JP2010504751A - 弱毒化された組換えニューカッスル病ウイルス及びこれを含むニューカッスル病ワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は韓国特許出願第2006-093620号に基づいた優先権を主張し、前記出願明細書は本明細書に参照として含まれる。
ニューカッスル病ウイルスは単鎖(single stranded)RNAウイルスでアブラウイルス属(genus Avulavirus)に属する。ニューカッスル病ウイルスはエンベロープ(envelope)を保有していて、エンベロープにはウイルスを宿主細胞に結合させるHN(Haemagglutinin-Neuraminidase)蛋白質とエンベロープと宿主細胞の融合を起こすF(Fusion)蛋白質がある。F蛋白質とHN蛋白質は糖タンパク質(glycoprotein)でエンベロープの表面に分布されている。
スプレー及びエアゾールによる生ワクチンの大量適用は複数の鳥類が短時間内にワクチン接種できるという容易性のためにまた非常に人気が高い。粒子が発生するノズルを調節することによって正確な粒子の大きさを達成することが重要である。
NDVの遺伝型はF遺伝子の部分塩基配列に基づいた系統分析によってI型からIX型までに分類される。国内に分布するニューカッスル病ウイルスは大概分子力学上VI型とVII型に属する。このうち、VI型の場合には集中的なワクチン接種によって変異株が出現したが、VII型に比べては相対的に低い分離率を示し、2000年後には大概VII型ウイルスのみ分離されていて絶滅の可能性もあると考えられている。したがって、塩基配列分析及びゲノム事業を通じた最近NDVの遺伝子構造結晶及び最近GenBankに登録されている全世界NDVとの遺伝子比較による分子力学研究は最適のワクチン株開発において非常に重要である。
本発明の他の目的は、病原性NDVの表面抗原を有する弱病原性組換えNDVを提供することにある。
本発明の他の目的は、前記組換えNDVを含むNDワクチンを提供することにある。
[式1]
113-X1X2X3X4-116
[式2]
113-X4X5X7X8-116
また他の側面において、本発明は弱病原性ニューカッスル病ウイルスのF及びHN遺伝子のコーディング部位を強病原性ニューカッスル病ウイルスのF及びHN蛋白質コーディング配列に置換させ、前記F遺伝子の115番塩基性アミノ酸コーディングコドンをGCA、GCC、GCG及びGCUからなるアラニンコーディングコドン;GAC及びGAUからなるアスパラギン酸コーディングコドン;UUC及びUUUからなるフェニルアラニンコーディングコドン;AUC及びAUUからなるイソロイシンコーディングコドン;UUA及びUUGからなるロイシンコーディングコドン;UCA、UCC、UCG及びUCUからなるセリンコーディングコドン;ACC及びACUからなるスレオニンコーディングコドン;GUA、GUC、GUG及びGUUからなるバリンコーディングコドン;UAC及びUAUチロシンコーディングコドンからなる群より選択されたコドンに置換させることを特徴とする、ニューカッスル病ウイルスの抗原性及び安定性増加及び弱毒化方法に関するものである。
前記のように、ニューカッスル病ウイルスの病原性はF蛋白質のフラン切断部位アミノ酸配列に応じて決められる。つまり、F蛋白質のフラン切断部位のアミノ酸配列がR-X-K/R-R(113番目から116番目アミノ酸位置、以下、特別な言及のない限りすべてのアミノ酸四量体に適用される)であればすべての細胞内に存在するフランによって切られて活性化されるので、全身感染が起こって強病原性を示す。しかし、R-Q-G-RまたはG-Q-G-Rのように塩基性アミノ酸が単に1つあるいは離れて1つのみ存在すると一部細胞内、消化管及び器官の上皮細胞一部に存在するトリプシン及び類似酵素によってのみ活性化されるので、局所感染のみ起こって病原性が低い。HNにおいても強病原性ウイルスは相対的に短い571個のアミノ酸のみ有している。これに反し、弱病原性ニューカッスル病ウイルスの場合にはより長い577個または616個のアミノ酸を有し、その後の部分のアミノ酸によって強病原性株と区分される。したがって、Fのフラン切断部位とHNのC末端部位を多様に組み合わせた組換えウイルスを作って多様な段階の病原性を有するウイルスを製作することができる。
