KR101636683B1 - 내열성이 향상된 뉴캣슬병 바이러스 ｂｐ ａｃｎｄｍ - Google Patents

Abstract

본 발명은 내열성이 향상된 키메라 뉴캣슬병 바이러스 BP ACNDM에 관한 것이다. 본 발명의 키메라 뉴캣슬병 바이러스는 국내 및 아시아 지역에서 유행하는 강병원성 뉴캣슬병 바이러스와 항원성이 유사하지만, 병원성은 현재 사용되고 있는 백신주들과 유사하거나 현저하게 낮고, 내열성이 매우 높아 조류들에게 백신이 접종되는 실제 상황에서도 높은 면역원성을 유도할 수 있다.

Description

내열성이 향상된 뉴캣슬병 바이러스 ＢＰ ＡＣＮＤＭ{NEW CASTLE DISEASE VIRUS BP ACNDM WITH IMPROVED THERMOSTABLE PROPERTY}

본 발명은 내열성이 향상된 뉴캣슬병 바이러스 BP ACNDM에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 내열성이 향상된 키메라 뉴캣슬병 바이러스, 상기 키메라 뉴캣슬병 바이러스의 제조 방법, 상기 키메라 뉴캣슬병 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신, 및 상기 키메라 뉴캣슬병 바이러스를 조류 대상에 분무 투여에 의해 접종하는 방법에 관한 것이다.

뉴캣슬병(Newcastle Disease, ND)은 국제적으로 가장 중요한 가축 질병 15종 중 하나로, 급성 열성 호흡기 질병이며, 면역이 안 된 가금에 감염되는 경우 100% 폐사하는 법정 제1종 전염병이다.

우리나라는 뉴캣슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV) 상재지역으로, 이 질병의 근절에 상당한 어려움이 있다. 또한, 우리나라와 활발한 교역을 하고 있는 동남아시아, 중국, 및 대만에는 다양한 뉴캣슬병 바이러스들이 유행하고 있어서 잠재적인 위해 요인으로 존재하므로, 아시아형 뉴캣슬병 백신의 개발이 절실한 시점이다.

뉴캣슬병 바이러스는 단일 가닥(single stranded) RNA 바이러스로 아부라바이러스 속(genus Avulavirus)에 속한다. 뉴캣슬병 바이러스는 엔벨롭(envelope)을 가지고 있으며 엔벨롭에는 바이러스가 숙주 세포에 결합할 수 있도록 해주는 HN(Haemagglutinin-Neuraminidase) 단백질과 엔벨롭과 숙주 세포의 융합을 일으키는 F(Fusion) 단백질이 있다. F 단백질과 HN 단백질은 글리코단백질(glycoprotein)로서 엔벨롭의 표면에 분포되어 있다.

뉴캣슬병 바이러스는 F 유전자의 염기서열의 계통분석에 의해 I부터 IX까지의 유전형으로 분류되며, 이 중 유전형 VII형은 우리나라를 비롯한 아시아 국가인 인도네시아, 중국, 대만 및 일본에서 문제되는 것으로 보고되어 있다.

뉴캣슬병 바이러스는 닭에서 질병 정도에 따라 아래와 같은 병원성 타입(phathotype)으로 분류된다: 1) 소화기 병변과 높은 폐사율을 보이는 장 친화 강병원성 (velogenic) NDV; 그리고 호흡기 및 신경학적 증상이 주로 나타나며 높은 폐사율을 보이는 신경 친화 강병원성 NDV; 2) 낮은 치사율, 일부 조류에서 급성 호흡기 질환 및 신경성 증상을 보이는 중병원성 (methogenic) NDV; 및 3) 경증 또는 무증상의 호흡기 감염을 유발하는 약병원성 (lentogenic) 및 무병원성 (apathogenic) NDV.

뉴캣슬병 바이러스가 세포에 감염성을 갖기 위해서는 F1 및 F2로 절단될 전구체 당단백질 Fo이 필요하다. 이 번역-후 절단은 숙주 세포 프로테아제들에 의해 중재된다. 강병원성 및 중병원성 NDV의 Fo 단백질은 광범위한 프로테아제에 의해 절단될 수 있어 치명적인 전신감염을 초래할 수 있는 반면에, 약 병원성 NDV들의 Fo 단백질들은 단지 호흡기 또는 장관과 같은 트립신-같은 효소들을 갖는 영역에서만 절단되어 국소 감염만 가능하다

Fo 전구체의 아미노산 사열화는 약 병원성 바이러스들은 F2 및 F1 사슬을 연결하는 절단 인식 부위에 단일 아르기닌 (R)을 갖는 반면, 중간독 이상의 균주들은 절단 인식부위가 (112)R-K/R-X-K/R-R-F(117)처럼 아르기닌 (R) 혹은 라이신(K)과 같은 염기성 아미노산이 쌍으로 존재한다는 것을 보여주었다. 게다가, 중병원성 이상의 병원성을 갖는 NDV의 F2 사슬은 일반적으로 페닐알라닌 (F₁₁₇) 잔기로 개시하는 반면에, 약병원성 이하의 병원성을 보이는 NDV의 F2 사슬은 일반적으로 류신 (L₁₁₇)으로 개시한다.

HN 단백질은 II형 막 글리코단백질(type II membrane glycoprotein)로 바이러스 엔벨롭의 표면에서 4합체(tetramer)를 형성하여 세포막에 침투한다(Gorman et al., 1988; Ng et al., 1989). HN 단백질은 비리온(virion)이 글리코접합(glycoconjugates)의 시알산(sialic acids)에 결합함으로써 호스트 세포 표면에 위치시키는 기능을 한다.

HN 단백질은 관통막(transmembrane) 도메인, 줄기(stalk) 도메인 및 구형(globular) 도메인의 세 지역으로 나뉜다. 항원성인 수용체 결합과 뉴라미니다제(neuraminidase) 활성 위치는 모두 구형 도메인에 위치해 있다. 융합 유도 활성은 줄기 도메인에 위치해 있고 이것은 F 단백질과 상호작용을 한다(Sergei et al., 1993).

현재 상용화 된 뉴캣슬병 불활화 백신은 약병원성 NDV인 클론 30 또는 라소타주를 사용하여 생산된 것과, 본 발명자들에 의해 역유전학 기술에 의해 개발된 약병원성 뉴캣슬병 바이러스의 F 및 HN 단백질 코딩 서열을 강병원성 뉴캣슬병 바이러스의 F 및 HN 단백질 코딩 서열로 치환시킨 불활화 백신(KBNP-C4152, 한국 특허 등록 제10-0454870)이 있다. 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 역유전학(Reverse Genetics) 기술은 바이러스 게놈으로부터 감염성 있는 바이러스를 회수하는 기술로서 제안된 방식이다 (US Patent No. 5,166,057 등 참조). 이러한 기술은 원래 인플루엔자 바이러스 게놈을 조작하기 위하여 제안된 것이지만, 인플루엔자 바이러스 이외의 RNA 바이러스인 광견병 바이러스(Rabies Virus), 호흡기 합포체 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus), 센다이 바이러스 (Sendaivirus)를 비롯하여 다양한 분절과 비분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스에 성공적으로 적용되고 있다.

