KR100801180B1 - 약독화된 재조합 뉴캐슬병 바이러스 및 이를 함유하는뉴캐슬병 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 뉴캐슬병 바이러스 게놈 전사 벡터, 이를 통해 제작된 병원성 뉴캐슬병 바이러스의 표면 항원을 갖는 약병원성 재조합 뉴캐슬병 바이러스, 상기의 게놈 전사 벡터를 사용하여 뉴캐슬병에 대해 탁월한 예방효능을 가지면서 병원성은 낮은 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제조하는 방법, 및 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 함유하는 뉴캐슬병 백신에 관한 것이다.

Description

약독화된 재조합 뉴캐슬병 바이러스 및 이를 함유하는 뉴캐슬병 백신{ATTENUATED RECOMBINANT NEWCASTLE DISEASE VIRUS AND VACCINE CONTAINING THE SAME}
도 1은 국내 강병원성 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle disease virus, NDV)인 KBNP-4152의 게놈 RNA RT-PCR 결과와 증폭 산물의 이름 및 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 도 1의 증폭산물을 TA-클로닝 벡터에 클로닝 한 결과이다.
도 3은 재조합 NDV 게놈의 양쪽 말단을 정확하게 만들어낼 수 있도록 인식부위와 절단부위가 상이한 제한효소인 BsmBI과 BsaI 인식 염기서열을 삽입하는 과정을 보여주는 것이다.
도 4는 NDV 게놈 DNA 클로닝을 위한 모벡터 pTMH 제작을 위한 링커 염기서열과 링커의 제작을 위한 프라이머 염기서열을 나타낸 것이다.
도 5는 pTMH 벡터의 제조 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 6은 pTMH의 주요 부위의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 7은 pTMH 벡터의 전체 염기서열을 나타낸 것이다.
도 8은 라소타주의 게놈 RNA RT-PCR 결과 및 증폭산물의 이름과 위치를 나타낸 것이다.
도 9는 도 8의 증폭산물을 TA-클로닝 벡터에 클로닝 한 결과이다.
도 10은 NDV의 게놈 DNA 클로닝 과정을 나타낸 것이다.
도 11은 NDV의 NP, P 및 L 유전자 발현 플라스미드의 제작 과정을 보여주는 것으로, A의 2,3,4 레인은 각각 NP, P, L 유전자의 RT-PCR결과이며, 6,7,8 레인은 각각 NP, P, L 유전자를 pcDNA3.1/topo에 클로닝한 후 NotI으로 처리하여 삽입 유전자를 확인한 사진이고, B는 이에 대한 모식도 이다.
도 12는 PTDS 기법을 이용한 F 및 HN 유전자 반합성 과정을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 재조합 바이러스의 M 및 F 유전자 연결부 및 F 단백질의 퓨린 인식 부위의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
도 14는 PTDS 및 site-directed mutagenesis를 이용한 F 단백질의 furin (퓨린) 인식부위에 돌연변이가 유발된 유전자 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 15는 KBNP-4152 HN (1-566) 유전자와 라소타주의 HN말단 (567-577번) 유전자 연결을 위한 PTDS용 프라이머 설계도이다.
도 16은 재조합 바이러스인 KBNP-C4152R2L의 제작 과정을 나타낸 것이다.
도 17은 다양한 퓨린 인식부위를 갖는 재조합 바이러스 클론의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 18은 계태아에 접종한 KBNP-C4152R2L의 증식 여부를 평판 혈구응집 반응시험으로 확인한 것이다.
도 19는 KBNP-C4152R2L의 병원성을 알아보기 위한 pathotype-specific RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 KBNP-4152와 KBNP-C4152R2L의 F 단백질의 퓨린 인식 부위의 염기서 열을 비교한 것이다.
도 21은 교차 혈구응집억제법을 이용하여 라소타주, KBNP-4152 및 KBNP-C4152R2L의 항원적 관련성을 나타낸 것이다.
도 22는 KBNP-C4152R2L의 세포변성효과를 나타낸 것이다.
도 23은 pTMH에 클로닝 된 KBNP-C4152R2L의 게놈지도 및 게놈의 염기서열을 나타낸 것이다.
본 발명은 재조합 NDV 게놈 전사 벡터, 이를 통해 제작된 병원성 NDV의 표면 항원을 갖는 약병원성 재조합 NDV, 상기의 게놈 전사벡터를 사용하여 뉴캐슬병에 대해 탁월한 예방효능을 가지면서 병원성은 낮은 재조합 NDV를 제조하는 방법 및 상기 재조합 NDV를 함유하는 ND 백신에 관한 것이다.
뉴캐슬병((Newcastle Disease, ND)은 국제적으로 가장 중요한 가축 질병 15종 중 하나로, 급성 열성 호흡기 질병이며, 면역이 안 된 가금에 감염되는 경우 100% 폐사하는 법정 제1종 전염병이다. 우리나라는 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus, NDV) 상재지역으로, 이 질병의 근절에 상당한 어려움이 있을 것으로 예상된다. 또한, 우리나라와 활발한 교역을 하고 있는 동남아시아, 중국, 및 대만에는 다양한 뉴캐슬병 바이러스들이 유행하고 있어서 잠재적인 위해 요인으로 존재하므로, 아시아형 뉴캐슬병 백신의 개발이 절실한 시점이다.
뉴캐슬병 바이러스는 단일 가닥(single stranded) RNA 바이러스로 아부라바이러스 속(genus Avulavirus)에 속한다. 뉴캐슬병 바이러스는 엔벨롭(envelope)을 가지고 있으며 엔벨롭에는 바이러스가 숙주 세포에 결합할 수 있도록 해주는 HN(Haemagglutinin-Neuraminidase) 단백질과 엔벨롭과 숙주 세포의 융합을 일으키는 F(Fusion) 단백질이 있다. F 단백질과 HN 단백질은 글리코단백질(glycoprotein)로서 엔벨롭의 표면에 분포되어 있다.
F 단백질은 Ⅰ형 막 글리코단백질(type Ⅰ membrane glycoprotein)로써 삼합체(trimeric) 구조를 형성한다. F 단백질은 비활성 전구체 형태(F0)로 만들어지고 골지 막(Golgi membranes)을 통해 이동하는 동안 활성 형태인 F1과 F2로 잘리게 된다. 이러한 과정은 F1 소단위체(subunit)의 아미노 말단에서 소수성 도메인(domain)을 노출시키고 이것은 성숙한 단백질의 생물학적 활성에 중요한 역할을 한다. 융합 펩티드(fusion peptide)라 불리는 소수성 도메인은 파라믹소바이러스(paramyxovirus) F 단백질에서 매우 보존되어 있고 막 융합을 매개하는데 직접적으로 관여하고 있을 것이라 여겨지고 있다. 파라믹소바이러스 F 단백질은 7개 반복(heptad repeats)을 포함하고 알파 헬릭스 구조를 형성할 가능성이 있는 두 지역을 포함하는 여러 개의 공통된 구조 형태를 갖고 있다. 두 반복중 가장 긴 7개 반복 A(heptad repeat A)는 F1의 아미노 말단에서 소수성 융합 펩티드와 인접해 있으며, 7개 반복 B는 관통막(transmembrane) 지역의 윗부분에 밀착하여 있다. 7개 반복 B는 매 7개 잔기마다 매우 보존된 류신 또는 이소류신의 연속으로 구성되어 있다.
HN 단백질은 Ⅱ형 막 글리코단백질(type Ⅱ membrane glycoprotein)로 바이러스 엔벨롭의 표면에서 4합체(tetramer)를 형성하여 세포막에 침투한다(Gorman et al., 1988; Ng et al., 1989). HN 단백질은 비리온(virion)이 글리코접합(glycoconjugates)의 시알산(sialic acids)에 결합함으로써 호스트 세포 표면에 위치시키는 기능을 한다. HN 단백질은 관통막(transmembrane) 도메인, 줄기(stalk) 도메인 및 구형(globular) 도메인의 세 지역으로 나뉜다. 항원성인 수용체 결합과 뉴라미니다제(neuraminidase) 활성 위치는 모두 구형 도메인에 위치해 있다. 융합 유도 활성은 줄기 도메인에 위치해 있고 이것은 F 단백질과 상호작용 한다(Sergei et al., 1993). 줄기 도메인은 예상되는 형태로 α-헬릭스와 함께 2개의 7개 반복 지역 A(74-88 위치)와 7개 반복 지역 B(96-110 위치)를 갖고 있다. 또한, 구조를 파괴하는 어떤 돌연변이도 수용체 결합과 뉴라미니다제 활성을 감소시키는 원인이 된다는 보고가 있다.
NDV은 닭에서 질병 정도에 따라 아래와 같은 병원성 타입(phathotype)으로 분류된다: 1) 소화기 병변과 높은 폐사율을 보이는 장 친화 강병원성 (velogenic) NDV; 그리고 호흡기 및 신경학적 증상이 주로 나타나며 높은 폐사율을 보이는 신경 친화 강병원성 NDV; 2) 낮은 치사율, 일부 조류에서 급성 호흡기 질환 및 신경성 증상을 보이는 중병원성 (methogenic) NDV; 3) 경증 또는 무증상의 호흡기 감염을 유발하는 약병원성 (lentogenic) 및 무병원성 (apathogenic) NDV.
NDV이 세포에 감염성을 갖기 위해서는 F1 및 F2로 절단될 전구체 당단백질 Fo이 필요하다. 이 번역-후 절단은 숙주 세포 프로테아제들에 의해 중재된다. 만 약 절단이 일어나는 것이 실패되면, 비-감염성 바이러스 입자들이 생성되고 그리고 바이러스 복제가 진행할 수 없다. 독성 바이러스의 Fo 단백질은 광범위한 프로테아제에 의해 절단될 수 있으나, 낮은 독성의 바이러스들에서 Fo 단백질들은 그들의 감수성에 제약되고 이들 바이러스는 단지 특정 숙주 세포 타입에서만 증식가능하다.
약병원성인 렌토제닉 바이러스는 단지 호흡기 또는 장관과 같은 트립신-같은 효소들을 갖는 영역에서만 복제하는 반면에, 독성 바이러스들은 조직 및 기관의 범위에서 복제할 수 있어 치명적인 전신감염을 초래한다.
Fo 전구체의 아미노산 사열화는 약 병원성 바이러스들은 F2 및 F1 사슬을 연결하는 단일 아르기닌 (R)을 갖는 반면에, 중간독 이상의 균주들은 절단 부위에 K/R-X-K/R-R-F와 같은 두 쌍을 형성하는 추가의 기본 아미노산들을 보유한다는 것을 보여주었다. 게다가, 중병원성이상의 병원성을 갖는 균주들의 F2 사슬은 일반적으로 페닐알라닌 (phenylalanine) 잔기로 개시하는 반면에, 약병원성 이하의 병원성을 보이는 균주들의 F2 사슬은 일반적으로 류신 (leucine)으로 개시한다.
미국에서 뉴캐슬병의 동정은 불활화 백신의 사용을 이끌어 냈다 (Hofstad, 1953). 일부 동물 풍토병 바이러스가 단지 순한 질환을 생산했다는 관찰은 최초로 미소제닉 생 백신 Roakin의 개발의 결과를 가져왔고, 이어서, 더 순한 Hitchner B1 및 LaSota (Goldhaft, 1980)의 개발을 가져왔다.
생백신들의 주요한 이점중 하나는 비용이 싼 대량 적용 기술에 의해 투여될 수 있다는 것이다. 통상적인 적용 방법은 물을 마시는 것을 통하는 것이다.
스프레이 및 에어로졸에 의한 생백신의 대량 적용은 많은 수의 새가 짧은 시간내에 백신 접종될 수 있다는 용이성 때문에 또한 매우 인기가 좋다. 입자들이 발생되는 조들을 조절함에 의해 정확한 입자 크기를 달성하는 것이 중요하다.
최근 사용되는 생백신들은 몇가지 문제점을 가지고 있다. 이 백신은 여전히 약간의 병원성을 가지고 있어 경우에 따라 백신 부작용이 나타 날 수 있다. 게다가, 모계로부터 물려받은 항체들이 생백신 바이러스를 중화하여 성공적인 면역 형성이 방해 될 수 있다. 그러므로 1차 백신 접종은 극히 순한 바이러스를 사용하는 것이 중요하며, 모체 이행 항체의 극복이 가능한 백신이 요구된다.
불활화된 백신은 바이러스를 죽이기 위해 포말린 또는 베타프로피오락톤으로 처리되고 적절한 보조제와 혼합된 감염성 요낭액으로부터 보통 생산된다. 불활화된 백신들은 근육 또는 피하 주사로 투여된다. 그러나 불활화된 백신들은 생산하고 적용하는데 비용이 비싼 단점이 있다.