1.1.ウイルスcDNAの合成
最近国内で流行する強病原性抗原性変異株ニューカッスル病ウイルスを代表するウイルスとして、ソウル大学校水医科大学鳥類疾病学室で分離されたSNU4152週を選定した。このウイルスを鶏胎児繊維亜細胞(CEF)上で3回プラーク精製を行なってクローニングし、SPF発育卵で2回継代培養してKBNP-4152(寄託番号KCTC 10919BP)と命名した。
GeneBankのデータに基づいて15,192bpに至る前記合成された9種のウイルスcDNAを次の表2に示したような9個のプライマー対でPCR法を通じて遺伝子を増幅し、クローニングして得られたクローンをZ1乃至Z9と命名した。
2.1.ニューカッスル病ウイルス(NDV)発現母ベクターpTMHの設計及び製作
NDVのcDNAからウイルスを作り出すためにはウイルスゲノムの5'と3'両端に不要な塩基の添加なくウイルスゲノムと同じ構造で転写されなければならない。このような構造を得るために次のような特徴の母ベクターpTMHを製造した(SEQ ID NO:84):
1)転写(transcription)開始部の直前にT7プロモーターを位置させた(図3及び4参照)。
2)NDVアンチゲノム(antigenomic)RNA直後には肝炎デルタウイルス(Hepatitis delta virus;HDV)リボザイム(リボザイム)RNAを位置させてセルフクレイヴィジ(self cleavage)が起こるようにした。
3)T7プロモーターとHDVリボザイムの間には最終的にNDVゲノムがクローニングできる制限酵素領域(MCS)を有するようにした(図4参照)。
4)15kbに至るNDVアンチゲノム全体を含んでもクローニングベクターが大腸菌内で安定的に存在するようにpBR322の複製開始塩基配列(ori)を有するようにした。
5)T7プロモーターとNDV転写開始が行なわれるアンチゲノム5'-末端の間、及びNDV転写が終了するアンチゲノム3'-末端とHDVリボザイムの間にそれぞれ認識部位と切断部位が相異なるBsmB IとBsa I認識塩基配列を位置させてNDVアンチゲノムからウイルスゲノムRNAの両側末端を正確に転写した(図3参照)。
pCR-HDVベクターをBsaIとNdeI制限酵素で切断して得られたHDV断片とBsaIとNdeI制限酵素で切断したpCR-TMベクターをT4DNAリガーゼで連結し、Top10F´適格細胞に変換して得られたベクターをpCR-TMHと命名した。大腸菌に安定的にクローニングできるようにpBR322ベクター(Promega co, Cat.#D1511)にpCR-TMHベクターのT7プロモーター-MCS-HDVリボザイム部分をEcoRIとNdeI制限酵素を利用してサブクローニングし、これをpTMHベクターと命名した(SEQ ID NO:84)。
(認識部位のない場合(No site found))
ラソタ/46菌株(AY845400)に対するRNA抽出及びcDNA合成は前記実施例1に記載された方法によって実施した。
GenBankのデータに基づいて全15,186bpに至るNDVcDNA全体をクローニングするために全て8部分(S1乃至S9)に分けて下記の表8に記載したプライマーを使用して実施例1に記載された方法によって重合酵素連鎖反応(PCR)を行った。
ラソタ株の遺伝子8部分をそれぞれTA-クローニングベクターにクローニングした模様を図9Bに示し、PCRにEcoRIで処理して挿入された切片のサイズを確認して図9Aに示した。
前記PCRによって得られた産物はアガロースゲルで電気泳動した後、GeneClean IIITM(Qbio co.)を使用して精製し、トップクローニングキット(Invitrogen)またはXL-Topo Tcloning kit(Invitrogen)を使用してクローニングした。クローニングされた各クローンはベクター内にあるM13forward、M13reverseなどのようなプライマーを使用したり、下記の表9に記載されたプライマーを使用して全塩基配列分析を通じて公知のラソタ株の塩基配列と同一な、つまり、突然変異の発生しないクローンのみ選別した。
