KR102532698B1 - 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신 - Google Patents

뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신 Download PDF

Info

Publication number
KR102532698B1
KR102532698B1 KR1020210037426A KR20210037426A KR102532698B1 KR 102532698 B1 KR102532698 B1 KR 102532698B1 KR 1020210037426 A KR1020210037426 A KR 1020210037426A KR 20210037426 A KR20210037426 A KR 20210037426A KR 102532698 B1 KR102532698 B1 KR 102532698B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ndv
virus
avian
meth
ampv
Prior art date
Application number
KR1020210037426A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220132295A (ko
Inventor
조선희
김태은
Original Assignee
주식회사 바이오포아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 바이오포아 filed Critical 주식회사 바이오포아
Priority to KR1020210037426A priority Critical patent/KR102532698B1/ko
Priority to PCT/KR2022/004093 priority patent/WO2022203404A1/ko
Publication of KR20220132295A publication Critical patent/KR20220132295A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102532698B1 publication Critical patent/KR102532698B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18161—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
    • C12N2760/18334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/91—Cell lines ; Processes using cell lines

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 출원은 조류메타뉴모바이러스(aMPV)에 대한 백신에 관한 것으로서, 자세하게는 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 키메라 바이러스, 바람직하게는 aMPV subtype A의 표면 항원 및 aMPV subtype B의 표면 항원을 동시에 발현하는 키메라 바이러스와, 상기 키메라 바이러스를 이용한 백신 및 조류 면역화 방법에 관한 것으로, 뉴캣슬병 바이러스의 병원성을 결정하는 F 단백질이 10년 이상 국내 외 사용되어 안전성 및 유효성이 검증된 KBNP-C4152 바이러스의 서열과 동일하여 안전하고, aMPV에 대한 항체 형성 효과가 우수하다.