최근 국내외에서 발생하고 있는 강병원성 NDV는 항원성에서 백신주와 많은 차이를 보일 것으로 추정되는데 이에 대한 근거로는 백신주의 유전형과 상당한 차이를 보이는 야외주의 발견과 백신 항체역가가 충분히 높지 않은 경우 폐사는 막을 수 있지만 산란율 저하는 막지 못한다는 사실 등을 들 수 있다.
NDV의 유전형은 F 유전자의 부분 염기서열에 기초한 계통 분석에 의하여 I형부터 IX형까지로 분류된다. 국내에 분포하는 뉴캐슬병 바이러스는 대부분 분자역학 상 VI형과 VII형에 속한다. 이 중, VI형의 경우 집중적인 백신 접종에 의하여 변이주가 출현하였지만, VII형에 비해서는 상대적으로 낮은 분리율을 보이고 있으 며, 2000년 이후에는 대부분 VII형 바이러스만이 분리되고 있어서, 멸종의 가능성도 있는 것으로 생각되고 있다. 따라서 염기서열 분석 및 게놈사업을 통한 최근 NDV의 유전자 구조 결정 및 최근 GenBank에 등록되어 있는 전 세계 NDV와의 유전자 비교를 통한 분자역학 연구는 최적의 백신주 개발에 있어 매우 중요하다.
현재 상용화 된 뉴캐슬병 (ND) 불활화 오일백신은 약병원성 NDV인 클론 30 또는 라소타주를 사용하여 생산된 것이며, 강병원성 NDV를 이용한 불활화 백신은 안전성 문제 때문에 제조가 금지 되어 있다. 따라서 보다 안전하고, 경제적이며, 야외주와 유사한 항원성을 보이는 ND 백신 생산기술의 필요성이 증대되고 있는데 현재 역유전학 (Reverse Genetics) 기술을 이용한 백신 개발이 이러한 요구에 가장 근접한 기술이다.
네거티브 가닥 RNA 바이러스의 역유전학(Reverse Genetics) 기술은 바이러스 게놈으로부터 감염성 있는 바이러스를 회수하는 기술로서 제안된 방식이다 (US Patent No. 5,166,057 등 참조). 이러한 기술은 원래 인플루엔자 바이러스 게놈을 조작하기 위하여 제안된 것이지만, 인플루엔자 바이러스 이외의 RNA 바이러스인 광견병 바이러스(Rabies Virus), 호흡기 합포체 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus), 센다이 바이러스 (Sendaivirus)를 비롯하여 다양한 분절과 비분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스에 성공적으로 적용되고 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 역유전학 기술을 이용하여 신규 백신주 개발을 위한 연구를 거듭한 결과, 야외주와 유사한 항원성을 갖는 안전한 ND 백신주 생산 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 재조합 NDV 게놈 전사 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 병원성 NDV의 표면 항원을 갖는 약병원성 재조합 NDV를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같은 재조합 NDV 게놈 전사 벡터를 사용하여 ND에 대해 탁월한 예방효능을 가지면서 병원성은 낮은 재조합 NDV를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 역유전학 기술을 이용하여 NDV의 면역원성은 높이고 병원성은 낮추는 NDV의 약독화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 NDV를 함유하는 ND 백신을 제공하는 것이다.
본 발명은 재조합 뉴캐슬병 바이러스 게놈 전사 벡터, 이를 포함하는 병원성 뉴캐슬병 바이러스의 표면 항원을 갖는 약병원성 재조합 뉴캐슬병 바이러스, 상기의 재조합 뉴캐슬병 바이러스 게놈 전사 벡터를 사용하여 ND에 대해 탁월한 예방효능을 가지면서 병원성은 낮은 재조합 NDV를 제조하는 방법, 및 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 함유하는 뉴캐슬병 백신에 관한 것이다.
본 발명의 F 유전자 (384bp; F 유전자 뉴클레오타이드 위치 1~384bp)와 Neighber-Joining법을 이용한 뉴캐슬바이러스의 계통 분석 결과는 다음과 같다:
Figure 112006069976085-pat00001
상기 그림에 나타난 균주들은 예시에 불과한 것이며, 현재 수많은 종류의 뉴캐슬병 바이러스 균주들이 상기와 같이 I형 내지 IX형으로 분류되어 있으며, 뉴캐슬병 바이러스를 분자 역학적으로 분류한 결과가 많이 보고되어 있어서, 상기와 같은 분류의 기준과 각 유형에 속하는 균주들은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상 의 지식을 가진 자가 용이하게 알 수 있을 것으로 생각된다. 본 명세서에서의 균주 분류 및 그 기준은 다음과 같은 참고 문헌에 기재된 내용을 인용하며, 하기의 문헌들은 모두 본 명세서에 참조로서 포함된다:
1. Kwon H.J. PhD Thesis. Seoul National University, 2000.
2. Lomniczi B., Wehmann E., Herczeg J., Ballagi-Pordㅱny A., Kaleta E.F., Werner O., Meulemans G., Jorgensen P.H., Mante A.P., Gielkens A.L.J., Capua I., and Damoser J., Arch Virol143, 49-64, 1998.
3. Herczeg J., Wehmann E., Bragg R.R., Travassos Dias P.M., Hadjiev G., Werner O., andLomniczi, B. Arch Virol144, 2087-2099, 1999.
4. Yang C.Y., Shieh H.K., Lin Y.L., Chang P.C., Avian Dis 43, 125-130, 1999.
5. Kwon H.J., Cho S.H., Ahn Y.J., Seo S.H., Choi K.S., and Kim S.J. Vet Microbiol95, 39-48,2003.
6. Liu X.F., Wan H.Q., Ni X.X., Wu Y.T., and Liu W.B. (2003). Pathotypical and genotypical characterization of strains of Newcastle disease virus isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001. Arch Virol, 148, 1387-1403.
7. Tsai H.J., Chang K.H., Tseng C.H., Frost K.M., Manvell R.J., and Alexander D.J. Vet Microbiol, 104, 19-30, 2004.
현재 백신주로서 사용되는 라소타/46은 II형인데 반하여, 현재 야외주로서 발견되고 있는 균주들은 이와 유전적으로 거리가 먼 VI형 내지 VII형이 대부분이다. 예컨대, NDV의 HN 단백질에서 345-PDEQDYQIR-353 부위가 중화항체를 형성하는 중요한 선형항원으로 알려져 있다. 국내 병원성 NDV는 VI형 (95-98, 99-70, 99-71)과 VII형 바이러스가 공존해 왔으나 VI형 NDV는 1999년을 마지막으로 2000년부터 2006년까지는 전혀 분리되지 않고 있고, 1995년 가금에서 최초로 분리된 VIIa형의 NDV는 이후 분리되지 않고, VIId 형의 NDV만 분리되고 있다. VI 형 바이러스의 경우 선형항원의 변이 (E347K)가 1993년과 1994년 분리주들 (SNU9358GG, SNU9444)에서 처음 확인된 이후로 95-98, 99-70, 99-71에서도 지속적으로 관찰되어 이러한 변이주가 한동안은 면역을 회피하여 생존해왔던 것으로 판단되며, 2000년 이후 VIId형 바이러스의 전국적인 확산 이후 거의 멸종 된 것으로 판단된다. VII형 바이러스들의 경우 1995년부터 2001까지 분리된 바이러스들은 모두 라소타주의 선형항원과 동일하였으나 2002년에 처음으로 선형항원 변이주 (E347K)가 출현하였고, 2005년에는 추가적인 변이를 보이는 NDV가 우점하는 양상을 보여 주었다 (아래 표 참조).
Classical epitope Variant epitope
Year 346DEQDYQIRM354 346-K------M/K-354
1995 1 -
2000 16 -
2001 1 -
2002 15 (79%) 4 (10.5%)
2003 1 1
2004 - 1
2005 1 (6.25%) 15 (93.75%)
2006 - 2
이러한 점을 감안할 때, 기존의 백신주 라소타/46으로는 현재 유행하고 있는 뉴캐슬병에 대한 효과적인 예방이 불가능할 것으로 생각되며, 본 발명은 야외주에 대하여 우수한 항원성을 갖는 백신주 개발 기술을 제공한다는 점에서 가장 큰 의의가 있다고 할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스는, 별도의 언급이 없는 한, 통상적으로 분류되는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스 뿐 아니라 중간 이상의 병원성을 갖는 모든 병원성 뉴캐슬병 바이러스를 포함하는 의미로 사용된다. 본 발명에 있어서, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스는 동물 감염 시 체내 모든 세포에서 감염성 있는 바이러스가 만들어짐으로써 병원성을 나타내는 것으로, F 단백질의 113번째부터 116번째 아미노산 서열이 다음의 식 1과 같이 표현되는 경우 체내 대부분의 세포 내에 분포하는 퓨린 또는 퓨린 유사 단백질분해효소 (이하 퓨린)에 의해 절단되어 활성을 갖는 구조를 갖게 되므로 바이러스의 감염능력이 생기게 된다. 따라서 병원성 뉴캐슬병 바이러스는 F 단백질의 113번째부터 116번째 아미노산 서열의 코딩 서열로서 다음의 식 1로 표현되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것으로 정의된다:
[식 1]
113-X1X2X3X4-116
상기 식 중
X1, X3 및 X4는 각각 독립적으로 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)이고,
X2는 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르 트산, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산임.
이 때, F의 112번째 아미노산도 아르기닌 또는 리신과 같은 염기성 아미노산인 경우 더욱 강한 병원성을 나타내게 된다.
또한, 본 명세서에 있어서, 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는, 별도의 언급이 없는 한, 통상적으로 분류되는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스 분 아니라 무독 뉴캐슬병 바이러스를 포함하는 의미로 사용된다. 본 발명에 있어서, 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는 동물 감염 시 체내 일부 세포 내와 소화관 및 호흡기관의 세포외 단백질 분해효소에 의해서만 활성화되어 국소적인 바이러스 증식이 일어나 약한 병원성을 나타내는 것으로, F의 113번째부터 116번째 아미노산 서열이 다음의 식 2와 같이 표현되는 경우를 의미한다. 따라서 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는 F의 113번째부터 116번째 아미노산 서열의 코딩 서열로서 다음의 식 2로 표현되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것으로 정의 된다:
[식 2]
113-X5X6X7X8-116
상기 식 중
X5, X6 및 X7은 각각 독립적으로 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로 이 루어진 군 중에서 선택된 아미노산이고, X5와 X7은 동시에 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)이 아니며,
X8은 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)임.
뉴캐슬병 바이러스는 퓨린에 의하여 F 단백질에 위치하는 퓨린 인식 부위(cleavage site)가 절단되어 세포막과 융합되는 F 단백질의 융합 펩티드 부위가 노출되면 비로소 감염능력을 갖게 된다. 퓨린은 동물의 전신에 분포하는 효소이므로, 퓨린에 의한 바이러스 감염능력 활성화는 전신에서 발생하여 병원성을 나타낸다. 따라서, 뉴캐슬병 바이러스의 병원성은 F 단백질에 위치하는 퓨린 절단 부위가 퓨린에 의하여 인지되고 절단되는 정도에 따라서 달라진다.
뉴캐슬병 바이러스 F 단백질의 퓨린 인식 부위 (113 내지 116번째 아미노산)가 상기의 식 1의 아미노산 서열과 같이 적어도 3개 이상의 염기성 아미노산 (113-R-X-K/R-R-116)을 갖는 경우, 퓨린에 의한 바이러스 감염이 전신적으로 일어나므로 병원성을 나타내게 된다. 그러나 상기의 식 2의 아미노산 서열과 같이, 하나 이상의 염기성 아미노산이 비염기성 아미노산으로 치환되는 경우에는 퓨린에 의한 인식 및 절단이 거의 일어나지 않고, 오로지 국소적으로 존재하는 세포 내 또는 세포 외 단백분해효소에 의해 절단이 이루어지므로 치명적인 전신감염은 일어나지 않아 병원성은 낮다.
본 발명은 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 게놈을 근간으로 하면서, 표면 항원과 관련된 F 단백질 및 HN 단백질 코딩 부위를 국내 및 아시아 지역에서 유행하 는 강병원성 바이러스의 것으로 치환시킴으로써 강병원성 바이러스에 대한 방어효능을 높이는 동시에, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 115번째 코돈을 비염기성 아미노산을 코딩하는 코돈으로 치환하되 적어도 2번 이상의 점 돌연변이를 거쳐야 염기성 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변하는 특정 코돈으로 치환시켜 유전적으로 안정한 약독 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제작하는 기술에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 상기한 바와 같이, 야외주와 동일 또는 유사한 표면 항원을 나타내어 야외주에 대한 항원성이 높고, 효과적으로 약독화되어 있을 뿐 아니라, 115번 코돈에서 적어도 2번 이상의 점 돌연변이를 거쳐야 강병원성으로 변환 가능하므로, 안정성과 안전성 면에서 탁월한 특성을 가지고 있다.