ニューカッスルウイルスNP、P及びL遺伝子ゲノム転写ベクターを製造するために下記の表10のプライマーでラソタ株のNP、P及びL遺伝子をそれぞれRT-PCRし、これをTA-クローニングベクターにクローニングした。クローンを塩基配列分析した後、突然変異のないクローンのみNotIで処理してpcDNA6/V5ベクターのNotI位置にサブ-クローニングした。
2.3.1.強病原性KBNP-4152のFとHN遺伝子を弱毒化した組換えクローン製作
本実施例では最近国内で流行する強病原性ニューカッスル病ウイルスであるKBNP-4152のFとHN誘電者をラソタ株を基本バックボーンとしたラソタ株転写ベクター(rNDV)に挿入した組換えNDVゲノム転写ベクターを製作した。
それぞれのFとHN遺伝子は部位特異的突然変異誘発またはPTDS(PCR based Two steps DNA synthesis)を利用してフラン切断部位が変形されたそれぞれのFとHN遺伝子を得た(非特許文献14、Xiong,A.S.et al.,2004,Nucleic Acids Research, Vol32, No.12 e98)。前記製作過程を図12乃至図15に示した。
Hep-2(韓国遺伝子銀行)またはBHK21細胞株(MOGAM生命工学研究所のpark man hoon博士チームから提起)を6ウェル(孔)プレートで80%程度育てた後(37℃、5%のCO2)、vacciniaT7ウイルス(MOGAM生命工学研究所のpark man hoon博士チームから提起)を感染させた。前記細胞株にNDVのRNP複合体を形成するためのNP、P、L遺伝子ゲノム転写ベクターであるpcDNA3.1-NP、pcDNA3.1-P及びpcDNA3.1-L3個のベクター(図11のB)と弱毒化されたKBNP-4152F遺伝子の転写開始部からHN遺伝子569までをラソタ株ゲノム転写ベクター(rNDV)中M遺伝子後の遺伝子間配列(intergenic sequence)部分とHN遺伝子の570間に挿入して組換えNDVゲノムを転写することができるpTMH C4152-R2L(SEQ ID NO:1、図23参照)を製作した。
このようなKBNP-C4152R2Lの生成過程を図16に示した。
3.1.キメラNDVの一般的特性調査
前記で得られたKBNP-C4152R2Lを9〜10令のSPF発育卵に接種した後、3〜5日後尿膜液を収得して平板血球凝集検査を通じて組換えNDVの増殖有無を確認した。その結果を図18に示した。図18から分かるように、KBNP-C4152R2Lを接種して得られた尿膜液から血球凝集が観察され、これを通じてKBNP-C4152R2Lの増殖を確認した。
KBNP-C4152R2LのF及びHNはKBNP-4152と類似してラソタ株ワは明確な差を示すので、KBNP-C4152R2LはKBNP-4152と血清学的に類似しているが、ラソタ株ワは差を示すと予想された。これを確認するために交差-血球凝集抑制検査を実施して血清学的特性を調査し、その結果を図21に示した。予想した通り、KBNP-C4152R2LはKBNP-4152と類似の血清学的特性を示すことが確認された。つまり、抗ラソタ抗血清はラソタ株と比較してKBNP-C4152R2L及びKBNP-4152に対して4乃至8倍低い血球凝集力価を示し、抗KBNP-4152抗血清は自分やKBNP-C4152R2Lに対してほとんど類似な血球凝集力価を示すことが確認された。
3.3.1.平均死亡時間(Mean Death Time;MDT)測定
MDT測定はAlexander(1988)の方法に基づいて実施した。本発明のKBNP-C4152R2Lを滅菌PBSに10-6で希釈したウイルスを10個の発育卵を5個ずつ1つのグループに分けて接種した。最初グループは午前9時に接種を実施し、第2グループは午後5時に実施した。接種後7日間37℃で培養しながら毎日午前9時と5時に検卵を実施して死亡時間を記録してMDTを計算した。測定されたMDTが60時間以内である場合には強病原性、60〜90時間以上である場合には中間毒、90〜120時間は弱病原性、そして120〜∞は無病原性に判定した。ワクチンウイルスのMDTは最少90時間以上でなければならない。その結果、本発明のKBNP-C4152R2Lは平均死亡時間が168時間以上で測定されて無病原性NDVに分類された。
