JP2009261387A - ニューカッスル病ウイルス感染性クローン、ワクチンおよび診断アッセイ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 該方法は遺伝子修飾によりNDVゲノムを修飾する可能性を提供し、突然変異、欠失、および/または挿入の導入を可能とする。該方法はNDVの毒性を修飾するために使用し得るものであり、それによって高い特性の新しい弱毒化生ワクチンを生成させることができる。該方法はNDVの抗原性構造を修飾するために使用し得るものであり、したがって、NDV野生株と血清学的に識別し得る生菌NDVマーカーワクチンの生成を可能とする。
【選択図】なし
Description
ている(Stauber et al., 1995; Kant et al., 1997)が、しかし、さらに血清学的な区別は不可能である。
材料および方法
標準クローニング法は、別に記載しない場合は、Sambrookらの方法(1989)によって行った。複製連鎖反応(PCR)によって生成したDNA断片を含む全構成分は、塩基配列分析によって確認した。下に挙げるプライマーの配列において、下線を引いた塩基はNDVの配列に対応し、NDVゲノム内のポジションを表示する。クローニングに使用した制限部位の塩基配列は、太字で示す。
細胞およびウイルス
ウシ胎児血清5%ならびに1000U/mlペニシリン、1000μg/mlストレプトマイシン、20μg/mlファンギゾン、500μg/mlポリミキシンBおよび10mg/mlカナマイシンからなる抗生物質ミックスを2%含むGMEM/EMEM(1:1)中でCER細胞(Smithら、1976)を培養した。QT35細胞(Moscoviciら、1977;Cho、1982)は、FCS5%および抗生物質ミックス2%を追加した、GibcoBRL/Life Technologiesによって供給された培地(カタログ番号No.041−91536;Fort Dodgeが独占権をもつ組成物)で培養した。QM5細胞(AntinおよびOrdahl、1991)は、燐酸トリプトースブイヨン10%、FCS10%および混合抗生物質2%を追加したM199培地で培養した。
操作はすべて、RNアーゼの存在しないガラス容器またはプラスチック容器で行い、溶液はすべて、1%ジエチルピロカルボネート(DEPC)で処理したRNアーゼ除去の水で作成した。Beckman SW40遠心機による、21,000rpm、4℃で70分間の遠心分離により、尿膜腔液からウイルスをペレット化した。このペレットをホモジナイズ化緩衝液(50mM Tris−HCl(pH7.5),50mM NaCl,5mM EDTA,0.5% SDS)に再懸濁し、絶えず攪拌しながら37℃で90分間プロテイナーゼK(200μg/ml)で処理した。溶菌液を、等量のフェノール/クロロホルム(1:1)(pH5.4)で2回、等量のクロロホルムで1回抽出した。ウイルスRNAは、3M NaOAc(pH5.3)および2.5倍量の100%エタノールを添加して水相から沈殿させた。沈殿は、遠心により採取して、70%エタノールで1回洗浄し、水に再懸濁させ、分割して−70℃で保存した。
ウイルスRNA(1.5μg)を、12μlの容量にプライマー500ngを含む液と混合し、70℃で10分間インキュベートした。5xRT緩衝液(250mM Tris−HCl,pH8.3,375mM KCl,15mM MgCl2;GibcoBRL/Life Technologies)4μl、0.1M DTT 2μlおよび10mM dNTP's 2μl(各2.5mM)を添加し、混合液を42℃で2分間インキュベートした。最終容量20μl中で、逆転写酵素(Superscript II;GibcoBRL/Life Technologies)200単位を添加し、ついで42℃で60分間インキュベートすることにより逆転写を行った。
NDVゲノムの3'および5'末端を決定するために使用したPCR反応(下記参照)はすべて、Taq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer)を用いて行った。個々のNDV遺伝子または大サブゲノムcDNAのクローニングのために、プルーフリーディングDNAポリメラーゼPwoか、TaqとPwoの混合物(Expand High FidelityキットまたはExpand Long Templateキット)を、メーカー(Boehringer Mannheim)の指示書に従って使用した。試料はすべて、指示された回数のPCRサイクルの開始前に94℃で2分間インキュベートした。指示された回数のPCRサイクルの後、試料を、PCRサイクルの伸長反応時間の少なくとも3倍の時間、伸長反応温度でインキュベートした。PCR断片を、高純度PCR製品精製キット(Boehringer Mannheim)で直接精製するか、またはアガロースゲル電気泳動の後、QiaexII抽出キット(Qiagen)を基本的にメーカーの指示どおりに使用して精製した。
塩基配列はすべて、PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencingキット(Perkin Elmer)を用いて決定した。反応混合液(5μl)をGeneAmp2400サーモサイクラー中で25サイクルの線形増幅(94℃で10秒、50℃で5秒、および60℃で4分)にかけた。その後、反応混合体をエタノールで沈殿させ、70%エタノールで1回洗浄し、TSR緩衝液(Perkin Elmer)15μlで再懸濁させ、94℃で2分間加熱した後、Applied BiosystemsのAB310自動シークエンサーにかけた。
