KR20010053000A - 뉴캐슬병 바이러스 감염성 클론, 백신 및 진단 분석방법 - Google Patents

뉴캐슬병 바이러스 감염성 클론, 백신 및 진단 분석방법 Download PDF

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올라브 스벤 드리우
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Abstract

본 발명은 클론된 전체-길이 CDNA로부터 전체적으로 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV)을 산출하는 방법 및 상기 방법으로부터 생산되고 유래된 백신들의 용도 및 진단 방법에 관한 것이다. 이 방법은 유전학적 변형에 의한 NDV 게놈을 변형할 가능성을 제공하고 그리고 돌연변이, 결실 및/또는 삽입의 도입을 허용한다. 이 방법은 NDV의 독성을 변형하기 위해 사용될 수 있어서 향상된 특성들을 갖는 신규한 약독화된 생백신들을 생산한다. 이 방법은 NDV의 항원성 구성을 변형하기 위해 사용되어서, NDV 야외 균주들로부터 혈청학적으로 구별될 수 있는 생 NDV 마커 백신들을 생산하게 한다.

Description

뉴캐슬병 바이러스 감염성 클론, 백신 및 진단 분석방법{Newcastle disease virus infectious clones, vaccines and diagnostic assays}
뉴캐슬병 바이러스 (NDV)는 가장 다양하고 그리고 치명적인 조류의 병원체중의 하나이다. 몇몇의 상이한 지리학적 위치들에의 분명한 새로운 질환으로서 뉴캐슬병의 거의 동시적인 발생 및 그 질환의 타입 및 가혹도에서의 큰 변이는 명명법에 몇가지 문제를 야기했다.
그 질환은 가성 닭 페스트, 가성 가금 페스트, 조류 페스트, 조류 디스템퍼 및 조류 뉴모엔세팔리티스(pneumoencephalitis)로 칭해졌다. 이 질환의 중요성은 우선 20세기 동안 국가들간의 막대한 무역에 의존한 고 효율의 국제적인 산업으로의 가금 산업의 발달에 기인한다.
뉴캐슬병의 첫번째 발발은 인도네시아의 자바 및 영국의 뉴캐슬-우폰 타이네에서 1926년에 일러났다고 일반적으로 추정된다 (Kraneveld, 1976:Doyle, 1927). 뉴캐슬병의 이름은 다른 질환들과 혼동될 수 있는 묘사적인 이름을 피하기 위하여 일시적인 이름으로 Doyle에 의해 붙여진 것이었다. 다른 덜 가혹한 질병들이 NDV와 구별이 되지 않는 바이러스들에 의해 야기되었음이 후에 분명해졌다. 미국에서 비교적 순한 호흡기 질환이 조류 뉴모엔세팔리티스로 칭해졌고 그리고 NDV에 의해 야기됨이 밝혀졌다 (Beach, 1944). 몇년 이내에, 닭에서 극히 순한 질환을 야기하거나 또는 질환을 야기하지 않는 수많은 NDV 단리체들이 세게 도처에서 달성되었다.
하기의 방법들이 그 질환의 확산에 연루되어 왔다: 1) 살아있는 새들의 이동; 2) 인간 및 장비들의 이동; 3) 가금 생산품의 이동; 4) 풍매(風媒) 확산; 5) 오염된 가금 사료; 6) 오염된 물; 7) 불완전하게 비활성화된 또는 이종성의 백신들. OIE에 따르면, 뉴캐슬병은 햇병아리에서 0.7 또는 그 보다 큰 뇌내 병원성 지수 (ICPI)를 갖는 조류 파라미쏘바이러스(paramyxovirus) 세로타입(serotype) 1(APMV-1)의 바이러스에 의해 야기되는 가금의 질환이다. 전염성 바이러스는 또한 F2 단백질의 C-말단의 다중 기본 아미노산들 및 F1 단백질의 N-말단의 F(페닐라닌)의 존재에 의해 확인될 수 있다. 이 아미노산 서열을 증명하는 것의 실패는 ICPI 테스트에 의한 특징화를 요구할 것이다. 용어 '가금'은 사육되는 또는 기르기, 소비용 고기 또는 알의 생산을 위해 또는 게임의 방류 공급을 위해 강금된 닭, 칠면조, 기니아닭, 오리, 거위, 메추라기, 비둘기, 꿩, 목도리뇌조 및 주금류의 새를 말한다.
Alexander(1988)에 따르면, 그 질환의 첫번째 인식 이래로, 세번의 대유행성의 뉴캐슬 질환이 발발하였다. 첫번째는 그 질환의 1차 발발을 나타냈고 그리고 남동 아시아에서 발생한 것처럼, 즉 1926년 영국에서의 것과 같이 격리된 발발로 보여, 아시아를 통하여 유럽으로 천천히 이동한 메카니즘 전의 도입의 기회였다.
두번째 대유행은 1960년 후반에 중동에서 시작한 것으로 보이고 1973년까지 대부분의 국가들에 이르렀다. 두번째 대유행의 더 빠른 확산은 아마도 상당한 국제적인 무역의 가금 산업의 주요 혁명에 의해 기인한 것이었다.
세번째 대유행은 초기에는 비둘기와 같은 길들여진 새들에게 영향을 미쳤다 (Vindevogel and Duchatel, 1988). 이 질환은 분명히 1970년대 후반에 중동에서 발생하였다. 1981년까지 유럽에 이르고 그리고 나서 경주 및 진열에서 새들간의 접촉 및 그러한 새들의 국제적인 무역의 결과로서 광범위하게 세계 도처로 급속히 확산되었다.
오늘날, 뉴캐슬병은 아시아, 아프리카, 아메리카 및 유럽의 많은 나라들에서 여전히 만연되어 있다. 단지 오세니아의 국가들만이 비교적 그 질환으로부터 자유로운것 처럼 보인다 (Spradbrow, 1988).
NDV는 Momonegavirales 목, Paramyxoviridae 과, Paramyxovirinae 아과, Rubulavirus 속에 속한다. 일반적으로 조류 파라미쏘바이러스 타입-1으로 불리는 NDV와는 별도로, 조류 파라미쏘바이러스 타입-2 내지 -9로 명명된 8개의 다른 세로타입들이 적혈구 응집-저해 테스트 및 혈청 중화 테스트에서 그들의 항원 연관성을 기초로 하여 구별될 수 있다 (Alexander, 1993).
혈청학적 그룹화의 일치성에도 불구하고, 다른 세로타입들의 바이러스들간에는 몇몇의 교차-관계가 있다.
NDV의 게놈은 바이러스 단백질들을 코드하는 전령 RNA들에 상보적인 음(-) 극성의 단일-가닥 RNA 분자이다. RNA 게놈은 크기로 대략 15,200 nt이고 그리고 다음의 유전자 생성물들을 코드한다 (게놈 RNA의 3' 말단 내지 5' 말단으로 나열된): 뉴클레오캡시드 단백질 (NP), 포스포프로테인 (P), 매트리스 단백질 (M), 융합 단백질 (F), 적혈구 응집소-뉴라미니다제 (HN), 및 대 폴리머라제 단백질 (L) (Chambers et al., 1986).
이 RNA는 M 단백질에 의해 내부에 늘어선 엔벨로프에 의해 둘러싸인 리보뉴클레오캡시드 입자 (RNP)를 형성하기 위해 NP, P 및 L과 복합체를 형성한다. 이 엔벨로프는 숙주 세포의 부착 및 침투에 관련된 F 및 HN 단백질을 함유한다.
NDV의 복제는 다른 파라미쏘비리네에 사용되는 전략과 비슷하다. 1차 단계는 HN 단백질에 의해 중재되는 숙주 세포 수용체들에 이 바이러스를 부착하는 것이다. 바이러스성 엔벨로프와 숙주세포 막의 융합은 HN 및 F 단백질 둘다의 작용에 의존적이고 그리고 바이러스 복제가 일어나는 세포질로 RNP의 방출을 초래한다.
바이러스성 RNA-의존 RNA 폴리머라제 (RNP의 일부)는 mRNA들로 작용하고 그리고 바이러스 단백질들의 합성을 위한 세포의 번역 기구에 의해 사용되는 상보성 전사체들을 생성한다. NP 단백질의 축적 때문에, RNA 폴리머라제 복합체는 전체-길이 게놈성 및 항-게놈성 RNA 분자들의 합성을 초래케하는, 전사로부터 복제로 전환한다.
새롭게 형성된 RNP들은 M 단백질 및 세포성 혈장 막에 축적된 F 및 HN 단백질들의 작용에 의해 세포성 막에 엔캡시스된다. 새롭게 형성된 바이러스 입자들은 발아 메카니즘에 의해 감염된 세포로부터 방출된다. NDV 복제에 대한 더 상세한 정보는 Peeples(1988)을 참조하라. 파라미쏘비리네의 분자생물학의 최근 검토는 Lamb and Kolakofsky (1966)을 보라.
상업적인 가금류 (즉, 닭, 칠면조, 메추리, 기니아닭, 오리, 거위, 비둘기)와는 별도로, 이동성 물새를 포함하여 우리에 가둔, 반-가축 및 자유롭게 살아가는 광범위한 새들이 NDV에 걸리기 쉽고 1차 감염원일 수 있다 (Kaleta and Baldauf, 1988).
NDV 균주들의 병원성은 숙주에 따라 크게 다르다. 대부분의 저항성 종들은 물새인 것으로 보이고, 반면에 가장 감수서이 큰 것은 대부분의 영구적인 떼의 일시적인 형성을 하는 군거성 새들이다. 닭들은 매우 걸리기 쉬우나, 오리 및 거위는 감염될 수도 있고 그리고 닭에게는 치명적인 균주들 조차도 거의 또는 전혀 임상적인 징후가 나타나지 않는다.
뉴캐슬병은 바이러스의 상이한 단리체들 및 균주들이 이 질환의 가혹도에서 막대한 변이를 도입할 수 있다는 점에서 복잡하다. Bread와 Hanson(1984)은 NDV 균주들 및 단리체들을 완전히 걸리기 쉬운 닭들에서 보여지는 질환의 징후에 관련된 상이한 파쏘타입(phathotype)으로 그룹화했다: 1) 내장에서 출현 병변이 현저한 급성 치사 감염을 생산하는 내장향성 벨로제닉(velogenic) NDV; 그리고 내장 병변은 없고 호흡기 및 신경학적 징후가 전제되는 높은 치사율을 보이는 신경향성 벨로제닉 NDV; 2) 낮은 치사율, 일부 새들에서 급성 호흡기 질환 및 신경성 징후를 생산하는 메소제닉(methogenic) NDV; 3) 순한 또는 분명하지 않은 호흡기 감염을 생산하는 렌토제닉(lentogenic) NDV, 또는 심지어 무증상의 장내 NDV, 장관에서 1차 복제하는 무발병성의 바이러스들. 이 상이한 그룹들에 관련된 징후들간에 일부 겹침이 보고되어 있다.
이 바이러스는 호흡기 및 장관을 통하여 또는 눈을 통하여 체내에 들어간다. 호흡관에서, 바이러스는 섬모 작용에 의해 그리고 세포-대-세포 확산에 의해 확산된다. 도입 부위에서의 1차 다중화 후에, 바이러스는 비라에미아(viraemia)의 증상발현 동안에 비장, 간, 신장 및 폐로 이동된다. 일부 균주들의 바이러스는 간 및 신장과 같은 치명적인 기관에 이르러서 새들을 증상이 명백해지기 전에 죽게 한다.
대부분의 바이러스는 항체의 상당한 양이 존재하기 전에 혈액을 통하여 중추 신경계에 다다른다. 앵무새(psittacines)에서 일어날 것으로 예상되는 긴, 무증상의 보균 상태는 가금 산업에 잠재적인 위협을 구성한다. 렌토제닉 또는 벨로제닉 바이러스 둘다의 긴 보균 상태는 또한 닭에 존재한다 (Heuschele and Easterday, 1970).
NDV의 복제 동안에, 감염성 자손 바이러스를 위한 F1 및 F2로 절단될 전구체 당단백질 Fo가 필요하다 (Rott and Klenk, 1988). 이 번역-후 절단은 숙주 세포 프로테아제들에 의해 중재된다. 만약 절단이 일어나는 것이 실패되면, 비-감염성 바이러스 입자들이 생성되고 그리고 바이러스 복제가 진행할 수 없다. 독성 바이러스의 Fo 단백질은 광범위한 프로테아제에 의해 절단될 수 있으나, 낮은 독성의 바이러스들에서 Fo 단백질들은 그들의 감수성에 제약되고 이들 바이러스는 단지 특정 숙주 세포 타입들의 생체내에서만 생육하고 일반적으로 생체외에서는 생육될 수 없다.
렌토제닉 바이러스는 단지 호흡기 또는 장관과 같은 트립신-같은 효소들을 갖는 영역에서만 복제하는 반면에, 독성 바이러스들은 치명적인 시스템적 감염을 초래하는 조직 및 기관의 범위에서 복제할 수 있다.
Fo 전구체의 아미노산 사열화는 저-독성 바이러스들은 F2 및 F1 사슬을 연결하는 단일 아르기닌 (R)을 갖는 반면에, 독성 균주들은 절단 부위에 K/R-X-K/R-R-F와 같은 두 쌍을 형성하는 추가의 기본 아미노산들을 보유한다는 것을 보여주었다. 게다가, 독성 균주들의 F2 사슬은 일반적으로 페닐알라닌 잔기로 개시하는 반면에, 비독성 균주들의 F2 사슬은 일반적으로 로이신으로 개시한다.
NDV의 일부 균주들에서는 HN 단백질이 또한 생물학적으로 활성이 되기 위해서는 절단을 요구하는 전구체로서 또한 생성된다 (Garten et al., 1980; Miller et al., 1988).
F 및 HN 단백질들의 절단성 외에도, 다른 바이러스성 인자들이 병원성에 기여할 수 있다. Madansky 및 Bratt (1978, 1981a, 1981b)는 전사 및 번역에서의 변경들은 바이러스의 성장 및 세포-대-세포 확산 및/또는 사이토파소제니시티 (cytophathogenicity)를 변형할 수 있음을 밝혔다.
NDV로 감염에 대한 1차 면역 반응은 세포 중재되고 그리고 생 백신 균주들로 감염시킨 후 2-3일 정도로 초기에 검출가능하다. 이것은 측정가능한 항체 반응이 가시화되기 전에 백신 접종된 새들에서 기록된 공격(challenge)에 대한 1차 보호를 추측상 설명한다 (Gough and Alexander, 1973).
감염후 약 1주일경에, 순환 항체들은 재-감염으로부터 숙주를 보호할 수 있다. 초기 상에서는 IgM이 관련되고, 이어서 IgG가 관련된다. 적정량(titres) 및 보호는 약 3주후에 최고점에 달하고 그리고 추가투여(boosting)가 없으면 점차 줄어든다. 이것은 더 나이든 새들은 재-백신 접종이 필요함을 의미한다.
단지 호흡기를 통해 투여된 생백신만이 혈청뿐만 아니라 모든 점막 표면들에서 항체를 자극한다. 비활성화된 백신은, 심지어 근육주사를 통해 적용되었을 때도, 혈청 항체의 고 농도에도 불구하고 호흡관에서 국소적 저항을 이끌러내지 않는다.
이것은 국소 및 시스템 면역 둘다를 유도하는 상부 호흡관에 바이러스성 항원을 존재하게 할 수 있는 생백신의 중요성을 강조한다. 작은 비말(droplets)은 하부 호흡관으로 침투해서 주로 체액성 면역 반응을 야기하는 반면에, 굵은 비말은 상부 호흡관에서 국소적 면역을 자극한다. 그러므로 광범위한 크기의 비말을 갖는 에어로졸이 가장 좋은 전반적인 국소 및 체액성 면역을 발생한다.
그러나 높은 수준의 항체 적정량을 만들어 내는 현행 백신으로 광범위한 백신 접종에도 불구하고, 바이러스는 여전히 점막 표면으로부터 회복될 수 있음을 주지하여야 한다.
미국에서 뉴캐슬병의 동정은 비활성화된 백신의 사용을 이끌어 냈다 (Hofstad, 1953). 일부 동물 풍토병 바이러스가 단지 순한 질환을 생산했다는 관찰은 최초로 미소제닉 생 백신 Roakin의 개발의 결과를 가져왔고 (Beaudette et al., 1949) 그리고 이어서, 더 순한 Hitchner B1 (Hitchner and Johnson, 1948) 및 LaSota (Goldhaft, 1980)의 개발을 가져왔다.
NDV 생백신은 두 그룹, 렌토제닉 및 메소제닉으로 나뉠 수 있다. 메소제닉 균주들은 그들의 더 강력한 독성 때문에 새들의 단지 2차 백신 접종에 적합하다. 면역 반응은 생백신의 병원성의 증가에 따라 증가한다. 그러므로, 심각한 반응없이 요구되는 보호 수준을 달성하기 위해서는, 점차 더 독성의 백신의 순차적인 사용, 또는 생백신과 이어서 비활성화된 백신의 사용을 포함하는 최근 백신 프로그램이 사용된다.
생백신들의 주요한 이점중 하나는 비용이 싼 대량 적용 기술에 의해 투여될 수 있다는 것이다. 통상적인 적용 방법은 물을 마시는 것을 통하는 것이다. 그러나, 물 마시기 적용은 바이러스가 과도한 열 및 빛에 의해 그리고 물속의 살-바이러스제 분순물에 의해 비활성화 될 수 있기 때문에 주의깊게 모니터되어야 한다.
스프레이 및 에어로졸에 의한 생백신의 대량 적용은 많은 수의 새가 짧은 시간내에 백신 접종될 수 있다는 용이성 때문에 또한 매우 인기가 좋다. 입자들이 발생되는 조들을 조절함에 의해 정확한 입자 크기를 달성하는 것이 중요하다.
최근 사용되는 생백신들은 몇가지 문제점을 가지고 있다. 이 백신은 여전히 환경 조건들 및 악화하는 감염의 존재에 의존하는 질환 증후들을 유발한다. 그러므로, 1차 백신 접종을 위한 극히 순한 바이러스를 사용하는 것이 중요하고 그리고 대체로 다중 백신 접종이 주로 요구된다. 게다가, 모계로부터 물려받은 항체들이 렌토제닉 생백신들로의 1차 백십접종을 성공적으로 방어할 수 있다.
비활성화된 백신들은 바이러스를 죽이기 위해 포말린 또는 베타프로피오락톤으로 처리되고 적절한 보조제와 혼합된 감염성 요낭액으로부터 보통 생산된다. 비활성화된 백신들은 근육 또는 피하 주사로 투여된다. 비활성화된 백신들은 생산하고 적용하는데 비용이 비싸다.
그러나, 비활성화된 오일-유제(emulsion) 백신들은 생백신 만큼 모계 면역에 의해 불리한 영향을 받지 않고 그리고 이것들은 햇병아리에 사용될 수 있다. 비활성화된 백신들의 이점은 백신 접종된 새들에서 낮은 수준의 부작용, 높은 수준의 방어 항체, 및 방어의 장기간이다. 상기 백신들의 어느 것도 야생형 NDV와 혈청학적으로 상이할 수 없다.
재조합 바이러스성 백신들의 개발은 수 많은 세월동안 가금 산업에 흥미를 가졌다. 그 개념은 관심의 질환 제제의 필수적인 면역화 에피토프의 유전자를 벡터 바이러스의 비필수적인 유전자로 삽입하는 것이다. 그래서 재조합 바이러스로 백신 접종하는 것은 관심의 질환 제제 뿐만아니라 벡터 바이러스 둘 다에 대한 면역화를 초래한다.
몇몇 타입의 백신들은 가금을 위한 잠재적인 생백신으로서 평가되어 왔다. 가장 주목을 받아온 두개의 조류 바이러스는 계두(fowlpox) 바이러스 (FPV) 및 칠면조의 헤르페스바이러스 (HVT)이다. 계두 바이러스는 대(大) 게놈을 갖는 DNA 바이러스이고 그런 연유로 외래 유전자를 지니는 충분한 공간을 갖는 것으로 생각된다.
약독화된 경우, FPV는 임상적 질환을 일으키지 않고 그리고 통상적으로 닭에 백신으로 사용된다. HVT는 또한 DNA 바이러스이고 마레크(Marek) 질환 바이러스 (MDV) 과(科)의 세로타입 III으로서 분류된다. HVT는 MDV에 대한 교차-방어적인 닭에 대해서는 비-병원성이고 그리고 보통 마레크 질환에 대해 닭을 백신 접종하기 위해 사용된다.
뉴캐슬병에 대한 방어는 재조합 HVT 및 FPV 백신을 사용하여 유도될 수 있음이 보여졌다 (Morgan et al., 1992, 1993; Heckert et el., 1996; Boursnell et al., 1990; Taylor et al., 1990).
