可以用于在其它细菌中表达相关病毒的抗原编码基因，也可以用于其它病毒的抗原编码基因的表达。

具体实施方式

巨噬细胞作为抗原呈递细胞在免疫反应的应答中起着至关重要的作用。可以在巨噬细胞内生长的细菌如李斯特杆菌、结核杆菌、军团杆菌、兔拉热杆菌，特别是鼠伤寒杆菌，通过对其毒性及其调控基因的灭活，作为疫苗的载体广泛用于各种疫苗的研究。

目前除了乙肝病毒外，尚未有其它的基因工程亚单位疫苗研制成功。在实际工作中使用的疫苗主要是灭活或减毒的全病毒疫苗。在这些疫苗中除了一些与毒性有关的基因发生变异或删除外，几乎保留了所有的病毒基因。目前以病毒为载体的基因工程疫苗，因病毒容量有限，无法将一个病毒完整的编码序列插入到另一个病毒中。而在长期的进化过程中，病毒与宿主的相互作用是通过多点完成的，只在一个点上阻断其相互作用，不能有效地阻止野生毒株对宿主的感染或发病。只有用众多的病毒抗原刺激机体的免疫系统，就像灭活或减毒的全病毒疫苗，方能达到有效保护宿主不受感染的目标。

作为在巨噬细胞内复制的细菌，其本身除了可以直接刺激抗原呈递细胞，刺激免疫反应外，其本身可以作为大容量的外源基因的受体，使整个完整病毒所有基因的编码序列插入到细菌染色体中成为可能。同时通过对与细菌毒性相关的基因进行多点敲除，使我们制备出对人畜无毒的细菌载体，用于各种病毒和/或其它外源抗原的插入。

下面以鼠伤寒杆菌的减毒，定向插入和定时表达可以引起禽传染性支气管炎、法氏囊病、新城疫、马立克氏病和禽流感病毒的抗原编码序列为例，说明本发明的实施过程：

1.鼠伤寒杆菌PagC促进子的克隆

1.1根据鼠伤寒杆菌PagC促进子的序列，设计下列引物：

1.1.1F PagCUp acggtgaactaatctgcctggctt

1.1.1R PagCDn tcggcctgtgcaacatttacaacc 1069bp

1.1.2F PagCFKpnI gga GGTACC taatgggttttatagcgaaatagacttttttat

1.1.2R PagCRNsiI ggac ATGCAT caactccttaatactacttattatttacggt 708bp

1.2所有的PCR反应均采用下列体系：

10X Pfu DNA聚合酶缓冲液        5.0ul

dNTP 2mM                       5.0ul

1.1.1F 2uM                     5.0ul

1.1.1R 2uM                     5.0ul

鼠伤寒杆菌染色体DNA 10ng/ul    5.0ul

Pfu 2.5u/ul                    1.0ul

dH2O                           24.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃90秒，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。

1.3从琼脂糖胶上回收片断，作为模板，进行下列反应：

10X Pfu DNA聚合酶缓冲液        5.0ul

dNTP 2mM                       5.0ul

1.1.2F 2uM                     5.0ul

1.1.2R 2uM                     5.0ul

来自1.2的PCR DNA 1ng/ul        5.0ul

Pfu 2.5u/ul                    1.0ul

dH2O                           24.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃60秒，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。

1.4从琼脂糖胶上回收1.3的片断，分别用KpnI和NsiI进行限制性酶切，并回收片断备用。

2.鼠伤寒杆菌sifB蛋白104个氨基端氨基酸编码序列的克隆

2.1根据鼠伤寒杆菌SifB蛋白104个氨基端氨基酸编码序列，设计下列引物：

2.1.1F SifBUp acatatttcatggccaggaggcgt

2.1.1R SifBDn aggtgggcagactgagtatcaaca 608bp

2.1.2FSifBFNdeI gga Cat atgccaattactatcgggagag

2.1.2R SifBRXbaI gga TCTAGA cttcgccatctttaatac 313bp

2.2所有的PCR反应均采用下列体系：

10X Pfu DNA聚合酶缓冲液      5.0ul

dNTP 2mM                     5.0ul

2.1.1F 2uM                   5.0ul

2.1.1R 2uM                   5.0ul

鼠伤寒杆菌染色体DNA 10ng/ul  5.0ul

Pfu2.5u/ul                   1.0ul

dH2O                         24.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃60秒，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。

2.3从琼脂糖胶上回收片断，作为模板，进行下列反应：

10X PfuDNA聚合酶缓冲液      5.0ul

dNTP 2mM                    5.0ul

21.2F 2uM                   5.0ul

2.1.2R 2uM                    5.0ul

来自2.2的PCRDNA 1ng/ul        5.0ul

Pfu2.5u/ul                    1.0ul

dH2O                          24.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃60秒，循环30次，最后在72℃延伸

10分钟。

2.4从琼脂糖胶上回收2.3的片断，分别用NdeI和XbaI进行限制性酶切，并回收片断备用。

3.克隆载体的构建为了增加插入片断的稳定性，拟采用来自pBAD24的复制起源和氨苄青霉素耐药基因，和来自于pUC19的核糖体结合位点及其上游序列。

3.1根据pBAD24和pUC19的序列，设计下列引物：

3.1.1F PBAD24FNcoINotI gga ccatgg gcggccgcTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAA

3.1.1R PBAD24RKpnI gga ggtacc ACAGGTGCGGTTGCTGGC 2773bp

3.1.2F PUC 19FKpnIRINsiINotI gga ggtacc gga gaattc atgcat gcggccgcCGCGCGTTGGCCGAT

3.1.2R

PUC 19RNcoIXbaINdeIggaccatggTCTAGAggacatatgAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTA

TCC 208bp

3.2建立下列反应体系：

10XPfu DNA聚合酶缓冲液      5.0ul

dNTP 2mM                    5.0ul

3.1.1F 2uM                  5.0ul

3.1.1R 2uM                  5.0ul

pBAD24DNA 10ng/ul           5.0ul

Pfu2.5u/ul                  1.0ul

dH2O                        24.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃3分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。

3.3建立下列反应体系：

10XPfu DNA聚合酶缓冲液      5.0ul

dNTP 2mM                    5.0ul

3.1.1F 2uM                  5.0ul

3.1.1R 2uM                  5.0ul

pUC19DNA 10ng/ul            5.0ul

Pfu 2.5u/ul                 1.0ul

dH2O                        24.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃30秒，循环30次，最后在72℃延伸

3.4从琼脂糖胶上回收3.2和3.3的片断，分别用NcoI和KpnI进行限制性酶切，并回收片断备用。

3.5建立下列反应体系：

10X T4DNA连接酶缓冲液          2.0ul

3.2DNA片断                     8.0ul

3.3DNA片断                     8.0ul

T4DNA连接酶3u/ul               2.0ul

16℃过夜。然后加入5ul 3M醋酸钠pH 5.2，5ul酵母tRNA 5ug/ul，100ul无水酒精，离心10分钟，用70％漂洗2遍，溶于10ul水中。

3.6将3.5所得的连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1010.

3.7将pSZTC 1010用KpnI和NsiI进行限制性酶切，回收片断与步骤1.4所得的片段连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1011，该质粒基因的转录受到只有在巨噬细胞内方被诱导的PagC促进子的控制。

3.8将pSZTC 1011用NdeI和XbaI进行限制性酶切，回收片断与步骤2.4所得的片段连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1012，该质粒基因的转录不仅受到只有在巨噬细胞内方被诱导的PagC促进子的控制，而且插入到该质粒的基因与鼠伤寒杆菌的效应蛋白sifB融合，可以由sifB引导分泌到巨噬细胞的胞浆中，来更有效地刺激细胞免疫反应。

4.传染性支气管炎病毒所有蛋白编码基因的克隆

4.1根据传染性支气管炎病毒蛋白编码基因序列，设计下列引物：

4.1.1FLeaderProtein87FNarI gga GGCGCC AAC TTG AGT GCT CTT TTT CAA ATTGTTAAA CA

4.1.1R LeaderProtein87RIR XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT CCATAT GCA AGC TTC CAG AAT TCA AA 870bp

4.1.2F LeaderProtein87RIF1NarI gga GGCGCC TTTG AAT TCT GGA AGC TTG CATATG G

4.1.2R LeaderProtein87R1XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT CTTGTG TAC AAT ACA TCC ATT ATA GAC GC  1175bp

4.1.3FMembranePFNarI gga GGCGCC ATG CCC AAC GAG ACA AAT TGT AC

4.1.3RMembranPR XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT TTA TGTGTA AAG ACT ACT TCC TCC TGT T 678bp

4.1.4FNsp2FNarI gga GGCGCCGGT GAA TTC TAT GGT GGT TAT GTT GAT

4.1.4RNsp2RXhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT AGT AGT GTGCAC CAA CTC GA 921bp

4.1.5FNsp4FNarI gga GGCGCCTTA C TTT TC TCA ATG CTT AAG AAA ATAGAT TCT G

4.1.5RNsp4R XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT TGT AGA AGTTGG GTG TAA CTC TGT 249bp

4.1.6FNsp5FNarI gga GGCGCC GGT AGT GGA TTG ACA TAC TGT ATA AGT G

4.1.6RNsp5R XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT GTC AGG AGTAGG ACT TGG CT 630bp

4.1.7FNsp6FNarI gga GGCGCC CAG GAT TCT TAT GGA GGA GCT TCT

4.1.7RNsp6R XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT ACA TCC ACTAGC AAG GGG TAT C 333bp

4.1.8FNsp7FNarIKpnI gga GGCGCC GGTACC GAT CCT GAT GTT GTA AAGCGA GC

4.1.8RNsp7R XhoISalIClaIRI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT GAATTCTTC TAT TGG GTC GTA CCA ATC CT  435bp

4.1.9FNsp9FNarI gga GGCGCC AACT CA AAA TAT TAT GTC ATG TTG GCTAAA ATG

4.1.9R Nsp9RxbaI XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT TCC TGTTCC TCT AGA CTC ATTT CA TAATA 1071bp