NDVゲノムの3'および5'末端の塩基配列は、RACE法(cDNA末端の迅速増幅法)を用いて決定した。プライマーp360(5'−GGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT−3';nt 14756−14779)(NDVのL−遺伝子の公表された塩基配列(Yusoffら、1987)から引き出した)を用いる、最終容量20μlでの逆転写反応には、NDV RNAを使用した。一本鎖cDNA(RT混合物の2.5μl)を、アンカープライマーALG3(5'−CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC−3')8pmolに添加し、Tessierら(1986)による記載のとおりに、50mM Tris−HCl、pH8.0、10mM MgCl2、10μg/ml BSA、25% PEG、1mM HCC、20μM ATPおよびT4 RNA リガーゼ(New England Biolabs)10単位を含む反応混合液20μlの中で、室温で一夜連結反応をさせた。連結反応の1μlを、プライマーp375(5'−CAATGAATTCAAAGGATATTACAGTAACT−3';nt 14964−14983)およびALG4(5'−GAAGGATCCAGAATCGATAG−3')を用いるPCR反応におけるテンプレートとして使用した。後者のプライマーは、アンカープライマーALG3に対し相補的である。PCRの条件(40サイクル)は次のとおりである:94℃で1分間、55℃で1分間および72℃で2分間。PCR生成物を精製し、T−ベクターpBluescript−TSK(IchiharaおよびKurosawa、1993)中にクローニングした。あるいはその代わりに、精製したPCR生成物をKlenow DNAポリメラーゼIで処理して平滑末端を作り、プラスミドpGEM4Z(Promega)のHincII部位にクローニングした。13個の独立クローン(8×pBleuscriptII−TSKおよび5×pGEM4Z)を配列して、NDV株LaSotaゲノムの5'末端の塩基配列を決定した。3'末端の塩基配列は、二つの独立した方法によって決定した。方法Iでは、Schutzeら(1995)によって記載されているとおりに、T4 RNAリガーゼを用いることによって、プライマーALG3をウイルスRNAの3'末端に連結させた。反応混合液(最終容量10μl)には、NDV RNA 2.5μg、ALG3 100pmol、10× T4 RNAリガーゼ緩衝液(500mM Tris−HCl、pH7.8、100mM MgCl2、100mM DTT、10mM ATP)1μl、DMSO 1μl、10μM ヘキサミン−塩化コバルト 1μl、RNアーゼ(Promega)1μlおよびT4 RNAリガーゼ(New England Biolabs)10単位が含まれていた。この混合液を室温で1夜インキュベートし、この連結反応の5μlを、プライマーとしてALG4を用いる逆転写反応のテンプレートして使用した。プライマーALG4およびp376(5'−GAGCCTTAAGGAGCTGCTCGTACTGATC−3';nt 137−164)(この塩基配列は、NDVの3'末端の公表された塩基配列(Ishidaら、1986)から引き出した)を用いるPCR反応にRT−反応の1μlを使用した。PCR条件は、5'RACEについて上に記載したのと同じであった。方法IIにおいては、方法Iについて記載したのと同じ条件で、T4 RNAリガーゼを用いることによってウイルス性NDV RNAの3'と5'末端を互いに連結した。連結反応混合液の5μlを、プライマーp360を用いる逆転写反応においてテンプレートとして使用した。プライマーp375およびp376を用い、かつ5'RACEについて上に記載したPCR条件を用いるPCR反応に、RT反応の1μlを使用した。PCR生成物は、Klenow DNAポリメラーゼIで処理して平滑末端を作り、プラスミドpGEM4ZのHincII部位(Promega)にクローニングした。10個の独立したクローン(方法Iから4個、方法IIから6個)の配列を分析して、NDV株LaSotaのゲノムの3'末端の塩基配列を決定した。
基本レプリコンとしてプラスミドpOK12(VieiraおよびMessing、1991)を用いることによって低コピー番号の転写ベクターを構築した。プラスミドpOK12をPvuIIで消化し、複製開始起点およびカナマイシン−抵抗遺伝子を含むDNA断片を単離した。このDNA断片を、転写ベクター2.0(Andrew Ball博士の恵贈品;Pattnaikら、1992)から得たEco47III−AflII断片(AflII部位は、Klenow DNAポリメラーゼIを用いて平滑にした)に連結した。得られたプラスミドからXbaI−NheI断片を削除して、できるだけ多くの特定の制限部位を減らした。得られたプラスミドをpOLTV5と称す(図1)。転写ベクターpOLTV5には、特異なStuIおよびSmaI制限部位が後続するT7 DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター、D型肝炎ウイルス(HDV)由来の自己触媒性リボザイムおよびバクテリオファージT7由来の転写終結シグナルが含まれている。StuI部位とSmaI制限部位の間にクローニングされた断片は、T7RNAポリメラーゼを用いることによって、インビトロでもインビボでも転写することができる。転写の後、得られた転写産物の5'末端には、プラスミドによってコードされた2個のG残基が含まれている。HDVリボザイムの自己触媒作用により、転写産物の3'末端は、クローニングされたDNA断片の正確な末端塩基に対応している(Pattnaikら、1992)。
NDVの複製および転写の要件を調べるために、全NDV遺伝子を置換したレポーター遺伝子を側に配置しているNDVの3'および5'末端部分を含んだミニゲノムプラスミドを構築した(図2)。NDVの3'および5'末端領域に対応するDNA断片を、Pwo DNAポリメラーゼ(30サイクル;94℃で15秒、50℃で30秒および72℃で30秒)を用いること、ならびにテンプレートとして3'および5'RACE断片(上記参照)を含んだプラスミドを用いることによるPCR法によって産生した。
NDVの標準5'および3'末端を含むインビトロまたはインビボの転写産物を生成させるために、プラスミドpOLTV535およびpOLTV553中のT7プロモーターを、転写がNDVの3'および5'末端の最初の塩基から始まるように修飾した。