그러나, 종래 불활화 백신(KBNP-C4152)의 경우 내열성이 없는 La Sota주를 이용하였기 때문에 사독 백신용으로는 우수한 효과를 나타내지만, 내열성이 약하여 실제 백신이 사용되는 환경인 분무용 생 백신 주로 사용하기에는 백신으로서의 기능이 약해진다는 문제점이 있었다.

본 발명은 내열성이 향상된 키메라 뉴캣슬병 바이러스(BP ACNDM)를 제공하고자 한다. 본 발명은 상기 내열성이 향상된 키메라 뉴캣슬병 바이러스의 제조 방법을 제공하고자 한다. 본 발명은 상기 내열성이 향상된 키메라 뉴캣슬병 바이러스 및 적어도 하나의 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 제공하고자 한다. 또한, 본 발명은 조류 대상에 상기 내열성이 향상된 키메라 뉴캣슬병 바이러스를 분무 투여하는 단계를 포함하는 조류 대상의 접종 방법을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 내열성이 향상된 키메라 뉴캣슬병 바이러스는 3'-NP-P-M-F-HN-L-5' 단백질을 암호화하는 서열로 구성된 유전자; 상기 3' 말단에 연결된 리더(leader) 유전자; 및 상기 5' 말단에 연결된 트레일러 영역(trailer region) 유전자를 포함하고,

상기 리더, NP, P, M, L 및 트레일러 영역 유전자는 약병원성 내열성 뉴캣슬병 바이러스로부터 유래하고,

상기 F 및 HN 유전자는 강병원성 뉴캣슬병 바이러스로부터 유래하고,

상기 F 유전자의 퓨린 절단 부위 112-RRQKRF-117의 112 및 115 번째 아미노산 서열은 글리신(G)으로 치환되고, 117 번째 아미노산 서열은 류신(L) 코딩 그룹으로 치환된 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 내열성이 향상된 키메라 뉴캣슬병 바이러스는 국내 및 아시아 지역에서 유행하는 강병원성 뉴캣슬병 바이러스와 항원성이 유사하지만, 병원성은 현재 사용되고 있는 백신주들과 유사하거나 현저하게 낮고, 내열성이 매우 높으므로, 높은 면역원성을 유도할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 뉴캣슬병 바이러스의 HN 선형항원 부위의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 실시예 2.1.에 따른 비병원성 내열성 키메라 NDV 발현 벡터 제작과정을 나타낸다.
도 3는 실시예 2.2.에 따라 제작된 비병원성 내열성 키메라 NDV 발현 벡터의 전체 염기 서열을 나타낸다.
도 4는 실시예 2.1에 따라 제조된 약병원성 NDV 발현벡터와 비병원성 내열성 키메라 NDV 발현벡터 내의 L gene 염기 서열을 비교 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 3에 따른 내열성 NDV L gene이 도입된 비병원성 NDV 작출과정을 나타낸다.
도 6은 실시예 3.2.1.에 따른 내열성 L gene이 도입된 비병원성 NDV 작출 확인 RT-PCR 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 3.2.2.에 따른 내열성 L gene이 도입된 비병원성 NDV 바이러스의 혈구응집반응 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 4.2.에 따른 56℃에서 열처리한 각각의 바이러스를 계태아신장세포에 감염시킨 후 바이러스에 의한 세포변성 효과를 나타낸 그래프이다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 비록 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어 서는 안된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 쓰여진다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수지 범위를 포함할 것이다.

본 명세서에서 제공된 제목은 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서, 하기의 구현예를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.

발현 벡터

일 구현예에 따르면, 3'-NP-P-M-F-HN-L-5' 단백질을 암호화하는 서열로 구성된 유전자, 상기 3' 말단에 연결된 리더(leader) 유전자, 및 상기 5' 말단에 연결된 트레일러 영역(trailer region) 유전자를 포함하는 키메라 뉴캣슬병 발현 벡터가 제공된다.

핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 “키메라” 또는 “재조합”은 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입에 의해 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형된 것을 의미한다. 따라서, 키메라 및 재조합 벡터는 천연 (비-키메라 또는 비-재조합) 형태의 벡터 내에서 발견되지 않는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 키메라 뉴캣슬병 발현 벡터는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 뉴캣슬병 발현 벡터를 의미한다.

본 명세서에 사용되는 용어 “발현 벡터”는 숙주 세포에서 특정 핵산을 전사시킬 수 있는 일련의 명시된 핵산 요소를 통해 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 작제물을 의미한다. 상기 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 단편일 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 전사시키고자 하는 핵산을 포함한다. 또한, 상기 발현 벡터는 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태, 예를 들면 복제 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 파지 또는 바이러스 입자, DNA 구축물, 및 카세트를 포함할 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 도입된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 예를 들면, 발현 조절서열 및 해당 유전자는 선별 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자"는 선행하는 및 이어지는 암호화 영역, 예를 들면, 각 암호화 조각(엑손) 사이의 개입 서열(인트론)뿐만 아니라, 5' 미번역(5' UTR) 또는 리더 서열 및 3' 미번역(3' UTR) 또는 트레일러 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 폴리뉴클레오티스 서열을 의미한다. "이종 유전자"는 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 것을 의미한다. 상기 이종 유전자는 자연적으로 발생하는 유전자, 돌연변이 유전자, 합성 유전자일 수 있다. "상동 유전자"는 숙주 세포에서 고유의 또는 자연적으로 발생하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프로모터”는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열 어레이를 의미한다. 프로모터는 임의로 전사 개시 부위로부터 수천 염기쌍 만큼의 거리에 위치할 수 있는, 원위 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적 및 유도 가능한 프로모터를 포함한다. “구성적” 프로모터는 대부분의 환경적 조건과 발달 조건에서 활성인 프로모터이고, “유도 가능한” 프로모터는 환경 조건 또는 발달 조건 하에 활성인 프로모터이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “터미네이터”는 전사의 종료를 가져오거나 효과를 주는 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “작동가능하게 연결된”은 유전자의 전사에 영향을 미치는 경우, 프로모터 서열이 유전자를 암호화하는 서열의 전사에 영향을 미치는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “핵산” 및 “폴리뉴클레오티드”는 상호교환적으로 사용되며, 이는 단일- 또는 이중-가닥형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 결합을 함유하며, 합성인 것, 천연적으로 발생된 것, 및 비천연적으로 발생된 것이고, 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 가지며, 기준 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사가 이루어지는 핵산을 포함한다. 달리 지시하지 않으면, 특정 핵산 서열은 또한 보존적으로 변형된 그의 변이체 (예를 들면, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보성 서열뿐만 아니라, 명확하게 명시된 서열을 포함한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된 또는 모든 코돈의 세번째 위치의 것이 혼합-염기 및/도는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 축퇴성 코돈 치환을 달성할 수 있다. “핵산”은 유전자, cDAN, mRNA, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드와 상호교환적으로 사용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 “폴리펩티드”, “펩티드” 및 “단백질”은 상호교환적으로 사용되며, 이는 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연적으로 발생된 아미노산의 인공화학적 모사체인 아미노산 중합체뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 아미노산 중합체 및 비천연적으로 발생된 아미노산 중합체도 포함된다.