그러나, NDV F 단백질 또는 F 및 HN 단백질 둘다를 발현하는 그러한 재조합 백신들로 백신 접종함에 뒤이은 뉴캐슬병에 대한 방어의 개시는 종래의 생 또는 비활성화된 NDV 백신으로 백신 접종에 뒤이은 그것 보다 상당히 지연되었다. 이것은 아마도 이 재조합 백신들은 재조합 백신에 의해 발현되거나 또는 면역 시스템에 적절하게 존재하지 않는 NDV 단백질 상에 발견된 것들 이외의 항원적으로 관련 NDV 에피토프들의 충분히 넓은 면역학적 요인(spectre)을 제공하지 않기 때문일 것이다.
게다가, 국소 (점막, 호흡기 또는 장) 방어는 재조합체로 백신 접종된 새들에서 효과적으로 유도되지 않았다. 이것은 호흡기 질환에 대한 1차 백신 접종을 위해 사용된 백신이 야외에서 사육된 닭을 감염시키는 독성 바이러스의 감염 및 확산을 방어하는 국소 면역을 유도해야만 하는 중대한 결점이다.
숙주를 방어할 수 있는 NDV에 대한 항체들은 바이러스 중화 테스트에서 측정될 수 있다. 그러나, 중화 반응은 적혈구 응집 저해 (HI) 반응과 대등한 것으로 보이기 때문에, 후자의 테스트는 보호 반응을, 특히 백신 접종 후에 평가하기 위하여 자주 사용된다.
F 및 HN 단백질 둘다에 대한 항체들은 NDV를 중화할 수 있다. 그러나, F 단백질에 대한 항체들은 생체내 및 생체외 테스트에서 HN에 대한 것들보다 더 큰 중화를 유도하는 것으로 보인다.
새의 혈청에서 NDV에 대한 특이적인 항체들의 존재는 NDV의 감염 균주에 대한 정보를 거의 주지 않으므로 진단 가치를 제한하였다.
대부분 국가들에서 새들에 레토제닉 NDV 균주들의 편재 및 적어도 혈청학적으로 야생 NDV로부터 구별될 수 없는 생백신의 거의 보편적인 사용은 감염의 단순한 증명이 거의 부과되는 조절 측정들을 위한 적절한 원인이 아니다 라는 것을 의미한다. 야외 질환은 바이러스의 진정한 감염성의 신뢰할 수 없는 측정일 수 있기 때문에, 발견된 바이러스를 더 특징화하는 것이 필요하다.
현재, 감염화 균주의 특징화를 가능케하는 뉴캐슬병 진단의 유일한 방법은 바이러스 단리와 뒤이은 병원성 테스트이다. 현재, 3개의 생체외 테스트가 이 목적을 위하여 사용된다: 1) 알에서 평균 사멸 시간 (MDT); 2) 1일-햇병아리에서 뇌내 병원성 지수 (ICPI); 3) 6일된 새에서 정맥내 병원성 지수 (IVPI).
이 테스트들은 동물의 유용성, 미약한 재현성, 및 테스트의 비교적 장기간과 같은 수많은 결점을 갖고 있다. 마지막으로 말하지만 결코 가볍게 볼것은 아닌데, 이 테스트들은 백신으로 백신 접종된 또는 야생형 균주로 감염된 가금의 시료 혈청확적 확인을 허용하지 않는다.
생체내 테스트의 대안으로서, 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)은 독성과 비-독성 단리체들을 구별하기 위해 성공적으로 사용되어 왔으나 (Stauber et al., 1995; Kant et al., 1997), 그러나 역시 혈청학적 구별화는 불가능하다.
가금의 사육 및 그 제품들의 무역은 이제 국제적으로 빈번히 다국적 회사들의 관리로 조직화되어 있다. 뉴캐슬병의 위협은 그러한 무역에 큰 제약을 가져왔다.
뉴캐슬병의 성공적인 조절은 모든 국가들이 발발을 보고할때 만이 달성될 것이다. 그러나, 국제적 의정서는 상이한 나라들에서 질환 감시의 범위에서 막대한 차이 때문에 단순하지 않다. 일부 국가들은 백신 접종된 가금이 야생형 NDV에 감염된 것들과 구별될 수 없기 때문에 가축 가금에 백신 접종 및 어떤 형태의 NDV의 도입도 원하지 않는다.
나머지 나라들은 단지 특정의 생백신의 사용만을 허용하고 다른 백신들은 수용할 수 없는 독성으로 간주한다. 아직 나머지 나라들은 매우 독성의 바이러스 순환의 연속된 존재에 직면하는데, 분명한 질환이 백신 접종에 의해 차단되기 때문에, 이것은 그 자체로 인정되지 않는다.
많은 국가들에서 입법화가 일어날 수 있는 뉴캐슬병 발발을 조절하기 위해 존재한다. 국가적 조절 수단들은 도입 및 확산의 방어에 향해 있다. 대부분의 나라들은 가금 생산품, 알 및 살아있는 가금의 무역에 제약을 갖고 있다. 대부분의 나라들은 수입, 특히 앵무새들에 대한 검역 과정을 수립하고 있다.
일부 나라들은 감염된 새들, 그들의 접촉동물들 및 제품들의 강제적인 도축의 박멸 정책을 적용하여 왔다. 다른 나라들은 심지어 발병이 없을지라도 새들의 예방적 백신 접종을 요구하는 반면에, 일부 나라들은 완충 지대를 수립하기 위하여 발발 주위에 링(ring) 백신접종의 정책을 갖고 있다.
분명히, 뉴캐슬병을 조절하는데에 사용될 수 있는 더 나은 백신 및 더 나은 진단방법이 요구되고 있다. 생백신의 대량 적용 동안에 개개의 새등에 의해 수용되는 용량에서의 큰 차이와 어린 닭들에서 모계 면역의 수준의 차이 때문에, 생백신으로 후-백신 반응이 피할 수 없다. 이것은 백신 접종이 강제적인 나라들에서 농부들의 주요 관심중의 하나이다.
게다가, 많은 백신들이 부차-집단(sub-population)들의 혼합물이다. 클론된 경우, 이 부차-집단들은 면역원성 및 병원성에서 서로서로 상당히 상이하다 (Hanson, 1988).
그러나, 현재 사용되는 생백신 및 비활성화된 백신의 가장 큰 결점은 백신 접종된 동물들은 적혈구 응집-저해 또는 바이러스 중화 테스트와 같은 현재 사용되는 선별 기술들로 감염된 동물들로부터 구별해 낼 수 없다는 사실이다.
독성 야외-바이러스는 질환 증상들이 백신 접종에 의해 가려지기 때문에 백신 접종된 떼들에서 여전히 확산할 것이다. 생체내 기술들에 의한 바이러스 단리 및 독성의 특징화는 대규모에서 실행할 수 없기 때문에, 야외-바이러스들로부터 혈청학적으로 구별될 수 있는 신규하고 그리고 효과적인 약독화된 생백신들에 대한 큰 요구가 있다.
항원성으로 관련한 NDV 에피토프들의 가장 가능성의 면역학적 요인을 제공해야 하고 그리고 야생형 NDV와 혈청학적으로 달라야 하는, 소위 NDV 마커 백신들 (및 진단방법 및 키트들을 동반하는)이라 불리는 그런 백신들은 아직 이용가능하지 않다.
본 발명은 가금(家禽)의 뉴캐슬병 바이러스 감염에 관한 것이다.
도 1
전사벡터 pOLTV5는 Pattnaik et al.(1992)에 의해 기재된 전사벡터의 유도체이다. 상세한 구조는 텍스트를 참조하라. 이 플라스미드는 T7 DNA-의존 RNA 폴리머라제 프로모터(고딕체)와 뒤이은 독특한 StuⅠ 및 SmaⅠ 제한 부위 및 헤파티티스 델타 바이러스(HDV)로부터의 자동촉매 리보자임을 함유한다. DNA 단편은 StuⅠ 및 SmaⅠ 부위 사이에 클론되며 T7 RNA 폴리머라제를 사용함에 의해 생체외 또는 생체내에서 전사될 수 있다. 생성되는 전사물의 5' 말단은 삽입물에 의해 코드화 되지 않는 2개의 여분 G-잔기를 함유한다. 리보자임의 작용으로, 전사물의 3' 말단은 삽입물의 마지막 뉴클레오티드에 정확히 대응한다.
도 2
미니게놈 플라스미드 pOLTV535(도 2a) 및 pOLTV553(도 2b)의 구조이다. 미니게놈 플라스미드는 전사 플라스미드 pOLTV5(도 1)를 기초로 하며, 그리고 분비된 알카리성 포스파타제 (SEAP)를 코드화하는 유전자에 접하는 NDV 균주 LaSota 3' 영역(nt 1-119) 및 5' 영역 (nt 14970-15186)을 포함한다. T7 RNA 폴리머라제에 의한 pOLTV535의 전사는 항-게놈성 RNA(또는 [+]-RNA)를 생성하는 반면, pOLTV553의 전사는 게놈성 RNA(또는 [-]-RNA)를 생성한다. 바이러스 전사 개시 및 종결 신호인 개시(S) 및 끝(E) 박스를 표시하였다. SEAP 유전자의 개시 코돈은 밑줄을 그었다. 또한, 길이가 각각 1 nt 다른 미니게놈 플라스미드 (각각 pOLTV535N0-N5 및 pOLTV553N0-N5)를 생성하는 ClaⅠ-부위에 삽입(N0-M5) 서열을 나타내었다.
도 3
NDV 균주 LaSota의 게놈의 뉴클레오티드 서열 및 NDV 유전자의 추론된 아미노산 서열이다. 나타낸 서열은 항-게놈성 가닥에 대응하며 ssDNA 형태로 5' 에서 3' 방향으로 도시되어 있다. 본 도에 나타난 서열은 전체 NDV 게놈에 산재하는 중복된 서브게놈성 cDNA들의 두개의 독립 세트를 완전하게 서열화함으로써 결정된 컨센서스의 서열이다. 나머지 불명확함(아마도 PCR 오류의 결과로서)은 세번째의 독립 세트의 관련된 부분을 서열화함으로써 해결할 수 있다.
중복된 서브게놈성 cDNA 클론(도 4)으로부터 조립된 전체-길이 cDNA 클론 pNDFL+의 서열은 하기의 위치에서 컨센서스 NDV 서열의 것과는 다르다(괄호안의 컨센서스 서열). nt 1755, G (A); nt 3766, A (G); nt 5109, G (A); nt 6999, T (C); nt 7056, G (A); nt 9337, G (A); nt 9486, A (T); nt 10195, T (C); nt 13075, A (G). 이들 차이는 3 아미노산을 변경을 가져온다 (괄호안의 컨센서스 서열); F 단백질, R189(Q); HN 단백질 S200(P) L-단백질 N369(I).
도 4
(A) 서브게놈성 중복 cDNA 클론으로부터 전체-길이 NDV cDNA를 조립하는데 사용되는 전체적인 전략. cDNA는 NDV 균주 LaSota의 3' 및 5' 말단을 이미 포함하는 플라스미드 pOLTV535에 조립되었다(도 2 참조). pNDFL+로 명명된 생성된 플라스미드를 감염성 NDV의 생성에 사용하였다.
(B) 서브게놈성 중복 cDNA 클론으로부터 전체-길이 NDV cDNA를 조립하는데 사용되는 상세한 콜로닝 방법. Cm은 표현형적 태그로서 일시적으로 도입된 클로람페니콜-내성 유전자를 표시한다(상세한 것은 텍스트를 참조).
(C) 유전적으로 변형된 전체-길이 NDV cDNA를 생성하기 위한 상세한 콜로닝 방법. 변형은 F 유전자에 도입되고 그리고 F 단백질의 단백질가수분해 절단 부위의 아미노산 서열의 변형을 가져오는 3 뉴클레오티드 변경으로 이루어져 있다 (상세한 것은 텍스트를 참조).
도 5
(A) pOLTV535-시리즈
T7 RNA 폴리머라제에 의한 전사는 세포에 의해 SEAP 단백질로 직접 번역될 수 있는 항-게놈성 RNA (또는 [+]-RNA)를 생성한다. 헬퍼 바이러스로 세포를 감염시킨 후(또는 NP, P 및 L로 코드화한 플라스미드의 공-트랜스펙션 후), 항-게놈성 RNA를 게놈성 RNA(또는 [-]-RNA)의 합성을 위한 바이러스성 폴리머라제 복합체에 의해 사용된다. 그리고 나서, 게놈성 RNA를 mRNA(특이적 전사 개시(S) 및 끝(E) 박스를 사용함에 의해) 및 항-게놈성 RNA 모두를 합성하기 위한 바이러스성 폴리머라제 복합체에 의해 사용된다.
(B) pOLTV553-시리즈
T7 RNA 폴리머라제에 의한 전사는 SEAP 단백질로 번역될 수 없는 게놈성 RNA (또는 [-]-RNA)를 생성한다. 헬퍼바이러스로 세포를 감염시킨 후(또는 NP, P 및 L로 코드화한 플라스미드의 공-트랜스팩션 후), 게놈성 RNA는 mRNA(특이적 전사 개시(S) 및 끝(E)박스를 사용함에 의해) 및 항-게놈성 RNA 모두를 합성하기 위한 바이러스성 폴리머라제 복합제에 의해 사용된다.
도 6
NDV LaSota 및 기타 파라미쏘바이러스의 헥산 서열 5' 말단의 배열이 Rubulavirus 속의 4 멤버, Paramyxovirus 속의 3 멤버, 및 Morbillivirus 속의 3 멤버와 NDV의 서열 비교로서 제시하였다. 서열을 L 유전자 말단 박스에서부터 5' 말단으로 (3' - 5' cDNA) 제시하였다.
NDV, 뉴캐슬병 바이러스; hPIV2, 인간 유사인플루엔자 바이러스 2; MuV, 이하선염 바이러스; SV5 및 SV41, 각각, 심미안(simmian) 바이러스 5 및 41; SeV, 센다이 바이러스; bPIV3, 및 hPIV3 각각, 소 및 인간 파라인플루엔자 바이러스; CDV, 개 디스템퍼 바이러스; MeV 마진 바이러스; RPV, 우역 바이러스. 전체 게놈 뉴클레오티드(nt) 서열을 다음과 같이 얻었다 (수탁번호); NDV(AF077761); hPIV2(X57559); MuV(AB000388); SV5(AF052755); SV41(X64275); bPIV3(D84095); hPIV3(Z11575): CDV(L13194); MeV(X16565); RPV(Z30697).
본 발명은 유적학적인 변형에 의한 조류-파라미쏘바이러스 게놈을 변형하는 방법을 제공하고, 유전적으로 변형된 조류-파라미쏘바이러스 및 조류-파라미쏘바이러스 마커 백신을 제공한다.
현대 분자생물학 기술의 출현은 음(-)가닥 RNA 바이러스들을 포함하여 많은 RNA 바이러스의 유전학적 변형을 가능케 하였다. 이 기술은 종종 "역 유전학"으로 종종 불린다. 하나는 우선 바이러스성 RNA의 (전체-길이) cDNA 복사체를 제공하고, 뒤에 하나는 감염성 바이러스 입자들을 생산하기 위해 다시 복제할 수 있는 감염성 RNA를 생성하기에 용이한 세포들에서 이 DNA를 전사한다.
일반적으로, 기준 분자생물학 기술로 cDNA의 이전 변형에 의해, 유전학적으로 변형된 RNA 바이러스들 수득하는 것이 가능하였다. 그러나, 이것은 NDV 또는 다른 조류-파라미쏘바이러스에 대해서는 결코 실현되지 않았었고, 심지어 조류-파라미쏘바이러스의 복제를 연구하여 감염성 복사체 바이러스를 어떻게 축조하는 가에 대한 이해하기 위한 미니게놈 단편들 또는 조류-파라미쏘바이러스 게놈 단편들의 플라스미드들을 발생하는 것도 가능하지 않았다.
놀랍게도, 비록 기재일지라도, 조류-파라미쏘바이러스의 게놈은 지금까지 모든 서열화된 파라미쏘바이러스 게놈중 가장 작은 것이고, 특히 NDV 게놈의 5' 말단 서열은 다른 Paramyxoviridae와 비교하여 이전에 수립되고 예측되었던 것 보다 훨씬 더 길다. 본 발명은 이제 최초로 조류-파라미쏘바이러스 게놈의 전체 서열을 제공하고 그리고 그러한 바이러스의 전체-길이 또는 미니게놈 길이 cDNA를 제공한다.
본 발명은 이것과 함께 적어도 조류-파라미쏘바이러스의 감염성 복사체를 발생하는 조류-파라미쏘바이러스 게놈의 5'-말단에 대응하는 핵산서열을 포함하는 조류-파라미쏘바이러스 cDNA를 제공하고, 상기 cDNA는 바람직하게는 전체-길이 cDNA를 포함한다. 그러나, 본 발명은 또한 적어도 조류-파라미쏘바이러스 게놈의 5'-말단에 대응하는 핵산 서열을 포함함에 의해 조류-파라미쏘바이러스 미니게놈의 복제를 발생케 하는 cDNA를 제공한다. 그러한 미니 게놈들은 유익하게도 RNA를 전사및/또는 변형된 핵산 서열로부터 단백질을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 적어도 부분적으로 뉴캐슬병 바이러스로부터 유래된 본 발명에 따른 cDNA를 제공하는데, 예를들면 상기 뉴캐슬병 바이러스는 렌토제닉 바이러스이고, 바람직하게는 LaSota 균주 ATCC VR-699와 같은 백신 균주로부터 유래된다.
또한 본 발명은 추가로 결실, 삽입, 돌연변이, 역위와 같은 변형이 핵산에 제공되는 본 발명에 따른 cDNA를 제공한다. 예를들면, 상기 변형이 변형된 프로테아제 절단 부위를 코드화하는 핵산을 포함하고, 예를들면 상기 절단 부위가 융합 (F) 단백질의 프로테아제 절단 부위인 cDNA가 제공된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 변형이 본 발명의 실험부에 기재된 바와 같이 하이브리드 적혈구 응집 (HN) 단백질과 같은 하이브리드 바이러스성 단백질을 코드화하는 핵산을 포함하는 본 발명에 따른 cDNA를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 변형이 매트리스 (M) 단백질과 같은 바이러스성 단백질을 코드화하는 핵산에서 결실을 포함하는 본 발명에 따른 cDNA를 제공한다.
본 발명은 추가로 이종성 항원을 코드화하는 핵산이 제공된, 바람직하게는 예를들면 하기에 기재된 바와 같이 상기 항원이 가금 병원체로부터 유래되는 본 발명에 따른 cDNA를 추가로 제공한다. RNA 및 본 발명에 따른 cDNA로부터 수득되는 그것의 유래된 단백질이 또한 제공된다.
최근 몇년에, 수 많은 비-절편화된 음-가닥 RNA 바이러스가 충분히 특징화되었고 그리고 그들의 게놈의 복제 및 발현에 대한 기초적 연구가 상기 바이러스의 클론된 cDNA로 세포들을 트랜스펙션함에 의해 전체적으로 감염성 바이러스를 산출하는 능력에서 정점에 달했다 (reviewed by Conzelmann, 1996).
지금까지, 비-절편화된 음-가닥 RNA 바이러스들의 감염성 바이러스는 예를들면 광견병 바이러스 (Schnell et al., 1994, Conzelmann; EP0702085A1), 소포 구내염 바이러스 (Lawson et al., 1995, Whelan et al., 1995), 샌다이 바이러스 (Garci et al., 1995), 홍역 바이러스 (Radecke et al., 1995; Schneider et al., 1997; EP0780475A1), 인간 인간 호흡기 신시티얼(syncytial) 바이러스 (Collins et al., 1995), 우역 바이러스 (Baron and Barrett, 1997), 및 인간 유사인플루엔자 바이러스 타입 3 (Hoffman and Banerjee, 1997, Conzelmann; P0702085A1), (Schnell et al., 1994; EP0702085A1)의 클론된 cDNA로부터 생산되어 왔다.
그러나, 상기 감염성 복사체 바이러스들 모두는 적절한 세포주 상에서 감염성 입자들의 용이한 cDNA 트랜스팩션 및 복제 및 생산을 가능케 하는, 숙주, 조직 또는 다양한 기원의 세포들에서 생체외에서 뿐만아니라 생체내에서도 생육할 수 있다.
그러한 가능성은 NDV, 분명히 백신을 제공할 수 있는 렌토제닉 NDV 균주들에 대해서는 존재하지 않는다. 그러한 NDV 균주의 독성은 독성 균주들은 생체외 및 생체내에서 용이하게 복제할 수 있는 반면에, 백신 균주들은 단지 생체내에서만 복제할 수 있다는 사실에 의해 반영된, 광범위한 세포들에서 복제하는 그것의 능력에 관련된다.