1日齢ヒヨコそれぞれ10匹に滅菌食塩水で10倍希釈した尿膜液(実施例2.3.3)50μlを1ccの注射器を利用して脳内に接種した後、毎日正常ヒヨコは0、病症を示したヒヨコは1、死亡したヒヨコは2に点数を付け、毎日合計を出して8日間の合計点数を80に分けて計算した。無病原性は0.0〜0.2、弱病原性は0.2〜0.5、亜病原性は1.0〜1.5、強病原性は1.5〜2.0に分類した。国内でワクチンウイルスとして活用するためには最少0.5以下の病原性指数を示さなければならないので、0.0〜0.5までの組換えウイルスを選定した。
本発明の組換えウイルスKBNP-C4152R2Lを鶏胎児で9回以上系対培養した後、キメラゲノムヌクレオチド4030〜8889までをRT-PCRで増幅した後、塩基配列分析した結果、塩基配列に変化がなくて非常に安定であることが確認された。
ウイルスを10進希釈(10倍、100倍、1000倍など、2進数列では6,12,24時間など)して各稀釈倍数当り9〜10日齢鶏胎児5〜7個に0.1mlずつ尿膜腔内に接種し、5〜7日間37℃で培養した後、鶏胎児を冷却しながら尿膜液を収得して血球凝集反応によってウイルスの増殖有無を判定し、定められた計算式によって算出した。その結果、KBNP-C4152R2LのEID50は1010.1/mlで従来のラソタ株と類似して生産性が非常に高いことが確認された。
血球凝集解離に対する調査は(非特許文献15,Spalatin,1970)の方法に準じて実施した。つまり、マクロプレート孔にCMF-PBSに2進稀釈したラソタ株とKBNP-C4152R2Lそれぞれ0.5mlに1%の鶏血球を0.25mlずつ入れて室温で1時間反応させた後、血球凝集力価を測定した。1次判読が終わった後、プレートを4℃で24時間定置をした後に血球凝集力価を測定し、再浮遊2時間後に再び血球凝集力価を測定する。力価は凝集が起こる最高稀釈倍数の逆数にした。判定方法は解離様相の判定は血球凝集反応24時間後に完全に解離が起こって再浮遊2時間後にも血球凝集が現れない場合にrapid eluter、そうではない場合にslow eluterに判定した。
鶏胎児繊維亜細胞(CEF)を96孔プレート全面に断層を形成するように培養した後、ラソタ株、KBNP-4152及びKBNP-C4152R2Lでそれぞれ感染させた後(それぞれ200 TCID50/well)、FBS0.5%、トリプシン20μg/mlを添加した培地に交替して培養し、3日後に観察した結果を図22に示した。写真中間の赤い矢印はNDVの典型的な細胞変成効果である合胞体が形成された模様を示すことで、実際にKBNP-C4152R2Lはトリプシン添加時にNDVの特徴的な合胞体を形成することを確認することができた(図22のEの赤い矢印)。
KBNP-C4152R2Lの鶏胎児培養原液、これを10倍濃縮した濃縮液及びラソタ株鶏胎児培養液をそれぞれ0.3%のフォルムアルデヒドで不活化し、不活化されたそれぞれのウイルス抗原浮遊液30%にISA70オイル70%を混合してそれぞれの不活化ワクチンを製造した。このように製造された不活化ワクチンを6週令のSPF鶏の皮下に接種し、ワクチン接種3週後に検疫院で標準として使用する校正円周106TCID50(AY6304009)を鼻腔及び口腔で攻撃した。攻撃接種後10日までの死亡率を観察し、その結果をの下の表14に示した。
KBNP-C4152R2Lは現在ワクチンとして使用されている菌株よりも病原性が非常に低くてin ovoワクチンの可能性が高くて、これを確認するために18日齢常用鶏の胎児を利用してin ovoワクチンを投与し、孵化率及び孵化2週後の増体率を対照群と比較し、2週令後の抗体価を検査することによって母体移行抗体克服の有無と免疫水準を比較し、2週後強病原性ウイルスを攻撃接種して防御率を確認した。
Claims (20)
- F蛋白質の113番から116番アミノ酸配列として下記の式2で表現される配列を有する弱病原性ニューカッスル病ウイルスのNP、P、M及びL蛋白質をコードするヌクレオチド配列;及び
F蛋白質の113番から116番アミノ酸配列として下記の式1で表現される配列を有する強病原性ニューカッスル病ウイルスのF及びHN蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、