GGTGAATG−3')およびSEAP5を用いることによって、pOLTV553中のSEAP遺伝子の終点までに修飾したT7プロモーターおよびNDVの全5'末端を含むDNA断片を作製した。得られた断片を、それぞれ、BglIとSphI(3'末端)で、またはBglIとClaI(5'末端)で消化し、pOLTV535中のBglI−SphI断片またはpOLTV553中のBglI−ClaI断片に置換するのに使用した。得られたプラスミドは、それぞれ、pOLTV735およびpOLTV753と称した。プラスミドpOLTV735N3およびpOLTV753N3は、SEAP遺伝子と、それぞれ、pOLTV735およびpOLTV753の中にあるNDVの5'末端との間に位置するClaI部位に、自己相補性オリゴヌクレオチド(5'−CGCGAGCWGCTCG−3';W=AまたはT)を挿入することによって作製した。
真核生物の発現ベクターpCIneo(Promega)のXhoI部位とSmaI部位との間に、プラスミドpSEAP−Basic(Clontech)から得たSEAP−遺伝子を含むXhoI−ClaI断片(ClaI部位は、Klenow DNAポリメラーゼIを用いて平滑にした)をクローニングすることによってプラスミドpCIneoSEAPを構築した。プラスミドpSEAP−Basicには、バクテリオファージT7プロモーターに加えてヒトサイトメガロウイルス(hCMV)が含まれている。T7プロモーターだけから作製した転写産物によるSEAP発現を検査・定量するために、hCMVプロモーターを欠いた他のプラスミドを構築した。この目的のために、HindIIIでの部分消化とそれに続くBglIIでの完全消化によって、pCIneoからhCMVプロモーターを削除した。hCMVプロモーターを削除したDNA断片(Clontechの番号付けによれば、nt 756〜5469)を単離し、T4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を作成し、T4 DNAリガーゼを用いて再環化した。得られたプラスミドは、pCIneoDと称した。最後に、SEAP遺伝子を、pSEAP−BacisからMluI−AccI断片として回収し、pCIneoD中、MluI部位とClaI部位の間にクローニングした。得られたプラスミドをpCIneoD SEAPと称した。
細胞を、24穴のペトリ皿に植付け、1夜増殖させて60〜80%の集密度にし、感染多重度(m.o.i.)1で、37℃1時間、FPV−T7に感染させた。この細胞に、基本的にメーカー(GibcoBRL/Life Technologies)の指示どおりにLipofectAMINEおよびOptiMem3μlを用いて、ミニゲノムプラスミドDNA0.5μgをトランスフェクションした。37℃で4時間(CER細胞)または16時間(QM5細胞)インキュベートした後、細胞に、多重感染度5で1時間、NDV(Dutch virulent isolate番号152608;ウエル当たり200μl)に感染させるか、または感染させないままで放置した。接種物を吸引し、完全培地1mlで置換し、細胞を37℃でさらにインキュベートした。コトランスフェクションのために、6穴のペトリ皿で細胞を増殖させ、上記と同じようにFPV−T7に感染させた。細胞は、LipofectANINE 8μlまたはFuGeneTM6(Bohringer Mannheim)9μlを使用することによって、ミニゲノムプラスミドDNA 0.25μg、pCIneoNP 0.4μg、pCIneoP 0.2μgおよびpCIneoL(c)またはpCIneo 0.2μgをコトランスフェクションした。感染性ウイルスを産生するために、ミニゲノムプラスミドを、全鎖長NDV cDNAを含んだ転写プラスミドに置換した。
Phospha−LightTM Chemiluminescent Reporter Assay for Secreted Alkaline Phosphatase kitを基本的にメーカー(Tropix)の記載どおりに使用して、96穴の使い捨てプレート上で、トランスフェクションした細胞の培地に分泌されたSEAPの量を測定した。化学発光を、液体シンチレーションカウンター(Wallac 1450 microbeta PLUS)を用いて定量した。
NDV株LaSotaの全ゲノムをクローニングし、塩基配列を決めるために、RT−PCRによって大サブゲノムcDNAクローンを作製し、pGEM−Tの中にクローニングした。上記のごとく、プライマー3UITを用いて第1鎖cDNAを合成し、RT反応の1μlを、Expand Long Template PCRキット(Boehringer Mannheim)を用いるPCR反応に使用した。PCR法は、94℃で10秒間、58℃で30秒間および68℃で6分間のサイクル5回、さらに94℃で10秒間、58℃で30秒間、および68℃で6分間のサイクル10回からなっていた。その中で、68℃での伸長反応時間は、サイクルごとに20秒ずつ延ばした。PCR断片は、基本的にメーカー(Promega)が記載しているとおりにpGEM−Tクローニングキットを使用してpGEM−T中にクローニングした。連結反応混合液をE.Coli株SURE II(Strategene)に形質転換した。2回の独立したRT−PCR反応(AおよびB)を行い、おのおのでcDNAクローンの類似セットを得た。サブゲノムcDNAクローンの塩基配列は、NDV−特異的プライマー(表1)を用いて、かつ挿入体の側に配置しているプライマーによって決定した。クローンのAおよびBシリーズの塩基配列を比較した後、残っているあいまいさをcDNAの第3独立シリーズ(Cシリーズ)の相当領域の塩基配列を決めることによって取り除いた。NDV株LaSotaの塩基配列を図3に示す。