그래서, NDV로 캐치(catch) 22 상황이 분명하다. 예를들면 감염성 cDNA로부터 감염성 복사체 바이러스을 산출하려는 시도들이 가능하게 감염성 바이러스를 초래할 수 있는 반면에, 그러한 바이러스는 그렇게 발생된 감염성 바이러스가 백신으로 사용되기에는 너무 독성이 강해서 결격되기 때문에 일반적으로 백신으로서 사용에 적절하지 않다; 그것이 세포주 상에 cDNA의 트랜스팩션 후 생산되고 그리고 복제될 수 있다는 사실은 Fo 단백질의, 상기에서 토의된 바와 같이 NDV의 독성의 검증마크인, F1 및 F2로의 그것의 용이한 절단성을 반영한다.
cDNA에 대한 친(親) 물질로서 백신 균주의 사용은 이 문제를 해결하지 못할 것이다: 백신 균주, 특히 렌토제닉 타입은 용이하게 전달할 수 있는 Fo 단백질을 함유하지 않는데 이것은 제1 세대 바이러스가 복제를 계속하는 것이 불가능함을 말해 준다. 트랜스펙션에 사용된 세포는 단순히 비-절단된 Fo 단백질을 갖는 백신-타입 바이러스의 한번 이상의 복제 라운드를 뒷받침할 수 있는 것은 아닐 것이다.
이제 본 발명은 훌륭하게 이 문제점의 해결책을 제공하고, 그리고 그와 함께 예를들면 백신에 사용을 위한 감염성 복사체 NDV를 제공한다.
본 발명은 감염성 복사체 뉴캐슬병 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 바이러스 RNA와 복합체화하기 위한 바이러스성 NP, P 및 L 단백질들을 발현할 수 있는 세포들을 상기 바이러스의 클론된 전체-길이 또는 게놈-길이 cDNA로 트랜스팩션하는 단계를 포함하고 그리고 상기 세포를 상기 바이러스의 Fo 단백질의 절단을 허용하는 단백질가수분해 활성을 포함하는 배양 배지에서 인큐베이트 하는 단계를 더 포함한다.
본 시스템에서, NP를 발현하는 플라스미드의 공-트랜스펙션은 생략될 수 있다. NP 유전자는 항-게놈성 RNA의 5 말단뒤의 첫번째 유전자이기 때문에, NP는 완전한 길이의 cDNA로부터 발현될 수 있다. 진핵세포의 mRNA는 보통 단일시스트론성이기때문에, 말단 유전자의 발현은 기대할 수 없다. 그러나, NDV 유전자의 상대적 위치가 바뀐 전체 길이의 cDNA를 생성하는 것이 가능하다. 이 cDNA의 첫번째 유전자가 P 또는 L인 경우, 공-트랜스펙트된 플라스미드로부터 상응하는 유전자를 발현시킬 필요가 반드시 있는 것은 아니다.
전체 길이의 cDNA를 사용의 대안으로, 둘 이상의 cDNA를 사용하여 반응력 있는 서브게놈성 RNA에 해당하는 복제를 할 수 있고, 조류-파라믹소바이러스 단백질의 전체 보완물(complement)을 발현시킬 수 있다. RNA가 개별적으로 패키징된 경우에서도, 결과물인 바이러스성 입자는 공-감염과 유전자 기능의 보완에 의해 연속적인 복제 라운드에 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 단백질 분해활성이 트립신 같은 효소에서 유래하거나 또는 상기 단백질가수분해 활성을 가진 조성물에서 유래하는 방법을 제공한다. 더 바람직한 구체예에서는, 상기 성장 배지는 단백가수분해 활성을 갖는 요낭액을 포함한다. Fo 단백질의 분해는 감염성 바이러스의 생성에 필수적이다. 외인성 단백질가수분해 활성을 첨가하지 않고도 렌토제닉 균주로부터 감염바성 바이러스를 생성하는 것이 가능하다. 트랜스펙트된 세포의 상징액을 발육란(embryonated)의 요낭강에 접종시켜, 요낭액에 존재하는 단백질가수분해 활성으로 Fo 단백질을 분해하여 융합 F1-F2 복합체를 생성할 수 있다. 이런 활성화된 Fo 단백질을 가진 바이러스들은 감수성 있는 세포를 감염시킬 수 있고, 요구하는 단백질가수분해 활성를 나타내는 세포에서이 복제는 감염성 자손들을 생성한다. 요구하는 단백질가수분해 활성을 트랜스펙트된 세포의 상징액에 제공하는 대안으로서, 예를들면, NDV를 허용하고, 상기 단백질가수분해 활성을 이미 발현하는 세포를 사용하는 것이 가능하다. 이런 세포주는 외인성 단백질가수분해 활성을 첨가하지 않고 감염성 렌토제닉 NDV을 생성하는데 쓰일 수 있다. 이런 세포주는 또한 상기 활성을 구체화하는 유전자로 세포주를 안정하게 트랜스팩트시켜 생성될 수 있다. 더우기, 바이러스 엔벨로프에서 야생형 F 단백질을 발현하는 안정하게 트랜스팩트된 세포주를 생성하는 것이 가능함에 의해, 세포안으로 들어가는 수단으로 감염성 입자들(야생형 F 단백질을 코드화하는 유전적 정보를 그 자체로는 제공하지 않는)을 생산하는 것이 가능하다. 감염성 렌토제닉 바이러스의 구출은 NDV 헬퍼바이러스로 트랜스팩트된 세포를 감염시켜서 할 수 있다. 이런 헬퍼바이러스에 대한 필수적인 요구사항은 예를들면, 헬퍼바이러스를 제거하고 렌토제닉 바이러스와 반응하지 않는 항체들을 중화하는 방법으로 선별될 수 있다. 결론적으로, 3가지 기본적 NDV 단백질(NP, P, L) 중 한개, 두개 또는 세개를 발현하는 안정하게 트랜스펙트된 세포주를 축조할 수 있다. 이런 세포주들은 3가지 기본 단백질의 서브세트 만의 공-발현을 요구하거나 또는 감염성 복사체 바이러스 생성을 도와주는 공-발현을 전혀 요구하지 않는다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 트랜스팩팅에 사용되는 상기 세포들이 닭 1차 또는 2차 세포 또는 세포주에서 유래되는 방법을 제공한다. 본 명세서는 일반적으로 대부분의 생체외 세포들로, LaSota 균주 같은 NDV의 Fo 단백질의 절단에 요구되는 적절한 단백질가수분해 효소가 결여된, 예를들면 CER 또는 CER 세포를 제공한다. 그러나, 다른 조류에서 유래된 세포들도 사용될 수 있다.
본 발명은 세포를 예를들면 도 3에서 나타낸 상기 바이러스의 클론된 전체 길이 또는 게놈성 길이 cDNA를 트랜스펙션하는 단계를 포함하고 그리고 상기 바이러스의 Fo 단백질을 절단할 수 있는 단백질가수분해 활성이 있는 성장배지에서 상기 세포를 배양하는 단계를 더 포함하고, 상기 세포를 배양하여 감염성 바이러스를 회수하고, 상기 배양된 세포에서 유래된 물질을 발육란의 요막 강에 접종하는 단계를 더 포함하는, 감염성 복사체 뉴캐슬병 바이러스를 생성하는 방법을 제공한다. 예를들면, 상기 물질은 세포 또는 세포 조각, 또는 상기 세포 배양물에서 유래된 (채취되거나 또는 동결-해동된) 상징액으로 구성된다.
예를들어, 본 발명은 감염성 바이러스를 회수하는 방법을 기재하고 있는데, 이 방법에서 트랜스펙트된 CEF 단층의 상징액은 발육란의 요막 강에 접종된다. 4일 후에, 요막액을 채취하여 적혈구 응집 분석법으로 분석한 후에, 발육란에서 더 계대배양한다.
또한, 본 발명은 요막액을 수확하고 발육란을 재접종하여 상기 감염성 복사체 뉴캐슬병 바이러스를 계대시키는 단계를 더 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서는, 이 방법에서 상기 바이러스가 렌토제닉 바이러스, 예를들면 NDV의 비-독성 야외에서 유래되거나, 또는 NDV LaSota 균주 같은 NDV의 백신으로부터 유래된 바이러스이다. 더우기, 이 방법은 한개 이상의 변이, 결실, 및/또는 삽입 또는 다른 변형들의 도입을 허용하는 유전학적 변형에 의해 조류-파라미쏘바이러스 게놈을 변형하는 방법이다. 예를들면, 이 방법은 예를들어 V 단백질 같은 바이러스 단백질을 코드화하는 cDNA를 변형하고 그리고 상기 변형된 cDNA를 전체 길이의 cDNA로 클론하고 상기 전체 길이의 cDNA로부터 감염성 복사체 바이러스를 생성하여, 새로운 NDV 균주들 또는 향상된 특성들을 가진 새로운 약독화된 생백신을 생성하여 조류 파라미쏘바이러스의 독성을 약화시키거나 변형시키는 방법이다.
유전자 생성물을 변형하여 약독화시키는 것과 별개로, 전사 및/또는 복제에 관련된 핵산을 변형하여 조류-파라믹소 바이러스를 약독화시키는 것이 또한 가능하다. 이런 변형들은 광범위한 세포에서 생체외 및 생체내 모두에서 절단성이고 그리고 결과적으로 종래 백신균주 보다 더 면역원성인 F 단백질 같은 야생형을 발현하는 약독화된 균주를 만들 수 있다.
더욱 바람직한 구체예에서는, 본 발명은 뉴캐슬병 바이러스 같은 조류 바이러스의 독성을 약화시키거나 변형시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 하기 절단 부위를 코드화하는 cDNA를 변형하여 바이러스 단백질의 프로테아제 절단 부위를 변형하는 단계를 포함하고, 또한 상기 cDNA를 예를들어 뉴캐슬병 바이러스의 게놈길이 cDNA로 클론하고, 감염성 복사체 뉴캐슬병 바이러스를 생성하는 단계를 포함한다. 상기 절단 부위는 예를들면 뉴캐슬병 바이러스의 F 또는 NH 단백질에서 프로테아제 절단부위이다. 일반적으로 약독화는 독성의 감소로 국한되지만, NDV의 상대적으로 비독성 균주를 사용하고, 이런 균주의 자손에 예를들어, 강한 독성을 특정화된 세포타입에서 증가된 복제 경향을 제공함에 의해 독성을 제공하는 것이 가능하다. 따라서, 분명한 독성 특징을 NDV에 제공하는 것이 이제 가능하다.
본 발명은 뉴캐슬병 바이러스 같은 조류 파라미쏘바이러스를 항원적으로 변형하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 적어도 한개의 면역지배적 에피토프를 장착하는 바이러스성 단백질의 적어도 일부를 코드화하는 cDNA를 변형시키는 단계를 포함하고, 상기 cDNA를 뉴캐슬병 바이러스의 게놈길이 cDNA에 클론시키고, 감염성 복사체 뉴캐슬병 바이러스를 생성시키는 단계를 더 포함한다.
본 발명은 예를들면 NDV(백신)의 감염성 복사체를 생산하는 방법을 사용하여 NDV를 변형시키는 방법을 제공하고, 재조합 마커 NDV 백신을 생산하는 방법을 제공하며, 이 마커 백신은 완전히 가능하거나 또는 요구되는 항원적으로 관련된 NDV 에피토프의 면역원성 스펙트럼을 포함하고, 그리고 혈청학적으로 관련된 에피토프 또는 마커가 재조합 기술로 제거되었기 때문에 야생형 NDV를 혈청학적으로 구분된다. 본 발명은 NDV 같은 조류 파라미쏘바이러스의 항원성 구성을 변형하는 방법을 제공하여, 예를들어 조류 파라미쏘바이러스 야외 균주들과 혈청학적으로 구별될 수 있는 생 NDV 마커 백신의 생산을 가능하게 한다.
한 구체예에서, 본 발명은 감염성 복사체 NDV를 제공하는데, 여기서 NDV의 NH 단백질은 예를들어 타입 2 또는 타입 4 조류 파라미쏘바이러스로부터 유래된 NH 단백질의 일부를 코드화하는 cDNA와 상기 NH 단백질의 일부를 코드화하는 cDNA를 재조합함으로서 변형된다. 상기 하이브리드 HN 단백질은 그래서 얻어진 감염성 복사체 NDV 균주에 대한 혈청학적 마커로서 작용하고, 따라서 조류 파라미쏘바이러스의 향성을 다른 세포 및/또는 조직으로 변화시키는 역활을 할 수 있다. 본 발명에 따른 이런 마커 균주들은 세계적인 상업적 집단에서 NDV의 유행을 판단하는 귀중한 도구인 백신의 생산을 가능하게 한다. 더우기, 이런 마커 백신들을 대규모로 적용하여 감염된 집단들의 집중적인 스크리닝 및 박멸 공정에 의해 완전히 NDV를 없앨 수 있게 한다.
또한, 본 발명은 한개 이상의 다른 병원체에 대한 항원을 발현하고 그리고 다중 질병들에 대한 백신 접종에 사용될 수 있는 감염성 복사체 NDV 균주를 생성하는 방법을 제공한다. 이런 감염성 NDV 바이러스는 예를들면 조류 인플루엔자(AI) (적혈구 응집소 (H5 및 H7), 뉴라미니다제), 조류 백혈증 바이러스(ALV) (env 단백질(gp85)), 닭 빈혈 바이러스(CAV) (VP1+VP2), 마레크 병 바이러스(MDV) (당단백질 B (gB), gH), 감염성 라린고트라케이티스 바이러스 (ILT) (gB, gH, gD), 감염성 부르살(brusal)병 바이러스(IBDV) (VP2 및 VP3), 칠면조 리노트라케이티스 바이러스 (TRT) (융합 (F) 단백질), 조류 파라미쏘바이러스-2,-3,-6,(PMV) (F-단백질, 적혈구응집소 뉴라미니다제(HN),또는 기타 감염성 기관지염증 바이러스(IBV) (페플로머 단백질, 뉴클레오프로테인), 레오바이러스(시그마 단백질), 아데노바이러스, 뉴모바이러스, 살모넬라 장염 바이러스, 캄피로박터 제쥬니, 대장균, 보데텔라 아비움(종전의 알칼리 대변균), 헴피루스 파라갈리나룸, 서역균, 오니토박테리움 리노트라케알레, 리에멜라(종전의 파스테렐라) 아나티페스티퍼, 미코플라스마타 (엠. 갈리셉티쿰, 엠. 시노비에, 엠. 메레아그리디스, 엠. 아이오와에) 또는 아스퍼길리(에이. 플라버스, 에이. 퓨미가투스)에서 얻어진 이종성 단백질를 코드화하는 이종성 cDNA를 포함한다.
본 발명은 다른 가금류 병원체 유래의 항원 발현을 위해 백신 벡터로서 사용될 수 있는 조류 파라미쏘바이러스 또는 그것의 유래된 균주들을 제공한다. 몇몇 특성들은 NDV를 호흡기 또는 장 질환에 대한 백신 접종을 위한 이상적인 백신 벡터로 만든다. 1) NDV는 발육란에서 높은 역가로 쉽게 배양될 수 있다. 2) 발육란에서 대량으로 NDV를 배양하는 것은 것은 비교적 비용이 싸다. 3) NDV 백신은 비교적 안정되고, 물주기 또는 스프레이, 에어로졸 형성과 같은 대량 적용법으로 단순하게 투여될 수 있다. 4) NDV의 자연적 감염 경로는 호흡기 및/또는 소화기이고, 이것은 또한 많은 다른 가금류 병원체의 주요한 천연 감염경로이다. 5) NDV는 순환하는 모계 항체가 존재함에도 불구하고 국소적인 면역성을 유도해 낼 수 있다.
NDV는 강력한 항암효과(antineoplastic) 뿐만아리라 면역 자극 특징을 가지고 있다고 알려져 있다(Schirrmacher et al., 1998) [Schirrmacher, V., Ahlert, T., Steiner, H.H. , Herold-Mende, C., Gerhards, R. and Hagmuller E. (1998) Immunization with virus-modified tumor cells Seminars in Oncology 25: 677-696]. NDV는 정상 인간세포에서는 생산적으로 복제를 할 수 없지만, 인간의 암세포를 선택적으로 NDV-매개하여 죽이는 것은 보고되었다. 국소적 NDV 치료후에, 바이러스 종양과 인간 종양 이종이식편이 경감하는 것이 누드 마우스에서 관찰되었다. 이것은 종양 치료에서 NDV를 사용할 수 있게 한다. 그러나, 문제는 이런 적용는 국소 치료에 제한된다는 것이다.
NDV 감염은 인터페론, 케모킨, 다른 잠재적으로 중요한 유전자 생성물을 유도하고, 다형질 발현성(pleiotropic) 면역-자극 특성을 종양세포에 도입한다. 이 개념은 NDV로 감염된 새로운 작용 표본으로 이루어진 자가 종양 세포 백신을 생산하는데 사용되고 있다. 이런 종류의 백신은 자가 종양 백신-NDV 또는 ATV-NDV로 불리어진다(Schirrmacher et al., 1998). NDV 감염된 세포는 세포분열를 방해하는 감마선 조사로 비활성이 되지만, 감염된 세포의 세포질에서는 NDV 복제를 가능하게 한다. ATV-NDV를 환자에게 접종한 후에, T-세포는 NDV로 유도된 케모킨을 통해서 모아진다. 이들 T-세포의 일부는 세포 표면에서 조직적합성 복합체 클래스 I 분자와 복합체에서 종양-관련 항원 유래의 펩티드와 상호작용할 수 있는 T-세포 수용체를 발현할 수 있다. 이 상호작용은 결과적으로 자가 종양세포을 특이적으로 사멸할 수 있는 세포독성 T-세포 반응의 유도를 가져온다.
본 발명은 NDV 감염으로 유도된 케모킨과 면역자극 단백질의 레파토리와 양을 조절할 수 있게 한다. 본 발명은 이종 유전자를 삽입시키고 발현하기 위해 변형된 재조합 NDV를 생성하는 방법을 제공한다. 이런 재조합 NDV는 감염된 세포에서 면역 자극 단백질의 레파토리와 양을 변형시키는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 인간 인터페론, 케모킨, 또는 다른 면역 자극 단백질들을 코드화하는 유전자를 혼입하고 발현하는 재조합 NDV를 제공한다. 상기 재조합 NDV는종래의 ATV-NDV 보다 훨씬 강력한 ATV-NDV를 생성하는데 사용된다. 예를들면: 사이토킨 INF-α, -β, TNF- α, IL-1, IL-6, 케모킨 RANTES IP-10; HSP, ACTH, 엔돌핀, iNOS, EPA/TIMP, NFkB 등의 다른 유전자이다. NDV의 다형질 발현성 면역 자극 특성들은 감염성 질환에 대한 동물과 인간 백신 접종의 보조제로 사용될 수 있는 것이다. 본 발명의 한 구체예에서, 감염 제제의 적절한 항원을 코드화하는 외래 유전자는 NDV게놈에 도입되고, 감염된 세포로 항원 및 면역 자극 단백질의 동시 발현은 감염성 제제에 대한 강력한 면역 반응을 유도할 것이다. 본 발명의 다른 구체예에서, NDV의 면역 자극 특성은 항원과 특이적인 면역 자극 단백질을 동시에 발현시키는 NDV 재조합제를 사용함에 의해 더욱 강화될 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서는, 본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스의 적당한 항원을 발현하는 NDV 재조합제를 단독으로 또는 면역 자극 단백질과 조합하여 사용하여 AIDS 백신을 생성하는데 이용될 수 있다.
NDV는 또한 감염성 질환에 대한 동물과 인간의 백신 접종 보조제로서 사용될수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 감염성 제제의 적당한 항원을 코드화하는 이종 또는 외래 유전자는 NDV 게놈에 도입되고, 그리고 감염된 세포들에 의한 항원 및 면역 자극 단백질의 동시발현은 감염 제제에 대한 강력한 면역 반응을 유발할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, NDV의 면역 자극 특징은 항원 및 특이 면역 자극 단백질을 동시에 발현하는 NDV 재조합체를 사용하여 더욱 강화될 수 있다. 더욱 바람직한 구현에세서, 본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스에 적당한 항원을 발현하는 NDV 재조합체를 단독으로 또는 면역 자극 바이러스와 조합시켜 사용하여 AIDS 백신을 생성하는데 사용될 수 있다.