또한, 병원성 뉴캐슬병 바이러스는 세포변성효과에 따라 합포체 (syncytium)를 형성하는 합포체형과 과립 (granules)을 형성하는 과립형 (granulation)으로 분류할 수 있는데, 일반적으로 합포체 형이 과립 형보다 병원성이 강한 것으로 알려져 있다. 본 발명은 F 및 HN 코딩 부위를 제공하는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스로서 과립-형에 속하는 바이러스 클론을 사용하여 병원성을 대폭 감소시켰다는 특징이 있다. 또한, 뉴캐슬병 바이러스의 HN에 있어서도, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스는 상대적으로 짧은 571개의 아미노산만 갖는 반면, 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는 이보다 긴 577개 또는 616개의 아미노산을 가지고 있어서, HN의 C 말단 아미노산 서열에 의해 강병원성주와 약병원성주가 구분될 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기와 같은 HN의 C 말단을 약병원성주와 같도록 변형 (577개 아미노산)시켜 더욱 더 약독화 된 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제작하였다.
본 명세서에 있어서, 본 발명에 따른 뉴캐슬병 바이러스의 게놈 전사 벡터와 재조합 뉴캐스병 바이러스에 포함된 것으로 기재된 P, M, F, HN 및 L 단백질의 코딩 서열은 상기 각각의 단백질을 직접 코딩하는 염기서열 뿐 아니라, 발현된 단백질에 영향을 미치지 않는 한, P, M, F, HN 및 L 유전자에 존재할 수 있는 모든 비암호화 (non-coding) 서열도 포함할 수 있는 것으로 해석된다.
보다 구체적으로, 본 발명은 뉴캐슬병 바이러스의 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질의 코딩 서열로 구성된 유전자 절편; 상기 유전자 절편에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스의 게놈 전사 벡터로서,
상기 NP, P, M 및 L 유전자는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스인 라소타주 게놈으로부터 유래한 것이고, 상기 F 및 HN 유전자는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스인 KBNP-4152 게놈에서 유래한 것이고,
상기 F 단백질 코딩 서열에 있어서, KBNP-4152를 포함하는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스 F의 115번째에 위치하는 염기성 아미노산을 코딩하는 코돈이 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이루어진 발린 코딩 코돈; 및 UAC 및 UAU로 이루어진 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 코돈으로 치환된 것을 특징으로 하는,
뉴캐슬병 바이러스의 게놈 전사 벡터에 관한 것이다.
상기 벡터의 HN 유전자는 1번부터 569번 코돈까지는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하고, 570번 이후의 코돈은 라소타주를 포함하는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하도록 추가적으로 변이된 것일 수 있다.
또한, 상기 프로모터와 터미네이터는 사용된 플라스미드에서 뉴캐슬병 바이러스 게놈과 작동가능하게 연결될 수 있는 것이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 이러한 프로모터와 터미네이터는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 선택하여 사용할 수 있을 것이다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프로모터 및 터미네이터로서 T7 프로모터 및 T7 터미네이터를 사용할 수 있다.
본 발명의 구체예에 있어서, 상기 게놈 전사 벡터는 SEQ ID NOs: 2 내지 7의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 아래의 SEQ ID NO: 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다 (도 23 참조).
Gene start
1 accaaacagagaatccgtgagttacgataaaaggcgaaggagcaattgaagtcgc acggg
61 tagaa ggtgtgaatctcgagtgcgagcccgaagcacaaactcgagaaagccttctgccaa
M S S V F D E Y E Q L L A A Q T R P N G ·
121 c ATG TCTTCCGTATTTGATGAGTACGAACAGCTCCTCGCGGCTCAGACTCGCCCCAATGG
·A H G G G E K G S T L K V D V P V F T L ·
181 AGCTCATGGAGGGGGAGAAAAAGGGAGTACCTTAAAAGTAGACGTCCCGGTATTCACTCT
·N S D D P E D R W S F V V F C L R I A V ·
241 TAACAGTGATGACCCAGAAGATAGATGGAGCTTTGTGGTATTCTGCCTCCGGATTGCTGT
·S E D A N K P L R Q G A L I S L L C S H ·
301 TAGCGAAGATGCCAACAAACCACTCAGGCAAGGTGCTCTCATATCTCTTTTATGCTCCCA
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361 CTCACAGGTAATGAGGAACCATGTTGCCATTGCAGGGAAACAGAATGAAGCCACATTGGC
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421 CGTGCTTGAGATTGATGGCTTTGCCAACGGCACGCCCCAGTTCAACAATAGGAGTGGAGT
·S E E R A Q R F A M I A G S L P R A C S ·
481 GTCTGAAGAGAGAGCACAGAGATTTGCGATGATAGCAGGATCTCTCCCTCGGGCATGCAG
·N G T P F V T A G A E D D A P E D I T D ·
541 CAACGGAACCCCGTTCGTCACAGCCGGGGCAGAAGATGATGCACCAGAAGACATCACCGA
·T L E R I L S I Q A Q V W V T V A K A M ·
601 TACCCTGGAGAGGATCCTCTCTATCCAGGCTCAAGTATGGGTCACAGTAGCAAAAGCCAT
·T A Y E T A D E S E T R R I N K Y M Q Q ·
661 GACTGCGTATGAGACTGCAGATGAGTCGGAAACAAGGCGAATCAATAAGTATATGCAGCA
·G R V Q K K Y I L Y P V C R S T I Q L T ·
721 AGGCAGGGTCCAAAAGAAATACATCCTCTACCCCGTATGCAGGAGCACAATCCAACTCAC
·I R Q S L A V R I F L V S E L K R G R N ·
781 GATCAGACAGTCTCTTGCAGTCCGCATCTTTTTGGTTAGCGAGCTCAAGAGAGGCCGCAA
·T A G G T S T Y Y N L V G D V D S Y I R ·
841 CACGGCAGGTGGTACCTCTACTTATTATAACCTGGTAGGGGACGTAGACTCATACATCAG
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901 GAATACCGGGCTTACTGCATTCTTCTTGACACTCAAGTACGGAATCAACACCAAGACATC
·A L A L S S L S G D I Q K M K Q L M R L ·
961 AGCCCTTGCACTTAGTAGCCTCTCAGGCGACATCCAGAAGATGAAGCAGCTCATGCGTTT
·Y R M K G D N A P Y M T L L G D S D Q M ·
1021 GTATCGGATGAAAGGAGATAATGCGCCGTACATGACATTACTTGGTGATAGTGACCAGAT
·S F A P A E Y A Q L Y S F A M G M A S V ·
1081 GAGCTTTGCGCCTGCCGAGTATGCACAACTTTACTCCTTTGCCATGGGTATGGCATCAGT
·L D K G T G K Y Q F A R D F M S T S F W ·
1141 CCTAGATAAAGGTACTGGGAAATACCAATTTGCCAGGGACTTTATGAGCACATCATTCTG
·R L G V E Y A Q A Q G S S I N E D M A A ·
1201 GAGACTTGGAGTAGAGTACGCTCAGGCTCAGGGAAGTAGCATTAACGAGGATATGGCTGC
·E L K L T P A A M K G L A A A A Q R V S ·
1261 CGAGCTAAAGCTAACCCCAGCAGCAATGAAGGGCCTGGCAGCTGCTGCCCAACGGGTCTC
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1321 CGACGATACCAGCAGCATATACATGCCTACTCAACAAGTCGGAGTCCTCACTGGGCTTAG
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1501 GGCGCCAAACTCTGCACAGGGCACTCCCCAATCGGGGCCTCCCCCAACTCCTGGGCCATC
·Q D N D T D W G Y
1561 CCAAGATAACGACACCGACTGGGGGTATTGAtggacaaaacccagcctgcttccacaaaa
1621 acatcccaatgccctcacccgtagtcgacccctcgatttgcggctctatatgaccacacc
1681 ctcaaacaaacatccccctctttcctccctccccctgctgtacaactccgcacgccctag
gene End
1741 ataccacaggcacaatgcggctcactaacaatcaaaacagagccgagggaa ttagaaaaa
gene start
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M A T F T D A E I D E L
1861 cctctacctgatagaccaggacaaac ATG GCCACCTTTACAGATGCAGAGATCGACGAGC
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1981 AGACTGTTGGAAGGAGTGCAATCCCACAAGGCAAGACCAAGGTGCTGAGCGCAGCATGGG
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2041 AGAAGCATGGGAGCATCCAGCCACCGGCCAGTCAAGACAACCCCGATCGACAGGACAGAT
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2101 CTGACAAACAACCATCCACACCCGAGCAAACGACCCCGCATGACAGCCCGCCGGCCACAT
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2161 CCGCCGACCAGCCCCCCACCCAGGCCACAGACGAAGCCGTCGACACACAGTTCAGGACCG
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2221 GAGCAAGCAACTCTCTGCTGTTGATGCTTGACAAGCTCAGCAATAAATCGTCCAATGCTA
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2341 GGAGTCAACCCAGTCGCGGAAACAGTCAGGAAAGACCGCAGAACCAAGTCAAGGCCGCCC
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2401 CTGGAAACCAGGGCACAGACGTGAACACAGCATATCATGGACAATGGGAGGAGTCACAAC
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2521 TATCTGCGGATCATGTCCAGCCGCCTGTAGACTTTGTGCAAGCGATGATGTCTATGATGG
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2581 AGGCGATATCACAGAGAGTAAGTAAGGTTGACTATCAGCTAGATCTTGTCTTGAAACAGA
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2641 CATCCTCCATCCCTATGATGCGGTCCGAAATCCAACAGCTGAAAACATCTGTTGCAGTCA
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2701 TGGAAGCCAACTTGGGAATGATGAAGATTCTGGATCCCGGTTGTGCCAACATTTCATCTC
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2761 TGAGTGATCTACGGGCAGTTGCCCGATCTCACCCGGTTTTAGTTTCAGGCCCTGGAGACC
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Gene End
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HDV ribozyme sequences
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T7 terminator
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T7 Promoter
17461 TCTAATACGACTCACTATAGG
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 NP, P, M, F, HN 및 L 유전자의 코딩부위를 갖는 뉴캐슬병 바이러스에 있어서, 상기 NP, P, M 및 L 유전자의 코딩부위는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스로부터 유래한 것이고, 상기 F 및 HN 단백질 코딩 서열은 강병원성 뉴캐슬병 바이러스로부터 유래한 것이며, 상기 강병원성 뉴캐슬병 바이러스 F 단백질의 115번 아미노산을 코딩하는 코돈이 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이 루어진 발린 코딩 코돈; UAC 및 UAU로 이루어진 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 코돈으로 치환된 것을 특징으로 하는, 재조합 뉴캐슬병 바이러스에 관한 것이다. 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 HN 유전자는 1번부터 569번 코돈까지는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하고, 570번 이후의 코돈은 라소타주를 포함하는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하도록 추가적으로 변이된 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에 있어서, 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 KCTC 10984BP일 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 강병원성 야외주와 동일 또는 유사한 표면 항원을 갖기 때문에 야외주와 동일 또는 유사한 항원성을 나타내면서도, 기존의 약병원성 백신주보다도 감소된 병원성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 병원성 뉴캐슬병 바이러스는 F에 퓨린 절단부위를 가지며, 퓨린에 절단됨으로써 세포막과 융합되는 F 단백질의 융합 펩티드가 노출됨으로써 바이러스의 감염능력이 생긴다. 퓨린은 체내 대부분의 세포 내에 분포하므로 뉴캐슬병 바이러스의 전신감염이 일어나므로 강병원성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 게놈 전사 벡터에 있어서, 상기 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는 상기에 정의된 바와 같으며, 예컨대, 뉴캐슬병 바이러스 I형 또는 II형에 속하는 균주들로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있으며, 본 발명의 구체예에 있어서, II형에 속하는 라소타/46 균주 (AY845400)를 사용할 수 있다. 상기 강병원성 뉴캐슬병 바이러스는 상기에 정의된 바와 같으며, 현재 전 세계적으로 유행하는 야외주 로서 III, V, VI, VII, VIII, XI형을 사용할 수 있고, 바람직하게는 뉴캐슬병 바이러스 VI형 및 VII형 균주들로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다. 본 발명의 구체예에 있어서, 상기 강병원성 뉴캐슬병 바이러스는 KBNP-4152(기탁번호: KCTC 10919BP)일 수 있다. 상기 KBNP-4152 균주의 제조 방법 및 특성은 대한민국 특허출원 제2006-0026667호 및 'Cho SH, Ahn YJ, Kim SJ, Kwon HJ. Characterization of a Newcastle disease virus with variation in the major Hemagglutinin-Neuraminidase (HN) linearepitope. The49th Annual Meeting of the Korean Society of Veterinary Science 2005, 45 (3,suppl),199.'에 기재된 바와 같다 (상기 문헌들은 모두 본 명세서에 참조로서 포함된다). 본 명세서에 있어서, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스와 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는 특별한 언급이 없는 한, 상기와 같이 정의된다.