前記F蛋白質コーディング配列において強病原性ニューカッスル病ウイルスF蛋白質の115番目アミノ酸のコーディングコドンがGCA、GCC、GCG及びGCUからなるアラニンコーディングコドン;GAC及びGAUからなるアスパラギン酸コーディングコドン;UUC及びUUUからなるフェニルアラニンコーディングコドン;AUC及びAUUからなるイソロイシンコーディングコドン;UUA及びUUGからなるロイシンコーディングコドン;UCA、UCC、UCG及びUCUからなるセリンコーディングコドン;ACC及びACUからなるスレオニンコーディングコドン;GUA、GUC、GUG及びGUUからなるバリンコーディングコドン;UAC及びUAUチロシンコーディングコドンからなる群より選択されたコドンで置換されたことを特徴とするニューカッスル病ウイルスのゲノム転写ベクター:
[式1]
113-X1X2X3X4-116
前記式のうち、
X1、X3及びX4はそれぞれ独立的にアルギニン(R)またはリシン(K)であり、
X2はアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸である。
[式2]
113-X4X5X7X8-116
前記式のうち、
X5、X6及びX7はそれぞれ独立的にアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸であり、X5とX7は同時にアルギニン(R)またはリシン(K)でなく、
X8はアルギニン(R)またはリシン(K)である。 - 前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスはII型ニューカッスル病ウイルス菌株からなる群の中から選択されたものであり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスはVI及びVII型ニューカッスル病ウイルス菌株からなる群の中から選択されたものであることを特徴とする、請求項1に記載のゲノム転写ベクター。
- 前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスはラソタ/46菌株(AY845400)であり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスはKBNP-C4152(寄託番号:KCTC 10919BP)であることを特徴とする、請求項2に記載のゲノム転写ベクター。
- 前記HN蛋白質コーディング配列が強病原性ニューカッスル病ウイルスのHNの569番目アミノ酸のC末端に弱病原性ニューカッスル病ウイルスのHN蛋白質の570番目後のアミノ酸配列が追加的に挿入された組換えHN蛋白質をコーディングするものであることを特徴とする、請求項1に記載のゲノム転写ベクター。
- SEQ ID NO:1の塩基配列で表現されることを特徴とする、請求項1に記載のゲノム転写ベクター。
- F蛋白質の113番目から116番目アミノ酸配列として下記の式1
[式1]
113-X1X2X3X4-116
[前記式中、
X1、X3及びX4はそれぞれ独立的にアルギニン(R)またはリシン(K)であり、
X2はアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸である]
で表現されるアミノ酸配列を有する弱病原性ニューカッスル病ウイルスのNP、P、M及びL蛋白質をコードするヌクレオチド配列、及び
F蛋白質の113番から116番アミノ酸配列として下記の式2
[式2]
113-X4X5X7X8-116
[前記式中、
X5、X6及びX7はそれぞれ独立的にアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸であり、X5とX7は同時にアルギニン(R)またはリシン(K)でなく、
X8はアルギニン(R)またはリシン(K)である]
で表現されるアミノ酸配列を有する強病原性ニューカッスル病ウイルスのF及びHN蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有し、