또한 자가-제한 비-독성 (담체) 백신으로서 사용될 수 있는 조건부 치사 NDV 결실 돌연변이체를 생성하는 방법이 제공된다. NDV 결실 돌연변이체는 내부 세포막에서 NDV의 발아에 관련된 매트릭스(M) 단백질을 발현할 수 없도록 생성된 것이다. 본 발명은 여전히 세포를 감염시키고 그리고 세포-대-세포 전이를 통하여 전염시킬 수 있는 M 단백질을 발현할 수 없는 표현형적으로 보완(complemented) NDV 균주를 제공한다. 그러나, 돌연변이 바이러스는 비-보완 세포에서 감염성 자손을 생성할 수 없다. 이것은 표현형적으로 보완 NDV 결실 돌연변이체가 환경에 전파될 수 없는 안전한 자가-제한 백신으로 사용될 수 있음을 보여준다. 이 비-전파성 백신은 생백신의 가장 중요한 장점(예, 약효)을 사멸된 백신의 가장 중요한 장점(예, 안전성)과 결합시킨다.
본 발명은 예를들면 발육란 또는 적절한 세포에 계대하여 또는 더 배양시킴에 의해 뉴캐슬병 바이러스, 또는 본 발명에서 제공하는 방법으로 얻을 수 있는 감염성 복사체 바이러스에서 유래된 그것의 유래 균주를 제공한다.
예를들어, 독성을 약화시커거나 변형되거나, 항원적으로 변형된 이종성 한원을 발현하는 또는 비전염성이거나 또는 그들의 조합의 감염성 복사체 뉴캐슬병 바이러스를 생성하는 적어도 한가지 방법을 변형된 NDV가 제공된다.
여기서 본 발명은 분명한 독성 또는 항원적 특징들을 가진 것으로 특징지어진 NDV 백신을 제공하며, 이는 마커 백신 목적 및/또는 다른 병원체에서 유래된 이종 항원을 발현하고, 독성 및/또는 비-전파성 형태이다.
그러한 백신은 사멸 또는 생백신일 수 있다. 바람직하기는 그러한 백신이 생백신이나, 본 발명에서 제공하는 사멸 백신은 예를들면 무역의 제한이나 또는 질병 조절 당국에 의한 다른 제재 때문에, 생백신이 적용될 수 없거나 또는 거의 적용되지 않는 조건에서는 바람직하다.
여기서 본 발명은 상기 혈청학적으로 적절한 면역 에피토프 또는 마커에 대한 항철를 검출하는 진단 방법 및 상응하는 테스트 키트를 제공하여, 가금류에서 다른 가금류 질환 및/또는 NDV를 조절 및/또는 박멸법을 실행하는 수단과 방법을 제시한다. 본 발명은 야외 바이러스 및 종래-타입 백신에서 혈청학적으로 구별될 수 있는 새롭고 효과적인 백신을 제공한다. NDV 마커 백신으로 불리우는 그러한 새로운 백신은 항원적으로 적당한 NDV 애피토프의 완전히 가능한 면역원성 스펙트럼을 제공하고, 그리고 진단방법과 키트를 동반하여 적용하여 야생형 NDV와 혈청학적으로 구별된다.
본 발명은 백신접종 되지 않은 동물과 본 발명에 따른 NDV 백신으로 백신 접종된 동물을 야생형 NDV에 감염되거나 또는 변형되지 않은 메소제닉 또는 렌토제닉 NDV-백신 균주로 백신 접종된 동물들을 구별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 동물에서 적어도 하나의 시료(예를들면, 혈청, 혈액, 알 또는 누액) 취하고 그리고 상기 시료에서 야생형 또는 변형되지 않은 NDV로 발현되지만 본 발명에 따른 백신으로는 발현되지 않는 면역지배적 에피토프에 대한 항체 또는 마커의 존재를 검출하는 것으로 이루어진다.
본 발명은 상기 항체가 NDV의 HN 또는 F 단백질에 대한, 예를들어 본 명세서의 실험부에 기재된 하이브리드 단백질인 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 예를들면, 가금류 특히 닭으로 이루어진 그룹에서 상기 동물이 선택되는 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 동물들을 혈청학적으로 구별하는 방법에 사용할 수 있는 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 한 구체예에서, 단순하고 빠른 적혈구 응집-저해(HI) 테스트는 백신 접종된 동물과 감염된 동물을 구별하는데 사용된다. NDV의 HN의 완전한 구형 헤드가 다른 세로타입의 HN에 상응하는 부분으로 대체된 마커 백신으로 백신처리한 동물은 항체를 NDV의 HN을 유도시키지 않으므로, NDV 비리온에 의한 적혈구 응집 반응을 억제하지 않는다.
HI 테스트에서 마커 백신 비리온을 사용함에 의해, 하이브리드 HN 단백질에 대한 항체가 검출되고 그리고 백신 접종후 효율성의 측정에 사용될 수 있다. 대체물로서, NDV의 F 단백질에 대한 항체를 검출하는 ELISA가 백신 접종의 효율성을 측정하는 데 사용된다.
HI 테스트와는 별도로, ELISA는 NDV의 HN에 대한 항체들의 존재를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 테스트에 사용될 항원은 예를들면 재조합 DNA 기술들에 의해 발현된 NDV의 HN 또는 NDV의 HN 유래의 보존된 펩티드이다. 블로킹 ELISA가 또한 사용될 수 있다. 이 경우에, NDV의 HN의 보존된 에피토프들에 대한 하나 이상의 모노클로날 항체들은 경합하는 항체들이 백신 접종된 동물로부터의 시료들에 존재하는지 아닌지를 결정하기 위해 사용된다. ELISA 테스트는 만약 마커 백신이 단지 키메라 HN 단백질을 함유한다면 또는 NDV의 HN의 몇몇 에피토프들이 대체된 경우에 유익하게 사용될 수 있다.
본 발명은 제한할 의도 없이 하기의 실험부(실시예)에 의해 더 설명된다.
실험부
재료 및 방법들
표준 클로닝 과정들은 다른 언급이 없다면 Sambrook et al. (1989)에 따라 수행하였다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의하여 생산된 DNA 단편들을 포함하는 모든 축조는 서열 분석에 의해 증명하였다. 하기에 주어진 프라이머 서열들에서, 밑줄친 뉴클레오티드들은 NDV 서열들에 대응하고 그리고 NDV 게놈내의 위치가 지적되어 있다. 클로닝에 사용된 제한 부위들의 뉴클레오티드 서열은 굵은 활자로 표시되어 있다.
세포 및 바이러스
CER 세포들 (Smithe et al., 1976)은 5% 태아 소 혈청 및 1000U/ml 페니실린, 1000㎍/ml 스트렙토마이신, 20㎍/ml 펀자존(Fongizone), 500㎍/ml 폴리마이신 B 및 10㎍/ml 카나마이신을 함유한 2% 항생제 혼합물을 함유하는 GMEM/EMEM(1:1)에서 배양되었다. QT35 세포들(Moscovici et al., 1977; Cho, 1982)은 5% FCS 및 2% 항생제 혼합물로 보충된 GibcoBRL/Life Technolohies (cat.no. 041-91536; Fort Dodge의 독점 조성물)에 의해 공급되는 배지에서 배양되었다. QM 세포들(Antin and Ordahl, 1991)은 10% 트립토스 인산염 브로스, 10% FCS 및 2% 항생제 혼합물로 보충된 M199 배지에서 배양되었다.
NDV 균주 LaSota는 ATCC (ATCC VR-699)로부터 수득되었고 그리고 발육란에서 두번 계배배양 하였다. 우리가 cDNA의 축조 및 클로닝을 시작하기 전에, 이 바이러스는 초기 닭 배아 피브로블라스트 (CEF)상에 3 라운드 플라크 정제에 의해 정제된 플라크였다. 이 때문에, 이 바이러스는 5% 태아 소 혈청, 2% 항생제 혼합물, 5% 요낭액, 30mM MgCl2, 200㎍/ml DEAE-덱스트린 (Sigma) 및 0.8% 한천 Nobel (Difco)를 함유하는 GMEM/EMEM(1:1)에서 배양된 CEP 세포들 위로 적정하였다. 플라크 정제의 세번째 라운드로부터의 바이러스 (클론 E13-1로 지정된)를 발육란에서 배양하였고 그리고 접종 4일 후, 요낭액을 수확하고 -70℃에서 분취량으로 저장하였다. T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 계두 재조합 바이러스 fpEFLT7pol (Britton et al., 1996; 이후부터는 FPV-T7로 칭함)은 Michael Skinner 박사로부터 제공되었고 QT135 세포상에서 배양하였다.
바이러스성 RNA의 단리
모든 조작은 RNase가 없는 유리제품 및 플라스틱 제품에서 수행되었고 그리고 모든 용액들은 1% 디에틸-피로카보네이트 (DEPC)로 처리되고 오토클레이브로 살균된 RNase-없는 물로 구성되었다. 바이러스를 Beckman SW40 로터에서 40℃, 21000rpm에서 70분간 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 이 펠렛을 균질화 완충액 (50mM Tris HCl pH7.5, 50mM EDTA, 0.5% SDS)에 재현탁했고 일정한 교반을 하면서 37℃에서 90분간 프로테아제 K(200㎍/ml)로 처리하였다. 용균물(lysate)을 pH 5.4의 페놀/클로로포름 (1:1)의 동일 용량으로 두번 그리고 클로로포름의 동일 용적으로 한번 추출하였다. 바이러스성 RNA를 pH 5.3의 3M NaOAC 0.1 용량 및 100% 에탄올 2.5 용량의 첨가로 수(水)상으로부터 침전하였다. 침전물을 원심분리로 모았고, 70% 에탄올로 한번 세척하였고, 물에 재현탁했고 그리고 -70℃에서 분취량으로 저장하였다.
역 전사
바이러스성 RNA(1.5㎍)을 12㎕ 용적에서 500ng의 프라이머와 혼합했고 그리고 70℃에서 10분간 배양하였다. 5×RT 완충액 4㎕ (250mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15mM MgCl2; GibcoBRL/Life Technologies), 0.1M DTT 2㎕ 및 10mM dNTP들(각각 2.5mM) 2㎕을 첨가했고 혼합물을 42℃에서 2분간 배양하였다. 역 전사는 최종 20㎕ 용적에서 역 전사효소 (Superscript II; GibcoBRL/Life Technolohies)의 200 유니트를 첨가하고 42℃에서 60분간 인큐베이트함에 의해 수행하였다.
폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)
NDV 게놈의 3' 및 5' 말단을 결정하기 위해 사용되었던 모든 PCR 반응들을 (하기 참조) Taq DNA 폴리머라제 (Perkin Elmer)를 사용함에 의해 수행하였다. 개개의 NDV 유전자들 및 대 서브게놈성의 cDNA들을 클로닝하기 위하여, 교정(proofreading) DNA 폴리머라제 Pwo, 또는 Taq 및 Pwo의 혼합물들 (Expand High Fidelity Kit 또는 Expand Long Template Kit)을 공급자의 지시에 따라 사용하였다 (Boehringer Mannheim). 모든 시료들을 PCR 사이클의 지시된 수를 시작하기 전에 94℃에서 2분간 인큐베이트 하였다. 지시된 수의 PCR 사이클 후에, 시료들을 적어도 3×PCR 사이클의 신장시간 동안 신장온도에서 인큐베이트 하였다. PCR 단편들을 고 순도 PCR 생성물 정제 키트 (Boehringer Mannheim)를 사용함에 의해 또는 아가로스 겔 전기영동 후에 공급자들에 의해 기재된 바와 같이 QiaexII 추출 키트 (Qiagen)을 필수적으로 사용함에 의해 직접적으로 정제하였다.
서열 분석
모든 서열은 PRISM Ready Reaction Dye Deoxy 터미네이터 사이클 서열화 키트 (Perkin Elmer)를 이용하여 결정하였다. 반응 혼합물들(5㎕)은 GeneAmp2400 열순환기에서 25 사이클의 선형 증폭(94℃에서 10초, 50℃에서 5초, 및 60℃에서 4분)을 했다. 연이어서, 이 반응 혼합물들을 에탄올로 침전시키고, 70% 에탄올로 한번 세척하고, 15㎕ TSR 완충액(Perkin Elmer)에 재현탁하고, 그리고 Applied Biosystems AB310 자동 서열화기에 로딩하기 전에 94℃에서 2분간 가열하였다.
NDV 균주 LaSota의 완전 게놈을 서열화하기 위해 사용된 프라이머들의 뉴클레오티드 서열들은 공개된 서열들 또는 서열화 프로젝트 동안에 수립된 서열들로부터 유래된 것이었다. 이 프라이머들은 표1에 도시되어 있다.
NDV 균주 LaSota 게놈의 3' 및 5'의 클로닝 및 서열화
NDV 게놈의 3' 및 5' 말단의 뉴클레오티드 서열을 RACE 과정들 (cDNA 말단들의 신속한 증폭)을 사용하여 결정하였다. NDV RNA를 NDV의 L-유전자의 공개된 서열로 (Yousoff et al., 1987)부터 유래된 프라이머 p360(5'-GGCGATGTAATCAGCCTAGT-GCTT-3', nt 14756-14779)을 사용하여 20㎕의 최종 용량으로 역전사 반응에 이용였다. 단일-가닥 cDNA (RT 혼합물 2.5㎕)를 8pmol 앵커프라이머(anchorprimer) ALG3 (5'-CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC-3')에 첨가하였고, Tessier 등(1986)에 의해 기재된 바와 같이, 실온에서 50mM Tris-HCl pH 8.0, 10mM MgCl2, 10㎍/ml BSA, 25% PEG, 1mM HCC, 20μM ATP 및 T4 RNA 리가제 10 유니트 (New England Biolabs)을 함유하는 반응 혼합물 20㎕에서 밤새 연결시켰다. 연결 반응물 1㎕를 프라이머 p375 (5'-CAATGAATTCAAAGGATATTACAGTAACT-3'; nt 14964-14983) 및 ALG4 (5'-GAAGGATCCA-GAATCGATAG-3')를 이용하는 PCR 반응에서 주형으로 사용하였다. 후자의 프라이머는 앵커프라이머 ALG3에 상보적이다. PCR 조건 (40 사이클)은 다음과 같다: 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 및 72℃에서 2분. PCR 생성물들은 정제하고 T-벡터 pBluescriptII-TSK에서 클론하였다 (Inchihara and Kurosawa, 1993). 또한, 정제된 PCR 생성물들을 블런트 말단을 만들기 위하여 Klenow DNA 폴리머라제 I으로 처리하고 플라스미드 pGEM4Z의 HincII-부위에 클론하였다 (Promega). 13개의 독립 클론들 (8×pBleuscriptII-TSK 및 5×pGEM4Z)를 NDV 균주 LaSota 게놈의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 서열화했다. 3' 밀단의 뉴클레오티드 서열은 두개의 독립된 방법으로 결정했다. 방법 I에서, 프라이머 ALG3이 Schutze 등(1995)에 의해 기재된 바와 같이 T4 RNA 리가제를 사용함에 의해 바이러스성 RNA의 3' 말단에 연결되었다. 반응 혼합물 (최종 용량 10㎕)은 2.5㎍ NDV RNA, 100pmol ALG3, 1㎕ 10×T4 RNA 리가제 완충액 (500mM Tris-HCl pH 7.8, 100mM MgCl2, 100mM DTT, 10mM ATP), 1㎕ DMSO, 1㎕ 10μM 헥사민-코발트클로라이드, 1㎕ RNasin (Promega) 및 T4 RNA 리가제 10 유니트 (New England Biolabs)를 함유했다. 이 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이트했고 연결 혼합물 5㎕를 ALG4를 프라이머로 사용함에 의한 역 전사 반응에서 주형으로 사용하였다. RT-반응의 1㎕를 프라이머 ALG4 및 NDV의 3' 말단의 공개된 서열로부터 유래된 p376 (5'-GAGCCTTAAGGAGCTGC-TCGTACTGATC-3'; nt 137-164)를 사용함에 의한 PCR 반응에 사용하였다 (Ishida et al., 1986). PCR 조건은 5' RACE에 대해 상기에서 언급한 바와 같다. 방법 II에서, NDV RNA의 3' 및 5' 말단을 상기 방법 I에서 기재된 바와 같은 동일한 조건들을 이용하는 T4 RNA 리가제를 사용함에 의해 서로서로 연결하였다. 이 연결 혼합물 5㎕를 프라이머 p360을 사용함에 의한 역 전사 반응에서 주형으로 사용하였다. RT-반응물의 1㎕를 프라이머 p375 및 p376을 사용하는 PCR 반응에 사용하였고 PCR 조건은 5'-RACE에서 언급한 바와 같았다. PCR 생성물들을 블런트 말단을 만들기 위하여 Klenow DNA 폴리머라제 I으로 처리하고 플라스미드 pGEM4Z의 HinDII-부위에 클론하였다 (Promega). 10개의 독립 클론들 (방법 I에서 4개 및 방법 II에서 6개)을 NDV 균주 LaSota 게놈의 3' 말단의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 서열화했다.
전사 벡터의 축조
저-복사-수 전사 벡터를 기본 리플리콘으로서 플라스미드 pOK12 (Vieira and Messing, 1991)을 사용하여 축조하였다. 플라스미드 pOK12을 PvuII로 소화했고 복제 기원 및 카나마이신-내성 유전자를 함유하는 DNA 단편을 분리하였다. 이 DNA 단편을 전사 벡터 2.0 (Andrew Ball 박사의 선물; Pattnaik et al., 1992)의 유래의 Eco47III-AflII 단편 (AfIII 부위는 Klnenow DNA 폴리머라제 I을 사용하여 블런트로 만들었다)에 연결하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드으로부터 XbaI-NheI 단편을 가능한한 더 독특한 제한 부위들을 제거하기 위하여 삭제하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드를 pOLTV5로 명명하였다 (도5 참조). 전사 벡터 pOLTV5는 T7 DNA 의존 RNA 폴리머라제 프로모터와 뒤이은 독특한 StuI 및 SmaI 제한 부위들, 헤파티티스 델타 바이러스 (HDV) 유래의 자동촉매성 리보자임 및 박테리오파지 T7 유래의 전사 종결 시그널을 함유한다. StuI 및 SmaI 제한 부위 사이에 클론된 DNA 단편들은 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 생체외 또는 생체내에서 정사될 수 있다. 전사 후, 결과적으로 생성되는 전사체들의 5' 말단은 플라스미드에 의해 코드화되는 두개의 G 잔기를 함유한다. HDV 리보자임의 자동촉매 작용때문에, 이 전사체들의 3'-말단은 클론된 DNA 단편의 정확한 말단 뉴클레오티드에 대응한다 (Pattnaik et al., 1992).
미니게놈 플라스미드의 축조
NDV의 복제 및 전사를 위한 요구조건들을 시험하기 위하여, 모든 NDV 유전자들을 대체한 리포터 유전자에 접하는 NDV의 3' 및 5' 말단 영역들을 함유한 미니게놈 플라스미드들을 축조하였다 (도 2). NDV의 3' 및 5' 말단 영역에 상응하는 DNA 단편들을 Pwo DNA 폴리머라제 (30 사이클: 94℃에서 15초, 50℃에서 30초, 및 72℃에서 30초)을 사용하여 그리고 주형으로서 3' 및 5' RACE 단편들을 함유하는 플라스미드들을 사용하여 PCR에 의하며 생산했다 (상기 참조).
3' 영역 (nt 1-119)을 프라이머 3UIT (5'-ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3', nt 1-27) 및 SEAP3 (5'-ATCGATACTGGTCAGCATGCTGGCAGAAGGCTTTCTCG-3', nt 102-119)를 사용함에 의해 생산했다. 5' 영역 (nt 14973-15186)을 프라이머 SEAP5 (5'-GC-ATGCTGACCAGTATCGATATTACAGTAACTGTGACT-3', nt 14973-14990) 및 5NDV (5'-ACCAAAC-AAAGATTTGGTGAATGACGA-3', nt 15158-15186)를 사용함에 의해 생산했다. 두 개의 DNA 단편들을 프라이머 3UIT 및 5NDV를 사용하여 중복 PCR (중복은 상기에서 도시된 프라이머 서열들에서 이탤릭자로 도시되어 있다)에서 합쳤다. 결과적으로 생성되는, 20 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있는 NDV의 3' 및 5' 말단의 융합인 DNA 단편을 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 처리함에 의해 인산화하였고 그리고 StuI 및 SmaI으로 절단하고 송아지 장내 포스파타제로 탈안산화된 (Boehringer Mannheim) 전사 플라스미드 pOLTV5 (도 1)에서 양 방향으로 클론하였다. 마지막으로, SEAP-유전자 (분비된 알카리성 포스파타제)를 SphI 및 ClaI으로 소화함에 의해 플라스미드 pSEAP-Basic(Clonetech)으로부터 회수했고 그리고 NDV의 3' 및 5' 말단 사이의 SphI와 ClaI 부위 사이에 클론하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드들을 각각 pOLTV535 및 pOLTV553으로 명명하였다. 플라스미드 pOLTV535의 T7 RNA 폴리머라제를 사용하는 생체내 또는 생체외 전사는 항-게놈성 RNA([+]-RNA)를 발생하는 반면에, 플라스미드 pOLTV553의 전사는 게놈성 RNA([-]-RNA)를 발생한다.