상기 구현예에 따르면, 상기 F 유전자의 퓨린 절단 부위는 112-GRQGRL-117로 표현되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

F 유전자의 퓨린 절단 부위가 상기와 같은 아미노산 서열을 갖는 경우 퓨린에 의한 인식 및 절단이 거의 일어나지 않고, 오로지 국소적으로 존재하는 세포 내 또는 세포 외 단백분해효소에 의해 절단이 이루어지므로 치명적인 전신감염은 일어나지 않아 병원성이 낮게 될 수 있다.

상기 F 유전자의 퓨린 절단 부위 112-RRQKRF-117의 112 및 115 번째 아미노산 글리신(G)로 치환되고, 117 번째 아미노산은 류신(L) 코딩 그룹으로 치환된 것임을 특징으로 한다.

상기 F 유전자는 국내분리 강병원성 뉴캣슬병 바이러스를 대표하는 genotype VII 바이러스의 유전자를 분자적으로 약독화 F gene의 단백분해효소 인식부위를 비병원성주의 특성을 갖도록 112-RRQKRF-117를 112-GRQGRL-117로 디자인한 인공합성 유전자가 사용되었다.

상기 구현예에 따르면, 상기 HN 단백질을 암호화하는 서열은 강병원성 뉴캣슬병 바이러스로부터 유래한 것으로, VII형 뉴캣슬병 바이러스의 유전자의 특성을 갖도록 디자인한 인공합성 유전자가 사용되었다.

상기 구현예에 따르면, 상기 NP, P, M 및 L 단백질을 암호화하는 서열은 약병원성 내열성 뉴캣슬병 바이러스로부터 유래한 것으로 일 실시예에서 BP-AT 균주로부터 유래한 NP, P, M, 및 L 단백질이 사용되었다. 상기 약병원성 내열성 뉴캣슬병 바이러스는 I형 또는 II형 뉴캣슬병 바이러스 균주들로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.

상기 구현예에 따르면, 3' 말단에 연결된 리더 유전자 및 5' 말단에 연결된 트레일러 영역 유전자는 각각 약병원성 내열성 뉴캣슬병 바이러스로부터 유래한 리더 및 트레일러 영역 유전자를 포함할 수 있다. 상기 약병원성 내열성 뉴캣슬병 바이러스는 I형 또는 II형 뉴캣슬병 바이러스 균주들로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 일 실시예에서, BP-AT주의 리더 유전자 및 트레일러 영역 유전자가 사용되었다.

상기 구현예에 따르면, 상기 키메라 뉴캣슬병 발현 벡터는 야외 강병원성 균주와 동일한 항원성을 갖지만 병원성이 없고 내열성을 갖는 것으로, BP-ACNDM(기탁번호: KCTC12445BP) 일 수 있다.

다른 구현예에 따르면, 상기 구현예에 따른 발현 벡터를 포함하는 키메라 뉴캣슬병 바이러스가 제공된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 키메라 뉴캣슬병 바이러스는 3'-NP-P-M-F-HN-L-5' 단백질을 암호화하는 서열로 구성된 유전자; 상기 3' 말단에 연결된 리더(leader) 유전자; 및 상기 5' 말단에 연결된 트레일러 영역(trailer region) 유전자를 포함하고,

상기 리더, NP, P, M, L 및 트레일러 영역 유전자는 약병원성 내열성 뉴캣슬병 바이러스로부터 유래하고,

상기 F 및 HN 유전자는 강병원성 뉴캣슬병 바이러스로부터 유래하고,

상기 F 유전자의 퓨린 절단 부위 112-RRQKRF-117의 112 및 115 번째 아미노산 서열은 글리신(G)으로 치환되고, 117 번째 아미노산 서열은 류신(L) 코딩 그룹으로 치환될 것일 수 있다.

상기 구현예에 따른 키메라 뉴캣슬병 바이러스는 기존 KBNP-C4152이 50 내지 60℃의 온도에서 열처리 후 25분 내에 면역원성을 완전히 상실하는데 반해, 50 내지 60℃의 온도에서 열처리 후 60분 이상, 70분 이상, 80분 이상, 90분 이상, 100분 이상, 110분 이상 또는 120분 이상 까지도 면역원성을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 키메라 뉴캣슬병 바이러스는 현저히 개선된 내열성을 갖는 것이다.

면역원성 조성물 또는 백신

다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 키메라 뉴캣슬병 바이러스 및 적어도 하나의 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “면역원성 조성물”은 본 발명의 뉴캣슬병 발현 벡터로부터 발현되는 관심의 항원 또는 면역원에 대해 면역 반응을 유발시키는 임의의 조성물을 의미하는 것으로, 예를 들면, 대상에 투여될 후 관심의 표적 면역원 또는 항원에 대해 면역 반응을 유발시킬 수 있는 조성물을 포함한다. 용어 “백신”은 관심의 항원에 대하여 방어 면역 반응을 유도하거나 또는 그 항원에 대해 효과적으로 방어하는 조성물을 의미하는 것으로, 예를 들면, 대상에 투여하거나 주사된 후 표적 항원 또는 면역원에 대해 방어 면역 반응을 유발시키거나 또는 본 발명의 뉴캣슬병 발현 벡터로부터 발현된 항원 또는 면역원에 대해 효과적인 방어를 제공하는 임의의 조성물을 포함한다.