Description

뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신{Avian metapneumovirus vaccine with high tilter using Newcastle virus vector}
본 출원은 조류 메타뉴모바이러스(aMPV)에 대한 백신에 관한 것으로서, 자세하게는 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 키메라 바이러스, 바람직하게는 aMPV subtype A의 표면 항원 및 aMPV subtype B의 표면 항원을 동시에 발현하는 키메라 바이러스와, 상기 키메라 바이러스를 이용한 백신 및 조류 면역화 방법에 관한 것이다.
조류메타뉴모바이러스 (avian metapneumovirus, aMPV)는 2001년 사람에서 최초로 분리 및 보고된 사람 메타뉴모바이러스 (human metapneumovirus)와 함께 파라믹소비리데 과 (Family Paramyxoviridae)의 새로운 genus인 Genus Metapneumovirus에 속하는 바이러스로 분류된다.
과거에는 칠면조 비기관염 (turkey rhinotracheitis), 조류비기관염 (avian rhinotracheitis), 두부 종창증, 조류뉴모 바이러스 감염증 (avian pneumovirus infection) 등으로 불리어 졌는데, 최근 동물보건기구(OIE)는 이 질병을 aMPV 감염증 또는 칠면조 비기관염으로 공식 명명하고 있다.
aMPV 감염증은 aMPV 감염에 의해 발생하며, 닭에서 상부호흡기도 섬모의 감소와 운동성의 소실등을 야기하여 이로 인한 기침, 재채기 등 호흡기 증상, 두부종창증(swollen head syndrome), 산란중인 닭에서의 산란저하 및 비정상 탈색란 생산 등을 유발하는 닭의 호흡기성 바이러스성 전염병으로 양계산업이 있는 대부분의 국가들에서 발생하고 있다.
육용 종계나 산란계에서는 연령에 상관없이 발생하나 시산 또는 산란 피그기 전후에 주로 나타난다. 육계농장에서 흉선이 심하게 위축되어 면역억제소견을 보이는 육계군에서 aMPV가 검출된 바 있으며, 또한 심한 콧물로 사료효율을 저하시키고 복막염 등 만성 호흡기로 지속적인 폐사를 유발한 육용종계군에서도 이 바이러스가 검출되고 있다. 닭에서 aMPV 단독 감염에 의한 임상증상은 뚜렷하게 나타나지는 않지만, aMPV 감염에 의해 손상된 점막 방어기전으로 인해 이차 세균 및 바이러스 감염이 용이하게 일어나게 된다. 따라서 Bordetella spp., Mycoplasma spp., E.coli 와 같은 세균 및 ND, IB 와 같은 바이러스에 의한 2차감염이 발생 할 경우 기낭염, 복막염 및 심각한 호흡기 증상을 유발하여 치사율이 증가된다고 보고되고 있다.
aMPV는 단일 혈청형(single serotype)만 존재하고 있으며 3'-N(nucleocapsid)-P(phospho protein)-M(matrix)-F(fusion)-M2(second matrix)-SH(small hydrophobic)-G(attachment glyco protein)-L(large polymerase)-5'의 순서대로 8개의 유전자 배열로 구성된 single-stranded, negative sense RNA genome을 가지고 있다. G 단백질의 유전자 염기서열을 기초로 A에서 D까지 4개의 유전형(genotype)이 존재한다. 모든 유전형이 발병하는 칠면조와 달리, 닭의 경우 A 및 B 유전형만이 질병 피해를 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다.
국내 가금농장에서 aMPV가 A와 B genotype이 거의 50%정도씩 발생하고 있으나, 백신은 A genotype 혹은 B genotype 단일 백신만 개발되어 이중 1개 genotype의 백신을 접종하여도 사육 중 다른 genotype의 aMPV가 발생해 산란율 감소 및 폐사율 증가에 따른 피해가 확인되고 있어 2 가지 genotype를 함께 예방이 가능한 백신 개발이 절실한 상황이다.
aMPV 생독백신의 경우 서브타입 별 교차방어가 된다고 알려져 있고 현재 해외에는 A 또는 B 각 서브타입 별 단독 생독 및 사독백신이 상용화되어 있는데 생독백신의 경우 백신주의 병원성 회귀에 의한 부작용이 계속 보고되고 있다. 일반적으로 생독백신 접종 후 6일 이내 면역이 발달되기 시작하여 14주까지 humoral antibodies가 지속되며(Avian Pathol. 18, 523-534., Vet. Rec. 136, 392-393.) 감염에 대해서는 22주까지 방어가 가능하다고 알려진 바 있다.
미국 및 프랑스에서는 aMPV에 대한 약독화 생독백신이 개발되어 상용화되어 있는데 백신주의 병원성 회귀에 의한 부작용이 계속 보고되고 있으며, 특히 단 한 개의 아미노산 변이에 의해서도 병원성이 증가하는 등 생독백신의 안전성이 계속 문제가 되고 있다. 국내에서는 백신바이러스의 병원성회귀로 인한 부작용의 우려로 aMPV 생독백신의 허가는 이루어지지 않고 있으며, 현재 A 또는 B 각 서브타입에 따른 단독 사독백신이 상용화되어 있다.