플라스미드 pOLTV535NO 내지 -N5 및 pOLTV553N0 내지 -N5를 각각 pOLTV535 및 pOLTV553내의 SEAP-유전자와 NDV의 5' 말단 사이에 위치된 ClaI-부위에 자기-상보적 올리고뉴클레오티드를 삽입함에 의해 생산하였다 (도 2 참조). 사용된 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다: NO, 5'-CGCGAGCTCG-3'; N1, 5'-CGCGAGSCTCG-3'; N2, 5'-CGCGAGCGCTCG-3'; N3, 5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; N4, 5'-CGCGAGCATGCTCG-3'; N5, 5'-CGCGAGCASTGCTCG-3' (W=A 또는 T; S=C 또는 G).
플라스미드 pOLTV535 및 pOLTV553내의 T7 프로모터의 변형
NDV의 진정한 5' 및 3' 말단을 함유하는 전사체들을 생체외 또는 생체내에서 생산하기 위하여, 플라스미드 pOLTV535 및 pOLTV553의 T7 프로모터를 전사가 NDV의 3' 또는 5' 말단의 첫번째 뉴클레오티드에서 개시하도록 변형하였다. 프라이머들은 다음을 함유하게 디자인했다: 1) BglI-제한 부위, 2) T7 프로모터의 말단의 두개의 G 잔기들이 A 잔기로 대체되게 변형된 T7 프로모터의 서열 (이탤릭체로 도시됨), 및 3) NDV의 3' (nt 1-21) 또는 5' 말단 (nt 15164-15186). 프라이머 BGL3F2 (5'-GATATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTATAACCAAACAGAGAATCCGTGAG-3') 및 SEAP3 (상기 참조)를 변형된 T7 프로모터 및 pOLTV535의 SEAP 유전자의 개시점까지 NDV의 3' 말단 전체를 함유하는 DNA 단편을 생산하기 위해 사용하였다. 유사하게, 프라이머 BGL5F2 (5'-GATATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTATAACCAAACAAAGATTTGGTGAATG-3') 및 SEAP5를 사용함에 의해 변형된 T7 프로모터 및 pOLTV553의 SEAP 유전자의 끝까지 NDV의 5' 말단 전체를 함유하는 DNA 단편을 생산하였다. 결과적으로 생성되는 단편들을 각각 BglI 및 SphI (3' 말단) 또는 BglI 및 ClaI (5' 말단)으로 소화하였고, 그리고 pOLTV535의 BglI-SphI 단편 또는 pOLTV553의 BglI-ClaI 단편을 대체하기 위하여 사용하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드들을 각각 pOLTV735 및 pOLTV753으로 명명하였다. 플라스미드 pOLTV735N3 및 pOLTV753N3을 각각 pOLTV735 및 pOLTV753에서 SEAP-유전자 및 NDV의 5' 말단 사이에 위치한 ClaI 부위에 자기-상보적인 올리고뉴클레오티드 (5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; W=A 또는 T)를 삽입함에 의해 생산하였다.
SEAP-리포터 플라스미드의 축조
플라스미드 pCIneoSEAP를 진핵 발현벡터 pCIneo (Promega)의 XhoI 및 SmaI 부위들 사이에 플라스미드 pSEAP-Basic (Clontech) 유래의 SEAP-유전자를 함유하는 XhoI-ClaI 단편 (ClaI-부위는 Klenow DNA 폴리머라제 I에 의해 블런크로 만들었다)을 클로닝함에 의해 축조하였다. 후자의 박테리오파지 T7 프로모터에 더하여 인간 시토메갈로바이러스 (hCMV)을 함유한다. 단지 T7 프로모터로부터 생산된 전사체들에 의한 SEAP 발현을 시험하고 정량하기 위하여, 또 다른, hCMV 프로모터가 부족한 플라스미드를 축조하였다. 이 때문에, hCMV 프로모터를 HindIII로 부분적으로 소화하고 이어서 BglII로 완전히 소화함에 의해 pCIneo로부터 제거하였다. hCMV 프로모터가 제거된 DNA 단편(Clontech의 번호에 따르면 nt 756-5469)을 단리하고, 블런트 말단을 만들기 위해 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고 그리고 T4 DNA 리가제를 사용함에 의해 재원형화하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드를 pCIneoD로 명명하였다. 마지막으로, SEAP 유전자를 MluI-AccI 단편으로서 pSEAP-Basic으로부터 회수했고, 그리고 pCIneoD의 MluI 및 ClaI 부위 사이에 클론하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드를 pCIneoD SEAP로 명명했다.
트랜스팩션
세포들을 24-웰 배양 디쉬에 접종하고 60-80% 컨플루언시(confluency)로 밤새 배양하고 그기고 37℃에서 1시간 동안 FPV-T7를 가지고 1 m.o.i로 감염시켰다. 이 세포들을 기본적으로 공급자 (GibciBRL/Life Technologies)에 의해 기재된 바와 같이 LipofectAMINETM3㎕ 및 OptiMem을 사용함에 의하여 0.5㎍ 미니게놈 플라스미드 DNA로 트랜스펙트시켰다. 37℃에서 4시간 (CER 세포들) 또는 16시간 (QM5 세포들)동안 인큐베이트한 후, 세포들을 NDV (네덜런드 감염성 단리체 nr. 152608;웰당 200㎕)를 가지고 1시간 동안 5 m.o.i.로 감염시키거나 또는 감염되지 않는채로 남겨두었다. 접종물을 흡입기로 빨아내고 완전 배지 1ml로 대체했고 그리고 세포들을 37℃에서 더 인큐베이트하였다. 공-트랜스펙션을 의하여, 세포들을 6-웰 배양 디쉬에서 배양하였고 그리고 상기에서 언급된 바와 같이, FPV-T7로 감염시켰다. 세포들을 8㎕의 LipofectAMINE 또는 9㎕의 FuGeneTM6 (Boehringer Mannheim)을 이용함에 의해 0.25㎍ 미니게놈 플라스미드 DNA, 0.4㎍ pCIneoNP, 0.2㎍ pCIneoP 및 0.2㎍ pCIneoL(c) 또는 pCIneo로 공-트랜스펙트하였다. 감염성 바이러스를 생산하기 위하여, 미니게놈 플라스미드를 전체-길이 NDV cDNA를 함유한 전사 플라스미드에 의해 대체하였다.
SEAP 활성의 정량화
트랜스펙트된 세포의 배지로 분비된 SEAP의 양을 분비된 기본적으로 공급자(Tropix)에 의해 기재된 바와 같이 알카리성 포스파타제 키트를 위한 Phospha-LightTMChemiluminescent Reporter Assay를 이용함에 의해 일회용 96-웰 플레이트에서 측정하였다. 화학발광을 액체 섬광 계수기 (Wallac 1450 microbeta PLUS)를 사용하여 정량하였다.
NDV 균주 LaSota의 전체 게놈에 산재하는(spanning) cDNA들의 클로닝 및 서열화
NDV 균주 LaSota의 전체 게놈을 클론하고 서열화하기 위하여, 대(大) 서브게놈성 cDNA 클론들을 RT-PCR에 의해 생산하고 pGEM-T에 클론하였다. 첫번째 가닥 cDNA 합성을 상기에 언급된 바와 같이 프라이머 3UIT를 사용하여 수행하였고, 그리고 RT반응물 1㎕를 Expand Long Template PCR 키트 (Boehringer Mannheim)을 사용함에 의한 PCR 반응에 사용하였다. PCR은 94℃에서 10초, 58℃에서 30초 및 68℃에서 6분의 5 사이클, 뒤이어 94℃에서 10초, 58℃에서 30초, 및 68℃에서 6분의 10 사이클로 구성되었고, 여기서 68℃에서 연장 시간이 사이클마다 20초로 증가했다. PCR 단편들을 기본적으로 공급자 (Promega)에 의해 기재된 바와 같이 pGEM-T 클로닝 키트를 사용함에 의해 pGEM-T에 클론했다. 연결 혼합물들을 E. coli 균주 SURE II (Stratagene)으로 형질전환했다. 두개의 독립된 RT-PCR 반응 (A 및 B)을 수행했고 그리고 각각 유사 세트의 cDNA 클론들을 산출했다. 서브게놈성 cDNA 클론들의 뉴클레오티드 서열을 NDV-특이적 프라이머들 (표1)을 사용함에 의해 그리고 삽입체들에 접해있는 프라이머들에 의해 결정했다. A 및 B 시리즈의 클론들의 뉴클레오티드 서열을 비교후, 남아있는 불명료함은 세번째 독립된 시리즈 (C 시리즈)의 cDNA들의 관련 영역을 서열화함에 의해 해결되었다. NDV 균주 LaSota의 뉴클레오티드 서열은 도3에 도시되어 있다.
NDV의 전체 길이 게놈성 cDNA의 축조
전체-길이 NDV cDNA를 개시 플라스미드로서 pOLTV535를 사용함에 의해 전사 플라스미드 pOLTV5에 조립하였다. DNA 단편들을 도4에 도시된 바와 같이 통상의 제한효소들을 사용하여 중복에 연결했다. 시리즈의 클로닝 단계들에서, 위치 3512 및 12355의 ClaI-부위들을 연결하여 생성된 ClaI-부위에 의해 분리된 뉴클레오티드 1-3521 및 12355-15186을 함유하는 플라스미드 (p535-DI로 명명된)를 축조했다. 또 다른 시리즈의 클로닝 단계들에서, 뉴클레오티드 3521-12355 (ClaI 단편)을 포함하는 NDV 게놈의 일부를 함유하는 플라스미드 (pGEM-B로 명명됨)을 축조하였다. 클로닝을 촉지하기 위하여, 후자의 ClaI 단편을 플라스미드 pACYC184 (Chang and Cohen, 1978) 유래의 클로람페니콜 내성(Cm) 유전자로 태그하였다. 이 때문에, Cm-유전자를 프라이머 CAT-F (5'-GCGTACGTCTAGACTGGTGTCCCTGTTGATACCGG-3') 및 CAT-R (5'-GCTCTAGACGTACGACCCTGCCCTGAACCGACG-3')를 사용함에 의한 PCR에 의하여 pACYC184로부터 회수하였다. 이 PCR은 Pwo DNA 폴리머라제로 수행하였고 94℃에서 30초, 60℃에서 45초 및 72℃에서 60초의 30 사이클로 구성되었다. 결과적으로 생성되는 PCR 단편들은 BsiWI로 소화하였고 pGEM-B(CAT)를 산출하는 pGEM-B의 독특한 BsiWI 부위에 클론했다. pGEM-B(CAT) 유래의 ClaI 단편을 pNDFL(CAT)를 산출하는 p535-DI의 독특한 ClaI 부위에 클론했다. 마지막으로, Cm-유전자를 BsiWI로 소화함에 의해 뒤이어 재연결 및 E.coli 균주 DH5a의 형질전환에 의해 이 플라스미드로부터 제거하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드를 pNDFL+로 명명했고 T7 프로모터 사이에 클론된 전체 NDV cDNA 및 전사 플라스미드 pOLTV5의 HDV 리보자임을 함유한다.
개개의 NDV 유전자의 클로닝 및 발현
각각의 NDV 균주 LaSota 유전자들을 함유하는 DNA 단편들을 RT-PCR에 의해 생산하고 pCIneo에 클론했다. 클로닝 후, 모든 단편들을 삽입체들에 접해있는 프라이머들을 이용함에 의해 그리고 유전자-특이적 프라이머들을 이용함에 의해 서열화했다. NP-유전자:프라이머 386 (5'-GAGCAATCGAAGTCGTACGGGTAGAAGGTG-3', nt 40-69)를 역 전사를 위해 사용하였다. 프라이머 365 (5'-GTGTGAATTCCGAGTGCGAGCCC-GAAG-3'; nt 77-94) 및 892 (5'-TTGCATGCCTGCAGGTCAGTACCCCCAGTC-3'; nt 1577-1593)을 Pwo DNA 폴리머라제를 사용함에 의한 PCR을 위해 사용했다. 다음의 PCR 프로파일 (30사이클)을 사용하였다: 95℃에서 30초, 65℃에서 40초 및 72℃에서 45초. 결과적으로 생성되는 DNA 단편을 EcoRI으로 소화했고 EcoRI 및 SmaI 부위들 사이에 pCIneo에 클론했다. NP의 발현을 모노클로날항체 38(Russell et al., 1983)을 사용함에 의해 Peeters(1992) 등에 의해 기재된 바와 같이 이뮤노페록시다제 단층 분석(IPMA)로 입증하였다.
P-유전자: 프라이머 pRT1 (5'-CAAAGAATTCAGAAAAAAGTACGGGTAGAA-3'; nt 1794-1814)를 역 전사를 위해 사용하였다. 프라이머 pRT1 및 p2 (5'-GCAGTCTAGATTAGCC-ATTCACTGCAAGGCGC-3'; nt 1794-1814)를 Pwo DNA 폴리머라제를 사용함에 의한 PCR을 위해 사용했다. 다음의 PCR 프로파일 (30사이클)을 사용하였다: 95℃에서 30초, 65℃에서 40초 및 72℃에서 60초. 결과적으로 생성되는 DNA 단편을 EcoRI 및 XbaI으로 소화했고 EcoRI 및 XbaI 부위들 사이에 pCIneo에 클론했다. P의 발현을 모노클로날항체 688(Russell et al., 1983)을 사용함에 의해 IPMA로 입증하였다.
M-유전자: 프라이머 3UIT (5'-ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3'; nt 1-27)를 역 전사를 위해 사용하였다. 프라이머 NDV5M (5'-GGGTGCTAGCGGAGTGCCCCAATTGTGC-CAA-3'; nt 3268-3288) 및 NDV3M (5'-TCTCCCCGGGGCAGCTTATTTCTTAAAAGGAT-3'; nt 4368-4389)를 Expand High Fidelity 키트를 사용함에 의한 PCR을 위해 사용했다. PCR은 95℃에서 15초, 55℃에서 30초 및 68℃에서 2분의 10 사이클과 뒤이은 68℃에서 연장 시간이 사이클마다 20초로 증가한 15사이클로 구성되었다. 결과적으로 생성되는 DNA 단편을 블런트 말단을 형성하기 위하여 T4 DNA 리가제로 처리했고, NheI으로 소화했고 NheI 및 SmaI 부위들 사이로 pCIneo에 클론했다. M 단백질의 발현을 모노클로날항체 424(Russell et al., 1983)을 사용함에 의해 IPMA로 입증하였다.
F-유전자: 프라이머 3UIT (상기 참조)를 역 전사를 위해 사용하였다. 프라이머 NDV5F (5'-ACGGGCTAGCGATTCTGGATCCCGGTTGG-3'; nt 4508-4526) 및 NDV3F (5'-ACTACCCGGGAAACCTTCGTTCCTCAT-3'; nt 6212-31)를 M-유전자에 대해 상기에서 언급한 바와 같은 조건을 이용하는 Expand High Fidelity 키트를 사용함에 의한 PCR을 위해 사용했다. 결과적으로 생성되는 DNA 단편을 블런트 말단을 형성하기 위하여 T4 DNA 리가제로 처리했고, NheI으로 소화했고 NheI 및 SmaI 부위들 사이로 pCIneo에 클론했다. F 단백질의 발현을 모노클로날항체 8E12A8C3(ID-DLO, department of Avian Virology)을 사용함에 의해 IPMA로 입증하였다.
HN-유전자: 프라이머 3UIT를 역 전사를 위해 사용하였다. 프라이머 NDV5HN (5'-GTAGGCTAGCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3'; nt 6335-6354) 및 NDV3HN (5'-CGAGCCC-GGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3'; nt 8205-8227)를 M-유전자에 대해 상기에서 언급한 바와 같은 조건을 이용하는 Expand High Fidelity 키트를 사용함에 의한 PCR을 위해 사용했다. 결과적으로 생성되는 DNA 단편을 블런트 말단을 형성하기 위하여 T4 DNA 리가제로 처리했고, XmaI으로 소화후, 블런트된 (Klenow DNA 폴리머라제 ) NheI 부위 및 SmaI 부위 사이로 pCIneo에 클론했다. HN 단백질의 발현을 모노클로날항체 86(Russell et al., 1983)을 사용함에 의해 IPMA로 입증하였다.
L-유전자: L-유전자를 SacII 및 SalI으로 소화하여 cDNA 클론 pGEM-L7a (도 4A)로부터 회수하였다. SalI으로 소화하기 전에, SacII 부위를 T4 DNA 리가제로 처리하여 블런트로 만들었다. 결과적으로 생성되는 단편을 블런트된 (Klenow DNA 폴리머라제) NheI 부위 및 SalI 부위 사이로 pCIneo에 클론했다. T 프로모터와 L-유전자의 ATG 개시코돈 사이의 5' 비번역 영역은 L 단백질의 정확한 발현을 방해할 수 있는 2 프래임외 ATG 코돈을 함유했다. 그러므로, 하기와 같이, 첫번째 ATG는 빼지고 그리고 두번째 ATG는 PCR 돌연변이로 AAG로 치환된 새로운 플라스미드를축조하였다. 프라이머 5LE (5'-CAATGGAATTCAAGGCAAAACAGCTCAAGGTAAATAATACGGG-3'; nt 8332-8374) 및 3LE(B) (5'-GTGAATCTAGAATGCCGGATCCGTACGTACGAATGC-3'; nt 8847-8870)를 주형으로 플라스미드 pGEM-L7a(도 4)를 사용하는 PCR에 사용했다. 이 PCR은 Pwo DNA 폴리머라제를 사용하여 수행했고 그리고 94℃에서 30초, 60℃에서 45초 및 72℃에서 40초의 30 사이클로 구성되었다. 결과적으로 생성되는 DNA 단편을 EcoRI 및 XbaI으로 소화했고 EcoRI 및 XbaI 부위들 사이에 pCIneo에 클론하여 플라스미드 pCLneoL(N)을 생산했다. 연이어서, L-유전자의 잔존 부분 (nt 8852-15046)을 함유하는 pGEM-L7a 유래의 BsiWI-SalI 단편을 BsiWI 및 SalI 부위들 사이로 pCIneoL(N)에 클론하여 플라스미드 pCIneoL(c)를 생산했다. L-단백질에 대한 항체들을 이용할 수 없기 때문에, L의 발현은 면역화학으로 체크될 수 없었다.
F-유전자에 유전학적 태그의 도입
감염성 바이러스가 클론된 전체-길이 cDNA로부터 생산될 수 있음을 분명히 보이기 위해, 유전학적 태그를 PCR 돌연변이에 의해 F 유전자에 도입하였다. 이것 때문에, F-유전자는 두개의 중복되는 PCR 단편들을 사용하여 클론하였다. 첫번째 PCR 단편은 프라이머 NDV5F (상기 참조) 및 프라이머 F5R (5'-AAAGCGCCGCTGTCTCC-TCCCTCCAGATGTAGTCAC-3'; nt 4859-4894)를 사용하여 생산했다. 진하게 도시된 잔기들은 NDV LaSota 균주의 것 (GGRQGR｜L)로부터 감염성 NDV 균주들 (GRRQRR｜F)에 대한 컨센서스 절단 부위로 F1과 F2 사이의 단백질가수분해 절단 부위의 아미노산을 변경하기 위하여 프라이머에 도입된 치환들이다. 두번째 PCR 단편은 프라이머 F3F (5'-GGAGGAGACAGCGGCGCTTTATAGGCGCCATTATTGG-3'; nt 4875-4911) 및 IV09 (5'-CTCTGTCGACACAGACTACCAGAACTTTCAC-3'; nt 6246-6266)를 사용하여 생산했다. 이 PCR은 Pwo DNA 폴리머라제로 수행했고 그리고 94℃에서 15초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 2분의 25 사이클로 구성되었다. 두개의 중복하는 PCR 단편들 (중복은 프라이머 서열들에서 이탤릭체로 도시된다)을 프라이머 NDV5F 및 IV09를 사용함에 의해 그리고 동일한 PCR 조건을 이용함에 두번째 PCR에서 연결하였다. F 유전자의 전체 ORF를 함유하고 독성 컨센서스 절단 부위를 코드화하는 결과적으로 생성되는 단편을 NheI 및 SalI으로 소화했고 NheI 및 SalI 부위들 사이로 pCIneo에 클론하여 pCIneoFwt를 생산했다. pCIneoFwt유래의 StuI-NotI 단편 (nt 4646-4952)를 pGEM-B 유래의 ClaI-ScaI (nt 3521-10311)를 ClaI 및 ScaI 부위들 사이로 p535-DI에 삽입함에 의해 축조된 플라스미드 p535-S에서 대응하는 단편을 대체하기 위해 사용하였다 (도 4c 참조). 결과적으로 생성되는 플라스미드를 p535-S[Fwtc]로 명명했다. pACYC184 유래의 Cm-내성 유전자를 함유하는 PCR 단편 (상기 참조)을 플라스미드 p535-S[Fwtc]의 독특한 XbaI 부위 (NDV 서열에서 위치 6172)로 XbaI 단편으로서 클론하여 플라스미드 p535-S[Fwtc]Cm을 산출했다. 연이어서, 이 플라스미드의 Cm-태그된 ApaI-SpeI 단편 (nt 2285-8094)을 전체-길이 cDNA 클론 pNDFL+의 대응하는 단편을 대체하기 위해 사용하였다. 마지막으로, Cm-유전자를 XbaI으로 소화함에 의해 이 플라스미드로부터 제거하고 뒤이더 T4 DNA 리가제를 사용하여 재원형화 하였다. 유전학적으로 태그된 전체-길이 NDV cDNA를 함유하는 결과적으로 생성되는 플라스미드를 pNDFL+[Fwt]로 명명했다.