상기 구현예에서, 상기 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 당업계에 잘 알려져 있는 것으로, 예를 들면, 살균수, 식염수 용액 또는 인산염 완충액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 구현예에서, 상기 백신은 생독 백신, 사독 백신, 뉴캣슬병 바이러스 균주의 유전자를 사용하여 생산한 서브유니트 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 및 DNA 백신을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

접종 방법

조류 대상에 본 발명에 따른 키메라 뉴캣슬병 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 분무 투여하는 단계를 포함하는, 조류 대상의 접종 방법이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 “조류 대상”은 조(Aves) 강에 속하는 임의의 모든 가내 및 야생 조류를 의미하는 것으로, 신조상목 및 치조상목을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 신조상목은 기러기목, 칼새목, 부세로포메스, 쏙독새목, 도요목, 황새목, 쥐새목, 비둘기목, 파랑새목, 뻐꾸기목, 매목, 갈벌리포메스, 닭목, 아미목, 두루미목, 무소파기포메스, 오피스토코미포메스, 참새목, 다라새목, 홍학목, 딱다구리목, 논병아리목, 바다제비목, 앵무목, 펭귄목, 올?미목, 벌새목, 비단날개새목, 세가락메추라기목 및 후투티목 등을 포함할 수 있다. 치조상목은 키위새목, 화식조목, 공조목, 레아목, 타조목 및 티니아미포메스 등을 포함한다. 상기 조유 대상은 성숙 조류, 조류 새끼 및 조류 배아/난을 포함할 수 있다.

상기 구현예에서, 상기 면역원성 조성물은 발육종란내(In Ovo), 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 결막 및 피하의 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 우수한 내열성을 갖기 때문에, 음용수를 통하는 것 또는 분무와 같이 농업적 목적을 위한 집단 투여의 경로에 적합할 수 있다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 뉴캣슬병 바이러스 유전자 선발

1.1. 강병원성 항원성 변이주로부터 F, HN 유전자 선발

최근 국내에서 유행하는 강병원성 항원성 변이주 뉴캣슬병 바이러스를 대표할 수 있는 바이러스로서, 서울대학교 수의과대학 조류질병학실에서 분리된 SNU4152주를 선정하였다.

국내 분리 65주에 대해 국내 유행 뉴캣슬 병 바이러스 분자 역학조사 및 항원결정부를 분석하였다. 분리된 F 유전자 다양성 부위(384bp)에 대해 Neighbor-Joining 법을 이용한 염기 서열의 계통 분석 결과는 다음과 같다.

뉴캣슬병 바이러스의 HN 선형항원 부위의 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다.

1.2.약독화된 F, HF 유전자 합성

실시예 1.1에서 선택된 강병원성 SNU 4152 뉴캣슬병바이러스의 F gene의 cleavage site를 112-GRQGRL-117로 비 병원성 아미노산 codon을 갖도록 디자인한 후 genotype VII형 NDV F, HN유전자를 인공합성하였다.

1.2.1 국내 분리 내열성주 BP-AT주의 염기서열 분석

비병원성 내열성 뉴캣슬병 바이러스의 NP, P, M 및 L 유전자 클로닝을 위해 BP-AT 바이러스의 해당 유전자 부분의 염기서열을 분석하였다. 상기 BP-AT 균주의 해당 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 4에 나타내었다

1.2.2. BP-AT주의 NP, P, M 및 L 유전자 클로닝

비병원성 내열성 뉴캣슬병 바이러스 발현벡터 제작을 위한 상기 BP-AT 주의 NP, P, M L gene 및 leader, trailer 영역을 각각 PCR한 후 클로닝하였다. 이때, Overlap extension PCR 방법을 사용하여 내열성 NDV의 L gene 도입에 사용되는 AvrII 제한효소 인식부위를 BP-AT주의 M gene으로부터 제거하고 BP-AT주의 trailer sequence 도입에 사용되는 PacI 제한효소 인식부위를 T7 promoter 서열 앞에 삽입하였으며, Red/ET Recombination Kit(Gene bridge)의 Counter-Selection method를 이용하여 약병원성 pTMH-Lasota 발현벡터 5' 말단의 벡터의 trailer sequence를 BP-AT주의 sequence로 교체하였다.

<실시예 2> 비병원성 내열성 뉴캣슬병 바이러스 발현 벡터 제조

2.1. 비병원성 내열성주를 기본 백본(back bone)으로 한 벡터 제조

동일 발명자에 의해 출원 등록된 10-0862049 특허와 동일한 방법으로 제작한 pTMH-LaSota eukaryotic cell 발현 vector를 야외 강독주의 항원성을 갖는 비병원성 내열성 키메라 NDV 발현벡터로 만들기 위해 앞서 클로닝한 유전자들로 교체하는 작업을 진행하였다. 교체에 사용한 제한효소 및 교체순서는 도 2에 나타내었다.

2.2. 키메라 뉴캣슬병 바이러스 발현 벡터의 염기 서열 분석

제작한 키메라 NDV 발현 vector의 전체 염기서열을 다음 프라이머 세트를 사용하여 분석하였으며 그 결과를 도 3에 나타내었다. 또한, L gene 도입 전 후의 염기서열을 도 4에 나타내었다. 도 4로부터 알 수 있듯이, 내열성 NDV L gene이 도입된 재조합 비병원성 NDV vector L gene 염기서열(아래)은 내열성 L gene 도입 전의 약병원성 NDV vector의 염기서열(위)과 다르다는 것이 확인되었다.

Primer	Primer sequence (5-> 3)
Uls8661F	GTT TAG AAG AAC TGG CTA GT (SEQ ID NO: 5)
Uls9381-F	TGA CTC ACG CAA TAG CCA CT (SEQ ID NO: 6)
Uls10092	TCT TAG CTG ACC AGA TTG CA (SEQ ID NO: 7)
Uls11952	CGT ATC TCG GGT CAA AGA CT (SEQ ID NO: 8)
Uls12674	GAT GAA GAT ACC TCC ATA AAG (SEQ ID NO: 9)
Uls13462	GAA AGA TCC ATT TAC CCG ACA (SEQ ID NO: 10)
Uls10691	ATG GTG TTA ACA CAA TTG CAT C (SEQ ID NO: 11)
Uls11290-F	GCC AGT CTG TGT AAC GAC C (SEQ ID NO: 12)
LaUls14357-F	ATC AGA TGA GAT CAC ACT GAC (SEQ ID NO: 13)
La4941-F	ACA GCG GCA CAG ATA ACA GCA (SEQ ID NO: 14)
La5545-F	AGC TCG ACA CCT CAT ACT GCA (SEQ ID NO: 15)
LaUls-6183-F	GAT CAG ATG AGA GCC ACT ACA (SEQ ID NO: 16)
La6844-F	AGT GGA CGA CAT CAG TGA TGT (SEQ ID NO: 17)
Uls8264-R	CAA CTG GCA GCG TAG GAC TCG (SEQ ID NO: 18)
La60-F	GTA GAA GGT GTG AAT CTC GAG (SEQ ID NO: 19)
La755-F	GTA TGC AGG AGC ACA ATC CAA (SEQ ID NO: 20)
La2026-R	AGC ACC TTG GTC TTC CCT TGT (SEQ ID NO: 21)
La15396-F	ATG CGG TGT GAA ATA CCG CAC (SEQ ID NO: 22)
La16846-R	CTT CTG ACA ACG ATC GGA GGA (SEQ ID NO: 23)
La16712-F	ATC GTG GTG TCA CGC TCG TCG (SEQ ID NO: 24)
La17372-F	AGT GCC ACC TGA CGT CTA AGA (SEQ ID NO: 25)
La7989-F	AGC ATA CAC GAC ATC GAC ATG (SEQ ID NO: 26)
La264-R	TAT CTT CTG GGT CAT CAC TGT (SEQ ID NO: 27)
La4010	CTT ATG ACC ACC GTA GAT AGG (SEQ ID NO: 28)
La1901	GAT GCA GAG ATC GAC GAG C (SEQ ID NO: 29)
La2581	AGG CGA TAT CAC AGA GAG TA (SEQ ID NO: 30)
La3271	GTG CCC CAA TTG TGC CAA G (SEQ ID NO: 31)