4.1.10FNsp9F1XbaINarI gga GGCGCC TATT ATG AAA TGA GTC TAG AGGAAC AGG A

4.1.10RNsp9R1NsiIXhoISalIClaIggaCTCGAGGTCGACgaaATCGATgGTCCGTATGCAT GACGTG 1366bp

4.1.11FNsp9F2NsiINarI gga GGCGCC CA CGT CAT GCA TAC GGA Cc

4.1.11RNsp9R2XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT AAT GGCGGC CTG GTT TTT431bp

4.1.12FNsp10FNarIKpnI gga GGCGCC GGTACCGAA TAG AAA TTA TGT TTTCAC AGG TTA TCA CTT TA

4.1.12RNsp10RMfeI XhoISalIClaIEcoRI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGATGAATTC TTCA CAA ATT CCA ATT GTGT TG TGT TG 970bp

4.1.13FNsp10F1MfeINarI gga GGCGCC CA ACA CAA CAC AAT TGG AAT TTGTGAA

4.1.13RNsp10R XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT ACG TTGCAT AGA TTG TCT GCT AAC 858bp

4.1.14FNsp11FNarI gga GGCGCC TTC AGA TTG TGT AGT GTT TGT CAC ATG

4.1.14RNsp 11R XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT AAC GCACCA TTA ACA CGC TTA TAA 1511bp

4.1.15FNucleocapsidFNarI gga GGCGCC GGTACC ATG GCA AGC GGT AAAGCA

4.1.15RNucleocapsidR BspEI XhoISalIClaIRI gga CTCGAG GTCGAC gaaATCGAT gaattc TCA AAG TTC ATT CTC TCC TAG AGC T 1230bp

4.1.16FSpikeProteinFBssHII GGA GCGCGC ATG TTG GTA ACA CCT CTT TTACTA GTG A

4.1.16RSpikeProteinRBsrGI XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaa ACGCGTCCA TAT TCA CCT TGT ACA ACA AAG ATG TC 1446bp

4.1.17FSpikeProteinF1BsrgINarI gga GGCGCC GAC ATC TTT GTT GTA CAAGGT GAA TAT GG

4.1.17RSpikeProteinR1H3XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGATTAG TAT ACA AAG CTT GCA TTT CTG CTGt 838bp

4.1.18FSpikePoteinF2H3NarI gga GGCGCC aCAG CAG AAA TGC AAG CTTTGT ATA CTA

4.1.18RSpikeProteinR2XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT TCAAAC AGA CTT TTT AGG TCT GTA TTG TTC 1263bp

4.2将1毫升TRIzol RNA分离试剂(购自Invitrogen)加入500羽冻干的传染性支气管炎疫苗中，震荡混匀，加入0.2毫升氯仿，混匀，于25℃放置15分钟，于4℃离心10分钟；将上清转移到新的离心管中，加入0.5毫升异丙醇，于25℃放置15分钟，于4℃离心10分钟，其上清，加入70％的酒精漂洗1遍，溶于12ul水中。所有的离心速度为12000转/分钟。

4.3建立下列反应体系：

自步骤4.2的RNA               12ul

随机引物0.5ug/ul             3ul

混匀后，于65℃孵育5分钟，然后缓慢冷却到25℃，并放置10分钟然后加入

10X AffinityScript RT缓冲液  2.0ul

dNTP25mM                     0.8ul

Rnase抑制剂40u/ul            1.0ul

逆转录酶                     1.0ul

(购自Stratagene)

于42℃反应2小时。

4.4建立下列反应体系：

10X Pfu DNA聚合酶缓冲液      5.0ul

dNTP 2mM                     5.0ul

上游引物F2uM                 5.0ul

下游引物R2uM                 5.0ul

步骤4.2的cDNA                1.0ul

Pfu 2.5u/ul                  1.0ul

dH2O                         28.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃30秒，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。所有的引物组合的退火温度均为55℃，延伸时间根据扩增片断的长度而定，500bp以内，30秒，1000bp以内，60秒，2000bp以内，2分钟。

4.5将PCR产物，分别用NarI和XhoI，或BssHII和XhoI进行酶切，回收片断备用。

4.6合成下列DNA片断及其互补片断：

4.6.1F Gga TCTAGA gaa ATCGATgaa ACGCGT gaaGTCGAC gaa ccatgg gga

4.6.1R tccCCATGGttcGTCGACttcACGCGTttcATCGATttcTCTAGAtcC将等摩尔的片断4.6.1F和片断4.6.1R混合，并分别用XbaI和NcoI酶切，回收片断备用。

4.7将pSZTC1011和pSZTC1012分别用XbaI和NcoI酶切，并与步骤4.6所得的片断连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1013和pSZTC1014.

4.8将pSZTC1013和pSZTC1014分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.1F和4.1.1R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1111和pSZTC1112；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.2F和4.1.2R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1113和pSZTC1114；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.3F和4.1.3R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1115和pSZTC1116；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.4F和4.1.4R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1117和pSZTC1118；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.5F和4.1.5R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1119和pSZTC1120；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.6F和4.1.6R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1121和pSZTC1122；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.7F和4.1.7R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1123和pSZTC1124；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.8F和4.1.8R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1125和pSZTC1126；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.9F和4.1.9R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1127和pSZTC1128.

4.9将pSZTC1013和pSZTC1014分别用KpnI和EcoRI酶切，然后再与4.1.8F和4.1.8R的引物对扩增的KpnI和EcoRI酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1129和pSZTC1130；将pSZTC1129和pSZTC1130分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.10F和4.1.10R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1131和pSZTC1132；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.11F和4.1.11R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1133和pSZTC1134；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.12F和4.1.12R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1135和pSZTC1136；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.13F和4.1.13R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1137和pSZTC1138；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.14F和4.1.14R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1139和pSZTC1140；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.15F和4.1.15R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1141和pSZTC1142；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.9F和4.1.9R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1143和pSZTC1144。

4.10将pSZTC1013和pSZTC1014分别用KpnI和EcoRI酶切，然后再与4.1.12F和4.1.12R的引物对扩增的KpnI和EcoRI酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1145和pSZTC1146；将pSZTC1145和pSZTC1146分别用MluI和SalI酶切，分别与4.1.16F和4.1.16R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1147和pSZTC1148；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.17F和4.1.17R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1149和pSZTC1150；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.18F和4.1.18R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1151和pSZTC1152；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与4.1.13F和4.1.13R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1151和pSZTC1152.

4.11用NotI酶切pSZTC1127和pSZTC128，pSZTC 1143和pSZTC1144，和pSZTC1151和pSZTC1152，回收6.3kb，7.8kb和5.3kb的片断备用。

5.法氏囊病病毒所有蛋白编码基因的克隆

5.1根据法氏囊病毒所有蛋白编码基因序列，设计下列引物：

5.1.1.F VP1FNarI gga GGCGCC ATGAGT GAC ATT TTC AAC AGT CCA

5.1.1R VP1RKpnI BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT cACTCAG GTA CCC TGG TTG T 1664bp

5.1.2FVP1F1KpnI NarI gatcc GGCGCC CA ACC AGG GTA CCT GAG Tg

5.1.2R VP1R1BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT CTA TTGGCG GCT CTC TTT TTG 997bp

5.1.3F VP2FNarI gga GGCGCC ATG ACAAAC CTG CAA GAT CAAACC

5.1.3R VP2R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TTA GAAGCC AAA TGC TCC TGC 1335bp

5.1.4F VP3FNarI gga GGCGCC CGT TTC CCT CAC AAT CCA CG

5.1.4R VP3R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT CTC AAGGTC CTC ATC AGA GAC AG 870bp

5.1.5F VP5FNarI gga GGCGCC ATG GTT AGT AGA GAT CAG ACA AAC GAT

5.1.5R VP5R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TCA CTCAGG CTT CCT TGG AA 438bp

5.1.6F VP4FBssHII gga GGCGCC GGA GGA TAG CTG TGC CG

5.1.6R VP4RRI BssHIIMluIClaI gga gaattc GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATTTT GAT GAA CGT TGC CCA GTTG 812bp

5.2将1毫升TRIzol RNA分离试剂(购自Invitrogen)加入500羽冻干的传染性支气管炎疫苗中，震荡混匀，加入0.2毫升氯仿，混匀，于25℃放置15分钟，于4℃离心10分钟；将上清转移到新的离心管中，加入0.5毫升异丙醇，于25℃放置15分钟，于4℃离心10分钟，其上清，加入70％的酒精漂洗1遍，溶于12ul水中。所有的离心速度为12000转/分钟。

5.3建立下列反应体系：

自步骤5.2的RNA    12ul

随机引物0.5ug/ul  3ul

混匀后，于65℃孵育5分钟，然后缓慢冷却到25℃，并放置10分钟然后加入

10X AffinityScript RT缓冲液  2.0ul

dNTP25mM                     0.8ul

Rnase抑制剂40u/ul            1.0ul

逆转录酶                     1.0ul

(购自Stratagene)

于42℃反应2小时。

5.4建立下列反应体系：

10X Pfu DNA聚合酶缓冲液      5.0ul

dNTP 2mM                     5.0ul

上游引物F2uM                 5.0ul

下游引物R2uM                 5.0ul

步骤4.2的cDNA                1.0ul

Pfu 2.5u/ul                  1.0ul

dH2O                         28.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃30秒，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。所有的引物组合的退火温度均为55℃，延伸时间根据扩增片断的长度而定，500bp以内，30秒，1000bp以内，60秒，2000bp以内，2分钟。

5.5将PCR产物，分别用NarI和BssHII进行酶切，回收片断备用。

5.6将pSZTC1013和pSZTC1014分别用ClaI和MluI酶切，分别与5.1.1F和5.1.1R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC

1211和pSZTC1212；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与5.1.2F和5.1.2R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1213和pSZTC1214；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与5.1.3F和5.1.3R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1215和pSZTC1216；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与5.1.4F和5.1.4R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1217和pSZTC1218；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与5.1.5F和5.1.5R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1219和pSZTC1220；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与5.1.6F和5.1.6R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1221和pSZTC1222.