개개 NDV 유전자들을 발현하는 안정하게 형질전환된 세포주들의 산출
플라스미드 pCIneoNP, pCIneoP, pCIneoM, pCIneoF, pCIneoFwt, 및 pCIneoHN을 이 단백질들을 개개로 발현하는 안정하게 형질전환된 세포주즐의 산출을 위해 사용하였다. 트랜스팩션 전날에, CER 세포들을 6㎝ 배양 디쉬에 접종했고 60-80%의 컨플루언시를 부여하도록 밤새 인큐베이트하였다. 세포들을 기본적으로 공급자 (GibciBRL/Life Technologies)에 의해 기재된 바와 같이 LipofectAmine 12㎕ 및 OptiMem을 사용함에 의하여 2㎍ 플라스미드 DNA로 트랜스펙트시켰다. 48시간 후, 세포들을 트립신화하고 희석액을 G418 500㎍/ml를 함유하는 배지(Boehringer Mannheim)의 10㎝ 배양 디쉬에 접종하였다. 3일마다 배지를 G418의 농도가 800㎍/ml에 다다를때까지 양이 증가하는 (100㎍/ml의 단계로) G418을 함유하는 새로운 배지로 대체했다. 세포들을 800㎍/ml G418를 함유하는 배지로 유지하였고 트랜스펙션 3주 후에 개개의 콜로니들을 들어내어 96-웰 배양 디쉬로 옮겼다. 클론된 세포주들을 순간 발현 연구를 위해 상기에서 언급된 바와 같이, IPMA를 사용함에 의해 상대적인 NDV 유전자의 발현에 대해 실험하였다.
구성적으로 NP, P, M 또는 F를 발현한 세포주들이 확인되고 단리되었다. 그러나, 우리는 HN 단백질을 발현한 세포주들을 산출할 수는 없었다. 아마도 HN의 구성적인 발현은 세포에게 독성인 둣 하다.
T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 안정하게 형질전환된 세포주의 산출
T7 RNA 폴리머라제를 코드화하는 유전자를 플라스미드 pRT7NT (Rene van Gennip, ID-DLO, Department of Mammalian Virology)를 EcoRI 및 SalI으로 소화함에 의해 회수하였다. 결과적으로 생성되는 단편은 바쿨로바이러스 p10 프로모터 뒤에 위치한 T7 RNA 폴리머라제를 함유한다. 이 DNA 단편을 EcoRI 및 SalI 부위 사이로 플라스미드 pCIneo에 클론하여 플라스미드 pCIneo107을 산출했다. 플라스미드 pCIneo0은 T7 프로모터가 결여되어 있고 그리고 NheI으로의 절단과 뒤이은 ScaI으로 부분적인 절단하고, Klenow DNA 폴리머라제로 스티키(sticky) 말단을 채우고 그리고 T4 DNA 리가제를 이용하여 재원형화함에 의해 pCIneo으로부터 유래하였다. 바쿨로바이러스 서열들을 EcoRI 및 PacI으로 소화하여 pCIneo107로부터 제거하고 이어서 T4 DNA 폴리머라제 처리에 의해 블런트 말단을 생산하고 재원형화했다. 결과적으로 생성되는 플라스미드를 pCIneo007로 명명하였다. T7 RNA 폴리머라제의 발현을 pCIneo007 및 pPRh01로 세포들을 공-트랜스펙션함에 의해 증명하였다. 후자의 플라스미드는 T7 프로모터 뒤에 클론되고 내부 리보솜 입장(entry) 부위 (Rene van Gennip, personal communication)을 함유하는 고전 돼지열 바이러스의 E2 단백질을 함유한다. E2의 발현을 모노클로날 항체 V4 (Wensvoort et al., 1986)를 사용함에 의한 IPMA에서 결정하였다. T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 안정하게 형질전환된 CER 세포주들을 생산했고 10㎝ 배양 디쉬를 사용하고 그리고 세포들을 pCIneo007 0.5㎍ 및 LipofectAminme 25㎕로 트랜스펙트한 것을 제외하고는 상기에서 언급한 바와 같이 단리했다. 발현 T7 RNA 폴리머라제에 대한 개개의 세포주들을 시험하기 위하여, 그것들을 플라스미드 pPRh01로 트랜스펙션했고 E2의 발현 (T7 RNA 폴리머라제에 의존적인)을 모노클로날 항체 V4를 사용함에 의한 IPMA에서 결정하였다. T7 RNA 폴리머라제를 발현한 몇몇의 세포주들을 확인하였다. CER-C9로 명명된 한 세포주를 연이은 실험들을 위해 사용하였다.
HN-유전자들 및 하이브리드-HN 유전자들의 클로닝 및 발현
프라이머 3UIT를 상기에서 언급한 바와 같이 NDV의 단일-가닥 cDNA 및 조류 파라미쏘바이러스 세로타입-2 및 -4 (APMV2 및 APMV4)를 합성하기 위해 사용하였다. 모든 연이은 PCR 반응들을 94℃에서 15초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 2분의 25 사이클을 사용하여 수행하였다.
APMV2의 HN-유전자의 전체 코딩 영역을 APMV2의 HN-유전자의 서열(GenBank accession number D14030)로부터 유래된 프라이머 IV03 (5'-GGGGGAATTCCCCATT-CAATGAAGGGTCTAC-3') 및 IV05 (5'-GATCCCCGGGTCTTAAACCAGGCTTCGCAATG-3')를 사용하는 PCR로 회수하였다. APMV4의 HN-유전자의 전체 코딩 영역을 APMV4의 HN-유전자의 서열(GenBank accession number D14031)로부터 유래된 프라이머 IV06 (5'-GGGGGAATTCTGGTAGGGTGGGGAAGGTAGC-3') 및 IV08 (5'-ATTGCCCGGGGGGTAACTAATCAGGAT-CTCAG-3')를 사용하는 PCR로 회수하였다. 결과적으로 생성되는 PCR 단편을 EcoRI 및 XmaI로 소화했고 (직접적으로 또는 pGEM-T에 서브클로닝 후) 그리고 EcoRI 및 XmaI 부위 사이로 플라스미드 pCIneo에 클론하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드들을 각각 pCIneoHN2 및 pCIneoHN4로 명명했다.
NDV 균주 Lasota의 HN-유전자와 APMV2 및 -4의 HN-유전자들간의 하이브리드들을 하기와 같이 중복 PCR로 축조하였다. NDV 균주 Lasota의 HN-유전자의 N-말단 부분 (aa 1-141)을 프라이머 IV01B (5'-GTAGGAATTCAAGAGGCCGCCCCTCAAT-3'; nt 6325-6354) 및 IV10 (5'-AATGAGTTCTTTGCCTATCCCCCC-3'; nt 6811-6834)를 사용함에 의해 Pwo DNA 폴리머라제로 증폭하였다. APMV2의 HN-유전자의 C-말단 부분 (aa 142-580)을 프라이머 IV11B (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTCAAGGAGATGCATCTGCAGGC-3') 및 IV05를 사용함에 의해 Pwo DNA 폴리머라제로 증폭하였다. 결과적으로 생성되는 PCR 단편들을 프라이머 IV01B 및 IV05를 이용하여 그리고 Expand High Fidelity 효소 혼합물를 사용하여 중복 PCR (중복은 이탤릭체로 도시됨)에서 연결하였다. 결과적으로 생성되는 PCR 단편을 EcoRI 및 XmaI로 소화했고 (직접적으로 또는 pGEM-T에 서브클로닝 후) 그리고 EcoRI 및 XmaI 부위 사이로 플라스미드 pCIneo에 클론하였다. 결과적으로 생성되는, NDV의 aa 1-141 및 APMV2의 aa 142-580으로 구성되는 하이브리드 HN-유전자를 함유하는 플라스미드들을 pCIneoHN1/2141로 명명했다. APMV4의 HN-유전자의 C-말단 부분 (aa 143-569)을 프라이머 IV14B (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') 및 IV08을 사용함에 의해 증폭하였다. 이 단편을 프라이머 IV01B 및 IV08를 이용하여 중복 PCR 에서 NDV의 HN-유전자의 n-말단 부분에 연결하였다. 결과적으로 생성되는 PCR 단편을 EcoRI 및 XmaI로 소화했고 (직접적으로 또는 pGEM-T에 서브클로닝 후) 그리고 EcoRI 및 XmaI 부위 사이로 플라스미드 pCIneo에 클론하였다. 결과적으로 생성되는, NDV의 aa 1-141 및 APMV4의 aa 143-569로 구성되는 하이브리드 HN-유전자를 함유하는 플라스미드들을 pCIneoHN1/4141로 명명했다.
상기에 기재된 축조와 유사하게, NDV의 aa 1-143 및 APMV2의 aa 144-580으로 구성되는 또는 NDV의 aa 1-143 및 APMV4의 aa 145-569으로 구성되는 하이브리드 HN 유전자들을 촉조하였다. 이들 축조를 위하여, PCR 단편들을 하기의 프라이머 쌍들을 이용하여 수득하였다: NDV의 aa 1-143, 프라이머 IV01B 및 IV13 (5'-ATCTACAATGAGTTCTTTGCCTATC-3'; nt 6816-6840); APMV2의 aa 144-580, 프라이머 IV14B (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') 및 IV05; APMV4 aa 145-569, 프라이머 IV15B (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATCAA-ACAGATGACTACACAGCAG-3') 및 IV08. PCR 단편들을 EcoRI 및 XmaI로 소화했고 (직접적으로 또는 pGEM-T에 서브클로닝 후) 그리고 EcoRI 및 XmaI 부위 사이로 플라스미드 pCIneo에 클론하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드들을 각각 pCIneo1/2143및 pCIneo1/4143로 명명했다. HP 단백질의 발현을 시험하기 위하여, CER 세포들 또는 QM5 세포들을 플라스미드 pCIneoHN, pCIneoHN2, pCIneoHN4, pCIneoHN1/2141, pCIneoHN1/2143, pCIneoHN1/4141및 pCIneoHN1/4143으로 트랜스팩트된 FPV-T7을 가지고 1 m.o.i.로 1 시간 감염시켰고 그리고 트랜스팩션 24시간 후, 그 단층을 PBS 중의 닭 적혈구의 1% 현탁액으로 실온에서 45분간 덮어 쒸었다. 연이어서, 그 단층을 주의깊게 PBS로 세번 세척했고 트랜스팩트된 세포들에 적혈구의 흡착을 현미경으로 시험했다. HN 및 F 단백질의 공-발현 후에 세포 융합의 유도를 시험하기 위하여, CER 세포들 또는 QM5 세포들을 플라스미드 pCIneoHN1, pCIneoHN2, pCIneoHN4, pCIneoHN1/2141, pCIneoHN1/2143, pCIneoHN1/4141또는 pCIneoHN1/4143와 함께 pCIneoFwt로 공-트랜스팩션 하였다. 2 내지 3일 동안 인큐베이트 후, 그 단층을 PBS로 세척했고, Giemsa 용액 (물로 1:30 희석)으로 15분간 염색했다.
전체-길이 게놈성 NDV cDNA에서 하이브리드-HN 유전자의 클로닝
HN12로 명명된 합성 링커를 올리고뉴클레오티드 HN12a (5'-GGCCGCATATTCTA-GAGTTAACGACTTA-3') 및 HN12b (5'-CTAGTAAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3')를 이용하여 pGEM-T(Promega)의 NotI 및 SpeI 부위들 사이에 삽입하였다. HN14로 명명된 합성 링커를 올리고뉴클레오티드 HN14a (5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGA-3') 및 HN14b (5'-CTAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3')를 이용하여 pGEM-T의 NotI 및 SpeI 부위들 사이에 삽입하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드들을 각각 pGEM-HN12 및 pGEM-HN14로 명명하였다. 이 플라스미드들을 NotI 및 XbaI으로 소화했고 플라스미드 p535-S[Fwtc]Cm으로부터 NotI-SpeI 단편 (nt 3390-7488)을 클론하기 위해 사용하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드들을 각각 pGEM-HN1/2NS 및 pGEM-HN1/4NS로 명명하였다. 이들 플라스미드의 HN-유전자들을 각각 플라스미드 pCIneoHN1/2143및 pCIneoHN1/4143유래의 하이브리드 HN 유전자들로 대체했다 (HN-유전자 및 하이브리드-HN 유전자의 클로닝 및 발현 섹션 참조). 이것 때문에, pCIneoHN1/2143및 pCIneoHN1/4143을 NheI 및 SmaI으로 소화했고 그리고 결과적으로 생성되는 단편들 (하이브리드 HN1/2143및 하이브리드 HN1/4143유전자들을 함유하는)을 플라스미드 pGEM-HN1/2NS 및 pGEM-HN1/4NS의 NheI 및 HpaI 부위 사이로 클로닝 하여 각각 pGEM+HN12 및 pGEM-HN14를 초래했다. 후자 플라스미드들을 NDV의 전체 길이 게놈성 cDNA으로 하이브리드 HN 유전자들을 도입하기 위해 사용하였다. 이것 때문에, 플라스미드 pGEM+HN12 및 pGEM-HN14를 NotI 및 SpeI으로 소화했고 그리고 HN12 또는 HN14를 함유하는 단편을 pNDFL+의 대응하는 단편을 대체하기 위해 사용하여 각각 pNDFL+HN1/2143Cm 및 pNDFL+HN1/4143Cm을 산출했다. Cm-유전자를 XbaI으로 소화하여 이들 플라스미들로부터 제거하고 뒤이어 T4 DNA 리가제를 사용하여 재환형화했다. "6의 규칙(rule-of-six)"에 부합하기 위하여, 링커를 자기-상보성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이 플라스미드들의 유일한 SpeI 부위로 삽입했다. 링커 H2 (5'-CTAGCGAGCGCTCG-3')를 플라스미드 pNDFL+HN1/2143에 삽입하고 그리고 링커 H3 (5'-CTAGCGAGCWGCTCG-3')를 플라스미드 pNDFL+HN1/4143에 삽입하여 각각 플라스미드 pNDFL+HN1/2143(H2) 및 pNDFL+HN1/4143(H2)를 산출했다.
NDV LaSota의 HN 단백질에서 특이적 에피토프의 제거
MAb 4D6 (Long et al., 1986; Meulemans et al., 1986)에 의해 인식되는 NDV LaSota의 HN 단백질에서 특이적 에피토프 즉, 아미노산 346 내지 354 (PDEQDYQIR)을 이 서열을 APMV-2 (NRTDIQQTI) 또는 APMV-4 (PDPLQDQIL)의 HN 단백질들의 대응 서열로 대체함에 의해 제거하였다. 이것 때문에, 플라스미드 pCIneoHN (개개 NDV 유전자의 클로닝 및 발현 섹션 참조)를 중복하는 PCR 단편들을 만들기 위하여 주형으로 사용했다. APMV-2 서열을 위하여, 첫번째 PCR 단편을 프라이머 IV01 (5'-GTAGACGCGTAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3') 및 프라이머 3HN2 (5'-GATAGTTTGCTGTATATC-AGTCCGATTGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3')를 사용하여 생산했다. 두번째 PCR을 프라이머 5HN2 (5'-AATCGGACTGATATACAGCAAACTATCATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAG-CC-3') 및 NDV3-HN (5'-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3')를 사용하여 생산했다. 결과적으로 생성되는 단편들을 결합하였고 그리고 프라이머 IV01B (5'-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3') 및 프라이머 NDV3-HN를 사용하는 세번째 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. APMV-4 서열을 위하여, 첫번째 PCR 단편을 프라이머 IV01 및 프라이머 3HN4 (5'-TAAGATCTGATCTTGCAGCGGGTCAGGGCATGTGTCATTGTATCG-CTTGTATATCAC-3')를 사용하여 생산했다. 두번째 PCR을 프라이머 5HN4 (5'-CCTGA-CCGCTGCAAGATCAGATCTTAATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3') 및 NDV3-HN을 사용하여 생산했다. 결과적으로 생성되는 단편들을 결합하였고 그리고 프라이머 IV01B 및 NDV3-HN를 사용하는 세번째 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. 프라이머 3HN2/5HN2 및 3HN4/5HN4는 부분적으로 상보적이고 그리고 각각 HN2 서열 (NRTDIQQTI) 및 HN4 서열 (PDPLQDQIL)에 대한 유전 코드를 함유한다. 이 PCR 반응들은 Expand Long Template PCR 키트 (Boehringer Mannheim)을 사용하여 수행하였다. PCR은 94℃에서 10초, 58℃에서 30초 및 68℃에서 2분의 30 사이클, 뒤이어 68℃에서 4분의 1 사이클로 구성되었다. PCR 단편들을 EcoNI 및 Bsu36I으로 소화했고, 그리고 pCIneoHN의 EcoNI와 Bsu36I 부위 사이에 클론하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드들을 각각 pCIneoHN1 (HN2e) 및 pCIneoHN1 (HN4e)로 명명했다. 연구된 일시적 발현은 변형된 HN 단백질들은 정확히 발현되었고 그리고 닭 적혈구를 사용하는 적혈구흡착 연구로부터 판단된 바와 같이 세포 표면으로 운송되었다. 게다가, NDV의 HN의 선형 에피토프에 대한 그리고 아미노산 346-354로 구성되는 (적어도 포함하는) MAb 6D4는 변형된 HN 단백질들과 반응하지 않았다.
플라스미드 pCIneoHN1 (HN2e) 및 pCIneoHN1 (HN4e)를 NarI 및 SpeI으로 소화했고, 그리고 변형된 HN 유전자를 함유하는 단편들을 각각 pGEM-HN1/2NS 및 pGEM-HN1/4NS의 NarI와 SpeI 부위 사이에 클론하였다. 결과적으로 생성되는, pGEM-HN1(HN2e) 및 pGEM-HN1(HN4e)로 명명된 플라스미드들을 NotI 및 SpeI로 소화했고 그리고 pNDFL+의 NotI-SpeI 단편을 대체하기 위해 사용했다. 결과적으로 생성되는 플라스미드들을 각각 pNDFL-HN(HN2e)Cm 및 pNDFL-HN(HN4e)Cm으로 명명했다. Cm-유전자를 이들 플라스미드들로부터 XbaI으로 소화하여 제거하였고 뒤이어 재연결하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드들을 각각 pNDFL-HN(HN2e) 및 pNDFL-HN(HN4e)으로 명명했다.
결과
NDV 균주 LoSota 게놈의 3' 및 5' 말단의 뉴클레오티드 서열
NDV 게놈의 추정 3' 및 5' 말단 의 서열이 비록 여기에 사용된 것(LaSota)과는 다른 NDV 균주 (D26)으로부터지만 개시되어 있다 (Ishida et al., 1986). Yusoff등(1987)은 L-유전자의 사열 및 NDV 균주 Beaudette C 뒤의 상대적으로 큰 비-코딩 영역을 개시하였다. 그러나, 여기서 보여진 바와 같이, 이 서열은 바이러스성 게놈의 전체 5' 말단을 포함하지 않아서 감염성 복사체 NDV를 생산하는 것을 불가능하게 하였다. 음-가닥 RNA 바이러스들의 게놈의 3' 및 5' 말단들은 복제 및 전사에서 필수적인 기능을 이행한다 (Lamb and Kolakofsky, 1996). 그래서, 역 유전학 (Conzelmann, 1966)에 의해 감염성 바이러스를 생산하기 위해 사용될 수 있는 전체-길이 NDV cDNA를 생산하기 위하여, 바이러스 게놈의 정확한 3' 및 5' 말단을 포함하는 것이 절대적으로 필수적이다. 그러므로, 우리는 3' 및 5' RACE 과정들 (cDNA 말단들의 신속한 증폭)을 이용함에 의해 NDV 균주 LaSota의 게놈 RNA의 3' 및 5' 말단 둘 다의 정확한 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 5' 말단은 단일-가닥 앵커프라이머 (ALG3)을 게놈 RNA의 5' 말단의 역 전사에 의해 생산된 단일-가닥 cDNA에 연결후 PCR에 의해 회수하였다. 앵커프라이머 및 NDV-특이적 프라이머에 상보적인 프라이머 (ALG4)를 사용함에 의해, 5' 말단을 함유한 PCR 생성물들을 생산했다.