出発プラスミドとしてpOLTV535を用いることによって転写プラスミドpOLTV5に全鎖長NDV cDNAを集めた。これらのDNA断片を、図4Bに示すように通常の制限酵素を用いて重複点で結合した。一連のクローニング段階で、ポジション3521および12355でClaI部位を結合することによって生成した、ClaI部位によって分離されたヌクレオチド1〜3521および12355〜15186を含むプラスミド(p535−DIと命名)を構築した。他の系列のクローニング段階で、ヌクレオチド3521〜12355(ClaI断片)を含むNDVゲノムの一部を含んだプラスミド(pGEM−Bと命名)を構築した。クローニングを容易にするために、後者のClaI断片に、プラスミドpACYC184から得たクロラムフェニコール抵抗性(Cm)遺伝子を標識に付けた(ChangおよびCohen、1978)。この目的のために、プライマーCAT−F(5'−GCGTACGTCTAGACTGGTGTCCCTGTTGATACCGG−3')およびCAT−R(5'−GCTCTAGACGTACGACCCTGCCCTGAACCGACG−3')を用いるPCRによってpACYC184からCm遺伝子を回収した。PCR法は、Pwo DNAポリメラーゼを用いて行い、94℃で30秒、60℃で45秒および72℃で60秒のサイクル30回からなっていた。得られたPCR断片をBsiWIで消化し、pGEM−Bの特定BsiWI部位にクローニングし、pGEM−B(CAT)を得た。pGEM−B(CAT)から得たClaI断片は、p535−DIの特定ClaI部位にクローニングして、pNDFL(CAT)を得た。最後に、このプラスミドからCm遺伝子を、BsiWIでの消化とそれに続くE.coli株DH5aの再連結および形質転換によって除去した。得られたプラスミドをpNDFL+と称した。これには、転写プラスミドpOLTV5の中のT7プロモーターおよびHDVリボザイムの間にクローニングしたNDV cDNA全塩基配列が含まれている。
NDV LaSota遺伝子の各々を含むDNA断片をRT−PCR法によって作成し、pCIneo中にクローニングした。クローニングの後、断片すべての塩基配列を、挿入配列を側に持つプライマーを用いることによって、かつ遺伝子特異的プライマーによって決定した。
クローニングした全鎖長cDNAから感染性ウイルスを産生させうることを明白に示すために、PCR突然変異誘発によってF遺伝子に遺伝的タグを導入した。この目的のために、2個の重複PCR断片を用いてF遺伝子をクローニングした。第一PCR断片は、プライマー類NDV5F(上記参照)およびプライマーF5R(5'−AAAGCGCCGCTGTCTCCTCCCTCCAGATGTAGTCAC−3';nt 4859〜4894)を使用することによって生成した。太字で示した残基は、F1とF2との間のタンパク質分解的切断部位のアミノ酸配列を、NDV LaSota株(GGRQGR|L)の配列から毒性のあるNDV株(GRRQRR|F)のための共通切断部位のそれに変えるために、プライマーに導入した変換部分である。第二PCR断片は、プライマーF3F(5'−GGAGGAGACAGCGGCGCTTTATAGGCGCCATTATTGG−3';nt 4875〜4911)およびIV09(5'−CTCTGTCGACACAGACTACCAGAACTTTCAC−3';nt 6246〜6266)を使用することによって産生した。PCR法は、Pwo DNAポリメラーゼで行い、94℃で15秒間、55℃で30秒間および72℃で2分間のサイクル25回からなっていた。2個の重複PCR断片(重複は、プライマーの塩基配列においてイタリックで示す)は、プライマーNDV5FとIV09を用い、かつ同一のPCR条件を用いる第二PCR法で、結合させた。得られた断片(F遺伝子の全ORFを含み、ビルレント共通切断部位をコードしている)をNheIとSalIで消化し、pCIneo中、NheI部位とSalI部位との間にクローニングして、pCIneoFwtを産生した。pCIneoFwtから得たStuI−NotI断片(nt 4646〜4952)を使用して、p535−DI中、ClaI部位とScaI部位との間にpGEM−Bから得たClaI−ScaI断片(nt 3521〜10311)を挿入することによって構築したプラスミドp535−S中の対応する断片を置換した(図4C参照)。得られたプラスミドは、p535−S[Fwtc]と称した。pACYC184(上記参照)由来のCm−抵抗性遺伝子を含むPCR断片を、XbaI断片としてプラスミドp535−S[Fwtc]の特定XbaI部位(NDVの塩基配列のポジション6172)にクローニングして、プラスミドp535−S[Fwtc]Cmを産生した。続いて、このプラスミドのCmで標識を付けたApaI−SpeI断片(nt 2285〜8094)を用いて、全鎖長cDNA クローンpNDFL+の対応する断片を置換した。最後に、XbaIでの消化とそれに続くT4DNAリガーゼを用いる再環化によって、このプラスミドからCm遺伝子を除去した。得られたプラスミド(遺伝的に標識を付けた全鎖長NDV cDNAを含んでいる)をpNDFL+[Fwt]と称した。
プラスミド類pCIneoNP、pCIneoP、pCIneoM、pCIneoF、pCIneoFwtおよびpCIneoHNを使用して、個別にこれらのタンパク質を発現する、安定に形質転換した細胞系を生成させた。トランスフェクションの前日に、6cmのペトリ皿にCER細胞を播種し、一夜インキュベートして60〜80%の集密度を得た。この細胞を、基本的にメーカー(GibcoBRL/Life Technologies)の指示どおりにLipofectAmineとOptiMemの12μlを用いて、プラスミドDNA2μgでトランスフェクションした。48時間後、細胞にトリプシン処理をし、希釈液を、10cmペトリ皿中、G418(Boehringer Mannheim)500μg/mlを含む培地に播種した。3日毎に、培地を新しい培地に置換したが、その際G418を100μg/mlずつ増量し、最終濃度は800μg/mlに至った。G418 800μg/ml含有培地に細胞を入れたままにし、トランスフェクションの3週間後、個々のコロニーをつまんで、96穴のペトリ皿に移した。クローニングした細胞系について、一過性発現試験について上に記載したのと同じようにIPMAを用いて、個々のNDV遺伝子の発現を調べた。