5.7将pSZTC 1221和pSZTC1222用NotI酶切，回收6.1kb的片断备用。

6.新城疫病病毒所有蛋白编码基因的克隆

6.1根据新城疫病毒所有蛋白编码基因序列，设计下列引物：

6.1.1F FusionProteinFNarI gga GGCGCC ATG GGC TCC AGA CCT TCT A

6.1.1R FusionProteinRBclI BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATgaattc ATCGAT GCC AGT GAT CAG GCC ACT 814bp A

6.1.2F FusionProteinF1BclINarI ggatcc gtcgacAGTG GCC TGATCACTG GC

6.1.2R FusionProteinR BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TCATGT TTTTGT GGT GGC TCT C 867bp

6.1.3F MatrixProtein FNarI gga GGCGCC ATG GAC TCA TCC AGG ACA ATC

6.1.3R MatrixProteinR BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATCTA TTT CTT GAA AGG GTT GTATTT AGC AAT G 1095bp

6.1.4F Nucleoprotein FNarI gga GGCGCC ATG TCG TCT GTA TTTGAC GAATAC G

6.1.4R NucleoproteinR BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATTCA GTA CCC CCA GTC AGT G 1470bp

6.1.5F PhosphoproteinFNarIKpnI gga GGCGCC GGTACC ATG GCC ACCTTTACA GAC G

6.1.5R PhosphoproteinR BssHIIMluIClaIEcoRI gga GCGCGC ACGCGT gaaATCGAT gaattc TTA ACC ATT CAA CGC AAG GCG 1188bp

6.1.6F RNAPolyFNarI gga GGCGCC ATG GCG GGCT CC G

6.1.6R RNAPolyRAgeI BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATGAT TCT GTT CTA AAC CGG TGA ATA TGG T 1046bp

6.1.7F RNAPolyF1AgeINarI gga GGCGCC ACCAT ATT CAC CGGTTT AGA ACAGAA TC

6.1.7R RNAPolyR1PflMI BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATGGC CCA TCA GTT GGT TGA TGgc 982bp

6.1.8F RNAPolyF2PflMINarI gga GGCGCC CAT CAA CCA ACT GAT GGG CC

6.1.8R RNAPolyR2SalI BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATTTG TTG TGT CGA CAA GCC C 1204bp

6.1.9F RNAPolyF3SalINarI gga AACGTTGGG CTT GTC GAC ACA ACA A

6.1.9R RNAPolyR3BtgII BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT GGAAAC CAC GGA CTG ACC 1128bp

6.1.10F  HAFNarI gga GGCGCC ATG GAT CAT GTA GTC AGC AGA GTT

6.1.10R HARBHI XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGATCAG CAC CGG ATC CTC Gcc 1165bp

6：1.11F HAF1BHINarI gga GGCGCC ggCGA GGA TCC GGT GCT G

6.1.11R HAR XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT TTA AAC CCTGTC TTC CTT GAG GA 570bp

6.1.12F RNAPolyF4BgtINarI gga GGCGCC GGT CAG TCC GTG GTTTCC

6.1.12R RNAPolyR4BclI XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT CATACA ATA CTT TGA TGA TCA CGA CCCc 1489bp

6.1.13F RNAPolyF5BclIBssHII gga GCGCGC GGG TCG TGA TCA TCA AAG TATTGT ATG

6.1.13R RNAPolyR5XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTAGGA ATC GTT ACA GCT ATA ATA TCC CTT 882bp

6.2将1毫升TRIzol RNA分离试剂(购自Invitrogen)加入500羽冻干的传染性支气管炎疫苗中，震荡混匀，加入0.2毫升氯仿，混匀，于25℃放置15分钟，于4℃离心10分钟；将上清转移到新的离心管中，加入0.5毫升异丙醇，于25℃放置15分钟，于4℃离心10分钟，其上清，加入70％的酒精漂洗1遍，溶于12ul水中。所有的离心速度为12000转/分钟。

6.3建立下列反应体系：

自步骤6.2的RNA    12ul

随机引物0.5ug/ul  3ul

混匀后，于65℃孵育5分钟，然后缓慢冷却到25℃，并放置10分钟然后加入

10X AffinityScript RT缓冲液 2.0ul

dNTP 25mM                   0.8ul

Rnase抑制剂40u/ul           1.0ul

逆转录酶                    1.0ul

(购自Stratagene)

于42℃反应2小时。

6.4建立下列反应体系：

10X Pfu DNA聚合酶缓冲液     5.0ul

dNTP 2mM                    5.0ul

上游引物F2uM                5.0ul

下游引物R2uM                5.0ul

步骤6.3的cDNA               1.0ul

Pfu 2.5u/ul                 1.0ul

dH2O                        28.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃30秒，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。所有的引物组合的退火温度均为55℃，延伸时间根据扩增片断的长度而定，500bp以内，30秒，1000bp以内，60秒，2000bp以内，2分钟。

6.5将PCR产物，分别用NarI和BssHII或NarI和XhoI，BssHII和XhoI进行酶切，回收片断备用。

6.6将pSZTCl013和pSZTC1014分别用ClaI和MluI酶切，分别与6.1.1F和6.1.1R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1311和pSZTC1312；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与6.1.2F和6.1.2R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1313和pSZTC1314；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与6.1.3F和6.1.3R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1315和pSZTC1316；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与6.1.4F和6.1.4R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1317和pSZTC1318；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与6.1.5F和6.1.5R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1319和pSZTC1320；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与6.1.6F和6.1.6R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1321和pSZTC1322；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与6.1.7F和6.1.7R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC pSZTC1323和pSZTC1324.

6.7将pSZTC1013和pSZTC1014分别用KpnI和EcoRI酶切，然后再与用KpnI和EcoRI酶切的6.1.5F和6.1.5R的引物对扩增的PCR产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1325和pSZTC1326；然后再与6.1.8F和6.1.8R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1327和pSZTC1328；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与6.1.9F和6.1.9R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1329和pSZTC1330；然后再分别用ClaI和XhoI酶切，分别与6.1.10F和6.1.10R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1331和pSZTC1332；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与6.1.11F和6.1.11R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1333和pSZTC1334；然后再分别用XhoI和MluI酶切，分别与6.1.12F和6.1.12R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1335和pSZTC1336；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与6.1.6F和6.1.6R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC pSZTC1337和pSZTC1338.

6.8将pSZTC 1323和pSZTC1324，及pSZTC1337和pSZTC1338用NotI酶切，回收7.3kb和4.6kb的片断备用。

7.禽流感病毒所有蛋白编码基因的克隆

7.1根据禽流感病毒所有蛋白编码基因序列，设计下列引物：

7.1.1F HAFNarI gga GGCGCC ATG GAAATAATA GCA CTAATA GCT ATA CTG TTA G

7.1.1R HARMfeIBssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TAC TACGCA ATTGCC ATTGTTCAG 865bp

7.1.2F HAF1MfeNarI gga GGCGCC CTG AAC AAT GGC AAT TGC GTA GTA

7.1.2R HAR1BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TTA TAT ACAAAT GTT GCA TCT GCA AGA C 843bp

7.1.3F Matrix1FNarI gga GGCGCC ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC G

7.1.3R Matrix1R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATTTA CTCCAG CTC TAT GTTGAC AAA ATG 294bp

7.1.4F Matrix2FNarIKpnI gga GGCGCC GGTACC  ATG AGT CTT CTA ACCGAG GTC G

7.1.4R Matrix2R BssHIIMluIClaIEcoRI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT gaattc TCA CTT GAA TCG CTG CAT TTG C 759bp

7.1.5F NAFNarI gga GGCGCC ATG AAT CCA AAT CAG AAG ATA ATA ACA ATTGGC

7.1.5R NAR BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TTA TAT AGGCAT GAA ATT GAT ATT CGC CC 1410bp

7.1.6F NS1FNarI gga GGCGCC ATG GAT TCC AAC ACT GTG TCA AG

7.1.6R NS1R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TCA AACT TCTGA CTC AAT TGT TCT CG 693bp

7.1.7F NS2FNarI gga GGCGCC ATG GAT TCC AAC ACT GTG TCA AG

7.1.7R NS2R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATTTA AAT AAGCTG AAA CGA GAA AGT TCT TAT CTC 366bp

7.1.8F Nucleoprotein FNarI gga GGCGCC ATG GCG TCT CAA GGC AC

7.1.8R NucleoproteinR BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATTTAATT GTC ATA CTC CTC TGC A TTGTC 1497bp

7.1.9F PolyAcid FNarI gga GGCGCC ATG GAA GACTTTGTG CGA CAA TG

7.1.9R PolyAcidRBamHI BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATTCA CTTTGG ATC CAG CTT GCT Ag 1230bp

7.1.10F PolyAcidF1BamHINarI gga GGCGCC cTAG CAA GCT GGA TCC AAAGTG A

7.1.10R PolyAcid R1BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT CTACTT CAG TGC ATG TGT GAG G 945bp

7.1.11F PolyBasic1FNarI gga GGCGCC ATG GAT GTC AAC CCG ACT TTG

7.1.11R PolyBasic1R SpeIBssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATtTGA TCC CAA CTA GTT TGC AAG T 1428bp

7.1.12F PolyBasic1F1SpeINarI gga GGCGCC ACTT G CAA ACT AGT TGG GATCAa

7.1.12R PolyBasic1R1BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TCACTA TTT TTG CCG TCT GAG C 873bp

7.1.13F PolyBasic2FNa rI gga GGCGCC ATG GAG AGA ATA AAA GAATTA AGAGAT CTA ATG TC

7.1.13R PolyBasic2REcoRI BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATACC ATT GTG AAT TCC TCA TAC CC 1097bp

7.1.14F PolyBasic2EcoRIF1NarI gga GGCGCC GGG TAT GAG GAATTC ACAATG GT

7.1.14R PolyBasic2R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT CTAATTGAT GGC CAT CCG AAT CC  1206bp

7.2将1毫升TRIzol RNA分离试剂(购自Invitrogen)加入500羽冻干的传染性支气管炎疫苗中，震荡混匀，加入0.2毫升氯仿，混匀，于25℃放置15分钟，于4℃离心10分钟；将上清转移到新的离心管中，加入0.5毫升异丙醇，于25℃放置15分钟，于4℃离心10分钟，其上清，加入70％的酒精漂洗1遍，溶于12ul水中。所有的离心速度为12000转/分钟。

7.3建立下列反应体系：

自步骤7.2的RNA              12ul

随机引物0.5ug/ul            3ul

混匀后，于65℃孵育5分钟，然后缓慢冷却到25℃，并放置10分钟然后加入

10X AffinityScript RT缓冲液     2.0ul

dNTP25mM                        0.8ul

Rnase抑制剂40u/ul               1.0ul

逆转录酶                        1.0ul

(购自Stratagene)