<실시예 3> 비병원성 내열성 NDV의 작출

전체 NDV 유전자를 복제하는 재조합 전장 NDV cDNA vector로부터 약독화 강병원성 항원성을 대표하며 내열성을 갖는 ND 바이러스를 도 5와 같이 작출하였다.

3.1. 키메라 NDV의 작출

Hep-2세포 주를 6well 플레이트 에 80%가랑 키워놓은 후, vaccinia T7 바이러스를 감염시켰다. 이후 세포주에 T7 promoter에 의해 개시되어 단백질이 발현되는 pCR-TM-NP, pCR-TM-P, pCR-TM-L 플라스미드 벡터 3개와 T7 promoter에 의해 개시되어 HDV 라이보자임에 의해 스스로 절단되어 정확하고 완전한 전체 키메라 내열성 NDV 게놈을 만들어 낼 수 있는 플라스미드인 pTMH-HT-CNDr을 준비하였다. 각각을 1:1:0.1:1 비율로 섞어 Lipofectamine^TM(Invitrogen. co)과 적정 비율로 혼합하여 트랜스펙션하였다. 이후 1ug/ml 의 acetylated trypsin을 첨가하여 내열성 비병원성 재조합 바이러스가 생성되어 감염성을 갖도록 하였다. 2-3일간 37℃에서 배양한 후 6 well 의 세포를 수확하여 11일령의 SPF 발육란에 접종하여 감염성 NDV를 얻었다.

3.2. 바이러스 확인 실험

11일령 SPF 발육란 접종 후 24시간마다 검란을 실시하여 중사란을 확인하고, 접종 72시간 후 접종란을 4℃ 냉장한 후 요막강액을 채취하여 바이러스 확인실험을 실시하였다.

3.2.1. RT-PCT

요막강액 150㎕에 Virus genome Ex Kit(BIOPOA) lysis buffer 150㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 실온에서 10분간 정치하였다. 여기에 다시 binding buffer 300㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 column에 loading하고 washing buffer A, B를 사용하여 차례로 column을 세척하고 elution buffer로 column에 부착되어있는 RNA를 용해시켰다.

추출한 내열성주 바이러스의 RNA 2㎕를 다음 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 ONE-STEP RT-PCR Kit(iNtRON)로 45℃/30min-94℃/5min-(94℃/20sec-50℃/15sec-72℃/30sec)30cycles 조건하에서 RT-PCR 하여 바이러스의 유무를 확인하였으며, Transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응을 확인하기 위하여 추출한 RNA를 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 MG-taq polymerase (macrogen)로 하기의 조건하에서 PCR하여 확인하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다:

바이러스 확인 RT-PCR: 45℃/30min-94℃/5min-(94℃/20sec-50℃/15sec-72℃/30sec)30cycles

False positive 확인 PCR: 94℃/5min-(94℃/20sec-50℃/15sec-72℃/30sec)30cycles

primer	primer sequence (5-> 3)
NDVcomF	ATA CAC CTC RTC YCA GAC AG (SEQ ID NO: 32)
NDVcomR	TGC CAC TGM TAG TTG YGA TA (SEQ ID NO: 33)

3.2.2. 혈구응집반응

추출한 요막강액을 닭혈구와 반응하여 혈구응집반응을 통해 작출된 재조합 NDV 바이러스를 확인하였다. 작출된 내열성 L gene이 도입된 비병원성 NDV 바이러스의 혈구응집반응 최초 작출 확인 이후 바이러스별로 종란에 2회, 3회 계대배양 후 혈구응집반응을 통해 바이러스의 배양을 확인하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

<실시예 4> 키메라 뉴캣슬병 바이러스 특성 분석

4.1. 병원성 분석

뇌 내 병원성 지수 (Intracerebral Pathogenecity Index, ICPI) 측정

1 일령 병아리 각각 10마리씩을 사용하고, Isolator는 단단한 종이로 된 밀폐상자를 이용하며, 뒷면은 glass-wool filter로 공기를 여과하여 바이러스의 교차 오염을 막고 앞면은 투명한 비닐로 창을 만들어 내부가 잘 보일 수 있게 하였다. 시험에 사용할 NDV를 계태아 장 뇨막강 내로 접종하여 죽은 계 태아의 장 뇨막강 액을 멸균 식염수로 1/10희석하여 얻은 바이러스 액 50㎕을 1cc주사기를 이용해 뒷머리에 5mm정도로 뇌 내로 접종한 10마리의 병아리를 isolator에 넣고 매일 병증 발생과 폐사 수를 기록하며 8일간 관찰하였으며 뇌 내 병원성 지수는 Alexander의 방법에 따라 수행하였다. 즉, 정상 병아리는 0, 병증을 보인 병아리는 1, 죽은 병아리는 2로 점수를 매겨 매일 합계를 내어 8일간의 총 점수를 80으로 나누었다. 이때 무병원성은 0.0~0.2, 약병원성은 0.2~0.5, 중병원성은 1.0~1.5, 그리고 강병원성은 1.5~2.0으로 분류하였다. 국내에서 백신 바이러스로 활용하기 위해서는 최소 0.5 이하의 병원성 지수를 보여야 하므로 0.0~0.5까지의 키메라 바이러스를 선정하였다. 그 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.

No.	Strain	Clinical	Days								Score
	(live)	view	1	2	3	4	5	6	7	8
1	BP-ACNDM	Sign	0	0	0	0	0	0	0	0
		Dead	0	0	0	0	0	0	0	0
		Normal	10	10	10	10	10	10	10	10
		Total	0	0	0	0	0	0	0	0	0
2	Avinew	Sign	0	0	1	2	1	1	0	0
		Dead	0	0	0	1	3	4	5	5
		Normal	10	10	9	7	6	5	5	5
		Total	0	0	1	4	7	9	10	10	0.26
3	KBNP-C4152	Sign	0	0	0	0	0	0	0	0
		Dead	0	0	0	0	0	0	0	0
		Normal	10	10	10	10	10	10	10	10
		Total	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Scoring : normal=0, sick=1, dead=2 ICPI=score의합/개체수X8일
Asymptomatic:0.0-0.2, lentogenic:0.2-0.5, mesogenic:1.0-1.5, velogenic : 1.5-2.0

상기 표 3으로부터 알 수 있듯이, 작출된 BP-ACNDM ND 바이러스의 ICPI는 0으로, 안전한 무병원성 백신 후보주임이 확인되었다.