이전의 역 유전학을 이용한 뉴캐슬병 바이러스의 약독화에서는 115번째 아미노산을 글리신으로 치환시킨 예가 있었으나, 이와 같이 글리신으로 치환된 경우에는 이를 코딩하는 코돈 중 단지 하나의 염기만 변이되어도 염기성 아미노산인 리신 또는 아르기닌으로 치환되어 다시 병원성을 회복하게 된다는 문제점이 있다.
그러나, 본 발명에 따른 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 F 단백질의 115번째 코돈이 적어도 2번 이상의 점 돌연변이를 거쳐야 염기성 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변하는 비 염기성 아미노산 코딩 코돈을 가지므로, 병원성을 회복할 가능성이 매우 낮으며, 기존의 약 독화된 변이주와 비교하여 안정성이 현저하게 증가된 것을 특징으로 한다. 본 발명과 같이 F 단백질의 퓨린 절단부위가 변형된 경우에는, 퓨 린에 의한 절단이 일어나지 않아 전신감염이 일어나지 않으며, 일부 체내 세포, 호흡기 및 소화기관에 분포하는 트립신 또는 트립신 유사 효소에 의해서만 분해되므로 국소 감염만이 일어나게 되는 것이다.
이러한 효과를 달성하기 위하여, 본 발명의 F 단백질의 115번째 코돈은 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이루어진 발린 코딩 코돈; 및 UAC 및 UAU 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 코돈으로 치환된 것을 특징으로 하는 것이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 단백질 및 HN 단백질 코딩 부위를 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 및 HN 단백질 코딩 서열로 치환시키고, 상기 F 유전자의 115번 코돈을 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이루어진 발린 코딩 코돈; 및 UAC 및 UAU 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 코돈으로 치환시켜, 강병원성 뉴캐슬병 바이러스와 동일 또는 유사한 항원성을 발현시키고, 병원성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 뉴캐슬병 바이러스 의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 제조를 위해 상기 HN 유전자는 1번부터 569번 코돈까지는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하고, 570번 이후의 코돈은 라소타주를 포함하는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하도록 추가적으로 변이시킨 것일 수 있다.
본 발명의 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 제조 방법은 상기한 바와 같은 본 발명에 따른 뉴캐슬병 바이러스의 게놈 전사 벡터를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 숙주 세포에는 제한이 없으며, 본 발명의 구체예에 있어서 Hep2 및 BHK21로 이루어진 군 중에서 선택된 동물 세포를 사용할 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 및 HN 유전자의 코딩부위를 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 및 HN 단백질 코딩 서열로 치환시키고, 상기 F 유전자의 115번 염기성 아미노산 코딩 코돈을 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이루어진 발린 코딩 코돈; UAC 및 UAU 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 코돈으로 치환시키는 것을 특징으로 하는, 뉴캐슬병 바이러스의 항원성 및 안정성 증가 및 약독화 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 상기 HN 유전자는 1번부터 569번 코돈까지는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하고, 570번 이후의 코돈은 라소타주를 포함하는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 아미노산을 코딩하도록 추가적으로 변이시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 방법은 본 발명에 따른 재조합 뉴캐슬병 바이러스 게놈 전사 벡터를 사용하는 것일 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기와 같은 항원성이 증가하고 병원성이 감소된 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 함유하는 뉴캐슬병 백신에 관한 것이다. 상기 뉴캐슬병 백신은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 불활화시킨 사독 백신형태일 수 있다. 상기 불활화는 이 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 모든 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 예컨대, 포름알데하이드 또는 브로모메틸아민 하이드로브로마이드 등을 사용하는 것일 수 있다. 또한, 상기 뉴캐슬병 백신은 병원성이 매우 낮고 안정성 및 안전성이 높은 균주이기 때문에, 생백신 형태로 사용하거나, 수정란에 직접 사용하는 in ovo 백신 형태로 사용할 수 있다. 생백신 형태로 사용되는 경우, 그 투여 방법에는 제한이 없으며, 증상 및 목적에 따라서, 피하 또는 근육 투여, 직접적인 계태아 주사법 (in ovo 백신), 또는 스프레이 또는 음수 등을 이용하여 투여할 수 있다. 본 발명의 백신 투여량은 투여 방법 및 투여 대상 개체의 상태에 따라서 달라지며, 예컨대, 101 EID50 내지 1012 EID50 균주/개체의 양으로 사용 가능하다. 구체적으로, 사독 백신의 경우 바람직하게는 106.0~12 EID50/수 가 적당하 며, 보다 바람직하게는 108.0~10 EID50/수 양으로 사용 가능하다. In ovo 백신의 경우 종란의 모체이행항체 정도에 따라 101~9.0 EID50/종란의 양으로 사용이 가능하지만, 보다 바람직하게는 103.0~7.0 EID50/종란 의 양으로 사용 될 수 있다.
상기한 바와 같이, 뉴캐슬병 바이러스의 병원성은 F 단백질의 퓨린 절단부위 아미노산 서열에 따라 결정된다. 즉, F 단백질의 퓨린 절단부위의 아미노산 서열이 R-X-K/R-R (113번째부터 116번째 아미노산 위치, 이하, 특별한 언급이 없는 한, 모든 아미노산 테트라머에 적용됨)이면 모든 세포내에 존재 하는 퓨린에 의해 잘라져 활성화 되므로 전신감염이 일어나 강병원성을 나타낸다. 그러나 R-Q-G-R 또는 G-Q-G-R과 같이 염기성 아미노산이 단 1개 혹은 떨어져서 1개만 존재하게 되면 일부 세포내, 소화관 및 기관의 상피세포 일부에 존재하는 트립신 및 유사 효소에 의해서만 활성화 되므로 국소감염만 일어나게 되어 병원성이 낮다. HN에 있어서도, 강병원성 바이러스는 상대적으로 짧은 571개의 아미노산만 가지고 있다. 반면, 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 경우에는 보다 긴 577개 또는 616개의 아미노산을 가지고 있으며, 이 뒷부분의 아미노산에 의해 강병원성주와 구분된다. 그러므로 F의 퓨린 절단부위와 HN의 C 말단 부위를 다양하게 조합한 재조합 바이러스를 만들어 다양한 단계의 병원성을 가진 바이러스를 제작할 수 있는 것이다.
특히, 본 발명은, 유전적 변이에 의해 병원성을 획득하지 못하도록 F의 퓨린 절단 부위의 아미노산 서열을 보다 안전한 아미노산 서열로 바꾼 것을 특징으로 한 다. 약병원성의 F의 퓨린 절단 부위의 아마노산 서열은 R-Q-G-R또는 K-Q-G-R이다. 강병원성주가 되기 위해서는 R-X-K/R-R로 변해야 하므로 3번째 위치하고 있는 글리신 (G)이 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)으로 바뀌어야만 한다. 그러나 G에서 R/K로의 변환은 한 개의 점 돌연변이만으로 쉽게 일어날 수 있다. 즉 글리신의 코돈은 GGA, GGC, GGG 또는 GGU인데 아르기닌/리신의 코돈은 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU, AAA 또는 AAG이므로 글리신의 코돈이 무엇이든 단 한 번의 돌연변이로도 쉽게 아르기닌이나 리신으로 치환되어 강병원성 뉴캐슬병 바이러스로 변환될 수 있는 것이다. 실제로 2001년 호주에서는 비병원성 NDV인 울스터주가 유사한 기전으로 병원성이 증가하여 NDV가 발생한 사례가 보고되었다.
따라서 본 발명에서는 이러한 백신주의 점 돌연변이에 의한 병원성 증가 확률을 기존의 백신주보다 현저히 낮추기 위하여, PTDS (PCR based Two steps DNA synthesis) 기법 등 통상적으로 알려진 기술을 이용하여 점 돌연변이에 의한 리신/아르기닌으로의 아미노산 변화가 일어날 확률이 낮은 아미노산과 코돈을 갖는 재조합 바이러스를 제작한 것이다. 즉, R-Q-A-R 또는 G-Q-A-R과 같이, 기존의 약병원성 뉴캐슬병 바이러스 F의 115번 아미노산 글리신을 알라닌, 아스파르트산, 페닐알라닌, 이소류신, 류신, 세린, 트레오닌, 발린 및 티로신으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산으로 치환시킴으로써, 이들 아미노산의 코딩 코돈의 전부 또는 일부는 최소 2 개 이상의 염기가 동시에 변이된 경우만 R/K로 변이가 일어나므로, 보다 안전한 백신주의 제조가 가능하게 된 것이다.
본 발명에 따라 제작된 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 병원성 정도는 평균치사 시간 (Mean Death Time; MDT) 및 뇌 내 병원성 지수 (Intracerebral Pathogenicity Index; ICPI)를 측정하여 결정하였으며, 그 생물학적 성상은 EID50 (50% egg-infectious dose) 및 혈구 응집 해리 양상 등에 의하여 확인하였다. 이와 같은 측정 결과, 본 발명의 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 기존의 약병원성 균주보다도 병원성이 감소된 것으로 나타났다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 바이러스 유전자 클로닝
1.1. 바이러스 cDNA의 합성
최근 국내에서 유행하는 강병원성 항원성 변이주 뉴캐슬병 바이러스를 대표할 수 있는 바이러스로서, 서울대학교 수의과대학 조류질병학실에서 분리된 SNU4152주를 선정하였다. 이 바이러스를 계태아섬유아세포 (CEF) 상에서 3회 플라크 정제를 하여 클로닝 하였고, SPF 발육란에서 2회 계배배양 하여 KBNP-4152(기탁번호 KCTC 10919BP)로 명명하였다.
RNA의 조작은 RNase가 없는 유리제품 및 플라스틱 제품에서 수행되었고, 사용된 모든 용액은 1% 디에틸-피로카보네이트 (DEPC)를 처리하여 고압멸균 한 3차 증류수 (DEPC-DW)를 사용하였다. 이후 바이러스를 Beckman SW40 로터 (Beckman)에 서 40℃, 21000rpm에서 70분간 원심분리 하였고, 펠렛을 완충용액 (50mM Tris HCl pH7.5, 50mM EDTA, 0.5% SDS)에 재부유시켜 교반하면서 37℃에서 90분간 프로테아제 K(200㎍/ml, Invitrogen co.)를 처리한 후 산성 페놀 추출법으로 RNA를 추출하였다. 그 후 에탄올 침전법으로 RNA를 침전시킨 후, 75% 에탄올로 세척하여 건조한 후 DEPC-DW에 부유시켰다. 자외선 분광기(Eppendorf, Biophotometer)로 정량 (15㎍/㎕) 하여 RNA 1㎕와 아래의 표 1에 나타낸 프라이머 (10pmol/㎕) 1㎕를 DEPC-DW 10㎕와 혼합하고, 70℃에서 10분간 변성시킨 후, 5ㅧ RT 완충용액 4㎕ (250mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15mM MgCl2; GibcoBRL/Life Technologies), 0.1M DTT 2㎕ 및 10mM dNTPs (각각 2.5mM) 2㎕를 첨가해 42℃에서 2분간 배양하였다. 그 후 역전사효소 1㎕(200unit, Invitrogen co.)를 첨가하고 42℃에서 60분간 배양하였다.