于42℃反应2小时。

7.4建立下列反应体系：

10XPfuDNA聚合酶缓冲液           5.0ul

dNTP 2mM                        5.0ul

上游引物F2uM                    5.0ul

下游引物R2uM                    5.0ul

步骤7.3的cDNA                   1.0ul

Pfu 2.5u/ul                     1.0ul

dH2O                            28.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃30秒，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。所有的引物组合的退火温度均为55℃，延伸时间根据扩增片断的长度而定，500bp以内，30秒，1000bp以内，60秒，2000bp以内，2分钟。

7.5将PCR产物，分别用NarI和BssHII进行酶切，回收片断备用。

7.6将pSZTC1013和pSZTC1014分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.1F和7.1.1R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1411和pSZTC1412；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.2F和7.1.2R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1413和pSZTC1414；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.3F和7.1.3R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1415和pSZTC1416；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.4F和7.1.4R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1417和pSZTC1418；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.5F和7.1.5R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1419和pSZTC1420；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.6F和7.1.6R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1421和pSZTC1422；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.7F和7.1.7R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1423和pSZTC1424；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.8F和7.1.8R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1425和pSZTC1426。

7.7将pSZTC1013和pSZTC1014分别用KpnI和EcoRI酶切，分别与7.1.4F和7.1.4R引物对扩增的PCR Kpn和EcoRI酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1427和pSZTC1428；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.9F和7.1.9R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1429和pSZTC1430；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.10F和7.1.10R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZT1431和pSZTC1432；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.11F和7.1.11R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZT1433和pSZTC1434；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.12F和7.1.12R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZT1435和pSZTC1436；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.13F和7.1.13R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZT1437和pSZTC1438；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.14F和7.1.14R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZT1439和pSZTC1440；然后再分别用ClaI和MluI酶切，分别与7.1.5F和7.1.5R的引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1441和pSZTC1442。

7.9将pSZTC1425和pSZTC1426，及pSZTC 1441和pSZTC142用NotI酶切，回收6.7kb和7.9kb的片断备用。

8.马立克氏病毒部分抗原的克隆

8.1根据马立克氏病毒的基因序列，设计下列引物：

8.1.1F MD25FBssHII gga GCGCGC ATG GAT ACT GAA TCA AAA AAC AAA AAAACGACC

8.1.1R MD25R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT CTA GTTCCA TAA CAA CAAATC AGC CGT 1542bp

8.1.2F MD28FBssHII gga GCGCGC ATG ACT ACG CAG AGA CTG AAG ATA CC

8.1.2R MD28R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGTTCA TAC GAC GTT GGG CTG TC 1083bp

8.1.3F MD29FBssHII gga GCGCGC ATG GAG GCG CAT ATA GAAAGC G

8.1.3R MD29RXhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TCA CATATA CAC CTC TGAAAC GTAAGG T 2190bp

8.1.4F MD36FBssHII gga GCGCGC ATG TCG GAG CCA CAA TCG TG

8.1.4R MD36RXhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA CATAGC CAT CTC TTT ATT ATA GGC TAG TAC ATC 1059bp

8.1.5F MD37FBssHII gga GCGCGCATG GCAAAC TTTATT TGG GAC GCG

8.1.5R MD37R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA CAACGTAGATATTAATTT CGGAATATACCC CAG 1752bp

8.1.6F MD38FBssHII gga GCGCGCATGAAT CCG GCC GAC CAT C

8.1.6RMD38R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA TTGATG CGC CAT CAT TTGATTAATAAATAC ATC 1992bp

8.1.7F MD39FBssHII gga GCGCGCATGAACACT CAATCT TCT CGC CC

8.1.7R MD39R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA TTGATG CGC CAT CAT TTG ATT AAT AAA TAC ATC 1038bp

8.1.8F MD51FBssHII gga GCGCGCATGAAACCACTC TTACGATCG CAC

8.1.8R MD51R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA ATAACA TTC GAT CCA TGT ACC TAT ATT CCAAAT T 1413bp

8.1.9F MD53FBssHII gga GCGCGC ATG AGC GGC CCT CCG

8.1.9R MD53R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA AAGATC GTT TGA CAC GCT TCC A 1032bp

8.1.10F MD55F BssHII gga GCGCGCATG GCAGGAATAACTATG GGCAG

8.1.10R MD55R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT

TCATTG GTT GATAAC TTT GGC AAG TTT CC 1110bp

8.1.11F MD68FBssHII gcga GCGCGC ATG TCT GTA GAT GCA TTC TCT CGC

8.1.11R MD68R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA CATACC AAA CAG AGTATT GCA GTAAAAATA CC 1422bp

8.1.12F MD83F BssHIIKpnI gga GCGCGC GGTACCATG TAC CCGATT GTC CGG C

8.1.12R MD83R XhoISalIMluI EcoRI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGTgaattc

TCA GCA CAT CGAAAT TTC CGC A 339bp

8.1.13F MD99FBssHII gga GCGCGC ATG TTT GCC TAC AGG GCT TTG G

8.1.13R MD99R XhoISalIMluI gga CT CGAG GTCGAC gaattc ACGCGT CTA ATGTTC TCG ATC CCC CCC  303bp

8.1.14F MD101FBssHIIKpnI gga GCGCGC GGTACC ATG GTA TTC AAG TAT TTGTTTACT GGG CAT

8.1.14R MD101R XhoISalIMluIRI  gga CT CGAG GTCGAC gaattc ACGCGTgaattc TTA GGC CAT GCT CCAATA CCA G 285bp

8.1.15F MD102FBssHII gga GCGCGC ATG TCG GGAATA TCC CTTACT CCT G

8.1.15R MD102R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TCA CTGTGTTCTCGGTCC G 327bp

8.1.16F MD103FBssHII gcga GCGCGC ATG CGC GGT CAT GTA GAG G

8.1.16R MD103R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT CTA GTCCGA GAGACC TGC G 249bp

8.2向冻干的马立克氏疫苗中加入0.5毫升0.3摩尔的氯化钠0.1％SDS，然后加入蛋白酶K使其终浓度为40微克/毫升，于50℃孵育2小时；然后加入0.5毫升的苯酚，混匀，离心10分钟。将上清转移到新的离心管中，再加入0.5毫升酚/氯仿，混匀，离心10分钟。将上清转移到新的离心管中，加入50微升3摩尔的醋酸钠，1毫升无水酒精，离心10分钟，弃上清，加入1毫升70％的酒精，离心10分钟，弃上清。将沉淀悬浮到20微升水中，备用。

8.3建立下列反应体系：

10X PfuDNA聚合酶缓冲液       5.0ul

dNTP 2mM                     5.0ul

上游引物F 2uM                5.0ul

下游引物R2uM                 5.0ul

步骤8.2的DNA                 1.0ul

Pfu2.5u/ul                   1.0ul

dH2O                         28.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃30秒，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。所有的引物组合的退火温度均为55℃，延伸时间根据扩增片断的长度而定，500bp以内，30秒，1000bp以内，60秒，2000bp以内，2分钟。

8.4将PCR产物，分别用XhoI和BssHII进行酶切，回收片断备用。

8.5将pSZTC1013和pSZTC1014分别用MluI和SalI酶切，分别与8.1.9F和4.1.9R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC1511和pSZTC1512；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与8.1.10F和8.1.10R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1513和pSZTC1514；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与8.1.11F和8.1.11R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1515和pSZTC1516；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与8.1.12F和8.1.12R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1517和pSZTC1518；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与8.1.13F和8.1.13R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1519和pSZTC1520；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与8.1.14F和8.1.14R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1521和pSZTC1522；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与8.1.15F和8.1.15R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1523和pSZTC1524；然后再分别用ClaI和SalI酶切，分别与8.1.16F和8.1.16R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1525和pSZTC1526。

8.6将pSZTC1013和pSZTC1014分别用KpnI和EcoRI酶切，分别与8.1.12F和8.1.12R引物对扩增的PCR KpnI和EcoRI酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1527和pSZTC1528；然后再分别用MluI和SalI酶切，与8.1.1F和8.1.1R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1529和pSZTC1530；然后再分别用MluI和SalI酶切，与8.1.2F和8.1.2R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1531和pSZTC1532；然后再分别用MluI和SalI酶切，与8.1.3F和8.1.3R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1533和pSZTC1534；然后再分别用MluI和SalI酶切，与8.1.4F和8.1.4R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1535和pSZTC1536；然后再分别用MluI和SalI酶切，与8.1.13F和8.1.13R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1537和pSZTC1538.

8.7将pSZTC1013和pSZTC1014分别用KpnI和EcoRI酶切，分别与8.1.14F和8.1.14R引物对扩增的PCR KpnI和EcoRI酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1539和pSZTC1540；然后再分别用MluI和SalI酶切，与8.1.5F和8.1.5R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1541和pSZTC1542；然后再分别用MluI和SalI酶切，与8.1.6F和8.1.6R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1543和pSZTC1544；然后再分别用MluI和SalI酶切，与8.1.7F和8.1.7R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1545和pSZTC1546；然后再分别用MluI和SalI酶切，与8.1.8F和8.1.8R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1547和pSZTC1548；然后再分别用MluI和SalI酶切，与8.1.9F和8.1.9R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1549和pSZTC1550；然后再分别用MluI和SalI酶切，与8.1.15F和8.1.15R引物对扩增的PCR酶切产物连接，回收并将连接产物电转到大肠杆菌中，所获得的质粒称为pSZTC 1551和pSZTC1552.

8.8将pSZTC 1525和pSZTC1526，pSZTC 1537和pSZTC1538，pSZTC 1551和pSZTC1552用NotI酶切，回收5.4kb，6.4kb和6.6kb的片断备用.