4.2. 열처리한 비병원성 내열성 바이러스의 세포 변성 효과 시험

BP-ACNDM이 내열성을 나타내는지 확인하기 위하여 계태아신장세포에 바이러스를 감염시켜 증식된 바이러스에 의한 세포변성효과를 확인하는 시험을 수행하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8로부터 알 수 있듯이, KBNP-C4152주의 경우 열처리 25분 후 감염능을 완전히 상실했으나, BP-ACNDM주의 경우 120분 까지도 25% 정도의 감염능이 남아있어 내열성이 획기적으로 개선되었음이 확인되었다.

한국생명공학연구원 KCTC12445BP 20130715

<110> BioPoA, Inc. <120> NEW CASTLE DISEASE VIRUS BP ACND WITH IMPROVED THERMOSTABLE PROPERTY <130> DPP-2013-0283 <150> KR 13/102,060 <151> 2013-08-28 <160> 33 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1470 <212> DNA <213> BP-AT NP gene <400> 1 atgtcttctg tattcgatga gtacgagcag ctcctcgcgg ctcagactcg ccccaatgga 60 gctcatggcg gaggagagaa ggggagcacc ttaaaggtag aagtcccggt attcactctc 120 aacagtgatg acccagaaga tagatggaac tttgcagtgt tttgtcttcg gattgctgtt 180 agcgaggatg ccaacaaacc acttaggcaa ggtgctctca tatctctctt atgttcccac 240 tctcaagtga tgaggaacca tgttgccctt gcggggaaac agaatgaggc cacactggct 300 gttcttgaga tcgatggttt taccaacggc gtgccccagt tcaacaacag gagtggagtg 360 tctgaagaga gagcacagag atttatgatg atagcagggt ctctccctcg ggcatgcagc 420 aacggtaccc cgttcgtcac agctggggtt gaagatgatg caccagaaga cattactgat 480 accctggaga ggatcctctc tatccaggct caagtatggg tcacggtggc aaaggccatg 540 actgcatatg agacagcaga tgagtcagaa acaagaagaa tcaataagta catgcagcaa 600 ggcagggtcc agaagaagta catcctccac cccgtatgca ggagcgcaat ccaactcaca 660 atcagacagt ctctggcggt ccgcatcttt ttggttagcg agcttaagag aggccgcaac 720 acggcaggtg ggacctccac ctattacaac ttggtggggg atgtagactc atacatcagg 780 aacactgggc taactgcatt cttcctgaca cttaaatatg gaattaacac caagacatca 840 gcccttgcac ttagcagcct ctcaggcgat atccagaaaa tgaagcagct catgcgcttg 900 tatcggatga aaggagataa tgcgccgtac atgacattgc tcggtgacag tgaccagatg 960 agctttgcac ctgccgagta tgcacaactt tactcctttg ccatgggtat ggcatcagtc 1020 ctagataaag gaactagcaa ataccaattt gccagggact ttatgagcac atcattctgg 1080 agacttggag tagagtacgc tcaggctcaa ggaagtagca tcaatgagga tatggccgcc 1140 gagctaaagc taaccccagc agcaaggaga ggcctggcag ctgctgccca aagagtgtct 1200 gaggagacca gcagcatgga catgcccacc caacaagccg gggtcctcac tggactcagc 1260 gacggaggct cccaagcccc ccaaggtgca ctgaacagat cacaagggca accggacacc 1320 ggggatgggg agacccaatt tctggatctg atgagagcgg tggcaaatag catgagagaa 1380 gcgccaaact ctgcgcaggg cacccctcaa ccggggcctc ccccaacccc tgggccctct 1440 caagacaatg acaccgactg ggggtactga 1470 <210> 2 <211> 1188 <212> DNA <213> BP-AT P gene <400> 2 atggccacct ttacagatgc ggagatcgac gagctatttg agaccagtgg aactgtcatt 60 gacagcataa ttacggccca gggaaaacca gtagagactg ttggaaggag tgcaatccca 120 caaggcaaaa ctaaggcttt gagcgcagca tgggagaagc atgggagcat ccagtcacca 180 gccagccaag acacccctga tcgacaggac agatcagata aacaactgtc cacacccgag 240 caagcgagtc caaacgacag ccccccagcc acatccactg accagcctcc cactcaggct 300 gcagatgagg ccggcgatac acagctcaag accggagcaa gcaactctct gctgtcgatg 360 cttgataaac tcagcaataa gtcatctaat gctaaaaagg gcccagggtc gagccctcaa 420 gaaaggcatc atcaacgtct gactcaacaa caggggagtc aacaaagccg cggaaacagc 480 caagagagac cgcagaacca ggccaaggcc atccctggaa accaggtcac agacgcgaac 540 acagcatatc atggacaatg ggaggagtca caactatcag ctggtgcaac ccatcatgct 600 ctccgatcag agcagagcca agacaatact cctgcacctg tggatcatgt ccagctacct 660 gtcgactttg tgcaggcgat gatgtctatg atggaggcga tatcacagag ggtaagtaaa 720 gttgactatc agctggacct tgtcttgaaa cagacatctt ctatccccat gatgcggtct 780 gaaatccagc agctgaaaac gtctgttgcg gtcatggaag ccaatttggg catgatgaag 840 atcctggacc ctggttgtgc caacgtttca tctctaagtg atctacgggc agttgcccga 900 tcccacccgg ttttaatttc tggccccgga gacccatctc cttatgtgac ccaagggggc 960 gaaatggcac tcaataaact ttcgcaaccg gtgcaacacc cctctgaatt gattaaaccc 1020 gccacggcaa gcgggcctga tataggagtg gagaaagaca ctgtccgtgc attgatcatg 1080 tcacgcccta tgcatccgag ctcttcagct aggctcttga gcaaactgga cgcagccgga 1140 tcgattgagg aaatcagaaa aatcaagcgc cttgcactga atggctaa 1188 <210> 3 <211> 1095 <212> DNA <213> BP-AT M gene <400> 3 atggactcat ctaggacaat cgggctgtac tttgattcta cccttccttc tagcaacctg 60 ctagcattcc cgatagtcct acaagacaca ggggacggga agaagcaaat cgccccgcaa 120 tacaggatcc agcgtcttga ctcgtggaca gacagcaaag aagactcggt attcatcacc 180 acctatggat tcatctttca ggttgggaat gaagaagcca ctgtcggcat gatcaatgat 240 aatcccaagc gcgagttact ttccactgcc atgctatgcc tagggagtgt accaaatgtc 300 ggagatcttg ttgagctggc aagggcctgc ctcactatgg tggtaacatg caagaagagt 360 gcaactaaca ccgagagaat ggtcttctca gtagtgcagg caccccaggt gctgcaaagc 420 tgtagggttg tggcaaacaa atactcgtcg gtgaatgcag tcaagcacgt gaaagcacca 480 gagaagattc ctgggagcgg aaccctagag tacaaagtga actttgtctc tctgaccgtg 540 gtgccaagaa aggacgtcta caagatacca actgcagcac ttaaggtctc tggctcaagt 600 ctgtacaatc ttgcgctcaa tgtcactatt gatgtggagg tagacccgaa gagcccgttg 660 gtcaaatccc tttccaagtc cgacagtggg tactatgcta atctcttctt acatattggg 720 cttatgtcca ctgtagataa gaaggggaag aaagtgacat ttgacaagct ggaaaggaag 780 ataaggagac ttgatctatc tgtagggctt agtgacgtgc tcggaccttc cgtgcttgta 840 aaggcgagag gtgcacggac taagctgctg gcacctttct tctctagcag tgggacagcc 900 tgctatccca tagcaaatgc ctctcctcag gtggccaaga tactctggag ccaaaccgcg 960 tacctgcgga gtgtaaaagt cattatccaa gcgggcaccc agcgtgctgt cgcagtgacc 1020 gccgaccacg aggttacctc tactaagctg gagaaggggc ataccattgc caaatacaat 1080 cccttcaaga aatag 1095 <210> 4 <211> 6615 <212> DNA <213> BP-AT L gene <400> 4 atggcgagct ccggtcccga gagggcggag catcagatta tcctaccaga gtcacacctg 60 tcttcaccat tagtcaagca caaactactc tattactgga aattaactgg gctaccactc 120 cctgacgagt gtgacttcga ccacctcatt ctcagccgac aatggaagaa aatacttgaa 180 tcggcctccc ctgacactga gagaatgata aaacttggaa gggcagtgca ccagactctc 240 aaccacaatt ccaagataac cggagtactc catcccaggt gtttagaaga attggctagt 300 attgaggttc ctgactcaac caacaagttt cggaagatcg agaagaaaat ccaaattcac 360 aacacaaggt atggagaact gttcacaaga ctgtgcacgc atgtagagaa gaaattgttg 420 ggatcatctt ggtctaataa tgtcccccgg tcagaagagt tcaacagcat ccgtacagat 480 ccggcattct ggtttcactc aaaatggtcc acaactaagt ttgcatggct ccatataaaa 540 cagattcaaa ggcatctgat tgtggcagca agaacaaggt ccgcagccaa caaattggtg 600 acgctgaccc ataaggtagg ccaagtcttt gttactcctg agcttgtcat tgtgacacat 660 acagatgaga acaagttcac gtgtcttacc caggaacttg tgttgatgta tgcagatatg 720 atggagggca gagatatggt caacataata tcatccacgg cggcacatct caggagccta 780 tcagagaaaa ttgatgacat tctgcggtta gtagatgccc tggcaaaaga tctgggtaat 840 caagtctacg atgttgtagc actcatggag ggatttgcat acggcgccgt ccagctgctt 900 gagccgtcag gtacattcgc aggggatttc ttcgcattca acctgcagga gctcaaagac 960 actttgatcg gcctccttcc taaggatata gcagaatctg tgactcacgc aatagccact 1020 gtattctctg gcttagaaca aaatcaagcg gctgagatgc tgtgcctgtt