菌株に含まれる前記F蛋白質コーディング配列が、強病原性ニューカッスル病ウイルスのF蛋白質の115番目のアミノ酸をコードするコドンが、GCA、GCC、GCG及びGCUからなるアラニンコーディングコドン;GAC及びGAUからなるアスパラギン酸コーディングコドン;UUC及びUUUからなるフェニルアラニンコーディングコドン;AUC及びAUUからなるイソロイシンコーディングコドン;UUA及びUUGからなるロイシンコーディングコドン;UCA、UCC、UCG及びUCUからなるセリンコーディングコドン;ACC及びACUからなるスレオニンコーディングコドン;GUA、GUC、GUG及びGUUからなるバリンコーディングコドン;UAC及びUAUからなるチロシンコーディングコドンからなる群から選択されたいずれか1つのコドンで置換されたことを特徴とする、
ニューカッスル病ウイルス菌株。 - 前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスがII型ニューカッスル病ウイルスからなる群から選択されたものであり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスがVI及びVII型ニューカッスル病ウイルスからなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項6に記載のニューカッスル病ウイルス菌株。
- 前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスがラソタ/46菌株(AY845400)であり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスがKBNP-C4152(寄託番号:KCTC 10919BP)であることを特徴とする、請求項7に記載のニューカッスル病ウイルス菌株。
- 前記HN蛋白質をコードするヌクレオチド配列が、強病原性ニューカッスル病ウイルスのHN蛋白質の569番のアミノ酸のC末端に、弱病原性ニューカッスル病ウイルスのHN蛋白質の570番目の後のアミノ酸配列が連結された、組換えHN蛋白質をコードするヌクレオチド配列である、請求項6に記載のニューカッスル病ウイルス菌株。
- 寄託番号KCTC 10984BPである、請求項6に記載のニューカッスル病ウイルス菌株。
- F蛋白質の113番から116番アミノ酸配列として下記の式2で表現されるアミノ酸配列を有する弱病原性ニューカッスル病ウイルスのF及びHN蛋白質をコードするヌクレオチド配列をF蛋白質の113番から116番アミノ酸配列として下記の式1で表現されるアミノ酸配列を有する強病原性ニューカッスル病ウイルスのF及びHN蛋白質をコードするヌクレオチド配列で置換させ、前記F蛋白質の115番目アミノ酸のコーディングコドンをGCA、GCC、GCG及びGCUからなるアラニンコーディングコドン;GAC及びGAUからなるアスパラギン酸コーディングコドン;UUC及びUUUからなるフェニルアラニンコーディングコドン;AUC及びAUUからなるイソロイシンコーディングコドン;UUA及びUUGからなるロイシンコーディングコドン;UCA、UCC、UCG及びUCUからなるセリンコーディングコドン;ACC及びACUからなるスレオニンコーディングコドン;GUA、GUC、GUG及びGUUからなるバリンコーディングコドン;及びUAC及びUAUチロシンコーディングコドンからなる群より選択されたコドンで置換させることを特徴とする組換えニューカッスル病ウイルスの製造方法:
[式1]
113-X1X2X3X4-116
前記式のうち、
X1、X3及びX4はそれぞれ独立的にアルギニン(R)またはリシン(K)であり、
X2はアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸である。
[式2]
113-X4X5X7X8-116
前記式のうち、
X5、X6及びX7はそれぞれ独立的にアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸であり、X5とX7は同時にアルギニン(R)またはリシン(K)でなく、