9.杂交质粒的构建

pDS132是一种具有R6K复制起源的质粒，除非在细菌中具有噬菌体的抑制蛋白，该质粒会整合到细菌的染色体中。但该质粒仅有非常有限的酶切位点，特设计下列引物，以增加.限制性酶切位点：

9.1.1F pDS 132F gga GTCGAC GACGTCTTAGCActgcag cacaaattgttatccgctcacaat

9.1.1R pDS 132R gga GTCGAC TGGAAGAAGCAGACCGCTAACA 4859bp

建立下列反应体系：

10XPfuDNA聚合酶缓冲液      5.0ul

dNTP 2mM                   5.0ul

9.1.1F 2uM                 5.0ul

9.1.1R 2uM                 5.0ul

pDS 132DNA 10ng/ul         1.0ul

Pfu 2.5u/u1                1.0ul

dH2O                       28.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃6分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。

将PCR产物用SalI酶切，连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1611.

10.鼠伤寒杆菌RfaH基因定向插入的同源序列的构建

10.1根据鼠伤寒杆菌RfaH基因序列，设计下列引物：

10.1.1F RfaHUp SalI gga GTCGACcgtttcgtcggcatattcagcact

10.1.1R RfaHDn ttcaaatgcgccttccgtgaTGAT GCGGCCGC ttgcccgcgtttgcagtacagtaa 595bp

10.1.2F RfaHUp1GCGGCCGC ATCAtcacggaaggcgcatttgaa

10.1.2R RfaDn1PstI gga CTGCAG tttcaggcgcagctacaaattgcc 604bp

10.2建立下列反应体系：1.扩增RfaH上游片断

10X Pfu DNA聚合酶缓冲液        5.0ul

dNTP 2mM                       5.0ul

10.1.1F SalI 2uM               5.0ul

10.1.1R 2uM                    5.0ul

鼠伤寒杆菌染色体DNA 10ng/ul    1.0ul

Pfu2.5u/ul                     1.0ul

dH2O                           28.0ul

和2.扩增RfaH下游片断

10X Pfu DNA聚合酶缓冲液        5.0ul

dNTP 2mM                       5.0ul

10.1.2F 2uM                    5.0ul

10.1.2RPstI 2uM                5.0ul

鼠伤寒杆菌染色体DNA 10ng/ul    1.0ul

Pfu2.5u/ul                     1.0ul

dH2O                           28.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃1分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。回收上游片断和下游片断，洗脱于50微升水中。

10.3建立下列反应体系，以获得RfaH上游和下游片断连接在一起的PCR片断。

10XPfuDNA聚合酶缓冲液          5.0ul

dNTP 2mM                       5.0ul

10.1.1F SalI 2uM               5.0ul

10.1.2R PstI 2uM           5.0ul

RfaH上游片断               3.0ul

RfaH下游片断               3.0ul

Pfu 2.5u/ul                1.0ul

dH2O                       23.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃2分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。用SalI和PstI酶切PCR片断，并与相同酶处理的pSZTC1611连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1612。

10.4将pSZTC1612用NotI酶切处理，并分别与pSZTC1127和1128的NotI酶切所回收的片断连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1613和1614。

10.5将pSZTC1611用NotI酶切处理，并分别与pSZTC1143，1144，1151和1152的NotI酶切所回收的片断连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1615，1616，1617和1618。

11.鼠伤寒杆菌AroA基因定向插入的同源序列的构建

11.1根据鼠伤寒杆菌AroA基因序列，设计下列引物：

11.1.1F AroAUpAatII gga GACGTC atctgttaggcaaggcgcatgaga

11.1.1R AroADn gaccagtgagaagcacatcgCCATgggttgtaacgtcagggattccat 547bp

11.1.2F AroAUp1ATGGcgatgtgcttctcactggtc

11.1.2R AroADn1PstI gga CTGCAG ttgcgagagtgccctaaagagaca 699bp

11.2建立下列反应体系：1.扩增RfaH上游片断

10XPfuDNA聚合酶缓冲液       5.0ul

dNTP 2mM                    5.0ul

11.1.1F AatII 2uM           5.0ul

11.1.1R 2uM                 5.0ul

鼠伤寒杆菌染色体DNA 10ng/ul 1.0ul

Pfu 2.5u/ul                 1.0ul

dH2O                        28.0ul

和2.扩增RfaH下游片断

10XPfuDNA聚合酶缓冲液       5.0ul

dNTP 2mM                    5.0ul

11.1.2F 2uM                 5.0ul

11.1.2R PstI 2uM            5.0ul

鼠伤寒杆菌染色体DNA 10ng/ul 1.0ul

Pfu 2.5u/ul                 1.0ul

dH2O                        28.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃1分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。回收上游片断和下游片断，洗脱于50微升水中。

11.3建立下列反应体系，以获得AroA上游和下游片断连接在一起的PCR片断。

10XPfuDNA聚合酶缓冲液    5.0ul

dNTP 2mM              5.0ul

11.1.1F AatII 2uM     5.0ul

11.1.2R PstI 2uM      5.0ul

AroA上游片断          3.0ul

AroA下游片断          3.0ul

Pfu 2.5u/ul           1.0ul

dH2O                  23.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃2分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。用AatII和PstI酶切PCR片断，并与相同酶处理的pSZTC1611连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1620。

11.4将pSZTC1620用NotI酶切处理，并分别与pSZTC1221和1222的NotI酶切所回收的片断连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1621，1622。

12.鼠伤寒杆菌Cya基因定向插入的同源序列的构建

12.1根据鼠伤寒杆菌Cya基因序列，设计下列引物：

12.1.1F CyaUp SalI gga GTCGACtaacaaacagtcccttaccgccca

12.1.1R CyaDn tgacggcaatttcacctggtTGGTgaagcaaataccgctgggaacgtt 755bp

12.1.2F CyaUp 1ACCAaccaggtgaaattgccgtca

12.1.2R CyaDn1PstI gga CTGCAG taagaatgaagccgaggctgacca 549bp

12.2建立下列反应体系：1.扩增Cya上游片断

10XPfuDNA聚合酶缓冲液        5.0ul

dNTP 2mM                     5.0ul

12.1.1F SalI 2uM             5.0ul

12.1.1R 2uM                  5.0ul

鼠伤寒杆菌染色体DNA 10ng/ul  1.0ul

Pfu 2.5u/ul                  1.0ul

dH2O                         28.0ul

和2.扩增Cya下游片断

10XPfuDNA聚合酶缓冲液        5.0ul

dNTP 2mM                     5.0ul

12.1.2F 2uM                  5.0ul

12.1.2R PstI 2uM             5.0ul

鼠伤寒杆菌染色体DNA 10ng/ul  1.0ul

Pfu 2.5u/ul                  1.0ul

dH2O                         28.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃1分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。回收上游片断和下游片断，洗脱于50微升水中。

12.3建立下列反应体系，以获得Cya上游和下游片断连接在一起的PCR片断。

10XPfuDNA聚合酶缓冲液        5.0ul

dNTP 2mM                     5.0ul

12.1.1FSalI 2uM              5.0ul

12.1.2RPstI 2uM        5.0ul

CyaH上游片断           3.0ul

CyaH下游片断           3.0ul

Pfu 2.5u/ul            1.0ul

dH2O                   23.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃2分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。用SalI和PstI酶切PCR片断，并与相同酶处理的pSZTC1611连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1630。

12.4将pSZTC1630用NotI酶切处理，并分别与pSZTC1323和1324的NotI酶切所回收的片断连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1631和1632。

12.5将pSZTC1611用NotI酶切处理，并分别与pSZTC1337和1338的NotI酶切所回收的片断连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1633和1634。

13.伤寒杆菌PurD基因定向插入的同源序列的构建

13.1根据鼠伤寒杆菌PurD基因序列，设计下列引物：

13.1.1F PurDUp SalI gga GTCGACattatctcccgccagttcgtggaa

13.1.1R PurDDn ccagccaatgtcgttacggcTGAAaacagtatcaaccagcggcgactg 686bp

13.1.2F PurDUp 1TTCAgccgtaacgacattggctgg

13.1.2R PurDDn1PstI gga CTGCAG tgtggatgttcggttaattgccgc 558bp

13.2建立下列反应体系：1.扩增PurD上游片断

10X Pfu DNA聚合酶缓冲液         5.0ul

dNTP 2mM                        5.0ul

13.1.1F SalI 2uM                5.0ul

13.1.1R 2uM                     5.0ul

鼠伤寒杆菌染色体DNA 10ng/ul     1.0ul

Pfu 2.5u/ul                     1.0ul

dH2O                            28.0ul

和2.扩增PurD下游片断

10XPfuDNA聚合酶缓冲液           5.0ul

dNTP 2mM                        5.0ul

13.1.2F 2uM                     5.0ul

13.1.2R PstI 2uM                5.0ul

鼠伤寒杆菌染色体DNA 10ng/ul     1.0ul

Pfu 2.5u/ul                     1.0ul

dH2O                            28.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃1分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。回收上游片断和下游片断，洗脱于50微升水中。

13.3建立下列反应体系，以获得PurD上游和下游片断连接在一起的PCR片断。

10XPfuDNA聚合酶缓冲液         5.0ul

dNTP 2mM                      5.0ul

13.1.1F SalI 2uM              5.0ul

13.1.2R PstI 2uM       5.0ul

PurD上游片断           3.0ul

PurD下游片断           3.0ul

Pfu 2.5u/ul            1.0ul

dH2O                   23.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃2分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。用SalI和PstI酶切PCR片断，并与相同酶处理的pSZTC1611连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1640。

13.4将pSZTC1640用NotI酶切处理，并分别与pSZTC1425和1426，1441和1442的NotI酶切所回收的片断连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1641和1642。

13.5将pSZTC1611用NotI酶切处理，并分别与pSZTC1441和1442的NotI酶切所回收的片断连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1643和1644。

14.鼠伤寒杆菌Asd基因定向插入的同源序列的构建

14.1根据鼠伤寒杆菌Asd基因序列，设计下列引物：

14.1.1F AsdUpSalI gga GTCGAC tccaactgctgagctgagtcttgt

14.1.1RAsdDn gatatcacgatcgttcggcaCCACttgcatgagaacagagccgaccat 498bp

14.1.2F AsdUp1GTGGtgccgaacgatcgtgatatc

14.1.2R AsdDn1PstI gga CTGCAG tctggtgcattccgagtacggaaa 629bp

14.2建立下列反应体系：1.扩增Asd上游片断

10XPfuDNA聚合酶缓冲液         5.0ul

dNTP 2mM                      5.0ul

14.1.1F SalI 2uM              5.0ul

14.1.1R 2uM                   5.0ul

鼠伤寒杆菌染色体DNA 10ng/ul   1.0ul

Pfu 2.5u/ul                   1.0ul

dH2O                          28.0ul

和2.扩增Asd下游片断

10XPfuDNA聚合酶缓冲液         5.0ul

dNTP 2mM                      5.0ul

14.1.2F 2uM                   5.0ul

14.1.2R PstI 2uM              5.0ul

鼠伤寒杆菌染色体DNA 10ng/ul   1.0ul

Pfu 2.5u/ul                   1.0ul

dH2O                          28.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃1分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。回收上游片断和下游片断，洗脱于50微升水中。