[표 1] KBNP-4152 cDNA 합성용 프라이머
프라이머 프라이머 서열 (5'->3')
ND-ZJ-1F cgtctcgaccaaacagagaatctgtgaggtac (SEQ ID NO: 8)
ND-ZJ-1746F gacaacacaggcacagctcg (SEQ ID NO: 9)
ND-ZJ-2827F catctccttacgtgacacaagg (SEQ ID NO: 10)
ND-ZJ-F-F tcgcgacgcaatatgg ctccaaactt tc (SEQ ID NO: 11)
ND-ZJ-HN-F ccgcggcaccgacaac aagagtcaat catg (SEQ ID NO: 12)
ND-ZJ-8100F actagttgagatcctcaaggatgatag (SEQ ID NO: 13)
ND-ZJ-11648F catgcaatgttgtccagagatg (SEQ ID NO: 14)
ND-ZJ-12539F tcagagagagatttcgcgagac (SEQ ID NO: 15)
ND-ZJ-14021F cattgtgacattgagattcctcc (SEQ ID NO: 16)
1.2. 바이러스 유전자의 클로닝
GeneBank의 데이터를 기초로 하여 15,192bp에 달하는 상기 합성된 9종의 바이러스 cDNA를 다음의 표 2에 나타난 바와 같은 9개의 프라이머 쌍으로 PCR 법을 통해 유전자를 증폭하였고, 클로닝하여 얻어진 클론을 Z1 내지 Z9이라 명명하였다.
[표 2] KBNP-4152 유전자 클로닝용 프라이머
프라이머 프라이머 서열 (5'->3')
ND-ZJ-1F cgtctcgaccaaacagagaatctgtgaggtac (SEQ ID NO: 8)
ND-ZJ-1844R tcgtcttggtctctggatgtctc (SEQ ID NO: 17)
ND-ZJ-1746F gacaacacaggcacagctcg (SEQ ID NO: 9)
ND-ZJ-2948R cttctccactcccatgtcagg (SEQ ID NO: 18)
ND-ZJ-2827F catctccttacgtgacacaagg (SEQ ID NO: 10)
ND-ZJ-4612R cagcataatccgggtgatcagc (SEQ ID NO: 19)
ND-ZJ-F-F tcgcgacgcaatatggctccaaactttc (SEQ ID NO: 11)
ND-ZJ-F-R ccgcggtagaacggatgttgtgaagcctaa (SEQ ID NO: 20)
ND-ZJ-HN-F ccgcggcaccgacaacaagagtcaatcatg (SEQ ID NO: 12)
ND-ZJ-HN-R ctcaacta g taagggaacgatcctaaattcc (SEQ ID NO: 21)
ND-ZJ-8100F actagttgagatcctcaaggatgatag (SEQ ID NO: 13)
ND-ZJ-11815R tatggtatcagggttggatacacc (SEQ ID NO: 22)
ND-ZJ-11648F catgcaatgttgtccagagatg (SEQ ID NO: 14)
ND-ZJ-12591R agctcataactcttgaagatagc (SEQ ID NO: 23)
ND-ZJ-12539F tcagagagagatttcgcgagac (SEQ ID NO: 15)
ND-ZJ-14110R cacagaatgcatggcaatcagg (SEQ ID NO: 24)
ND-ZJ-14021F cattgtgacattgagattcctcc (SEQ ID NO: 16)
ND-ZJ-15118R actgaatccgaatacgacttcc (SEQ ID NO: 25)
PCR 과정 중에 발생하는 인위적인 돌연변이율을 낮추기 위해 교정 기능이 있는 DNA 중합효소 Pwo (Invitrogen co.)를 사용하였고, PCR 증폭산물은 용액의 경우 Boehringer Mannheim 사의 정제키트를 아가로스 겔인 경우 Qiagen사의 정제 키트를 사용하였다.
상기 PCR 결과 얻어진 KBNP-4152 바이러스 유전자 RT-PCR및 각 PCR산물의 위치를 도 1에 나타내었다.
상기에서 정제된 9종의 증폭산물은 XL-topo, pCR8/GW/Topo 또는 pcDNA3.1V5 topo 벡터 (Invitrogen co.)에 TA 클로닝 하였으며, 각각 3개 이상의 클론을 확보하여 플라스미드를 추출 정제하여 염기서열을 결정하였다.
모든 염기서열은 cyclic sequencing kit (PRISM Ready Reaction Dye terminator kit)와 자동염기서열분석기 (ABI310, Applied Biosystems Co.)로 결정하였다.
염기서열 분석에 사용된 primer는 M13 forward, M13 reverse primer를 사용하였고, 이들 프라이머로 모두 읽히지 않는 fragments의 경우 primer walking의 방법에 의해 다음 표 3의 프라이머를 사용하여 분석하였다.
[표 3] KBNP-4152 바이러스 염기서열 분석용 프라이머.
Primer Primer sequence (5'->3')
ND-ZJ-597F ctgacactctggaaagaatcc (SEQ ID NO: 26)
ND-ZJ-3421F gatccagcgc cttgattcgt (SEQ ID NO: 27)
ND-ZJ-8662F caggtgtttagaagaactggc (SEQ ID NO: 28)
ND-ZJ-5759F cctcctggtatcatatcgca (SEQ ID NO: 29)
ND-ZJ-4679 gtaacaggagataaggcagtc (SEQ ID NO: 30)
ND-ZJ-7670 ttcttgtaccaacgagggtc (SEQ ID NO: 31)
ND-ZJ-9328F cctacaggagctcaaagacac (SEQ ID NO: 32)
ND-ZJ-9977F ctaagagatgacagtgtggc (SEQ ID NO: 33)
ND-ZJ-10588F acttgctgcagcaagatctc (SEQ ID NO: 34)
ND-ZJ-13052F gtggtctcaggcttatatgc (SEQ ID NO: 35)
상기와 같은 TA-클로닝 벡터를 아래의 도 2B에 나타내었으며, PCR을 통하여 EcoRI으로 처리하여 삽입된 절편의 크기를 확인하여 2A에 나타내었다.
KBNP-4152 균주는 중국의 거위 유래 SF02와 가장 높은 염기서열 및 아미노산 서열 상동성을 보였는데, 바이러스 단백질 중 NP, P, M, L의 경우 98% 이상의 높은 상동성을 보인 반면 P, V 및 HN의 경우 각각 96.2%, 95.0%와 97.6%의 비교적 낮은 상동성을 보였다. 서열 상동성 측정 결과를 표 4에 나타내었다.
[표 4] 분리된 KBNP-4152 균주와 다른 균주와의 서열 상동성
KBNP-4152 NP aaa (ntb) P aa (nt) V aa (nt) M aa (nt) F aa (nt) HN aa (nt) L aa (nt)
VII(SF02) (AF473851) VII(ZJ-1) (AF431744) Ulster (AY562991) La Sota (AY845400) 99.2 (97.1) 99.0 (97.0) 94.1 (87.2) 91.3 (84.5) 96.2 (97.6) 94.7 (97.1) 81.6 (83.1) 80.9 (81.6) 95.0 (96.8) 92.9 (95.7) 75.5 (79.0) 76.3 (78.6) 98.6 (98.0) 98.1 (97.4) 89.1 (86.6) 87.4 (84.7) 98.4 (97.6) 97.7 (97.5) 90.3 (86.2) 88.8 (84.2) 97.6 (97.6) 97.9 (97.7) 89.9 (84.4) 88.5 (81.7) 98.9 (98.0) 98.9 (98.0) 94.3 (87.2) 92.0 (85.9)
a: 아미노산 서열 상동성 퍼센티지 (%)
b: 뉴클레오타이드 서열 상동성 퍼센티지 (%)
특히 세포내 인터페론 발현을 방해하는 V 단백질에서의 변이가 큰 것은 세포내 방어 체계를 극복하는 과정에서 아미노산 변이가 축적된 결과일 수 있으며, HN 단백질의 변이가 비교적 큰 것은-선형항원의 변이에서 알 수 있듯이-체액성 면역 반응을 회피하는 과정에서 특정 아미노산 변이를 갖는 바이러스들이 선택되었기 때문인 것으로 사료된다. 상기 KBNP-4152 균주의 유전자 염기서열 및 각 유전자의 코딩 아미노산 서열을 GenBank에 등록하였다 (Accession No. DQ839397).
이 외에도 HN 및 F 단백질의 시스테인 및 N-linked glycosylation 위치의 변화, HN의 구조 및 극성에 영향을 줄 수 있는 아미노산의 변화 및 F의 구조 및 극성에 영향을 줄 수 있는 아미노산의 변화를 측정하여 각각 표 5 내지 7에 나타내었다.
[표 5] HN 및 F 단백질의 시스틴 및 N-linked glycosylation 위치의 변화
Figure 112006069976085-pat00002
[표 6] HN의 구조 및 극성에 영향을 줄 수 있는 아미노산의 변화
KBNP-4152 (508-510) NVS 60 L 128 C 256 G 269 S 293 K 310 D 323 D 340 H 347 K 354 K 384 K 479 H 494 D 495 E
VII(SL03) NIS S - - - - - N - - M - - - -
VII(consensus) NIS S - - - - - N - E M - - - -
Ulster SIS P - E - E N N Y E M E Y - K
La Sota STS P W E R G S N Y E M E Y G V
VGGA STS P W E R G S N Y E M E Y G -
a Not done.
[표 7] F의 구조 및 극성에 영향을 줄 수 있는 아미노산의 변화
KBNP-4152 27 R 76 C 104 G 112 R 115 K 145 N 192 N 195 R 232 Q 247 N 403 D 422 H 430 D 480 S 486 S
VII(consensus) - - - - - - - - - D - - - R -
Ulster C F E G G - K Q - D - Q - K -
La Sota C - E G G K K Q K D N Q G K R
VGGA C - E G G K K Q K D N Q G K R
상기한 결과들로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 사용된 KBNP-4152 균주는 VII형과 유사한 유전자형을 갖는 것으로 나타났으며, 기존의 백신주인 La Sota주를 비롯하여 다른 유형의 바이러스와 유전적으로 차이가 있는 균주인 것으로 나타났다.
실시예 2: 라소타주를 기본 백본(back bone)으로 한 재조합 뉴캐슬병 바이러스 게놈 전사 벡터의 제조
2.1. 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 발현 모벡터 pTMH의 설계 및 제작
NDV의 cDNA로부터 바이러스를 만들어내기 위해서는 바이러스 게놈의 5'과 3'양쪽 끝에 불필요한 염기의 첨가 없이 바이러스 게놈과 똑같은 구조로 전사되어야 한다. 이러한 구조를 얻기 위해서 다음과 같은 특징의 모벡터 pTMH를 제조하였다 (SEQ ID NO: 84):
1) 전사(transcription) 개시부 바로 앞에 T7 프로모터가 위치하도록 하였다. (도 3 및 4 참조).
2) NDV 안티게놈(antigenomic) RNA 직후에는 간염 델타 바이러스(Hepatitis delta virus; HDV) 리보자임 (ribozyme) RNA을 위치시켜 self cleavage가 일어날 수 있도록 하였다.
3) T7프로모터와 HDV 리보자임 사이에는 최종적으로 NDV 게놈을 클로닝 할 수 있는 Multi-Cloning Site (MCS)를 갖도록 하였다 (도 4 참조).
4) 15 kb에 달하는 NDV 안티게놈 전체를 포함하고도 클로닝 벡터가 대장균 내에서 안정적으로 존재 할 수 있도록 pBR322의 복제 개시 염기서열 (ori)을 갖도록 하였다.
5) T7 프로모터와 NDV 전사 개시가 되는 안티게놈 5'-말단 사이, 및 NDV전사가 끝나는 안티게놈 3'-말단과 HDV 리보자임 사이에 각각 인식부위와 절단부위가 상이한 BsmB I과 Bsa I 인식 염기서열을 위치시켜 NDV 안티게놈으로부터 바이러스 게놈 RNA의 양쪽 말단이 정확하게 전사되도록 하였다 (도 3 참조).
도 4에 나타낸 바와 같이, 링커 제작용 프라이머 TM p1-p4중 TM p2와 TM p3는 1.5pmole 씩 그리고 TM p1과 TM p4는 30pmole 씩을 한 PCR tube에 넣고, 10xPCR buffer 5㎕, 2.5mM dNTP 5㎕, Taq polymerase 2.5U을 각각 넣어 총 부피가 50㎕가 되도록 DW를 넣어 준 후, 94℃-1분, 90℃-30초- 55℃-45초-72℃-15초 반응을 25회 반복 하였고, 72℃-5분 반응시켰다. PCR amplicon을 확인한 후 pCR8/GW/Topo TA 클로닝 벡터에 클로닝 하였고, 정확한 염기서열을 갖는 클론을 pCR-TM vector로 명명하였다.