X8はアルギニン(R)またはリシン(K)である。 - 前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスはI型またはII型ニューカッスル病ウイルス菌株からなる群の中から選択されたものであり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスはVI及びVII型ニューカッスル病ウイルス菌株からなる群の中から選択されたものであることを特徴とする、請求項11に記載の製造方法。
- 前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスはラソタ/46菌株(AY845400)であり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスはKBNP-C4152(寄託番号:KCTC 10919BP)であることを特徴とする、請求項12に記載の製造方法。
- 前記HN蛋白質をコードするヌクレオチド配列を強病原性ニューカッスル病ウイルスのHNの569番アミノ酸のC末端に弱病原性ニューカッスル病ウイルスのHNの570番後のアミノ酸配列が追加的に挿入された組換えHN遺伝子をコーディングするように変異させる段階を追加的に含むことを特徴とする、請求項11に記載の製造方法。
- 請求項1乃至請求項5のうちのいずれか1つの請求項に記載の組換えニューカッスル病ウイルスのゲノム転写ベクターを使用することを特徴とする、請求項11に記載の製造方法。
- 前記組換えニューカッスル病ウイルスはKCTC 10984BPであることを特徴とする、請求項11に記載の製造方法。
- F蛋白質の113番から116番アミノ酸配列として下記の式2で表現されるアミノ酸配列を有する弱病原性ニューカッスル病ウイルスのF及びHN蛋白質コーディング部分をF蛋白質の113番から116番アミノ酸配列として下記の式1で表現されるアミノ酸配列を有する強病原性ニューカッスル病ウイルスのF及びHN蛋白質をコードするヌクレオチド配列で置換させ、前記F蛋白質の115番目アミノ酸のコーディングコドンをGCA、GCC、GCG及びGCUからなるアラニンコーディングコドン;GAC及びGAUからなるアスパラギン酸コーディングコドン;UUC及びUUUからなるフェニルアラニンコーディングコドン;AUC及びAUUからなるイソロイシンコーディングコドン;UUA及びUUGからなるロイシンコーディングコドン;UCA、UCC、UCG及びUCUからなるセリンコーディングコドン;ACC及びACUからなるスレオニンコーディングコドン;GUA、GUC、GUG及びGUUからなるバリンコーディングコドン;及びUAC及びUAUチロシンコーディングコドンからなる群より選択されたコドンで置換させることを特徴とするニューカッスル病ウイルスの抗原性及び安定性増加及び弱毒化方法:
[式1]
113-X1X2X3X4-116
前記式のうち、
X1、X3及びX4はそれぞれ独立的にアルギニン(R)またはリシン(K)であり、
X2はアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸である。
[式2]
113-X4X5X7X8-116
前記式のうち、
X5、X6及びX7はそれぞれ独立的にアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸であり、X5とX7は同時にアルギニン(R)またはリシン(K)でなく、
X8はアルギニン(R)またはリシン(K)である。 - 前記HN蛋白質をコードするヌクレオチド配列を強病原性ニューカッスル病ウイルスのHNの569番アミノ酸のC末端に弱病原性ニューカッスル病ウイルスHNの570番後のアミノ酸配列が追加的に挿入された組換えHN蛋白質をコーディングするように変異させる段階を追加的に含むことを特徴とする、請求項17に記載のニューカッスル病ウイルスの抗原性及び安定性増加及び弱毒化方法。
- 請求項6乃至請求項10のうちのいずれか1つの請求項に記載の組換えニューカッスル病ウイルス菌株を含むニューカッスル病に対するワクチン。
- 前記ワクチンが、不活化された死毒ワクチン形態、活性ワクチン形態及びin ovoワクチン形態で構成された群より選択されたある1つの形態で使用される、請求項19に記載のニューカッスル病ワクチン。
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