T7 RNAポリメラーゼを発現する、安定に形質転換させた細胞系の生成
T7 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子は、EcoRIとSalIでの消化によってプラスミドpRT7NT(Rene van Gennip、ID−DLO、哺乳動物ウイルス学の部門)から回収した。得られた断片には、バキュロウイルスp10プロモーターの背後に隠れて存在するT7 RNAポリメラーゼ遺伝子が含まれている。このDNA断片を、プラスミドpCIneo0中、EcoRI部位とSalI部位の間にクローニングして、プラスミドpCIneo107を産生した。プラスミドpCIneo0は、T7プロモーターを欠いているが、NheIでの切断、続いてのScaIによる部分切断、付着末端へのKlenow DNAポリメラーゼの導入、ならびにT4 DNA リガーゼによる再環化によってpCIneo107から誘導した。EcoRIとPacIによる消化、続いての平滑末端を作成するためのT4 DNAポリメラーゼ処理、および再環化によって、pCIneo107からバキュロウイルスの塩基配列を除去した。得られたプラスミドをpCIneo007と称した。T7 RNAポリメラーゼの発現は、細胞をpCIneo007とpPRh01でコトランスフェクションすることによって確認した。後者のプラスミドには、T7プロモーターの背後にクローニングされ、内在性リボソーム侵入部位(Rene van Gennip、私信)を含む古典的なブタコレラウイルスのE2が含まれている。E2タンパク質の発現は、モノクローナル抗体V4(Wensvoortら、1986)を用いるIPMAで測定した。T7 RNAポリメラーゼを発現する安定に形質変換したCER細胞を、10cmのペトリ皿を使用したことおよびpCIneo007 DNA 5μgとLipofectAmine 25μlで細胞をトランスフェクションしたことを除いて上記と同じように、産生し、単離した。T7 RNAポリメラーゼの発現について個々の細胞系を調べるために、細胞を、プラスミドpPRh01でトランスフェクションし、E2の発現(T7 RNAポリメラーゼに依存する)を、モノクローナル抗体V4を用いてIPMAで測定した。T7 RNAポリメラーゼを発現した数個の細胞系を同定した。1細胞系(CER−C9と称する)をその後の実験に使用した。
上記したように、プライマー3UITを使用して、NDVの一本鎖cDNAならびにトリパラミクソウイルスの血清型2および4(APMV2およびAPMV4)を作製した。その後のPCR反応はすべて、94℃で15秒間、55℃で30秒間および72℃で2分間のサイクル25回の条件を用いて行った。
オリゴヌクレオチドHN12a(5'−GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGACTTA−3')とHN12b(5'−CTAGTAAGTCGTTAACTCTAGAATATGC−3')とを用いて、一つの合成リンカー(HN12と表示)をpGEM−T(Promega)のNotI部位とSpeI部位との間に挿入した。オリゴヌクレオチドHN14a(5'−GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGA−3')とHN14b(5'−CTAGTCGTTAACTCTAGAATATGC−3')とを用いて、一つの合成リンカー(HN14)をpGEM−T(Promega)のNotI部位とSpeI部位との間に挿入した。得られたプラスミドは、それぞれ、pGEM−HN12およびpGEM−HN14と称した。これらのプラスミドをNotIとXbaIで消化し、プラスミドp535−S[Fwtc]Cmから得たNotI−SpeI断片(nt 3390〜7488)をクローニングするために使用した。得られたプラスミドは、それぞれ、pGEM−HN1/2NSおよびpGEM−HN1/4NSと称した。これらのプラスミドのHN遺伝子を、それぞれ、プラスミドpCIneoHN1/2143およびpCIneoHN1/4143から得たハイブリッドHN遺伝子で置換した(「HN遺伝子およびハイブリッド−HN遺伝子のクローニングおよび発現」のセクション参照)。この目的のために、pCIneoHN1/2143およびpCIneoHN1/4143をNheIとSmaIで消化し、プラスミドpGEM−HN1/2NSおよびpGEM−HN1/4NSのNheI部位とHpaI部位との間にクローニングして、それぞれ、pGEM+HN12およびpGEM+HN14を得た。
MAb 4D6によって認識される(Longら、1986;Meulemansら、1986)、NDV LaSotaのHNタンパク質中の特異的エピトープ、すなわちアミノ酸346〜354(PDEQDYQIR)を、この配列をAPMV−2(NRTDIQQTI)またはAPMV−4(PDPLQDQIL)のいずれかのHNタンパク質の相当する配列に置換することによって、削除した。この目的のために、プラスミドpCIneoHN(「個々のNDV遺伝子のクローニングおよび発現」のセクション参照)をテンプレートとして用いて、重複PCR断片を作製した。APMV−2配列のために、プライマー類IV01(5'−GTAGACGCGTAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT−3')およびプライマー3HN2(5'−GATAGTTTGCTGTATATCAGTCCGATTGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC−3')を用いて第一PCR断片を作製した。第二PCR断片は、プライマー5HN2(5'−AATCGGACTGATATACAGCAAACTATCATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC−3')およびNDV3−HN(5'−CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG−3')を用いて作製した。