14.3建立下列反应体系，以获得Asd上游和下游片断连接在一起的PCR片断。

10X Pfu DNA聚合酶缓冲液     5.0ul

dNTP 2mM                    5.0ul

14.1.1F SalI 2uM            5.0ul

14.1.1R PstI 2uM            5.0ul

Asd上游片断            3.0ul

Asd下游片断            3.0ul

Pfu 2.5u/ul            1.0ul

dH2O                   23.0ul

94℃2分钟，然后94℃15秒，55℃15秒，72℃2分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。用SalI和PstI酶切PCR片断，并与相同酶处理的pSZTC1611连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1650。

14.4将pSZTC1650用NotI酶切处理，并分别与pSZTC1525和1526的NotI酶切所回收的片断连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1651和1652。

14.5将pSZTC1611用NotI酶切处理，并分别与pSZTC1537，1538，1551和1552的NotI酶切所回收的片断连接，回收连接产物并转到大肠杆菌(DH5αλpir)中，于氯霉素的培养基上生长，并制备相应的质粒，称之为pSZTC1653，1654，1655和1656.

15.带有传染性气管炎病毒所有蛋白编码基因并在其两侧有rfaH基因同源序列的大肠杆菌与鼠伤寒杆菌的杂交及其鉴定

15.1将鼠伤寒杆菌涂在LB培养基上，将含有pSZTC1613和1614的大肠杆菌(DH5αλpir)于氯霉素培养基上于37℃过夜生长。

15.2于第2天，从过夜的培养基上刮少许，重新涂抹在相应的培养基上，于37℃培养3-4小时，然后将二种细菌涂抹在LB培养基上，尽量将二种细菌涂匀使其混杂在一起，于37℃过夜培养完成杂交过程。

15.3将步骤15.2的菌落涂抹在LB/氯霉素培养基上，于37℃过夜培养获得单个菌落。

15.4将步骤15.3所获得的耐氯霉素的菌落在LB液体培养基中生长，每12小时，取5微升加入到新的LB液体培养基中生长，重复5次。

15.5将步骤15.4最后一步所得的细菌涂抹在LR培养基上。于37℃过夜培养获得单个菌落。

15.6将步骤15.5所获得的单个菌落分别涂抹在LB/培养基和LB/5％蔗糖的培养基上。在5％的蔗糖上不生长的菌落为可能的阳性产物。

15.7用引物对4.1.5F和4.1.5R，对上述的可能的阳性产物进行菌落PCR，以鼠伤寒杆菌为对照，质粒pSZTC1613为阳性对照，阳性者出现249bp的条带。将阳性菌落命名为BSZTC 111和112.

15.8用BSZTC111和112及含有pSZTC1615和1616的大肠杆菌(DH5αλpir)重复步骤15.1至15.5的步骤，用引物对4.1.1F和4.1.1R，对上述的可能的阳性产物进行菌落PCR，以鼠伤寒杆菌为对照，质粒pSZTC1615为阳性对照，阳性者出现431bp的条带。将阳性菌落命名为BSZTC 113和114.

15.9用BSZTC113和114及含有pSZTC1617和1618的大肠杆菌(DH5αλpir)重复步骤15.1至15.5的步骤，用引物对4.1.17F和4.1.17R，对上述的可能的阳性产物进行菌落PCR，以鼠伤寒杆菌为对照，质粒pSZTC1617为阳性对照，阳性者出现838bp的条带。将阳性菌落命名为BSZTC115和116.

16.带有传染性支气管炎病毒所有蛋白编码基因的鼠伤寒杆菌与带有法氏囊病病毒所有蛋白编码基因并在其两侧带有AroA基因同源序列基因同源序列的大肠杆菌的杂交及其鉴定

用BSZTC115和116及含有pSZTC1621和1622的大肠杆菌(DH5αλpir)重复步骤15.1至15.5的步骤，用引物对5.1.5F和5.1.5R，对上述的可能的阳性产物进行菌落PCR，以鼠伤寒杆菌为对照，质粒pSZTC1621为阳性对照，阳性者出现438bp的条带。将阳性菌落命名为BSZTC117和118.

17.带有传染性支气管炎病毒和法氏囊病毒所有蛋白编码基因的鼠伤寒杆菌与带有新城疫病病毒所有蛋白编码基因并在其两侧带有Cya基因同源序列基因同源序列的大肠杆菌的杂交及其鉴定

17.1用BSZTC117和118及含有pSZTC1631和1632的大肠杆菌(DH5αλpir)重复步骤15.1至15.5的步骤，用引物对6.1.3F和6.1.3R，对上述的可能的阳性产物进行菌落PCR，以鼠伤寒杆菌为对照，质粒pSZTC1631为阳性对照，阳性者出现1095bp的条带。将阳性菌落命名为BSZTC 119和120.

17.2用BSZTC119和120及含有pSZTC1633和1634的大肠杆菌(DH5αλpir)重复步骤15.1至15.5的步骤，用引物对6.1.11F和6.1.11R，对上述的可能的阳性产物进行菌落PCR，以鼠伤寒杆菌为对照，质粒pSZTC1633为阳性对照，阳性者出现570bp的条带。将阳性菌落命名为BSZTC 121和122.

18.带有传染性支气管炎病毒、法氏囊病毒和新城疫病病毒所有蛋白编码基因的鼠伤寒杆菌与带有禽流感病病毒所有蛋白编码基因并在其两侧带有PurD基因同源序列基因同源序列的大肠杆菌的杂交及其鉴定

18.1用BSZTC121和122及含有pSZTC1641和1642的大肠杆菌(DH5αλpir)重复步骤15.1至15.5的步骤，用引物对7.1.3F和7.1.3R，对上述的可能的阳性产物进行菌落PCR，以鼠伤寒杆菌为对照，质粒pSZTC1641为阳性对照，阳性者出现294bp的条带。将阳性菌落命名为BSZTC 123和124.

18.2用BSZTC123和124及含有pSZTC1643和1644的大肠杆菌(DH5αλpir)重复步骤15.1至15.5的步骤，用引物对7.1.12F和7.1.12R，对上述的可能的阳性产物进行菌落PCR，以鼠伤寒杆菌为对照，质粒pSZTC1643为阳性对照，阳性者出现873bp的条带。将阳性菌落命名为BSZTC 125和126.

19.带有传染性支气管炎病毒、法氏囊病毒、新城疫病病毒和禽流感病毒所有蛋白编码基因的鼠伤寒杆菌与带有新城疫病病毒部分蛋白编码基因并在其两侧带有Asd基因同源序列的大肠杆菌的杂交及其鉴定

19.1用BSZTC125和126及含有pSZTC1651和1652的大肠杆菌(DH5αλpir)重复步骤15.1至15.5的步骤，但在所有的LB/培养基中加入二氨基庚二酸盐50微克/毫升。用引物对8.1.16F和8.1.16R，对上述的可能的阳性产物进行菌落PCR，以鼠伤寒杆菌为对照，质粒pSZTC1651为阳性对照，阳性者出现249bp的条带。将阳性菌落命名为BSZTC 127和128.

19.2用BSZTC127和128及含有pSZTC1653和1654的大肠杆菌(DH5αλpir)重复步骤15.1至15.5的步骤，但在所有的LB/培养基中加入二氨基庚二酸盐50微克/毫升，用引物对8.1.2F和8.1.2R，对上述的可能的阳性产物进行菌落PCR，以鼠伤寒杆菌为对照，质粒pSZTC1653为阳性对照，阳性者出现1083bp的条带。将阳性菌落命名为BSZTC 129和130.

19.3用BSZTC129和130及含有pSZTC1655和1656的大肠杆菌(DH5αλpir)重复步骤15.1至15.5的步骤，但在所有的LB/培养基中加入二氨基庚二酸盐50微克/毫升，用引物对8.1.7F和8.1.7R，对上述的可能的阳性产物进行菌落PCR，以鼠伤寒杆菌为对照，质粒pSZTC1655为阳性对照，阳性者出现1038bp的条带。将阳性菌落命名为BSZTC 131和132.

20.所获得的鼠伤寒杆菌可以作为单价、二价、三价、四价和五价疫苗用于上述病毒感染的预防。

21.