상기의 HDV F, R primer를 이용하여 pTV vecter (목암 생명공학연구소 박만훈 박사 제공)부터 HDV ribozyme과 T7 terminator부분을 PCR방법으로 증폭하여 얻은 fragments 역시 pCR8/GW/Topo TA cloning 벡터에 클로닝 하였고, 정확한 염기서열을 갖는 클론을 pCR-HDV로 명명하였다.
pCR-HDV vector를 BsaI과 NdeI 제한 효소로 절단하여 얻은 HDV fragment와 BsaI과 NdeI 제한 효소로 절단한 pCR-TM 벡터를 T4 DNA ligase로 ligation 하였고, Top10F' competent cell에 transformation하여 얻은 벡터를 pCR-TMH라 명명하였다. 대장균에 안정적으로 클로닝 할 수 있도록 pBR322 벡터 (Promega co, Cat. # D1511) 에 pCR-TMH 벡터의 T7 promoter-MCS-HDV ribozyme 부분을 EcoRI과 NdeI 제한효소를 이용하여 subcloning하였으며, 이를 pTMH 벡터라 명명하였다 (SEQ ID NO: 84).
상기의 pTMH 벡터 제작 과정을 도 5에 모식적으로 나타내었으며, 제작된 모벡터 pTMP의 개략적인 개열 지도와 주요 부위 염기서열을 도 6에 나타내었으며, 제작된 pTMH 벡터의 염기서열을 도 7에 나타내었다.
본 실시예에서 제작된 모벡터 pTMH의 제한효소 인식 부위는 다음과 같다:
인식부위가 없는 경우 (No site found)
AccI AflII AgeI AvaI BclI BglII BsaAI BsaBI BsmF I BsmI BspMI BssHII BstBI BstEII Bsu36I EagI EcoRV HindIII HpaI KpnI Mfe I MluI NaeI NcoI NheI NotI NsiI PmeI PvuII SalI SfiI SmaI SphI XbaI Xcm I XhoI XmaI
인식부위가 하나인 경우
XmnI 1959 SspI 2166 SpeI 64 SacII 55
SacI 175 RsrI 0 PstI 1605 NspI 471
NruI 49 NdeI 293 HincII 1903 FspI 1584
EcoRI 0 EaeI 1752 ClaI 43 BstXI 155
BsmB I 30 BsiWI 70 Bmr I 1404 BglI 1478
BanI 1312 BamHI 181 AvrII 76 AseI 1535
Apo I 0 ApaI 35 AlwNI 882 AflIII 471
인식부위가 2개인 경우
StyI 76, 256 RsaI 71, 1843 HaeII 345, 715
ApaLI 785, 2031 AatII 147, 2282 Bsa I 82, 1431*
2.2. 라소타주의 전체 cDNA 클로닝
라소타/46 균주(AY845400)에 대한 RNA 추출 및 cDNA 합성은 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 실시하였다.
2.2.1. NDV 전장 cDNA의 PCR
GenBank의 data를 기초로 하여, 총 15,186bp에 달하는 NDV cDNA 전체를 클로닝하기 위해 모두 8부분 (S1 내지 S9)으로 나누어 아래의 표 4에 기재한 프라이머를 사용하여 실시예 1에 기재된 방법에 따라 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다.
[표 8] 라소타 전체 게놈 유전자 클로닝용 프라이머
Primer Primer sequence (5'->3')
S1-F cgtctcgaccaaacagagaatccgtgagttacg (SEQ ID NO: 36)
S1-R ccatgggccc tttttagcat tggacg (SEQ ID NO: 37)
S2-F aaaagggccc atggtcgagc cc (SEQ ID NO: 38)
S2-R tatcatcgat catgccgaca gtg (SEQ ID NO: 39)
S3-F catgatcgat gataaaccca agc (SEQ ID NO: 40)
S3-R tcgcgaatgagccggt cgggatccag ac (SEQ ID NO: 41)
S4-F tcgcgacgcaatatgg ctccaaactt tc (SEQ ID NO: 42)
S4-R ccgcggtagaacggat gttgtgaagc ctaa (SEQ ID NO: 43)
S5-F ccgcggcaccgacaac aagagtcaat catg (SEQ ID NO: 44)
S5-R ctcaacta g t aagggaacga tcctaaattc c (SEQ ID NO: 45)
S6-F a c tagt tgagat cctcaaggat gatag (SEQ ID NO: 46)
S7-R gatccgtacg aatgcagctg aactc (SEQ ID NO: 47)
S9-F cctagg tatt accaaactca aaga (SEQ ID NO: 48)
S9-R GGTCTCaaccaaacaaa gatttggtga atg (SEQ ID NO: 49)
상기와 같은 라소타주 유전자 RT-PCR 및 각 PCR산물의 위치를 도 8에 나타내었다.
라소타주의 유전자 8부분을 각각 TA-클로닝 벡터에 클로닝한 모습을 도 9B에 나타내었으며, PCR로 EcoRI으로 처리하여 삽입된 절편의 크기를 확인하여 도 9A에 나타내었다.
2.2.2. NDV 전장 cDNA의 클로닝 및 염기서열 결정
상기 PCR에 의해 얻어진 산물은 아가로스 겔에서 전기영동한 뒤 GeneClean IIITM (Qbio co.)를 사용하여 정제하고, Topo cloning kit (Invitrogen) 또는 XL-Topo Tcloning kit (Invitrogen)를 사용하여 클로닝 하였다. 클로닝 된 각 클론들 은 벡터 내에 있는 M13 forward, M13 reverse등과 같은 프라이머를 이용하거나, 아래의 표 9에 기재된 프라이머를 사용하여 전체 염기서열 분석을 통해 이미 알려진 라소타주의 염기서열과 동일한, 즉 돌연변이가 발생하지 않은 클론들만 선별하였다.
[표 9] 라소타주 게놈 염기서열 분석용 프라이머.
Primer Primer sequence (5'->3')
La-601 taccctggagaggatcctc (SEQ ID NO: 50)
La-1261 cgagctaaagctaaccccag (SEQ ID NO: 51)
La-1901 agatgcagagatcgacgagc (SEQ ID NO: 52)
La-2581 aggcgatatcacagagagta (SEQ ID NO: 53)
La-3271 gtgccccaattgtgccaag (SEQ ID NO: 54)
S6-F-La actagttgagatcctcaaagatgacgg (SEQ ID NO: 55)
S6-R-La tgctctgccctttcaggaccggagctcgccatg (SEQ ID NO: 56)
S7-F-La catggcgagctccggtcctgaaagggcagagca (SEQ ID NO: 57)
La-5121 cagctcaggaattagactgc (SEQ ID NO: 58)
La-5711 gtcatcgccaactgcaagat (SEQ ID NO: 59)
La-7042 ctccggacatctgcaacag (SEQ ID NO: 60)
La-8591 aaactcggaagggcagtac (SEQ ID NO: 61)
La-9311 ttcgcattcaacctgcagg (SEQ ID NO: 62)
La-9971 cttagagatgacaatgtggc (SEQ ID NO: 63)
La-10661 gtaagatcagacgactctcc (SEQ ID NO:64)
La-11321 tttgagactgttgcaagcc (SEQ ID NO: 65)
La-12012 tgtcgccacatgtaaaggc (SEQ ID NO: 66)
La-12721 tacccgaaattggatcagtg (SEQ ID NO: 67)
La-13339 catgtctcggaagagcctc (SEQ ID NO: 68)
La-13981 atctgcagtgccctacaga (SEQ ID NO: 69)
La14976 acagtaactgtgactcttaacgaaaatcacatattaataggctcc (SEQ ID NO: 70)
La15020R ggagcctattaatatgtgattttcgttaagagtcacagttactgt (SEQ ID NO: 71)
S7-R gatccgtacgaatgctgctgaactc (SEQ ID NO: 72)
NDV-Pt-R tgccactgmtagttgygata (SEQ ID NO: 73)
NDcomF156 atacacctcrtcycagacag (SEQ ID NO: 74)
La-8892R gagccatgcaaacttggctgtggacc (SEQ ID NO: 75)
La-14708 acagtgcacgagacagatcc (SEQ ID NO: 76)
La-15092R gtcctaaggagtcagggttc (SEQ ID NO: 77)
염기서열에 변이가 없는 모든 클론들은 모벡터인 pTMH의 다중 제한효소 부위로 각각 순차적으로 도 10에 표시한 바와 같이 클로닝 하였다. L gene 사이에 새로운 제한효소 인식 부위 (ClaI)를 도입하였다. 상기 클로닝 과정을 도 10에 나타내었다.
2.2.3. RNP 복합체를 형성하기 위한 NP, P 및 L 유전자 게놈 전사 벡터 제조
뉴캐슬 바이러스 NP, P 및 L 유전자 게놈 전사 벡터를 제조하기 위하여 아래의 표 10의 프라이머로 라소타주의 NP, P 및 L 유전자를 각각 RT-PCR 하였고, 이를 TA-클로닝 벡터에 클로닝 하였다. 클론들을 염기서열 분석한 후, 돌연변이가 없는 클론들만 NotI으로 처리하여 pcDNA6/V5 벡터의 NotI 위치로 서브-클로닝 하였다.
[표 10] 라소타주 NP, P, L 유전자 증폭 및 클로닝 용 프라이머
Primer Primer sequence (5'->3')
NDV-NP-F gagcggccgc-accatgagtacgagcagctcc (SEQ ID NO: 78)
NDV-NP-R gagcggccgc-tcagtacccccagtcggtg (SEQ ID NO: 79)
NDV-P-F gagcggccgc-accatggccacctttacagatg (SEQ ID NO: 80)
NDV-P-R gagcggccgc-ttagccatttagagcaaggc (SEQ ID NO: 81)
NDV-L-F gagcggccgc-accatggcgagcctccgatcctgaaa (SEQ ID NO: 82)
NDV-L-R gagcggccgc-ttaagagtcacagttactgtaatatcc (SEQ ID NO: 83)
상기 RT-PCR에 의한 NP, P, L 유전자 증폭 결과를 도 11의 A에 나타내었다. 각 유전자는 TA-cloning vector에 클로닝 하여 염기서열을 분석하여 돌연변이 없는 클론을 선발하였다. 이와 같이 선발된 클론을 도 11의 B에 나타내었다.
2.3. 야외 강병원성 NDV의 표면 항원을 갖는 재조합 약병원성 NDV 제조
2.3.1. 강병원성 KBNP-4152의 F와 HN 유전자를 약독화한 재조합 클론 제작
본 실시예에서는 최근 국내에서 유행하는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스인 KBNP-4152의 F와 HN 유전자를 라소타주를 기본 백본으로 한 라소타주 전사 벡터(rNDV)에 삽입한 재조합 NDV 게놈 전사 벡터를 제작하였다.
2.3.2. 재조합 바이러스의 유전자 합성
각각의 F와 HN 유전자는 site-directed mutagenesis 또는 PTDS (PCR based Two steps DNA synthesis)를 이용하여 퓨린 절단 부위가 변형된 각각의 F와 HN 유전자를 얻었다 (Xiong, A. S. et al., 2004, Nucleic Acids Research, Vol32,No.12 e98). 상기 제작 과정을 도 12 내지 도 15에 나타내었다.
(가) 라소타의 M 유전자 3′-말단 부, KBNP-4152 F 유전자 연결부 및 퓨린 절단 부위의 염기서열이 변이된 유전자를 합성하였다.
재조합 바이러스를 제조하기 위하여, M 유전자 3′-말단까지는 라소타주의 게놈 서열을 갖도록 하고, 유전자간 염기서열 (intergenic sequence)과 유전자 시작 염기서열 (gene start sequence)부터는 KBNP-4152의 염기서열을 갖도록 두 개의 유전자를 융합시켰다 (도 13 참조). F 유전자를 약독화 하기 위하여 퓨린 절단 부위의 코돈들을 염기성 아미노산이 2개 또는 1개만 코딩 (112-RRQKRF-117에서 112-GRQARL-117)되도록 유전자 변이를 일으키고, 도 14와 같이 프라이머를 합성하여 화살표 방향대로 조합된 프라이머를 넣어, site directed mutagenesis 법 및 PTDS 법으로 인공합성 하였다.
(나) 그 후, KBNP-4152 HN (1-569) 유전자와 라소타주의 HN 유전자 말단 (570-577번)을 연결시켰다. 이와 같이 연결된 연결부위의 염기서열은 아래와 같다 (SEQ ID NO: 85, 밑줄 그은 부분부터 라소타주의 HN C-말단 코딩 염기서열임).
ccctttACTAGTTGAGATTCTCAAGGATGATGGGGTTAGGGAGGCCAGGGCTGGCCGCTT
GAGTCAATTGCGAGAGGGTTGGAAAGATGACATTGTATCACCTATCTTTTGCGACGCCAA
GAATCAAACTGAGTACCGGCGTGAGCTCGAGTCTTACGCTGCCAGCTGGCCA TAA TCAGC
TAGCGCTAATGTGATTAGATTAAATCTTGTCGATAGTCACTTGATTAAGAAAAAATGTAA
GTGGCAATGAGATACAAGGCAAAACAGCTCATGGTAAATAATACGGGTAGGACATGGCGA
(다) 상기와 같이 KBNP-4152 HN 유전자 (1-569)와 라소타주의 HN 유전자 말 단 (570-577)을 연결하기 위해 도 15와 같이 프라이머를 설계하여 PTDS를 수행하였다.