得られた断片を結合させて、プライマー類IV01B(5'−GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT−3')およびプライマーNDV3−HNを用いる第三PCR法のためのテンプレートとして使用した。APMV−4配列のために、第一PCR断片を、プライマー類IV01およびプライマー3HN4(5'−TAAGATCTGATCTTGCAGCGGGTCAGGGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC−3')を用いて作製した。第二PCR断片は、プライマー5HN4(5'−CCTGACCGCTGCAAGATCAGATCTTAATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC−3')およびNDV3−HNを用いることによって作製した。得られた断片を結合して、プライマーIV01BおよびNDV3−HNを用いる第三PCR法のためのテンプレートとして使用した。プライマー3HN2/5HN2および3HN4/5HN4は、一部相補的であり、それぞれ、HN2配列(NRTDIQQTI)およびHN4(PDPLQDQIL)のための遺伝子コードを含んでいる。PCR法は、Expand Long Template PCRキット(Boehringer Mannheim)を用いて行った。このPCR法は、94℃で10秒間、58℃で30秒間および68℃で2分間のサイクル30回、続いて68℃で4分間のサイクル1回からなっていた。PCR断片は、EcoNIとBsu36Iで消化し、pCIneoHNのEcoNI部位とBsu36I部位との間にクローニングした。得られたプラスミドは、それぞれ、pCIneoHN1(HN2e)およびpCIneoHN1(HN4e)と称した。検討した一過性発現は、修飾したタンパク質が正しく発現されて、ニワトリ赤血球を用いる赤血球吸着ウイルス試験から判断されるように、細胞表面に輸送されたことを示した。
NDV株LaSotaのゲノムの3'および5'末端部の塩基配列
NDVゲノムの推定3'末端の配列は、ここで用いたND株(LaSota)とは異なる株(D26)ではあるが、すでに公表されている(Ishidaら、1986)。Yusoffら(1987)は、L遺伝子およびNDV株Beaudette CのL遺伝子の背後にある比較的大きな非コード領域の配列を公表した。しかしながら、本出願に示すように、この配列には、感染性模写NDVを生成することを不可能にするウイルスゲノムの5'末端全体が含まれていなかった。マイナス鎖RNAウイルスのゲノムの3'および5'末端部は、複製および転写の基本的な機能を果たす(LambおよびKolakofsky、1996)。それゆえ、逆遺伝学による感染性ウイルスの作製(Conzelmann、1996)に使用することができる、全鎖長NDV cDNAを作製するためには、ウイルスゲノムの正確な3'および5'末端を含めることが絶対的に必須である。したがって、われわれは、3'および5'RACE法(cDNA末端の迅速増幅法)を利用して、NDV株LaSotaのゲノムRNAの3'および5'両末端の正確な塩基配列を決定した。5'末端は、一本鎖アンカープライマー(ALG3)を、ゲノムRNAの5'末端の逆転写によって産生した一本鎖cDNAに連結した後、PCR法によって回収した。アンカープライマーに相補的なプライマー(ALG4)およびNDV特異的プライマーを用いることによって、5'末端を含んだPCR生成物を産生した。
NDVの3'および5'末端が複製および転写に機能しているかどうかを決定するために、NDVの3'末端(nt 1〜119)、分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)をコードしているレポーター遺伝子およびNDVの5'末端(nt 14973〜15186)からなったミニゲノムを構築した(図2)。
ミニゲノムRNAがNDVヘルパーウイルスでパッケージされるか否かを決定するために、トランスフェクションした細胞の培地を新しい単層に移し、1時間の吸着の後、その単層をPBSで3回洗浄し、さらに完全培地でインキュベートした。24時間のインキュベーションの後、培地中のSEAP活性を測定した。その結果、SEAP活性はミニゲノムプラスミドpOLTV553N3でトランスフェクションした細胞からの培地で処理した細胞にだけ存在することが判った(表4)。この発見は、ミニゲノムRNAが、NDVエンベロープにパッケージされ得ることおよびこれらの粒子が細胞を感染させ得ることを示している。さらに、これらの結果が示していることは、パッケージングが複製に依存していることであり、このことは、ウイルス性NP、PおよびLタンパク質と複合体を形成するRNA分子だけがウイルス様粒子にパッケージされることを示している。
ミニゲノムRNAも基本的なNP、PおよびLタンパク質をコードしているプラスミドによって複製されるかどうかを決定するために、われわれは、FPV−T7に感染した細胞でコトランスフェクション実験を行った。ミニゲノムプラスミドならびに、それぞれ、プラスミドpCIneoNP、−Pおよび−L(c)からなるプラスミドの組み合わせで細胞をトランスフェクションした。ネガティブコントロールとして、pCIneoL(c)(基本的Lタンパク質をコードしている)を、ベクタープラスミドpCIneoで置換した。その結果(表5)、NP、PおよびLタンパク質をコードしているプラスミドは事実、ミニゲノムRNAを複製し得ることが判明した。さらにこれらの結果は、ヘルパーウイルスによるミニゲノム複製に類似して、NP、PおよびLタンパク質による複製もまた、6の法則に依存していることを示している。