一种活菌多价疫苗的制备方法

1.1.1F PagCUp acggtgaactaatctgcctggctt

1.1.1R PagCDn tcggcctgtgcaacatttacaacc

1.1.2F PagCFKpnI gga GGTACC taatgggttttatagcgaaatagacttttttat

1.1.2R PagCRNsiI ggac ATGCAT caactccttaatactacttattatttacggt

2.1.1FSifBUp acatatttcatggccaggaggcgt

2.1.1R SifBDn aggtgggcagactgagtatcaaca

2.1.2F SifBFNdeI gga Cat atgccaattactatcgggagag

2.1.2R SifBRXbaI gga TCTAGA cttcgccatctttaatac

3.1.1F PBR322FNcoINotI gga ccatgg gcggccgcTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAA

3.1.1R PBR322RKpnI aaa ggtacc ACAGGTGCGGTTGCTGGC

3.1.2F PUC 19FKpnIRINsiINotI gga ggttacc gga gaattc atgcat gcggccgc CGCGCGTTGGCCGAT

3.1.2R

PUC 19RNcoIXbaINdeIggaccatggTCTAGAggacatatgAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTA TCC

4.1.1FLeaderProtein87FNarI gga GGCGCC AAC TTG AGT GCT CTT TTT CAA ATT GTTAAACA

4.1.1R LeaderProtein87RIR XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT CCA TATGCA AGCTTC CAG AAT TCA AA

4.1.2F LeaderProtein87RIF1NarI gga GGCGCC TTTG AAT TCT GGAAGC TTG CAT ATG G

4.1.2R LeaderProtein87R1XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT CTT GTGTAC AAT ACA TCC ATT ATA GAC GC

4.1.3FMembranePFNarI gga GGCGCC ATG CCC AAC GAG ACA AAT TGT AC

4.1.3RMembran PR XhoISalI ClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGATTTA TGT GTAAAG ACT ACT TCC TCC TGT T

4.1.4FNsp2FNarI gga GGCGCCGGT GAA TTC TAT GGT GGT TAT GTTGAT

4.1.4RNsp2R XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT AGT AGT GTG CACCAA CTC GA

4.1.5FNsp4FNarI gga GGCGCC TTA CTT TTC TCA ATG CT T AAG AAA ATA GATTCT G

4.1.5RNsp4R XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT TGT AGA AGT TGGGTG TAA CTC TGT

4.1.6FNsp5FNarI gga GGCGCC GGT AGT GGATTG ACA TAC TGT ATA AGT G

4.1.6RNsp5R XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT GTC AGG AGT AGGACT TGG CT

4.1.7FNsp6FNarI gga GGCGCC CAG GAT TCT TAT GGA GGA GCT TCT

4.1.7RNsp6R XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT ACA TCC ACT AGCAAG GGG TAT C

4.1.8FNsp7FNarIKpnI gga GGCGCC GGTACC GAT CCT GAT GTT GTA AAG CGAGC

4.1.8RNsp7R XhoISalIClaIRI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT GAATTC TTCTAT TGG GTC GTA CCA ATC CT

4.1.9FNsp9FNarI gga GGCGCC AAC TCA AAA TAT TAT GTC ATG TTG GCT AAAATG

4.1.9R Nsp9RxbaI XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT TCC TGT TCCTCT AGA CTC ATT TCA TAA TA

4.1.10FNsp9F1XbaINarI gga GGCGCC TATTATG AAA TGA GTC TAG AGG AACAGG A

4.1.10RNsp9R1NsiIXhoISalIClaI ggaCTCGAGGTCGACgaaATCGATgGTCCGTATGCATGACGTG

4.1.11FNsp9F2NsiINarI gga GGCGCC CA CGT CAT GCA TAC GGA Cc

4.1.11RNsp9R2XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT AAT GGC GGCCTG GTT TTT

4.1.12FNsp10FNarIKpnI gga GGCGCC GGTACCGAA TAG AAATTA TGT TTTCACAGGTTA TCA CTT TA

4.1.12RNsp 10RMfeI XhoISalIClaIEcoRI  gga  CTCGAG  GTCGAC  gaa  ATCGATGAATTCTTCA CAA ATT CCA ATT GTGTTG TGT TG

4.1.13FNsp10F1MfeINarI gga GGCGCC CA ACA CAA CAC AAT TGG AATTTGTGAA

4.1.13RNsp 10R XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT ACG TTG CATAGA TTG TCT GCT AAC

4.1.14FNsp11FNarI gga GGCGCC TTC AGA TTG TGT AGT GTTTGT CAC ATG

4.1.14RNsp 11R XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT AAC GCA CCATTA ACA CGC TTA TAA

4.1.15FNucleocapsidFNarI gga GGCGCC GGTACC ATG GCA AGC GGT AAA GCA

4.1.15RNucleocapsidR BspEI XhoISalIClaIRI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGATgaattc TCA AAG TTC ATT CTC TCC TAG AGC T

4.1.16FSpikeProteinFBssHII GGA GCGCGC ATG TTG GTA ACA CCT CTTTTA CTAGTG A

4.1.16RSpikeProteinRBsrGI XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaa ACGCGTCCA TAT TCA CCT TGT ACA ACA AAG ATG TC

4.1.17FSpikeProteinF1BsrgINarI  gga GGCGCC GAC ATC TTT GTT GTA CAAGGT GAA TAT GG

4.1.17RSpikeProteinR1H3XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT TAGTAT ACA AAG CTT GCA TTTCTG CTGt

4.1.18FSpikePoteinF2H3NarI gga GGCGCC aCAG CAG AAA TGC AAG CTT TGTATA CTA

4.1.18RS pikeProteinR2XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT TCA AACAGA CTT TT AGG TCT GTATTG TTC

4.6.1F Gga TCTAGA gaa ATCGATgaa ACGCGT gaaGTCGAC gaa ccatgg gga

4.6.1R tccCCATGGttcGTCGACttcACGCGTttcATCGATttcTCTAGAtcC

5.1.1.F VP1FNarI gga GGCGCC ATG AGT GAC ATT TTC AAC AGT CCA

5.1.1R VP1RKpnI BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT cACT CAGGTA CCC TGG TTG T

5.1.2FVP1F1KpnI NarI gatcc GGCGCC CA ACC AGG GTA CCT GAG Tg

5.1.2R VP1R1BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT CTA TTG GCGGCT CTC TTT TTG

5.1.3F VP2FNarI gga GGCGCC ATGACAAAC CTG CAA GAT CAAACC

5.1.3R VP2R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATTTA GAA GCCAAA TGC TCC TGC

5.1.4F VP3FNarI gga GGCGCC CGT TTC CCT CAC AAT CCA CG

5.1.4R VP3R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT CTC AAG GTCCTC ATC AGA GAC AG

5.1.5F VP5FNarI gga GGCGCC ATG GTTAGT AGA GAT CAG ACA AAC GAT

5.1.5R VP5R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TCA CTC AGGCTTCCT TGG AA

5.1.6F VP4FBssHII gga GGCGCC GGA GGA TAG CTG TGC CG

5.1.6R VP4RRI gga gaattc TTT GAT GAA CGT TGC CCA GTTG

6.1.1F FusionProteinFNarI gga GGCGCC ATG GGC TCC AGA CCT TCT A

6.1.1R FusionProteinRBclI  BssHIIMluIClaI  gga  GCGCGC ACGCGT gaa  ATCGATgaattc ATCGAT  GCC AGT GAT CAG GCC ACT

6.1.2F FusionProteinF1Bc1INarI ggatcc gtcgac AGTG GCC TGA TCA CTG GC

6.1.2R FusionProteinR BssHIIM luIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TCA TGTTTT TGT GGT GGC TCT C

6.1.3F MatrixProtein FNa rI gga GGCGCC ATG GAC TCA TCC AGG ACA ATC

6.1.3R MatrixProtein R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT CTATTT CTT GAA AGG GTT GTA TTT AGC AAT G

6.1.4F NucleoproteinFNarI gga GGCGCC ATG TCGT CT GTA TTTGAC GAA TAC G

6.1.4R NucleoproteinR BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TCAGTA CCC CCA GTC AGT G

6.1.5F PhosphoproteinFNarIKpnI gga GGCGCC GGTACC ATG GCC ACC TTT ACAGAC G

6.1.5R  PhosphoproteinR  BssHIIMluIClaIEcoRI  gga  GCGCGC  ACGCGT  gaaATCGAT gaattc TTA ACC ATT CAA CGC AAG GCG

6.1.6F RNAPolyFNarI gga GGCGCC ATG GCG GGCT CC G

6.1.6R RNAPolyRAgeI BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT GATTCT GTT CTA AAC CGG TGAATA TGG T

6.1.7F RNAPolyF1AgeINa rI gga GGCGCC ACCAT ATT CAC CGG TTT AGA ACAGAA TC

6.1.7R RNAPolyR1PflMI BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT GGCCCA TCA GTTGGT TGA TGgc

6.1.8F RNAPolyF2PflMINarI gga GGCGCC CAT CAA CCA ACT GAT GGG CC

6.1.8R RNAPolyR2SalI BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TTGTTG TGT CGA CAA GCC C

6.1.9F RNAPolyF3SalINarI gga AACGTTGGG CTT GTC GAC ACA ACA A

6.1.9R RNAPolyR3BtgII BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT GGA AACCAC GGA CTG ACC

6.1.10F  HAFNarI gga GGCGCC ATG GAT CAT GTA GTC AGC AGA GTT

6.1.10R HARBHI XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT CAG CAC CGGATC CTC Gcc

6.1.11F HAF1BHINarI gga GGCGCC ggCGA GGA TCC GGT GCT G

6.1.11R HARXhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT TTA AAC CCT GTCTTC CTT GAG GA

6.1.12F RNAPolyF4BgtINarI gga GGCGCC GGT CAG TCC GTG GTTT CC

6.1.12R RNAPolyR4BclI XhoISalIClaI gga CTCGAG GTCGAC gaa ATCGAT CAT ACAATA CTT TGA TGA TCA CGA CCCc

6.1.13F RNAPolyF5BclIBssHII gga GCGCGC GGG TCG TGA TCA TCA AAG TATTGT ATG

6.1.13R RNAPolyR5XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA GGAATC GTT ACA GCT ATA ATA TCC CTT

7.1.1F HAFNarIgga GGCGCC ATG GAAATAATA GCA CTAATA GCT ATA CTG TTA G

7.1.1R HARMfeIBssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TAC TAC GCAATTGCC ATT GTT CAG

7.1.2F HAF1MfeNarI gga GGCGCC CTG AAC AAT GGC AAT TGC GTA GTA

7.1.2R HAR1BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TTA TAT ACA AATGTT GCA TCT GCA AGA C

7.1.3F Matrix1FNarI gga GGCGCC ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC G

7.1.3RMatrix1R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TTA CTC CAGCTC TAT GTT GAC AAA ATG

7.1.4F Mat rix2FNarIKpnI gga GGCGCC GGTACC  ATG AGT CTT CTA ACC GAGGTC G

7.1.4R Matrix2R BssHIIMluIClaIEcoRIgga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGATgaa ttcTCA CTTGAA TCG CTG CAT TTG C

7.1.5F NAFNarI gga GGCGCC ATG AAT CCA AAT CAG AAG ATA ATA ACA ATT GGC

7.1.5R NAR BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGTgaa ATCGAT TTA TAT AGG CATGAA ATT GAT ATTCGC CC

7.1.6F NS1FNarI gga GGCGCC ATG GAT TCC AAC ACT GTG TCA AG

7.1.6R NS1R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TCA AACT TC TGACTC AAT TGTT CT CG