2.3.3. 키메라 NDV (KBNP-C4152R2L) rescue
Hep-2 (한국유전자은행) 또는 BHK21 세포주 (목암생명공학 연구소의 박만훈 박사팀으로부터 제공받음)를 6웰 플레이트에서 80% 가량 키워놓은 후(37℃, 5% CO2), vaccinia T7 바이러스 (목암생명공학 연구소의 박만훈 박사팀으로부터 제공받음)를 감염시켰다. 상기 세포주에 NDV의 RNP복합체를 형성하기 위한 NP, P, L 유전자 게놈 전사 벡터인 pcDNA3.1-NP, pcDNA3.1-P 및 pcDNA3.1-L 3 개의 벡터 (도 11의 B)와 약독화 된 KBNP-4152 F 유전자의 전사 시작부에서 HN 유전자 569까지를 라소타주 게놈 전사 벡터 (rNDV?) 중 M 유전자 뒤의 유전자간 서열 (intergenic sequence) 부분과 HN 유전자의 570사이에 삽입하여 재조합 NDV 게놈을 전사 할 수 있는 pTMH C4152-R2L (SEQ ID NO: 1, 도 23 참조)를 제작하였다.
상기 플라스미드 벡터를 각각 1:1:0.1:1비율로 섞은 플라스미드 DNA 4㎍당 10㎕의 LipofectamineTM(Invitrogen Co.)과 혼합하여 트랜스펙션 하였다. 여기에 1㎕/ml 의 아세틸화 트립신을 첨가하여 약병원성 재조합 바이러스가 생성되어 감염성을 갖도록 하였다. 얻어진 세포주를 2-3일간 37℃에서 배양한 후 6웰의 세포 및 세포 배양액을 수확하여 급동결 및 급해동을 3회 거쳐 9~11일령의 SPF 발육란에 접종하고, 요막액을 수확하여 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 얻었으며, 이를 KBNP-C4152R2L이라 명명하였다. 상기 균주 KBNP-C4152R2L는 2006년 9월 12일자로 대한 민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재하는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여, 기탁번호 KCTC 10984BP를 부여받았다.
이와 같은 KBNP-C4152R2L의 생성 과정을 도 16에 나타내었다.
상기와 동일한 방법으로, F 단백질의 퓨린 절단 부위에 4 개의 염기성 아미노산을 갖는 강병원성 NDV (RRQKRF; KBNP-C4152R4L이라 명명)와 1 개의 염기성 아미노산을 갖는 약병원성 NDV (GGQARL; KBNP-C4152R1L이라 명명)을 각각 제조하였다. 상기 균주 이름은 퓨린 절단 부위의 염기성 아미노산 수에 따라 정한 것으로, R 뒤의 숫자는 퓨린 절단 부위의 112에서 116번 아미노산 중의 염기성 아미노산의 개수를 의미하며, L (long)은 HN 단백질의 길이가 라소타주와 같은 577개 아미노산인 것을 나타낸다.
상기 얻어진 KBNP-C4152R1L, KBNP-C4152R2L 및 KBNP-C4152R4L의 모식도를 도 17에 나타내었다.
실시예 3: KBNP-C4152R2L 분석
3.1. 키메라 NDV의 일반적 특성 조사
상기에서 얻어진 KBNP-C4152R2L을 9~10령의 SPF 발육란에 접종한 후, 3~5일 뒤 요막액을 수확하여 평판 혈구응집검사를 통해 재조합 NDV가 증식하였는지 확인하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에서 알 수 있는 바와 같이, KBNP-C4152R2L을 접종하여 얻은 요막액에서 혈구 응집이 관찰되었으며, 이를 통하여 KBNP-C4152R2L의 증식을 확인하였다.
KBNP-C4152R2L은 대부분의 F 및 HN 유전자가 야외 강병원성 주인 KBNP-4152 와 동일하지만, F의 퓨린 절단 부위가 인공적으로 합성된 바이러스로, 강병원성 NDV 특이 프라이머를 사용한 PCR로는 바이러스의 RNA가 검출 되지 않으며, 모든 NDV를 공통적으로 검출하는 프라이머를 통해서만 바이러스의 RNA가 검출되는 것으로 나타났다. 이러한 사실은 표 5의 NDV-pt-R과 NDVcomF156 프라이머를 사용하는 RT-PCR로 증폭된 바이러스의 RNA 염기서열을 결정하여 재조합 NDV의 유전자 표지를 확인하였다. 상기의 RT-PCR 방법을 통하여 키메라 바이러스를 검출하고 병원성 유형을 확인하여 그 결과를 도 19에 나타내었다. 도 19에 나타낸 바와 같이, KBNP-C4152R2L은 NDV 공통 프라이머로(NDVcomF156)는 검출 가능하지만, 병원성주 특이 프라이머(NDV-pt-R)(특허 제0451883호)로는 검출이 불가능하였다.
보다 정밀한 바이러스 동정을 위하여 RT-PCR 후 염기서열을 분석하여 인공적으로 합성된 F의 퓨린 절단 부위를 코딩하는 유전자 염기서열을 확인하여 그 결과를 도 20에 나타내었다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 모 균주인 KBNP-4152의 F의 퓨린 절단 부위는 112-RRQKRF-117의 구조를 갖는 반면, KBNP-C4152R2L은 112-GRQARL-117의 구조를 갖는 것으로 나타났다. 특히 115번째 아미노산 위치에 존재하는 알라닌(A)은 자연계의 NDV는 가지고 있지 않는 본 발명의 키메라 바이러스만의 특징이라고 할 수 있다.
3.2. 키메라 NDV의 혈청학적 특성 조사
KBNP-C4152R2L의 F 및 HN은 KBNP-4152와 유사하고 라소타주와는 뚜렷한 차이를 보이므로, KBNP-C4152R2L는 KBNP-4152와 혈청학적으로 유사하나 라소타주와는 차이를 보일 것으로 예상된다. 이를 확인하기 위하여 교차-혈구응집억제 검사를 실시하여 혈청학적 특성을 조사하였으며, 그 결과를 도 21에 나타내었다. 예상한 바와 같이, KBNP-C4152R2L은 KBNP-4152와 유사한 혈청학적 특성을 보이는 것으로 나타났다. 즉 항라소타 항혈청은 라소타주와 비교하여 KBNP-C4152R2L 및 KBNP-4152에 대해 4 내지 8배 낮은 혈구응집역가를 보였고, 항KBNP-4152 항혈청은 자신이나 KBNP-C4152R2L에 대해 거의 유사한 혈구응집역가를 보이는 것으로 나타났다.
3.3. KBNP-C4152R2L의 병원성 지수 측정
3.3.1. 평균치사시간 (Mean Death Time; MDT) 측정
MDT측정은 Alexander(1988)의 방법에 준하여 실시하였다. 본 발명의 KBNP-C4152R2L을 멸균 PBS로 10-6으로 희석한 바이러스를 10개의 발육 계란을 5개씩 두 그룹으로 나누어 접종하였다. 첫 번째 그룹은 오전 9시에 접종을 실시하며, 두 번째 그룹은 오후 5시에 실시하였다. 접종 후 7 일간 37℃에서 배양하면서 매일 오전 9시와 5시에 검란을 실시하여 치사시간을 기록하여 MDT를 계산하였다. 측정된 MDT가 60시간 이내의 경우 강병원성, 60-90시간 이상의 경우 중간 독, 90~120시간은 약병원성, 그리고 120~∞는 무병원성으로 판정하였다. 백신 바이러스의 MDT는 최소 90시간이상이어야 한다. 그 결과, 본 발명의 KBNP-C4152R2L은 평균치사시간이 168시간 이상으로 측정되어 무병원성 NDV로 분류되었다.
3.3.2. 뇌 내 병원성 지수 (Intracerebral Pathogenicity Index, ICPI) 측정
1 일령 병아리 각각 10마리에 멸균 식염수로 10배 희석한 요막액 (실시예 12.3.3) 50㎕를 1cc주사기를 이용해 뇌 내로 접종한 후 매일 정상 병아리는 0, 병 증을 보인 병아리는 1, 죽은 병아리는 2로 점수를 매겨 매일 합계를 내어 8일간의 총 점수를 80으로 나누어 계산하였다. 무병원성은 0.0~0.2, 약병원성은 0.2~0.5, 중병원성은 1.0~1.5, 강병원성은 1.5~2.0으로 분류하였다. 국내에서 백신 바이러스로 활용하기 위해서는 최소 0.5이하의 병원성 지수를 보여야하므로, 0.0~0.5까지의 재조합 바이러스를 선정하였다.
KBNP-4152, KBNP-C4152R2L 및 라소타주의 ICPI를 측정한 결과를 각각 표 11 내지 13에 나타내었다.
[표 11] KBNP-4152의 ICPI 측정.
Day 1 2 3 4 5 6 7 8 Sum(index)
Sign 6 0 0 0 0 0 0 0 6 x 1
Dead 4 10 10 10 10 10 10 10 74 x 2
Normal 0 0 0 0 0 0 0 0
Total = 154
ICPI = 154/80 = 1.925
[표 12] KBNP-C4152R2L의 ICPI 측정.
Day 1 2 3 4 5 6 7 8 Sum(index)
Sign 0 0 0 0 0 0 0 0 0 x 1
Dead 0 0 0 0 0 0 0 0 0 x 2
Normal 10 10 10 10 10 10 10 10
Total = 154
ICPI = 0/80 = 0.0
[표 13] 라소타주의 ICPI 측정.
Day 1 2 3 4 5 6 7 8 Sum(index)
Sign 0 0 0 0 0 3 5 2 10 x 1
Dead 0 0 0 0 0 0 1 4 5 x 2
Normal 10 10 10 10 10 10 10 10
Total = 20
ICPI = 20/80 = 0.25
상기 평균치사시간(MDT) 및 ICPI 결과를 보면, KBNP-C4152R2L은 MDT가 168 시간 이상이었으며, ICPI 또한 0.0으로 병원성이 거의 없는 바이러스로 확인되었다. 이러한 병원성 감소 결과는 본 발명의 KBNP-C4152R2L 균주가 기존의 약독화 된 라소타주보다도 훨씬 약독화 되어 병원성이 낮다는 것을 보여주며, 이러한 병원성의 급격한 저하는 세포변성 효과에 있어서 합포체 형성능력이 뛰어난 야외주의 F와 HN 유전자 대신 과립형의 세포 변성 효과를 보이는 야외 NDV의 F 및 HN 유전자를 도입하여 만든 재조합 바이러스에서 나타 날 수 있는 결과이다. 지금까지 강병원성 NDV 중 합포체형과 과립형의 세포변성효과를 나타내는 클론이 존재한다는 사실은 전세계적으로도 국내에서 거의 멸종한 것으로 의심되는 VI형 바이러스에서만 알려져 있었는데 합포체형 NDV 클론인 SNU9358GS (서울대학교 수의과대학 조류질병학실 보유)의 ICPI 수치 (1.95)보다 과립형 클론인 SNU9358GG (AF535861)의 수치 (1.78)가 더 낮아 병원성이 낮다는 것이 알려져 있었다. 그러나 VII형을 포함한 나머지 III, IV, V, VIII, XI 형 병원성 NDV에서는 이러한 과립형 세포변성효과를 일으키는 NDV 클론은 전혀 알려져 있지 않았는 바 본 연구자들은 VII형 NDV에서 과립형 NDV를 최초로 클로닝 하는데 성공하여 이 바이러스의 F 및 HN 유전자를 이용하여 과립형 세포변성효과를 나타내는 라소타주 보다 낮은 병원성을 갖는 재조합 NDV를 제작하는데 성공하였다.
3.4. KBNP-C4152R2L의 유전적 안정성 시험
본 발명의 재조합 바이러스 KBNP-C4152R2L을 계태아에서 9번 이상 계대 배양한 후, 키메라 게놈 뉴클레오티드 4030~8889까지를 RT-PCR로 증폭한 후 염기서열 분석한 결과, 염기서열에 변화가 없어 매우 안정한 것으로 확인되었다.