全NDVゲノムに亘るサブゲノムcDNA断片をRT−PCR法によって構築した(図4)。PCRエラーの数を最小限に保つために、プルーフリーディング酵素ミックス(Expand Long Template;Boehringer Mannheim)を、限られた回数のPCRサイクル(15サイクル)と組み合わせて使用した。NDV RNAの3'末端に相補的であるプライマー3UITを逆転写のために使用し、そして遺伝子特異的プライマーをPCR法のために使用した。起こり得るPCRエラーを確認するために、3つの独立したRT反応を行い、サブゲノムcDNAの3つの独立した組を作製した。サイズにおいて約4kbから7kbまでばらついているcDNAをpGEM−T中にクローニングした。公表されたNDV配列から引き出したプライマーを用いることによって、あるいはこの配列決定プロジェクトの間に引き出されたNDV配列から取り出したプライマーによって、二組のcDNAの塩基配列を決定した(表1)。残っている不確かさは、第3組のcDNAクローンの相当領域の配列決定をすることで解消した。NDV株LaSotaのゲノムは、15186ntからなっている(図3)が、これは、このゲノムが、今日までに全配列が確立されたパラミクソウイルスゲノム全体の中で最小のゲノムであることを示している(Kolakofsky、1998)。
NDV株LaSotaの全鎖長cDNAクローンを構築するために、図4に示されている戦略に従って、全NDVゲノムに亘る重複cDNAクローンを共有制限部位で結合した。転写プラスミドpOLTV5から導出されるミニゲノムプラスミドpOLTV535(上記参照)の中に全NDV cDNAを集めた。
クローニングしたcDNAだけから感染性NDVを産生するために、ミニゲノムプラスミドについて上に記載したように、pCIneoNP、−Pおよび−L(c)を用いるコトランスフェクション実験において、プラスミドpNDFL+を使用した。ミニゲノムプラスミドpOLTV553N3を用いること、およびSEAP発現を測定することによってCERおよびCEF細胞のトランスフェクションを監視した。ネガティブコントロールとしては、pCIneoL(c)をpCIneoに置換した。コトランスフェクションの後、5%尿膜腔液を含む培地で3〜6日間細胞をインキュベートした。尿膜腔液の添加は必要である。なぜなら、CERおよびCEF細胞は、NDV株LaSotaのFタンパク質を切断するために必要とされる適当なプロテアーゼを欠いているからである。
共存形質移入(コトランスフェクション)を用いて、クローニングした完全長のNDVのcDNAから感染性ウイルスを回収することができることをはっきりと示すために、プラスミドpNDFL(+)に遺伝子タグを導入した。この目的のために、PCRの変異誘発(詳細は材料と方法の項参照)によって、Foタンパク質におけるプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列を、LaSota株の配列(GGRQGR/L)から毒性NDV株のコンセンサス配列(GRRQRR/F)に変更した。上記共存形質移入システムを用いて、ウイルスを作成するために、出来上ったプラスミドpDNFL+[Fwt]を使用した。共存形質移入したCEF細胞の培養液を接種した胚含有卵の尿膜腔液から感染性ウイルスを回収した。HI試験では、LaSota株に特異的な7D4を含むあらゆるMAbは、新しく作成したウイルスとの間で元々のLaSota株との反応性と同一の反応性を示した。Fタンパク質のプロテアーゼ切断部位をコードする領域の核酸配列はRT−PCRによって決定した。結果は当該核酸配列が、元々のLaSota配列を修飾するのに使用された変異プライマーに導入された核酸の正確な変更を含むことを示した。この知見は、当該ウイルスがプラスミドpDNFL+[Fwt]に由来することを示し、(遺伝的に修飾された)NDVが、クローニングした完全長NDVcDNAから完全に作成できることを明らかにしている。NDVのFoタンパク質のプロテアーゼ切断部位は毒性に対する鍵となる決定基である。
NDVにおける包膜糖タンパク質F及びHNはウイルスで最も免疫原性のあるタンパク質である。感染後、F及びHNタンパク質は、強い抗体中和反応を引き出す。そのような抗体中和反応の誘導は、(広く用いられているLaSota株のような)非毒性NDV株によるワクチン接種が上手く行く基礎となる。
外来遺伝子をNDVゲノムに挿入することができるかどうかを調べるために、我々は、SEAPリポーター遺伝子を持つ組換えウイルスを構築した。SEAP遺伝子は、プラスミドpOLTV535に由来し、NDVの典型的な転写開始ボックスと転写停止ボックスを含むように修飾した。転写開始ボックスと転写停止ボックスが後に続いたSEAP遺伝子を含むDNA断片をプラスミドpNDFL+[Fwt]のXmnI部位(nt109)に挿入した。共存形質移入システムによってNDFL−APと命名した感染性ウイルスを作成し、RT−PCRによってSEAP遺伝子の存在を確認した。NDFL−AP株を感染させた細胞は、極めて高いレベルでSEAPタンパク質を発現した。SEAPタンパク質の比活性を用いて、我々はNDFL−APを感染させた細胞に発現されているタンパク質のx%がSEAPタンパク質から成っていることを算出した。このような結果は、組換えNDVから極めて高いレベルでヘテロ接合体遺伝子が発現されうることを示している。