NDV의 3' 말단을 클론하기 위하여, 단일-가닥 앵커프라이머 ALG3을 T4 리가제를 사용함에 의해 바이러스성 RNA의 3' 말단에 연결하였고 그리고 프라이머 ALG4 및 NDV-특이적 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다 (방법 I). 또한, NDV RNA의 3' 및 5' 말단들을 T4 RNA 폴리머라제를 사용하여 서로서로 연결하였고 그리고 결과적으로 생성되는 접합된 RNA를 연결점에 접해 있는 NDV-특이적 프라이머들을 사용함에 의해 RT-PCR을 위해 사용하였다 (방법 II). 3' 및 5' RACE 생성물들을 T-벡터 pBluescriptII-TSK (Ichihara and Kurosawa, 1993)에 또는 pGEM4Z에 클론하였고 그리고 몇몇 독립된 클론들을 단리하고 서열화했다. 결과들은 표2에 도시하였다. 3' 및 5' 말단이 직접적으로 비교되도록, 서열들은 DNA 형태로 도시되어 있고 그리고 게놈 가닥의 3' 말단은 항-게놈성 가닥의 5' 말단으로서 나타내어져 있다. 게놈성 RNA 수준에서, 3'-말단의 서열은 3'-UGGUUUGUCUCUUAG인 반면에, 5'-말단의 서열은 UUUAGAAACAAACCA-5'이다. 3' 말단의 서열은 거의 NDV 균주 D26 (Ishida et al., 1986)의 공개된 3' 말단 서열과 유사하다. 그러나, 5' 말단의 서열은 NDV 균주 LaSota가 NDV 균주 Beaudette C의 L-유전자의 공개된 서열 (Yusoff et al., 1987)과 비교하여 추가의 64 뉴클레오티드를 함유했다 (도 6).
헬퍼바이러스에 의한 NDV 미니게놈의 복제
NDV의 3' 및 5' 말단들이 복제 및 전사에 기능적인 가를 결정하기 위하여, NDV의 3' 말단 (nt 1-119), 분비된 알카리성 포스파타제 (SEAP)를 코드화하는 리포터 유전자 및 NDV의 5' 말단 (nt 14973-15186)으로 구성되는 미니게놈을 축조하였다 (도 2). 이 미니게놈들을 양 방향으로 전사 벡터 pOLTV5에 클론하여 각각 플라스미드 pOLTV535 및 pOLTV553을 생산하였다 (축조에 관한 설명은 Material and Method 참조). 플라스미드 pOLTV5 (도 1)은 T7 RNA 폴리머라제 프로모터와 뒤이은 유일한 StuI 및 SmaI 제한부위들, 헤파티티스 델타 바이러스 (HDV) 유래의 자동촉매성 리보자임 및 박테리오파지 T7 (Pattnaik et al., 1992) 유래의 전사 종결 시그널을 함유한다. 플라스미드 pOLTV535의 T7 RNA 폴리머라제를 사용하는 생체외 또는 생체내 전사는 항-게놈성 RNA(또는 [+]-RNA)를 발생하는 반면에, 플라스미드 pOLTV535의 전사는 게놈성 RNA(또는 [-]-RNA)를 발생한다 (도 5).
플라스미드 pOLTV535 및 pOLTV553에 의해 생산된 미니게놈 RNA들이 NDV를 헬퍼바이러스로 사용하여 복제되고 발현될 수 있는가를 시험하기 위하여, 우리는 구성적으로 (CER-C9 세포들, Material and Method 참조), 또는 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 계두 재조합 fpEFLT7pol (Britton et al., 1995; 이후로는 FPV-T7로 불림)로 감염된 후 T7 RNA 폴리머라제를 발현한 CER 세포들을 사용하였다. CER-C9 세포들 및 FPV-T7 감염된 CER 세포들을 미니게놈 플라스미드 pOLTV535 또는 pOLTV553로 트랜스팩트 하였고 그리고 37℃에서 3시간 인큐베이트한 후, 세포들을 NDV로 1시간동안 감염시키거나, 비감염상태로 두었다. 대략 트랜스팩션 24시간 후, 시료를 배지로부터 취하여 SEAP 활성을 분석하였다. 그 결과들은 SEAP 발현이 pOLTV535로 트랜스팩트된 FPV-T7 감염된 세포들에서 매우 높았다는 것을 나타냈다. 이것은 T7 RNA 폴리머라제에 의한 전사가 계두 효소들에 의해 캡(cap)되고 그리고 숙주세포에 의해 효율적으로 번역된 항-게놈성 [+]-RNA를 발생하기 때문에 놀라운 것은 아니다. pOLTV553로 트랜스팩트된 세포들에서, T7 RNA 폴리머라제에 의한 전사는 SEAP 단백질로 번역되기 위하여 헬퍼바이러스에 의해 [+]RNA로 전환되어야만 하는 게놈성 [-]-RNA를 생산한다 (도 5). 두 경우에서, SEAP 발현의 증가는 비-감염된 세포들에 비하여 NDV 감염된 세포들에서 관찰될 수 없었다. 반대로, NDV 감염된 세포들에서 SEAP 발현은 비-감염된 세포들에 비하여 지속적으로 약 2배 낮았다 (결과는 도시되지 않음). pOLTV535-트랜스팩트된 세포들에 대해서, 이것은 T7 RNA 폴리머라제에 의해 생산된 전사체들에 의한 이미 매우 높은 수준의 SEAP 발현으로 설명될 수 있다. 그러나, SEAP의 효율적 발현이 게놈성 [-]-RNA의 항-게놈성 [+]-RNA 또는 바이러스성 폴리머라제 복합체에 의한 mRNA로의 전환에 의존적인, pOLTV553-트랜스팩트된 세포들에서, 우리는 NDV 감염후 SEAP 발현에서 증가를 기대했었다. 우리는 미니게놈들이 NDV에 의해 발현 및 복제될 수 없었던 이유를 두가지로 생각할 수 있었다. 첫째, 미니게놈 RNA들의 크기는 소위 "6의 규칙" (Calain and Roux, 1993; Kolakofsky et al., 1988)에 부합하지 않는다. 이 규칙에 따르면, 파라미쏘바이러스 게놈들은 그들이 다중 6 nt 길이일때 단지 효율적으로 복제된다. 둘째, 미니게놈 RNA들의 5' 말단에 존재하는 두개의 과다 G 잔기들은 바이러스성 폴리머라제 복합체에 의한 정확한 복제 및/또는 전사를 방해할 것이다. 게놈의 복제가 6의 규칙에 의존적인가를 알아내기 위하여, 우리는 길이에서 1 nt 증가한 짧은 일련의 자기-상보적인 올리고뉴클레오티드들을 플라스미드 pOLTV535 및 pOLTV553의 유일한 ClaI-부위에 삽입했다 (도 2). 결과적으로 생성되는 플라스미드 (pOLTV535N0 내지 -N5 및 pOLTV553N0 내지 -N0)는 크기에서 1 내지 6 nt 다르므로 그둘중 하나는 6의 규칙에 적합한 미니게놈 RNA를 생산해야 한다. 이 플라스미드들을 상기에 언급된 바와 같이 CER 세포들 및 FPV-T7 감염된 CER-C9 세포들을 트랜스팩트하기 위해 사용하였다. 이 결과들은 단지 플라스미드 pOLTV535N3 및 pOLTV553N3만이 NDV 감염후 SEAP 활성을 증진시켰다. T7 RNA 폴리머라제에 의해 이 플라스미드들로부터 생산된 미니게놈 RNA들의 길이는 6n+2로 계산되었다. 미니게놈 RNA들의 5' 말단에 존재하는 두개의 과다 G 잔기들때문에, 이 결과들은 단지 미니게놈 RNA들의 진정한 3' 및 5' 말단 사이에 위히된 RNA 서열의 크기가 6의 규칙에 관련이 있음을 제시한다. 이것은 T7 RNA 폴리머라제의 전사 개시점이 변경되어 RNA로 혼입되는 첫번째 뉴클레오티드가 NDV의 3' 및 5' 말단의 첫번째 뉴클레오티드가 되는 미니게놈 플라스미드들을 축조함에 의해 증명되었다 (Material and Methods 참조). 이 플라스미드들의 트랜스팩션은 단지 플라스미드 pOLTV535N3 및 pOLTV553N3에 의해 생산된 미니게놈 RNA들이 헬퍼바이러스에 의해 복제됨을 가르켰다 (결과는 도시되지 않음). 이 발견들은 NDV의 복제가 엄격히 6의 규칙에 의존적임을 또한 가르키는 것이다. 게다가, 이 발견들은 미니게놈 RNA들의 5' 말단의 두개의 과다 G 잔기의 존재는 정확한 복제를 방해하지 않음을 나타낸다. 유사한 결과들이 다른 파라미쏘비리대 (Pattnaik et al., 1992; Harty and Palese, 1995) 유래의 미니게놈 플라스미드 (또는 DI 플라스미드)로 수득되었다.
헬퍼바이러스의 NDV 미니게놈의 패키징
미니게놈 RNA들이 NDV 헬퍼바이러스에 의해 패키징될 수 있는 가를 결정하기 위하여, 트랜스팩트된 세포들의 배지를 신선한 단층으로 옮기고 그리고 1 시간 흡착후에, 단층을 PBS로 세번 세척했고 완전 배지에서 더 인큐베이트했다. 24시간 인큐베이트한 후, 배지에서 SEAP 활성을 측정했다. 이 결과들은 SEAP 활성이 단지 미니게놈 플라스미드 pOLTV553N3로 트랜스팩트된 세포들로부터의 배지로 처리된 세포들에만 존재함을 보였다 (표 4). 이 발견은 미니게놈 RNA들이 NDV 엔벨로프들로 패키징될 수 있고 그리고 이 입자들이 세포들을 감염시킬 수 있음을 나타낸다. 게다가, 이 결과들은 패키징이 단지 바이러스성 NP, P 및 L 단백질들과 복합체화되는 RNA 분자들이 바이러스-같은 입자들로 팩키징됨을 나타내는 복제에 의존적임을 보인다.
NP, P 및 L 단백질들을 발현하는 플라스미드들에 의한 NDV 미니게놈들의 복제
기본적인 NP, P 및 L 단백질들을 코드화하는 플라스미드들에 의해 NDV 미니게놈들이 또한 복제될 수 있는가를 결정하기 위하여, 우리는 FPV-T7로 감염된 세포들에서 공-트랜스팩션을 수행하였다. 세포들을 각각 미니게놈 플라스미드로 구성되는 플라스미드들 및 플라스미드들 pCIneoNP, -P, 및 -L을 조합하여 트랜스팩트하였다. 음성 대조구로, 기본적은 L 단백질을 코드화하는 pCIneoL(c)를 벡터 플라스미드 pCIneo로 대체하였다. 이 결과들은 (표 5) NP, P 및 L를 코드화하는 진정한 플라스미드들은 미니게놈 RNA들을 복제할 수 있음을 나타냈다. 게다가, 이 결과들은, 헬퍼바이러스에 의한 미니게놈 복제에 유사하게, 또한 NP, P 및 L 단백질들에 의한 복제가 6의 규칙에 의존적임을 보인다.
NDV 균주 LaSota의 완전한 게놈의 뉴클레오티드 서열
전체 NDV 게놈에 산재하는 서브-게놈성 cDNA 단편들을 RT-PCR에 의해 축조하였다 (도 4). PCR 오류의 수를 최소로 유지하기 위하여, 교정 효소 (Expand Long Template; Boehringer Mannheim)를 제한된 수의 PCR 사이클들 (15 사이클)과 조합하여 사용하였다. NDV RNA의 3' 말단에 상보적인 프라이머 3UIT를 역 전사를 위해 사용하였고, 그리고 유전자-특이적인 프라이머들을 PCR을 위해 사용하였다. 가능한 PCR 오류들을 확인하기 위하여, 세개의 독립된 RT 반응들을 수행했고 그리고 세개의 독립된 세트의 서브-게놈성 cDNA들을 생산하기 위해 사용하였다. 약 4 내지 7kb의 다양한 크기의 cDNA들을 pGEM-T에 클론했다. 두 세트의 cDNA들의 뉴클레오티드 서열을 공개된 NDV 서열들로부터 연역된 프라이머들에 의해 또는 이 서열화 프로젝트(표 1) 동안에 연역된 NDV 서열로부터 유래된 프라이머들에 의해 결정하였다. 남겨진 불명료함은 세번째 세트의 cDNA 클론들의 관련 영역들을 서열화함에 의해 풀렸다. NDV 균주 LaSota의 게놈은 15186 nt로 구성되는데, 이것은 현재까지 전체 서열이 수립된 모든 파라미쏘바이러스 게놈들중 가장 작은 것이다 (Kolakofsky et al., 1998).
전사 플라스미드 pOLTV5에서 전체-길이 NDV cDNA 클론의 축조
NDV 균주 LaSota의 전체-길이 cDNA 클론을 축조하기 위하여, 전체 NDV 게놈에 산재하는 중복 cDNA 클론들을 도4에 도시된 전략에 따라 공유된 제한 부위들에 연결하였다. 전체 NDV cDNA를 전사 플라스미드 pOLTV5 유래의 미니게놈 플라스미드 pOLTV535 (상기 참조)에 조립하였다. 도 4b에서 볼 수 있는 바와 같이, 완전한 NDV cDNA의 조립에서 마지막 단계는 pGEM-B 유래의 약 8.8 kb ClaI (nt 3521-12355) 단편을 양 측면 (즉, 각각 nt 1-3521 및 nt 12355-15186)의 ClaI 부위에 접해 있는 NDV 서열을 함유한 p535-DI로 클로닝하는 것이다. 우리가 정확한 클론들을 생산하는데 반복해서 실패했기 때문에 이 단계는 꽤 다를 것임을 입증했다. 그러므로, pGEM-B의 ClaI 단편을 플라스미드 pACYC184 유래의 클로람페니콜 내성 (Cm) 유전자로 태그하였다. Cm-유전자를 장착하는 ClaI 단편을 분리하였고 p535-DI의 ClaI 부위에 클론되었고 그리고 형질전환체들을 양 Cm에 대해 내성으로 선별했다. 형질전환체들이 미약하게 자라기 때문에, 항생제 선별을 15㎍/ml 및 10㎍/ml Km으로 감소했고 그리고 인큐베이트 온도를 37℃로부터 32℃로 줄였다. 마지막으로, Cm-유전자를 BsiWI로 소화하여 이 플라스미드로부터 제거했고 뒤이어 T4 DNA 리가제를 사용함에 의해 재원형화했다. E. coli의 형질전환 후, 요구되는 플라스미드를 장착하는 세포들을 Km-내성 및 Cm-민감성에 대한 검색에 의해 표현형으로 확인하였다. 결과적으로 생성되는, 전사 플라스미드 pOLTV5의 SmaI 및 StuI 부위 사이에 클론된 전체-길이 NDV cDNA로 구성되는 플라스미드을 pNDFL+로 명명했다.
전체-길이 cDNA 유래의 감염성 NDV의 산출
클론된 cDNA로부터 전체적으로 감염성 NDV를 생산하기 위하여, 미니게놈 플라스미드들에 대해 언급된 바와 같이, 플라스미드 pNDFL+를 pCIneoNP, -P 및 -L(c)를 가지고 하는 공-트랜스펙션 실험들에 사용하였다. CER 및 CEF 세포들의 트랜스팩션을 미니게놈 플라스미드 pOLTV553N3를 사용함에 의해 그리고 SEAP 발현을 측정함에 의해 모니터하였다. 음성 대조구로서, pCIneoL(c)를 pCIneo로 대체하였다. 공-트랜스펙션 후, 세포들을 5% 요낭액을 함유하는 배지에서 3 내지 6일동안 인큐베이트하였다. CER 및 CEF 세포들은 NDV 균주 LaSota의 F 단백질을 절단하는데 요구되는 적절한 프로테아제들이 결여되어 있기 때문에, 요낭액의 첨가가 필수적이다. F 단백질의 절단은 세포-대-세포 확산을 위해 그리고 감염성 바이러스의 생산을 위해 절대적으로 요구된다. 인큐베이션 3일 후, 우리는 F 단백질에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 고정된 단층들을 면역학적으로 염색했다. 이 결과들은 항체로 염색된 세포들은 pNDFL(+), pCIneoNP, -P 및 -L(c)로 공-트랜스펙트된 단층들에서만 단지 존재했음을 보여주었다. 이 결과들은 게놈 복제 및 발현은 이 세포들에서 일어남을 나타냈다. 공-트랜스펙션 실험들에서 pCIneoL(c)가 pCIneo에 의해 대체된 때에는 염색 세포들은 관찰되지 않았다.
감염성 바이러스를 회수하기 위하여, 트랜스팩트된 CEF 단층의 상징액을 발육란의 요낭액에 주입하였다. 4일 후, 요낭액을 수확하고, 적혈구 응집 분석방법으로 분석하고 그리고 발육란에서 더 계대하였다. 그 결과들은 pNDFL+와 pCIneoNP, -P 및 -L(c)의 조합으로 트랜스펙트된 세포들의 상징액만이 적혈구 응집 분석방법에서 양성 반응을 나타내었음을 보여주었다. 양성 적혈구 응집 반응을 보였던 요낭액을 연이어 상이한 NDV 균주들 사이에서 구별하기 위해 사용될 수 있는 모노클로날 항체들 7B7, BC11, 5A1, 7D4 및 4D6 (Long et al., 1986)을 사용함에 의해 적혈구 응집 저해 분석방법에서 분석하였다. 이 분석의 결과들은 접종된 발육란으로부터 회수한 NDV 균주는 원래의 LaSota 균주와 동일한 방응성을 보였음을 나타내었다. 접종된 발육란으로부터 회수된 바이러스는 그것을 원래의 LaSota 균주와 구별하기 위하여 NDFL로 명명하였다.
전체-길이 cDNA으로부터 유전학적으로 변형된 NDV의 산출
공-트랜스펙션 시스템이 클론된 전체-길이 NDV cDNA 유래의 감염성 바이러스를 회수하기 위해 사용될수 있었음을 명확히 보이기 위하여, 유전학적 태그를 플라스미드 pNDFL(+)에 도입하였다. 이것을 위하여, Fo 단백질의 프로테아제 절단 부위의 아미노산 서열을 PCR 돌연변이 (상세한 정보는 Materials and Methods 참조)에 의해 LaSota 균주의 것 (GGRQGR｜L)로부터 독성 NDV 균주들의 컨센서스 서열 (GRRQRR｜F)로 변경했다. 결과적으로 생성되는 플라스미드, pNDFL+[Fwt]를 상기에 기재된 공-트랜스펙션 시스템을 사용함에 의한 바이러스를 생산하기 위해 사용하였다. NDFL+[Fwt]로 명명된 감염성 바이러스를 공-트랜스팩트된 CEF 세포들의 배지로 접종된 발육란의 요낭액으로부터 회수하였다. HI 테스트에서, LaSota 균주에 특이적인 7D4를 포함하는 MAb들은 원래의 LaSota 균주와 새로이 생산된 바이러스로 동일한 반응성을 보였다. F 단백질의 프로테아제 절단 부위를 코드화하는 영역의 뉴클레오티드 서열을 RT-PCR로 결정하였다. 그 결과들은 그 뉴클레오티드 서열이 원래의 LaSota 서열을 변형하기 위해 사용된 돌연변이 프라이머에 도입된 정확한 뉴클레오티드 변화들을 함유했음을 보여주었다. 이 발견은 그 바이러스가 플라스미드 pNDFL+[Fwt]로부터 유래하였음을 보여주고, 그리고 (유전학적으로 변형된) NDV는 클론된 전체-길이 NDV cDNA로부터 전체적으로 생산될 수 있음을 증명한다.