7.1.7F NS2FNarI gga GGCGCC ATG GAT TCC AAC ACT GTG TCA AG

7.1.7R NS2R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TTA AAT AAG CTGAAA CGA GAA AGT TCT TAT CTC

7.1.8F NucleoproteinFNarI gga GGCGCC ATG GCG TCT CAA GGC AC

7.1.8R NucleoproteinR BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TTA ATTGTC ATA CTC CTC TGC ATT GTC

7.1.9F PolyAcidFNarI gga GGCGCC ATG GAA GAC TTTGTG CGA CAA TG

7.1.9R PolyAcidRBam HI BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TCACTT TGG ATC CAG CTT GCT Ag

7.1.10F PolyAcidF1BamHINarI gga GGCGCC cTAG CAA GCT GGA TCC AAA GTG A

7.1.10R PolyAcidR1BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT CTA CTTCAG TGC ATG TGT GAG G

7.1.11F PolyBasic1FNarI gga GGCGCC ATG GAT GTC AAC CCG ACT TTG

7.1.11R PolyBasic1R SpeIBssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT tTGATCC CAA CTA GTT TGC AAG T

7.1.12F PolyBasic1F1SpeINarI gga GGCGCC ACTTG CAA ACT AGT TGG GAT CAa

7.1.12R PolyBasic1R1BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT TCA CTATTT TTG CCG TCT GAG C

7.1.13F PolyBasic2FNarI ggga GGCGCC ATG GAG AGA ATA AAA GAA TTA AGA GATCTA ATG TC

7.1.13R PolyBasic2REcoRI BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT ACCATT GTG AAT TCC TCA TAC CC

7.1.14F PolyBasic2EcoRIF1NarI gga GGCGCC GGG TAT GAG GAA TTC ACA ATGGT

7.1.14R PolyBasic2R BssHIIMluIClaI gga GCGCGC ACGCGT gaa ATCGAT CTA ATTGAT GGC CAT CCG AAT CC

8.1.1F MD25FBssHII gga GCGCGC ATG GAT ACT GAA TCA AAA AAC AAA AAA ACGACC

8.1.1R MD25RXhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT CTA GTT CCATAA CAA CAAATC AGC CGT

8.1.2F MD28FBssHII gga GCGCGC ATG ACT ACG CAG AGA CTG AAG ATA CC

8.1.2R MD28R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TCA TAC GACGTTGGGCTGTC

8.1.3F MD29FBssHII gga GCGCGC ATG GAG GCG CAT ATA GAAAGC G

8.1.3R MD29R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TCA CAT ATACAC CTC TGAAAC GTA AGG T

8.1.4F MD36FBssHII gga GCGCGC ATG TCG GAG CCA CAA TCG TG

8.1.4R MD36R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA CAT AGCCAT CTC TTTATTATA GGC TAG TAC ATC

8.1.5F MD37FBssHII gga GCGCGC ATG GCAAAC TTT ATT TGG GAC GCG

8.1.5R MD37R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA CAA CGTAGATATTAATTT CGGAATATACCC CAG

8.1.6F MD38FBssHII gga GCGCGC ATG AAT CCG GCC GAC CAT C

8.1.6RMD38R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA TTG ATGCGC CAT CATTTGATTAATAAATAC ATC

8.1.7F MD39FBssHIIgga GCGCGC ATG AAC ACT CAA TCT TCT CGC CC

8.1.7R MD39R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA TTG ATGCGC CAT CATTTGATTAATAAATACATC

8.1.8F MD51FBssHII gga GCGCGC ATG AAA CCA CTC TTA CGA TCG CAC

8.1.8R MD51RXhoISalIMluI gga CTCGAG GT CGAC gaattc ACGCGT TTA ATA ACATTC GAT CCA TGT ACC TAT ATT CCAAAT T

8.1.9F MD53FBssHII gga GCGCGC ATG AGC GGC CCT CCG

8.1.9R MD53R XhoISalIMluI gga CT CGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA AAG ATCGTTTGACAC GCTTCCA

8.1.10F MD55F BssHII gga GCGCGCATG GCA GGAATAACT ATG GGC AG

8.1.10R MD55RXhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TCA TTG GTTGATAAC TTT GGC AAG TTT CC

8.1.11F MD68FBssHII gga GCGCGC ATG TCT GTA GAT GCATTC TCT CGC

8.1.11R MD68R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TTA CAT ACCAAA CAG AGT ATT GCA GTA AAAATA CC

8.1.12F MD83F BssHIIKpnI gga GCGCGC GGTACCATG TAC CCGATT GTC CGG C

8.1.12R MD83R XhoISalIMluI EcoRI gga CT CGAG GTCGAC gaattc ACGCGT gaattcTCA GCA CAT CGAAAT TTC CGC A

8.1.13F MD99FBssHII gga GCGCGC ATG TTT GCC TAC AGG GCT TTG G

8.1.13R MD99R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT CTA ATG TTCTCGATC CCC CCC

8.1.14F MD101FBssHIIKpnI gga GCGCGC GGTACC ATG GTA TTC AAG TAT TTG TTTACT GGG CAT

8.1.14R MD101R XhoISalIMluIRI  gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT gaattcTTA GGC CAT GCT CCAATA CCA G

8.1.15F MD102FBssHII gga GCGCGC ATG TCG GGAATA TCC CTTACT CCT G

8.1.15R MD102R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT TCA CTG TGTTCTCGGTCCG

8.1.16F MD103FBssHII gga GCGCGC ATG CGC GGT CAT GTA GAG G

8.1.16R MD103R XhoISalIMluI gga CTCGAG GTCGAC gaattc ACGCGT CTA GTC CGAGAG ACC TGC G

9.1.1F pDS 132F  gga GTCGAC GACGTCTTAGCActgcag cacaaattgttatccgctcacaat

9.1.1R pDS 132R gga GTCGAC TGGAAGAAGCAGACCGCTAACA

10.1.1F RfaHUp SalI gga GTCGACcgtttcgtcggcatattcagcact

10.1.1R RfaHDn ttcaaatgcgccttccgtgaTGAT GCGGCCGC ttgcccgcgtttgcagtacagtaa

10.1.2F RfaHUp 1GCGGCCGC ATCAtcacggaaggcgcatttgaa

10.1.2R RfaDn 1PstI gga CTGCAG tttcaggcgcagctacaaattgcc

11.1.1F AroAUpAatII gga GACGTC atctgttaggcaaggcgcatgaga

11.1.1R AroADn gaccagtgagaagcacatcgCCATgggttgtaacgtcagggattccat

11.1.2F AroAUp 1ATGGcgatgtgcttctcactggtc

11.1.2R AroADn1PstI gga CTGCAG ttgcgagagtgccctaaagagaca

12.1.1F CyaUp SalI gga GTCGACtaacaaacagtcccttaccgccca

12.1.1R CyaDn tgacggcaatttcacctggtTGGTgaagcaaataccgctgggaacgtt

12.1.2F CyaUp 1ACCAaccaggtgaaattgccgtca

12.1.2R CyaDn1PstI gga CTGCAG taagaatgaagccgaggctgacca

13.1.1F PurDUp SalI gga GTCGACattatctcccgccagttcgtggaa

13.1.1R PurDDn ccagccaatgtcgttacggcTGAAaacagtatcaaccagcggcgactg

13.1.2F PurDUp 1TTCAgccgtaacgacattggctgg

13.1.2R PurDDn1PstI gga CTGCAG tgtggatgttcggttaattgccgc

14.1.1FAsdUpSalI gga GTCGAC tccaactgctgagctgagtcttgt

14.1.1R AsdDn gatatcacgatcgttcggcaCCACttgcatgagaacagagccgaccat

14.1.2F AsdUp 1GTGGtgccgaacgatcgtgatatc

14.1.2R AsdDn1PstI gga CTGCAG tctggtgcattccgagtacggaaa

Claims (10)

1.用同源重组方法，将编码传染性支气管炎、传染性喉支气管炎、马立克氏病、法氏囊病、新城疫和禽流感病毒的相关抗原的基因片断，定向插入到鼠伤寒杆菌染色体的特异性位点，通过抗原编码基因的表达，经接种动物后诱导产生特异性的免疫保护反应。

2.权力要求书1所述，同源重组方法是将在所要插入基因位点两侧的核酸序列通过聚合酶连反应和/或分步克隆的方法，分别连接到病毒抗原编码基因的5’和3’端，作为同源序列将病毒抗原编码基因整合到鼠伤寒杆菌的染色体中。

3.如权利要求书1所述，病毒抗原编码基因通过同源重组的方法整合到鼠伤寒杆菌染色体中，可以通过将相关的基因片断直接射入到细菌中和/或通过细菌之间的杂交来完成。

4.如权利要求书2所述，位于病毒抗原编码基因两侧的同源序列可以是与鼠伤寒杆菌的毒性相关的蛋白的编码基因和/或调控序列，通过在毒性相关的基因的编码序列或调控序列中插入病毒抗原编码基因，使毒性相关基因和/或调控灭活，而使鼠伤寒杆菌减毒。

5.如权力要求书1所述，病毒相关抗原编码基因的表达，可以通过只有在鼠伤寒杆菌进入巨噬细胞后才诱导的促进子所控制，通过定时诱导抗原基因的表达，增加鼠伤寒杆菌的稳定性。

6.如权利要求书1所述，病毒相关抗原编码基因可以融合到鼠伤寒杆菌III型分泌系统效应蛋白基因的羧基端，使病毒相关抗原在鼠伤寒杆菌入侵巨噬细胞后，分泌到巨噬细胞的胞浆中，使诱导产生的免疫反应更加倾向于细胞毒免疫，有利于对病毒感染的保护。

7.如权利要求书1所述，病毒相关抗原的编码基因可以通过重叠聚合酶连反应和/或分步克隆的方式连接在一起。

8.如权力要求书7所述，每一个病毒相关抗原的编码基因可以带有各自的促进子和核糖体结合位点，和/或几个病毒相关抗原的编码基因由一个共同的促进子和核糖体结合位点控制。

9.如权力要求书1所述，每一种病毒可以有一种或多种或全部的抗原编码基因完整的和/或部分的编码序列。

10.如权利要求书1-9所述的方法可以用于在其它细菌中表达相关病毒的抗原编码基因，也可以用于其它病毒的抗原编码基因的表达。