gcgtctatgg 1080 ggccacccat tacttgagtc ccgtattgcg gcaaaagcag taaggagcca aatgtgcgca 1140 ccaaaaatgg tagactttga tatgatcctc caggtattgt ctttctttaa aggaacaatc 1200 atcaacggat acagaaagaa gaatgcaggt gtttggccac gtgtcaaagt agatacgata 1260 tacgggaagg tcattgggca gctacacgct gattcagcgg agatttcaca cgatatcatg 1320 ttgagagagt acaagagttt atctgcgctt gaattcgagc catgtataga atacgaccct 1380 atcaccaatc tgagcatgtt tctaaaagac aaggcgatcg cacacccgaa agacaactgg 1440 ctcgccgcgt ttaggcgaaa ccttctctct gaggaccaga agaaacatgt aaaggaggca 1500 acctctacta accgtctctt gatagagttc ttagagtcaa atgattttga tccatataag 1560 gagatggaat atctgacgac ccttgagtac ctaagagatg acaatgtggc agtatcatac 1620 tcgctcaagg agaaggaagt gaaggttaat gggcggattt ttgctaagct aacaaagaaa 1680 ttaaggaact gtcaagtgat ggcggaaggg atcttagctg accagattgc acctttcttt 1740 caagggaatg gggtcattca ggatagcata tctttaacca agagtatgct agcgatgagt 1800 caattgtctt tcaacagcaa taagaaacgt atcactgact gcaaagaaag agtagcctca 1860 aaccgcaatc acgatcaaaa gagcaagaat cgtcggagag ttgccacttt tataacgact 1920 gacctgcaaa agtactgtct taattggaga tatcagacaa tcaaactgtt cgctcatgcc 1980 atcaatcagc tgatgggctt acctcacttc ttcgaatgga ttcatctaag actaatggat 2040 actacgatgt ttgtaggaga ccctttcaat cccccaagtg acccaactga ctgtgatctc 2100 tcaagagtcc caaatgatga catatatatt gtcagtgcta gagggggtat tgagggatta 2160 tgtcagaagc tatggacaat gatctcaatt gctgcaatcc aacttgctgc agcaagatca 2220 cattgtcgcg tcgcctgtat ggtacagggt gacaatcaag taatagctgt aacgagagag 2280 gtaaggtcag atgactcccc ggaaatggtg ttaacacaat tgcatcaagc cagtgataat 2340 ttcttcaagg aattgattca tgttaatcat ttgattggcc ataatttgaa ggatcgtgaa 2400 acaatcagat cagacacatt cttcatatac agcaaacgaa tattcaaaga tggagcaata 2460 ctcagtcaag tcctcaaaaa ttcatctaaa ttagtgctaa tatcaggcga ccttagtgaa 2520 aacaccgtaa tgtcctgtgc caacattgca tctactatag cacggctgtg cgagaacggg 2580 cttccaaagg atttctgtta ttacttaaac tacctgatga gttgcgtgca gacatacttt 2640 gattctgagt tttccatcac taacagctcg caccccgatt ctaaccagtc gtggattgaa 2700 gacatctctt ttgtgcactc atatgtcctg acccctgccc agctaggggg actgagcaac 2760 ctccaatact caaggctcta cacgaggaac atcggtgacc cgggaactac tgcttttgca 2820 gagatcaagc gattagaagc agtggggtta ctaagtccta gtattatgac taacatctta 2880 actaggccgc ctggaaatgg agattgggcc agtctgtgta acgaccctta ctctttcaat 2940 tttgagactg tcgcgagtcc aaatattgtc cttaagaaac atacacaaag agtcctattt 3000 gaaacttgtt caaatccctt attatctggc gtgcatacag aggataatga ggcagaagag 3060 aaggcgttgg ctgaattttt actcaatcaa gaagtaattc atccacgtgt cgcacatgct 3120 atcatggaag caagctctat aggtaggagg aagcagattc aagggcttgt tgacacaaca 3180 aacaccgtaa tcaagattgc attgactagg aggccacttg gcatcaagag gctgatgcgg 3240 atagttaact actcgagcat gcatgcaatg ctgtttagag acgatgtttt ctcatctaac 3300 aggtctaacc accccttagt ttcctctaat atgtgttctc tgacgctagc agactatgca 3360 cggaatagaa gctggtcacc attgacgggg ggtagaaaga tactgggtgt atctaatcct 3420 gatactatag aacttgtaga gggtgagatc cttagcgtca gcggaggatg cacaagatgt 3480 gacagcggag atgaacaatt cacttggttc catcttccga gcaatataga actgaccgat 3540 gacaccagca agaatcctcc gatgagagtg ccgtacctcg ggtcaaagac tcaagagagg 3600 agggccgcct cgcttgcgaa aatagctcat atgtcaccac atgtgaaagc tgctctaagg 3660 gcatcgtccg tgttgatctg ggcttatgga gacaacgaag taaattggac tgctgctctt 3720 aaaattgcaa gatctcggtg caatataaac tcagagtatc ttcgactatt gtccccctta 3780 cccacagctg ggaatctcca acatagactg gatgacggca taactcagat gacattcacc 3840 cctgcatctc tctacagggt gtcaccttat attcacatat ccaatgattc tcaaaggtta 3900 ttcacggaag aaggagtcaa agagggaaat gtagtttatc agcaaatcat gctcttgggt 3960 ttatctctaa tcgaatcact cttcccgatg acgacaacca ggacatacga tgagatcaca 4020 ttgcacctcc acagtaaatt tagctgctgt atcagggaag caccggttgc agttcctttc 4080 gagttactcg ggatggcacc agaactaagg acagtgacct caaataagtt tatgtatgat 4140 cctagtcctg tatcggaggg tgactttgcg agacttgact tagctatctt taagagttat 4200 gagcttaatc tagaatcata tcccacaata gagctaatga acattctttc aatatccagc 4260 gggaagttaa tcggccagtc tgtggtttct tatgatgaag atacctccat aaagaatgac 4320 gccataatag tgtatgacaa cacccggaat tggatcagcg aagctcagaa ttcagatgtg 4380 gtccgcctat tcgagtatgc agcacttgaa gtgcttctcg actgttctta tcagctctac 4440 tatctgagag taagaggcct agacaatatc gtgttgtata tgagtgactt atataagaat 4500 atgccaggaa ttctactttc caacattgca gctacaatat ctcatcccat cattcattca 4560 agattgcatg cggtaggcct ggtcaatcac gacgggtcac accaacttgc agacacagat 4620 ttcatcgaaa tgtctgcaaa actattagtc tcttgcactc gacgtgtggt ctcaggttta 4680 tatgcaggga ataagtatga tctgctgttc ccgtctgtct tagatgataa cctgagtgag 4740 aagatgcttc agctgatatc tcggttatgc tgcctgtata cggtgctctt tgctacaaca 4800 agagagatcc cgaaaataag aggcttatct gcagaagaga agtgttcagt acttactgag 4860 tacctactgt cagatgctgt gaaaccatta cttagttctg agcaagtgag ctctatcatg 4920 tctcctaaca tagttacgtt cccagctaat ctatattaca tgtctcggaa gagccttaat 4980 ttgattaggg aaagagagga cagggacact atcttggcat tgttgttccc ccaagagcca 5040 ctacttgagt tccccttagt acaagatatt ggcgctcgag tgaaagatcc attcacccga 5100 caacctgcgg cgtttttaca agaattagat ttgagcgctc cagcaaggta tgacgcattt 5160 acacttagtc aggttcattc tgaacacaca tcaccaaatc 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Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 16 gatcagatga gagccactac a 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 17 agtggacgac atcagtgatg t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 18 caactggcag cgtaggactc g 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 19 gtagaaggtg tgaatctcga g 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 20 gtatgcagga gcacaatcca a 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 21 agcaccttgg tcttcccttg t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 22 atgcggtgtg aaataccgca c 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 23 cttctgacaa cgatcggagg a 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 24 atcgtggtgt cacgctcgtc g 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 25 agtgccacct gacgtctaag a 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 26 agcatacacg acatcgacat g 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 27 tatcttctgg gtcatcactg t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 28 cttatgacca ccgtagatag g 21 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 29 gatgcagaga tcgacgagc 19 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 30 aggcgatatc acagagagta 20 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 31 gtgccccaat tgtgccaag 19 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 32 atacacctcr tcycagacag 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 33 tgccactgmt agttgygata 20