NDV의 Fo 단백질의 프로테아제 절단 부위는 독성의 가장 중요한 결정기이다
Fo 단백질의 프로테아제 절단 부위의 아미노산 서열이 다른 NDV 균주들의 독성을 위한 가장 중요한 결정기임이 일반적으로 추측된다. 프로테아제 절단 부위의 아미노산 서열이 렌토제닉 (비-독성)으로부터 벨로제닉 (독성) NDV 균주의 것으로의 변경된 유전학적으로 변형된 LaSota 균주의 산출은 이 추측을 테스트하기 위한 유일한 기회를 제공하였다. 그러므로, 우리는 새롭게 생산되는 바이러스 NDFL[Fwt]의 뇌내의 병원성 지수 (ICPI)를 결정했고 그리고 그것을 균주 NDFL의 및 원래의 LaSota 균주 (클론 E13-1)의 것과 비교하였다. 그 결과들은 균주 NDFL[Fwt]의 ICPI가 균주 NDFL (ICPI=0.0) 및 클론 E13-1 (IPCI=0.3)의 값 보다 훨씬 위인 1.3이었음을 보였다. 이 결과들은 기대된 바와 같이, NDV의 독성이 Fo 단백질의 프로테아제 절단 부위의 아미노산 서열에 의해 거의 결정됨을 보인다.
혈청학적 마커 도입
NDV의 엔벨로프 당단백질들 F 및 HN는 이 바이러스의 가장 면역원성 단백질들이다. 감염 후, F와 HN 단백질 둘다 강한 중성화 항체 반응을 이끌어낸다. 그러한 중성화 항체 반응의 도입은 비-독성 NDV 균주들 (광범위하게 사용된 LaSota 균주와 같이)에 의해 성공적인 백신 접종의 기초이다. 그러나, NDV 백신 균주들에 대한 항체 반응은 독성 NDV 야외 균주들에 대한 항체 반응으로부터 구별될 수 없다. 따라서, 독성 야외 바이러스의 감염은 혈청학적 방법들에 의해 추적될 수 없다. 이 상황은 야외 바이러스 감염은 백신 접종에 의해 가려지고 그리고 야외 균주들에 의해 야기된 임상학적 징후들도 무시되거나 심지어 백신에 의해 기인된 것으로 돌려지므로 바람직하지 못하다. 백신 접종과 감염 사이의 성공적인 차별화는 NDV의 근절에 기본적이기 때문에, 우리는 백신 접종에 사용될 수 있고 그리고 NDV 야외 균주들로부터 혈청학적으로 구별될 수 있는 유전학적으로 변형된 NDV 균주들(소위 마커 백신)을 개발을 착수하였다. NDV 마커 백신을 개발하기 위하여, 이 바이러스를 (주요) 항원들중 하나의 하나 또는 몇몇의 면역지배적인 에피토프들이 제거되거나 변형되도록 유전학적으로 변형되어야만 한다. 필수적인 단백질의 부분 결실은 그 단백질의 생물학적 기능의 손실을 이끌어 낸다. 그러므로, 우리는 NDV의 면역지배적인 엔벨로프 단백질중 하나를 그 단백질의 생물학적 기능이 보유되는 반면에 변형된 단백질에 대한 항체 레파토리가 원래의 단백질의 것과는 다르게 되는 방식으로 변형하는 것을 선택하였다. 하기의 구체화된 이유들로, 우리는 NDV의 HN 단백질을 변형하기 위해 본 발명의 한 구체예를 선택하였다. NDV의 감염은 숙주세포의 혈장 막과 비리온 엔벨로프의 융합에 의해 개시되었다. 이 프로세스를 위해, F 단백질 및 HN 단백질 둘다 요구된다. F 및 HN 단백질들은 물리적으로 상호작용하고 이 상호작용은 막 융함을 위해 요구됨이 확인되었다 (Deng et al., 1995). 게다가, 그 상호작용은 타입 특이적이고 즉, F 및 HN 단백질들은 융합 활성을 보여지기 위하여 동일한 바이러스로부터 유래되어야만 함이 확인되었다. NDV의 HN 단백질의 상호작용 도메인은 HN 단백질의 엑토도메인의 첫번째 92 아미노산 잔기들을 포함하는, 이 단백질의 스탈크(stalk)- 또는 스템(stem)-영역으로 불리는 곳에 위치되어 있다 (Deng et al., 1995). NDV의 aa 1-141 및 인간 유사인플루엔자 바이러스 타입-3 (hPIV3)의 aa 141-152로 구성되는 하이브리드 HN 단백질은 NDV F 단백질과 공-발현될때 융합 활성을 보유함이 확인되었다. 이들 발견은 NDV의 스템 영역과 뒤이은 다른 조류 파라미쏘바이러스 세로타입의 HN 단백질의 구형 헤드로 구성되는 하이브리드 HN 단백질을 장착하는 유전학적으로 변형된 NDV 균주들은 가시적임을 제시한다. 게다가, 그러한 균주들은 NDV위 것과는 다른 한-HN 항체 반응을 이끌어 낼 것이다. F 단백질에 대한 중성화 항체 반응은 공격 바이러스 감염에 대한 효율적인 방어를 하기에 충분하기 때문에, 그러한 유전학적으로 변형된 NDV 균주들은 마커 백신의 두개의 기본적인 조건들 즉, 질환에 대한 방어 및 혈청학적 차별화에 부합한다.
NDV의 aa 1-141 및 조류 파라미쏘바이러스 타입-2 (APMV2)의 aa 141-580 (HN1/2141) 또는 NDV의 aa 1-143 및 APMV2의 aa 144-580 (HN1/2143)의 융합으로 구성되는 하이브리드 HN 유전자들을 축조하였다. 유사하게, NDV의 aa 1-141 및 APMV4의 aa 143-569 (HN1/4141) 또는 NDV의 aa 1-143 및 APMV4의 aa 145-569(HN1/4143)으로 구성되는 하이브리드 HN 유전자들을 축조하였다. 이 하이브리드 유전자들을 진핵 발현 벡터 pCIneo에 클론하고 NDV F 단백질을 장착하는 플라스미드와 공-트랜스펙션 실험에 사용하였다. 이것을 위하여 F 단백질을 F2과 F1 사이의 단백질가수분해 절단 부위의 아미노산 서열이 LaSota 서열로부터 독성 NDV 균주들의 컨센서스 서열의 것 (Fwt, Maeterial and Method 참조)으로 변경되도록 변형하였다. CER 세포들 및 QM5 세포들에서 공-트랜스펙션 실험들은 HN1/4141및 HN1/4143뿐만아니라 HN1/2141및 HN1/2143도 Fwt단백질과 고-발현된 경우 세포 융합을 유도했음을 나타내었다. 이 결과들은 하이브리드 HN 단백질과 F 단백질간의 복합체들은 생물학적으로 활성임을 나타냈다. 하이브리드 HN 단백질들 HN1/2143및 HN1/4143을 전체-길이 cDNA 클론 pNDFL+의 원래의 HN 유전자를 대체하여 pNDFL-HN1/2143및 pNDFL-HN1/4143을 생산하기 위하여 사용하였다. 후자의 두 플라스미드는 실질적으로 상기의 공-트랜스펙션 시스템을 사용하여 감염성 바이러스를 생성하는데 사용되었다. 생육가능한 재조합형 바이러스 (NDFL-HN1/2143및 NDFL-HN1/4143으로 명명됨)를 트랜스펙트된 단일층의 상징액으로 접종시킨 발육란의 요막액으로부터 분리할 수 있었다.
두개의 재조합체 각각 중의 하이브리드 HN 유전자의 존재를 RT-PCR에 의해 입증하였다. 적혈구 응집 억제 테스트는 NDV에 대한 모노크로날 항체 및 다가의 항혈청이 재조합형 바이러스 NDFL-HN1/2143및 NDFL-HN1/4143에 의한 닭 발육란의 응집을 억제할 수 없다는 것을 나타낸다. 이와 같은 결과는 균주 NDFL-HN1/2143및 NDFL-HN1/4143을 전형적인 NDV 백신과 혈청학적으로 구별될 수 있는 백신으로서 사용할 수 있다는 것을 나타낸다.
재조합형 NDV로부터 이종 단백질의 발현
외래 유전자를 NDV 게놈에 삽입시킬 수 있는가를 조사하기 위해, 본 발명자들은 SEAP 리포터 유전자를 전달하는 재조합형 바이러스를 고안하였다. SEAP 유전자는 플라스미드 pOLTV535로부터 유래되었고 NDV의 전형적인 전사 종결(stop)및 개시(start) 박스를 포함하도록 변형되었다. SEAP 유전자와 뒤이은 전사 정지 및 개시 박스를 갖는 DNA 단편을 플라스미드 pNDFL+[Fwt] 중의 XmnI 부위(nt 109)에 삽입시켰다. NDFL-AP로 명명된 독성 바이러스를 공-트랜스펙션 시스템으로 생성하고, SEAP 유전자의 존재를 RT-PCR로 확인하였다. 균주 NDFL-AP로 감염된 세포는 SEAP 단백질을 매우 높은 농도로 발현하였다. SEAP 단백질의 특이적 활성을 이용하여, 본 발명자들은 SEAP 단백질로 이루어진 NDFL-AP로 감염된 세포 중에서 발현된 단백질의 x%를 산출하였다. 이들 결과는 이종 유전자들이 재조합형 NDV로부터 매우 높은 농도로 발현될 수 있음을 나타낸다.
트란스-보완 세포 라인에서 NDV 결실 돌연변이체의 생성
NDV의 M 단백질의 발현을 폐기하기 위해, pNDFL+[Fwt]를 BsaAI(nt 3087)로 소화하고 HindⅢ(nt 4252)로 부분 소화함으로써 M 유전자의 대부분을 제거하였다. HindⅢ 말단을 Klenow DNA 폴리머라제로 채운 후, 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 재원형화하고 E. coli를 형질전환하기 위해 사용하였다. pNDFL+[Fwt]dM으로 명명된, 생성된 프라스미드를 NDV M 단백질을 발현한 트란스-보완 CER-M 세포 중에서 공-트랜스펙션 시스템에 의해 바이러스를 생성하는데 사용하였다. 트랜스펙트된 단일층의 상징액을 CER-M 세포에 세번 계대하고 바이러스의 존재에 관하여 분석하였다. 세번째 계대 배양 상징액이 적혈구응집(HA) 및 적혈구응집 억제(HI) 테스트에 양성 반응을 생성했다는 사실을 증거로 하여 바이러스를 얻었다. 이 바이러스를 NDFL-dM로 명명했다. CFE 세포의 단일층을 감염시키는데 NDFL-dM을 사용하는 경우, 바이러스는 F 단백질에 대한 모노클로날 항체를 사용함으로써 IPMA에서 볼 수있듯이, 세포-대-세포 전이에 의해 전파될 수 있었다. 예상과 같이, M 단백질의 발현은 M 단백질에 대한 모노크로날 항체를 사용함으로써 IPMA에서 증명될 수 없었다. CEF 세포 또는 CER-M 세포를 감염시키기 위해 상징액을 사용한 경우에, 본 발명자들은 IPMA에 의해 이들 단일층에서 바이러스 복제의 존재를 볼 수 없었다. 이러한 발견은 감염성 바이러스가 비-보완 CEF 세포에서 생성될 수 없다는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 감염된 CEF 세포의 상징액으로 발육란을 접종한 것은, HA 또는 HI 테스트에서 시험했을 때, 자손 바이러스를 생성하지 않았음을 관찰함으로써 확인되었다.
더 나은 NDV 백신에 대한 요구, 및 특히 MDV 제조 백신에 대한 요구가 본 발명자들로 하여금 NDV 유전학적 변형을 허용하는 역 유전학 시스템을 개발하는 것을 촉진하였다. 본 명세서에서 본 발명자들은 클론된 전체-길이 cDNA로부터 전체적으로 감염성 NDV의 생성을 기재한다. 본 발명은 F 단백질의 프로테아제 절단 부위의 특이성을 결정하는 오직 3개의 뉴클레오티드만을 변형함으로써, DNV의 독성이 극적으로 변형될 수 있음을 보인다. 이와 같은 경우, 프로테아제 절단 부위는 LaSota 균주의 것으로부터 독성 NDV 균주의 컨센서스 제한 부위의 위치로 변경하였다. 이 유전적으로 변형된 NDV 균주의 생성에 의해, 본 발명자들은 F 단백질의 절단성이 NDV의 독성에 대한 중요한 결정기 (그러나 유일한 결정기는 아님)라는 이론적 증거를 내렸다. 동일한 역 유전적 접근을 사용함으로써, 절단 부위를 마음대로 어떤 다른 아미노산 서열로 변형시킬 수 있다. 이것은 독성 수준의 스펙트럼을 나타내는 NDV 균주의 시리즈를 생성할 수 있을 것이다.
생체 내
상기에 기재된 바와 같이, F 및 HN 단백질의 절단성 이외에, 기타 바이러스성 인자가 병원성에 원인이 된다고 알려져 있다. 전사 및 번역을 변경하여 바이러스 및/또는 시토파소제니시티의 성장 및 세포-대-세포 전이를 조절할 수 있다. NDV의 감염성 cDNA의 이용성은 전사 및 복제에 관련되는 서열의 시스템적 변형을 허용한다. 이것은 최적 면역원성에 돌연변이를 일으켜 실질적으로 존재하지 않는 독성으로 하는 신규 NDV 백신의 고안을 가능하게 한다.
안전성은 생백신의 가장 중요한 특징 중 하나이다. 그러나, NDV를 포함하여 많은 생백신의 경우, 면역원성은 종종 독성에 반비례로 관계한다. 그러므로, 면역원성의 손실 없이 생백신을 추가 약독화하는 것은 사용될 수 있는 유전학적 변형을 위한 가장 바람직한 변경 중 하나이다. 이러한 관점에서, 이것은 센다이 바이러스의 V 단백질의 발현의 제거가 마이스에 대해 생체내 병원성을 현저히 감소시키는 것을 나타내는 훌륭한 의미이다(Kato et al., 1997). 센다이 바이러스와 유사하게, NDV도 RNA 편집이라고 알려진 메카니즘에 의해 V 단백질을 생성한다(Steward et al., 1993). 또한, NDV의 V 단백질의 발현을 제거하면 생체내에서 병원성 약독화 표현형을 초래함을 예언하는 것이다.
NDV의 독성 변화와 별도로, 본 발명자들은 또한 NDV 야외 균주와 혈청학적으로 구별될 수 있는 균주가 생성될 수 있는 방법적으로 NDV의 항원성 구성을 변형할 수 있다는 것을 보인다. 이들, 소위 마커 백신은 세계의 상업군 중에서 NDV의 유행을 평가할 수 있는 매우 귀중한 도구이다. 더우기, 이와 같은 마커 백신의 대규모 적용은 감염된 떼의 광번위한 선별 및 근절방법에 의해 NDV의 완전한 박멸을 야기한다. 본 명세서에서, 본 발명자들은 이종 유전자가 NDV의 유전자에 삽입될 수 있다는 것을 보였다. 이들 이종 유전자는 감염된 세포 내에 매우 높은 농도로 발현될 수 있다. 이것은 NDV를 기타(가금) 병원체로부터의 항원의 발현에 대한 백신벡터로서 사용할 수 있음을 나타낸다. 몇몇 특성들은 NDV를 호흡기 또는 장내 질병에 대한 백신접종에 관한 이상적인 백신 벡터로서 사용할 수 있게 한다: 1) NDV는 발육란에서 매우 높은 적정으로 쉽게 배양될 수 있다. 2) 발육란 내의 NDV의 집단 배양은 상대적으로 저렴하다. 3) NDV 백신은 비교적 안정하며 및 식수에 첨가하는 것과 같은 대량 적용 방법에 의해 또는 스프레이 또는 에어로졸에 의해 간단히 투여될 수 있다. 4) NDV 감염의 천연경로는 또한 많은 다른 가금 병원체의 감염의 주요 천연경로인 호흡기 및/또는 장관에 의한 것이다. 5) NDV는 순환 모계 항체의 존재에도 불구하고 국소 면역을 유도시킬 수 있다.
최종적으로, 본 발명자들은 트란스-보완 세포주를 사용함으로써 생육가능한 NDV 결실 돌연변이체를 생성할 수 있음을 보였다. 내부 세포막에서 NDV의 발아에 관련된 매트릭스(M) 단백질을 발현할 수 없는 NDV 결실 돌연변이체가 생성되었다. 본 발명자들은 M 단백질을 발현할 수 없는 표현형으로 보완된 NDV균주가 여전히 세포를 감염시킬 수 있고 세포-대-세포 전이에 의해 전파될 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 돌연변이체 바이러스는 비-보완된 세포에서 감염성 자손을 생성할 수 없다. 이 발견은 표현형으로 보체된 NDV 결실 돌연변이체는 환경으로 전이될 수 없는 안전한 자기-제한 백신으로서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 이와 같은 비-전이성 백신은 생백신의 가장 중요한 장점, 즉 효능과 사멸 백신의 가장 중요한 장점인 안전성과 결합시킨다.
참고문헌

Claims (31)

  1. 적어도, 조류-파라미쏘바이러스의 감염성 복사체를 산출하게 하는 조류-파라미쏘바이러스 게놈의 5'-말단에 상응하는 핵산 서열을 포함하는 조류-파라미쏘바이러스 cDNA.
  2. 제 1항에 있어서, 전체-길이 cDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA.
  3. 적어도, 복제화 조류-파라미쏘바이러스 미니게놈을 산출하게 하는 조류-파라미쏘바이러스 게놈의 5'-말단에 상응하는 핵산 서열을 포함하는 cDNA.
  4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 적어도 부분적으로 뉴캐슬병 바이러스로부터 유래된 것을 특징으로 하는 cDNA.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 뉴캐슬병 바이러스는 렌토제닉 바이러스, 바람직하게는 백신 균주로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 cDNA.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 백신 균주는 LaSota 균주 ATCC VR-699인 것을 특징으로 하는 cDNA.
  7. 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 추가로 핵산에 변형이 제공된 것을 특징으로 하는 cDNA.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 변형은 변형된 프로테아제 절단 부위를 코드화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 절단 부위는 융합(F) 단백질의 프로테아제 절단 부위인 것을 특징으로 하는 cDNA.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 변형은 하이브리드 바이러스성 단백질을 코드화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 단백질은 적혈구 응집소-뉴라미니다제 (HN) 단백질인 것을 특징으로 하는 cDNA.
  12. 제 7항에 있어서, 상기 변형은 바이러스성 단백질을 코드화하는 핵산에서 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 바이러스성 단백질은 매트리스 (M) 단백질인 것을 특징으로 하는 cDNA.
  14. 제 1항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 추가로 이종성 항원을 코드화하는 핵산이 제공된 것을 특징으로 하는 cDNA.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 항원은 가금 병원체로부터 유래된 것을 특징으로 하는 cDNA.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 추가로 면역-자극 단백질 또는 그것의 부분을 코드화하는 핵산이 제공된 것을 특징으로 하는 cDNA.
  17. 제 1항 내지 제 16항중 어느 한 항에 따른 cDNA로부터 수득되는 RNA.
  18. 제 1항 내지 제 16항중 어느 한 항에 따른 cDNA로 적어도 하나의 세포를 트랜스팩션하는 단계를 포함하는 감염성 복사체 조류-파라미쏘바이러스를 생성하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 세포는 적어도 바이러스성 뉴클레오캡시드 (NP), 포스포-(P) 또는 대 폴리머라제 (L) 단백질을 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 상기 바이러스의 융합 단백질을 절단하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18항 내지 제 20항중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 단백질가수분해 활성을 포함하는 성장 배지에서 인큐베이트하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 성장 배지는 상기 단백질가수분해 활성을 포함하는 요낭액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 18항 내지 제 22항중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 닭 세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 18항 내지 제 23항중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 감염성 복사체 조류-파라미쏘바이러스.
  25. 제 24항에 따른 바이러스를 포함하는 백신.
  26. 제 25항에 따른 생 백신.
  27. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 상기 감염성 복사체 조류-파라미쏘바이러스는 적어도 부분적으로 뉴캐슬병 바이러스 (NDV)로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 백신.
  28. 비-백신 접종된 동물 또는 제 27항에 따른 NDV로 백신 접종된 동물을 야생형 NDV에 감염된 또는 비변형된 메소제닉 또는 렌토제닉 NDV 균주로 백신 접종된 동물로부터 구별방법으로, 상기 동물로부터 적어도 하나의 시료를 취하고 그리고 상기 시료에서 면역지배적 에피토프에 대한 항체들 또는 상기 백신에 의해서는 발현되지 않으나 상기 야생형 또는 비변형 NDV에 의해 발현된 마커의 존재를 측정하는 것으로 이루어지는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 항체들은 NDV의 HN 또는 F에 대한 것임을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 상기 동물은 가금으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 바람직하게는 닭인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 28항 내지 제 30항중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 진단 키트.
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