NDVのMタンパク質の発現を除くために、BsaAI(nt3087)によるpNDFL+[Fwt]の消化とその後のHindIII(nt4252)による部分消化によってM遺伝子の大部分を削除した。HindIII末端をKlenowDNAポリメラーゼで埋めた後、T4DNAリガーゼによって再び環状化し、E.coliを形質転換するのに用いた。pNDFL+[Fwt]dMと命名された出来上ったプラスミドを用いて、NDVのMタンパク質を発現しているトランス型相補性のCER−M細胞において共存形質移入によってウイルスを作成した。形質移入した単層培養細胞の培養上清でCER−M細胞を3回継代し、ウイルスの存在を分析した。3回継代した培養上清が赤血球凝集試験(HA)及び赤血球凝集抑制試験(HI)の陽性結果を生じたということを証拠としてウイルスが得られた。ウイルスをNDFL−dMと命名した。NDFL−dMを用いて単層CEF細胞に感染させた場合、Fタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いてIPMAで見られるように、ウイルスは依然として細胞から細胞への伝染することによって広がっていくことができた。予想通り、Mタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたIPMAではMタンパク質の発現を明らかにすることはできなかった。培養上清を用いてCEF細胞又はCEF−M細胞に感染させた場合、IPMAによってこのような単層培養細胞において複製しているウイルスの存在を示すことはできなかった。このような知見は感染性ウイルスは非相補性CEF細胞では作られなかったことを示している。感染させたCEF細胞から得た培養上清を接種した胚含有卵では、HA試験又はHI試験で調べたとき、子孫ウイルスを生じなかったという観察によってこの知見は裏付けられた。
既に上述したように、F及びHMタンパク質の切断可能性のほかに、他のウイルス因子が病原性に寄与している可能性があることが示されている。転写及び翻訳における改変がウイルス及び又は細胞病原性の増殖や細胞から細胞への広がりに介在する可能性がある。NDVの感染性cDNAによって転写や複製を含む配列の酵素的な改変ができるようになる。これによって現実には存在しない毒性への最適な免疫原性を保った新しいNDVワクチンの設計が導かれる可能性がある。
Claims (31)
- 鳥類パラミクソウイルス(Paramyxovirus)の感染性コピー生成を可能とする鳥類パラミクソウイルス・ゲノムの5'-末端に相当する核酸配列を少なくとも含んでなる鳥類パラミクソウイルスcDNA。
- 完全長cDNAを含んでなることを特徴とする請求項1記載のcDNA。
- 複製鳥類パラミクソウイルス・ミニゲノム生成を可能とする鳥類パラミクソウイルス・ゲノムの5'-末端に相当する核酸配列を少なくとも含んでなることを特徴とするcDNA。
- ニューカッスル病ウイルスから少なくとも一部由来することを特徴とする請求項1、2または3記載のcDNA。
- 前記ニューカッスル病ウイルスが長潜伏期性ウイルス、好ましくはワクチン株由来のものであることを特徴とする請求項4記載のcDNA。
- 前記ワクチン株がラソタ(LaSota)株ATCC VR−699であることを特徴とする請求項5記載のcDNA。
- さらに核酸内に修飾を含むことを特徴とする請求項1ないし6のいずれかに記載のcDNA。
- 前記修飾が修飾プロテアーゼ切断部位をエンコードする核酸を含んでなることを特徴とする請求項7記載のcDNA。
- 前記切断部位が融合(F)タンパク質のプロテアーゼ切断部位であることを特徴とする請求項8記載のcDNA。
- 前記修飾がハイブリッド・ウイルスタンパク質をエンコードする核酸を含むことを特徴とする請求項7記載のcDNA。
- 前記タンパク質が赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ(HN)タンパク質であることを特徴とする請求項10記載のcDNA。
- 前記修飾がウイルスタンパク質をエンコードする核酸において欠失を含むことを特徴とする請求項7記載のcDNA。
- 前記ウイルスタンパク質がマトリックス(M)タンパク質であることを特徴とする請求項12記載のcDNA。
- 異種抗原をエンコードする核酸をさらに含むことを特徴とする請求項1ないし13のいずれかに記載のcDNA。
- 前記抗原が家禽病原に由来することを特徴とする請求項14記載のcDNA。
- 免疫刺激タンパク質またはその部分をエンコードする核酸をさらに含むことを特徴とする請求項14または15記載のcDNA。
- 請求項1ないし16のいずれかに記載のcDNAから得られるRNA。
- 請求項1ないし16のいずれかに記載のcDNAを少なくとも1つの細胞にトランスフェクションすることを含む感染性コピー・鳥類パラミクソウイルスの生成方法。
- 前記細胞がウイルス・ヌクレオカプシド(NP)、ホスホ−(P)または大型ポリメラーゼ(L)タンパク質を少なくとも発現し得るものであることを特徴とする請求項18記載の方法。
- 前記ウイルスの融合タンパク質切断を可能とすることをさらに含むことを特徴とする請求項18または19記載の方法。
- タンパク質分解活性を含む増殖培地中で前記細胞をインキュベートすることをさらに含むことを特徴とする請求項18ないし20のいずれかに記載の方法。
- 前記増殖培地が前記タンパク質分解活性を有する尿膜液を含むことを特徴とする請求項21記載の方法。
- 前記細胞がニワトリ細胞由来のものであることを特徴とする請求項18ないし22のいずれかに記載の方法。
- 請求項18ないし23のいずれかに記載の方法により得られる感染性コピー・鳥類パラミクソウイルス。
- 請求項24記載のウイルスを含んでなるワクチン。
- 請求項25記載の生ワクチン。
- 前記感染性コピー・鳥類パラミクソウイルスがニューカッスル病ウイルス(NDV)に少なくとも部分的に由来するものであることを特徴とする請求項25または26記載のワクチン。
- 未予防接種動物または請求項27記載のNDVワクチンを接種した動物を、野生型NDVに感染した動物または未修飾亜病原性または長潜伏期性NDV株を接種した動物から識別する方法であって、最少量の1サンプルを前記動物から採取し、前記サンプルについて、前記野生型または未修飾NDVによって発現されるが、前記ワクチンによっては発現されない免疫優性エピトープまたはマーカーに対する抗体の存在を決定することを含んでなる方法。
- 前記抗体がNDVのHNまたはFタンパク質に対するものであることを特徴とする請求項28記載の方法。
- 前記動物が家禽類からなる群から選択される、好ましくはニワトリであることを特徴とする請求項28または29記載の方法。
- 請求項28ないし30のいずれかに記載の方法に使用する診断キット。
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