Claims (10)

1. 약병원성 내열성 뉴캣슬병 바이러스 BP-AT 균주의 NP(SEQ ID NO: 1), P(SEQ ID NO: 2), M(SEQ ID NO: 3) 및 L(SEQ ID NO: 4), 및
   강병원성 뉴캣슬병 바이러스 SNU 4152 균주의 F 및 HN 유전자를 포함하고,
   상기 F 유전자의 퓨린 절단 부위 112-RRQKRF-117의 112 및 115 번째 아미노산 서열은 글리신(G)으로 치환되고, 117 번째 아미노산 서열은 류신(L)으로 치환된 것인, 내열성이 향상된 키메라 뉴캣슬병 바이러스(기탁 번호: KCTC12445BP).
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 키메라 뉴캣슬병 바이러스는 50 내지 60℃의 온도에서 열처리 후 60분 이상, 80분 이상, 100분 이상 또는 120분 이상의 시간 동안 감염능을 유지하는 것인, 내열성이 향상된 키메라 뉴캣슬병 바이러스(기탁 번호: KCTC12445BP).
   
3. 제1항 또는 제2항에 따른 내열성이 향상된 키메라 뉴캣슬병 바이러스(기탁 번호: KCTC12445BP), 및 적어도 하나의 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물.
   
4. 제1항 또는 제2항에 따른 내열성이 향상된 키메라 뉴캣슬병 바이러스(기탁 번호: KCTC12445BP)를 포함하는 백신.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 백신은 생독 백신 또는 사독 백신인 것인, 백신.
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