3.5. KBNP-C4152R2L의 생산성 측정: EID 50 (50% egg-infectious dose) 측정
바이러스를 10진 희석하여 각 희석 배수 당 9~10일령 계태아 5~7개에 0.1ml 씩 요막강 내로 접종하고, 5~7일 간 37℃에서 배양한 후 계태아를 chilling 하며 요막액을 수확하여 혈구응집 반응을 통해 바이러스의 증식 여부를 판정하여 정해진 계산식에 따라 산출하였다. 그 결과, KBNP-C4152R2L의 EID50는 1010.1/㎖로 기존의 라소타주와 유사하여 생산성이 매우 높은 것으로 나타났다.
3.6. 혈구해리양상 측정
혈구응집 해리에 대한 조사는 Spalatin (1970)의 방법에 준하여 실시하였다. 즉 macro플레이트 웰에 CMF-PBS로 2진 희석한 라소타주와 KBNP-C4152R2L 각각 0.5ml에 1% 닭혈구를 0.25ml씩 넣고 실온에서 1시간 반응시킨 후 혈구응집 역가를 측정하였다. 1차 판독이 끝난 후 플레이트를 4℃에서 24시간 정치한 후에 혈구응집 역가를 측정하고 재 부유 2시간 후에 다시 혈구응집역가를 측정한다. 역가는 응집이 일어나는 최고 희석배수의 역수로 하였다. 판정 방법은 해리양상의 판정은 혈구응집 반응 24시간 후에 완전하게 해리가 일어나고 재 부유 2시간 후에도 혈구응집이 나타나지 않을 때 rapid eluter, 그렇지 않을 때 slow eluter로 판정하였다.
그 결과, 라소타주는 slow eluter였으나 KBNP-C4152R2L은 rapid eluter로서 KBNP-4152와 동일한 생물학적 특성을 갖는 것으로 나타났다.
3.7. 세포변성 효과 측정
계태아 섬유아세포(CEF)를 96웰 플레이트 전면에 단층을 형성하도록 배양한 후 라소타주, KBNP-4152 및 KBNP-C4152R2L로 각각 감염시킨 후 (각각 200 TCID50/well), FBS 0.5%, trypsin 20㎍/㎖을 첨가한 배지로 교체하여 배양하고, 3일 뒤에 관찰한 결과를 도 22에 나타내었다. 사진 중간의 붉은 화살표는 NDV의 전형적인 세포변성 효과인 합포체가 형성된 모습을 나타내는 것으로, 실제로 KBNP-C4152R2L는 트립신 첨가 시 NDV의 특징적인 합포체를 형성하는 것을 확인할 수 있다 (도 22의 E의 붉은 화살표).
이러한 세포 변성 효과는 키메라 바이러스가 합포체 형성에 트립신 의존성을 갖는 약 병원성주임을 의미하나, 라소타주와 KBNP-4152주와는 달리 전형적인 합포체를 거의 형성하지 않고, 도 22의 D와 같이 과립형의 세포변성효과를 보였다.
3.8. KBNP-C4152R2L의 불활화 백신 실험
KBNP-C4152R2L의 계태아 배양 원액, 이를 10배 농축한 농축액 및 라소타주 계태아 배양액을 각각 0.3% 포름알데히드로 불활화 하였으며, 불활화 된 각각의 바이러스 항원 부유액 30%에 ISA70오일 70%를 유화하여 각각의 불활화 백신을 제조하였다. 이와 같이 제조된 불활화 백신을 6주령의 SPF 닭의 피하에 접종하였으며, 백신 접종 3주 후에 검역원에서 표준으로 사용하는 교정원주 106TCID50 (AY6304009)를 비강 및 구강으로 공격하였다. 공격 접종 후 10일까지의 폐사율을 관찰하였으며, 그 결과를 아래의 표 14에 나타내었다.
[표 14]
Figure 112006069976085-pat00003
상기 표 14에 나타낸 바와 같이, KBNP-C4152R2L은 라소타주에 비하여 HA역가로 계산한 항원량이 낮은 경우에도 항체를 형성시키는 능력은 기존 백신에 비해 탁월한 것으로 나타났으며, 특히 혈청학적으로 라소타주에 비해 야외주에 대한 면역을 더욱 잘 형성하는 것으로 나타났다.
3.9. KBNP-C4152R2L의 in ovo 백신 실험
KBNP-C4152R2L은 현재 백신으로 사용되고 있는 균주보다도 병원성이 매우 낮아 in ovo 백신의 가능성이 높아 이를 확인하기 위해 18일령 상용계의 계태아를 이용하여 in ovo 백신을 투여했으며, 부화율 및 부화 2주 후의 증체율을 대조군과 비 교하였고, 2주령 이후의 항체가를 검사함으로써 모체이행 항체 극복 여부와 면역 수준을 비교하였으며, 2주 후 강병원성 바이러스를 공격 접종하여 방어율을 확인하였다.
시험에 사용한 계태아는 상용 산란계로 18일령의 계태아에 107.0 EID50/ml이 되도록 희석한 각 백신주를 0.1cc씩 접종하였다. 또한 음성 대조군에는 멸균 PBS 0.1cc를 접종하였다. 모체이행항체의 수준을 알아보기 위해서 음성 대조군 중 5수를 부화 직후 희생시켜 혈청을 확보하였다. 부화 후 17일령에 각 그룹 당 개체 별 체중을 측정하고 채혈 하였으며, 강독주인 KBNP-4152 106.5 TCID50를 비강 및 구강으로 공격 접종하였다. 생존율은 공격 접종 후 10일까지 관찰하였다. 이와 같이 하여 얻은 결과를 아래의 표 15에 나타내었다.
[표 15] KBNP-C4152R2L의 in ovo 백신 효능 비교.
Figure 112006069976085-pat00004
상기 표 15와 같이 KBNP-C4152R2L 접종군과 음성 대조군은 부화율 및 증체율에서 유의적인 차이가 없었으나, 부화 후 17일령의 항체 역가는 대조군에 비해 KBNP-C4152R2L 접종군에서 높게 유지되고 있음을 확인할 수 있다. 즉, 대조군의 경우 1일령의 경우 모체이행항체가 라소타주에 대한 혈구 응집 억제(HI)역가가 평균 5.8 ± 2.7에서 2.7 ± 1.7로 떨어진 반면 KBNP-C4152R2L 접종군은 라소타주에 대해서는 4.9 ± 1.1 그리고 자신에 대해서는 5.5 ± 1.4로 비교적 높은 역가를 보여 주었다. 또한 공격 접종 후 대조군에서 33.3%의 폐사를 보였으나 재조합 백신 접종군의 경우 100% 생존하였다.
이와 같은 결과는 Akzo Nobel N.V.(NL)사가 가지고 있는 기존의 "Recombinant Newcastle disease virus as an embryo vaccine"을 제목으로 하는 "US6,699,479B1" 특허 보다 월등한 결과 이며, P gene editing에 의한 약독화를 이 용하지 않고, 새로운 방법으로 개발된 KBNP-C4152R2L로부터 얻어진 것이라는 점에서 의미가 있다.
최근 선진국에서는 접종의 용이성 및 경제성 등의 이유로 병아리가 부화되기 전인 계태아에 직접 백신 하는 In ovo 백신이 선호되고 있지만, 뉴캐슬병의 경우 현재까지 알려진 생독 백신주들은 계태아 병원성이 있어 적용에 한계가 있었다. 그러나 본 발명의 KBNP-C4152R2L은 경우 계태아 병원성이 없는 것으로 확인되어 in ovo 백신으로서의 활용 가치가 매우 높을 것으로 기대된다.
상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 국내 및 아시아 지역에서 유행하는 강병원성 뉴캐슬병바이러스와 항원성이 유사하며, 병원성은 현재 사용되고 있는 백신주들과 유사하거나 현저하게 낮아 in ovo 백신으로 사용할 수 있고, 점 돌연변이에 의한 병원성 획득 가능성도 기존의 백신주에 비해 훨씬 낮은 유전자 구조를 가지고 있어 국내 뿐 아니라 아시아 지역의 뉴캐슬병 예방을 위한 사독백신 뿐 아니라 생독백신 및 in ovo 백신 제조에 유용하게 사용할 수 있다.
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  11. F 단백질의 113번부터 116번 아미노산 서열로서 아래의 식 2로 표현되는 아미노산 서열을 갖는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 및 HN 단백질 코딩 서열을 F 단백질의 113번부터 116번 아미노산 서열로서 아래의 식 1로 표현되는 아미노산 서열을 갖는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 및 HN 단백질 코딩 서열로 치환시키고, 상기 F 단백질의 115번째 아미노산의 코딩 코돈을 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이루어진 발린 코딩 코돈; 및 UAC 및 UAU 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 코돈으로 치환시키는 것을 특징으로 하는,
    재조합 뉴캐슬병 바이러스의 제조 방법:
    [식 1]
    113-X1X2X3X4-116
    상기 식 중
    X1, X3 및 X4는 각각 독립적으로 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)이고,
    X2는 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산임.
    [식 2]
    113-X5X6X7X8-116
    상기 식 중
    X5, X6 및 X7은 각각 독립적으로 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산이고, X5와 X7은 둘 다 아르기닌 (R)이 아니거나 또는 X5와 X7은 둘 다 리신 (K)이 아니며,
    X8은 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)임.
  12. 제11항에 있어서, 상기 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는 I형 또는 II형 뉴캐슬병 바이러스 균주들로 이루어진 군 중에서 선택된 것이고, 상기 강병원성 뉴캐슬병 바이러스는 VI 및 VII형 뉴캐슬병 바이러스 균주들로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 약병원성 뉴캐슬병 바이러스는 라소타/46 균주(AY845400)이고, 상기 강병원성 뉴캐슬병 바이러스는 KBNP-C4152(기탁번호: KCTC 10919BP)인 제조 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 HN 단백질 코딩 서열을 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 HN의 569번 아미노산의 C 말단에 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 HN의 570번 이후의 아미노산 서열이 추가로 삽입된 재조합 HN 유전자를 코딩하도록 변이시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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  16. 제11항에 있어서, 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 KCTC 10984BP인 제조 방법.
  17. F 단백질의 113번부터 116번 아미노산 서열로서 아래의 식 2로 표현되는 아미노산 서열을 갖는 약병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 및 HN 단백질 코딩부분을 F 단백질의 113번부터 116번 아미노산 서열로서 아래의 식 1로 표현되는 아미노산 서열을 갖는 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 및 HN 단백질 코딩 서열로 치환시키고, 상기 F 단백질의 115번째 아미노산의 코딩 코돈을 GCA, GCC, GCG 및 GCU로 이루어진 알라닌 코딩 코돈; GAC 및 GAU로 이루어진 아스파르트산 코딩 코돈; UUC 및 UUU로 이루어진 페닐알라닌 코딩 코돈; AUC 및 AUU로 이루어진 이소류신 코딩 코돈; UUA 및 UUG로 이루어진 류신 코딩 코돈; UCA, UCC, UCG 및 UCU로 이루어진 세린 코딩 코돈; ACC 및 ACU로 이루어진 트레오닌 코딩 코돈; GUA, GUC, GUG 및 GUU로 이루어진 발린 코딩 코돈; 및 UAC 및 UAU 티로신 코딩 코돈으로 이루어진 군 중에서 선택된 코돈으로 치환시키는 것을 특징으로 하는, 뉴캐슬병 바이러스의 항원성 및 안정성 증가 및 약독화 방법:
    [식 1]
    113-X1X2X3X4-116
    상기 식 중
    X1, X3 및 X4는 각각 독립적으로 아르기닌 (R) 또는 라이신 (K)이고,
    X2는 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산임.
    [식 2]
    113-X5X6X7X8-116
    상기 식 중
    X5, X6 및 X7은 각각 독립적으로 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산이고, X5와 X7은 둘 다 아르기닌 (R)이 아니거나 또는 X5와 X7은 둘 다 리신 (K)이 아니며,
    X8은 아르기닌 (R) 또는 리신 (K)임.
  18. 제17항에 있어서, 상기 HN 단백질 코딩 서열을 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 HN의 569번 아미노산의 C 말단에 약병원성 뉴캐슬병 바이러스 HN의 570번 이후의 아미노산 서열이 추가로 삽입된 재조합 HN 단백질을 코딩하도록 변이시키는 단계를 추가로 포함하는 뉴캐슬병 바이러스의 항원성 및 안정성 증가 및 약독화 방법.
  19. 제11항 내지 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의하여 제조된 재조합 뉴캐슬병 바이러스 균주를 함유하는 뉴캐슬병 백신.
  20. 제19항에 있어서, 상기 뉴캐슬병 백신은 불활화 된 사독백신 형태, 생독백신 형태 및 in ovo 백신 형태로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 한 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는 뉴캐슬병 백신.
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