국내 상용화된 사독백신의 경우 야외에서 분리한 바이러스를 일반적인 세포배양법으로 배양한 후 불활화(불활성화)한 형태로 뉴모바이러스의 특성상 BHK-21(Baby Hamster Kidneys), CEF(Chicken Embryo Fibroblast), CER(Chicken Embryo Related gene) 등 일반적으로 바이러스 배양에 사용되는 다양한 세포에서 최대 생산역가 106TCID50/ml로 충분한 면역반응 유도에 요구되는 사독백신 항원 양(106 TCID50/수)을 맞추기는 사실상 불가능하다. 일례로, 국내 상용화된 aMPV 사독백신(고려비앤피 힘백달구방 뉴모오일백신)의 경우 국내 야외농장에서 분리한 바이러스를 Vero 세포(원숭이 신장 세포)에 접종하여 배양한 후 불활화한 백신으로, 백신 개발 과정에서 바이러스 함량 별로(103~106 TCID50) 백신을 접종한 후 주별로 항체가를 관찰하고 백신군에 대해 공격실험을 진행한 결과 효과적인 방어에 적합한 항원량은 106 TCID50/ml임을 정의내린 바 있다(특허공개번호 10-2015-0001558)
또한 A 또는 B 각 서브타입 한 가지에 대한 사독백신만이 판매되고 있는데 사독백신의 경우 생독백신과는 달리 서브타입 별 교차방어 효과가 현저히 떨어지기 때문에 한 가지 서브타입 백신 사용으로는 aMPV의 감염을 효과적으로 방어하기 어렵다.
본 출원의 일 예는 뉴캣슬병 바이러스 게놈; 및
서브타입(subtype) A형의 조류메타뉴모바이러스(aMPV)의 표면항원인 F 단백질을 암호화하는 유전자 및 서브타입(subtype) B형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원인 F 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하며,
상기 서브타입 A형 및 서브타입 B형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원을 모두 발현하는, 키메라 바이러스에 관한 것이다.
본 출원의 다른 예는 상기 키메라 바이러스, 및 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 조류메타뉴모바이러스 감염증, 또는 조류메타뉴모바이러스 감염에 의한 조류 질병의 면역화용 조성물에 관한 것이다.
본 출원의 또 다른 예는 상기 면역화용 조성물을 조류에 투여하여 면역화를 유도하는 단계를 포함하는, 조류의 면역화 방법에 관한 것이다.
본 출원에서, 야생형 뉴캣슬병 바이러스를 분리하여 이를 기본골격(backbone)으로 하여, 재조합 뉴캣슬병 바이러스 게놈 전사벡터 (뉴캣슬병 바이러스 벡터)를 제조하고, 상기 제조한 재조합 뉴캣슬병 바이러스 게놈 전사벡터의 유전자 사이에 인공적으로 합성한 서브타입 A형 및/또는 서브타입 B형의 조류메타뉴모바이러스 F 단백질(항원)을 암호화하는 유전자를 도입하여, 서브타입 A형 및/또는 서브타입 B형의 조류메타뉴모바이러스 항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 (키메라 바이러스)를 제조하였다.
이하, 본 출원을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 출원의 일 예는 뉴캣슬병 바이러스 게놈; 및
서브타입(subtype) A형의 조류메타뉴모바이러스(aMPV)의 표면항원인 F 단백질을 암호화하는 유전자 및 서브타입(subtype) B형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원인 F 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하며,
상기 서브타입 A형 및 서브타입 B형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원을 모두 발현하는, 키메라 바이러스에 관한 것이다.
상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈은 3’에서 5’방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다. (NP 단백질: nucleocapsid protein, P 단백질: phosphoprotein, M 단백질: matrix protein, F 단백질: fusion protein, HN 단백질: hemagglutinin-neuraminidase protein, L 단백질: large polymerase protein)
상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈은, 상기 NP 단백질을 암호화하는 유전자의 5’말단에 연결된 T7 프로모터 (T7 promoter), 리더 서열 (leader sequence), 및 3’UTR (3’ untranslated region) 서열을 추가로 포함할 수 있으며; 및/또는,
상기 L 단백질을 암호화하는 유전자의 3’말단에 5’UTR (5’ untranslated region), 트레일러 서열 (trailer sequence), 및 T7 종결 서열 (T7 terminator sequence)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 뉴캣슬병 바이러스는 기탁번호 KCTC13595BP를 갖는 것일 수 있다.
상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈은, 야생형 뉴캣슬병 바이러스를 분리하여 이를 기본골격(backbone)으로 하여, 재조합 뉴캣슬병 바이러스 게놈 전사벡터 (뉴캣슬병 바이러스 벡터)를 제조하고, 이로부터 전사된 것일 수 있다.
상기 야생형 뉴캣슬병 바이러스는 발육란에서 증식성이 우수하고, 높은 온도에서 열처리했을 경우에도 생존하는 내열성 바이러스일 수 있다. 예컨대, 상기 야생형 바이러스는 50 내지 60℃에서, 예컨대 56℃에서 10분 이상, 15분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 35분 이상, 40분 이상, 45분 이상, 50분 이상 또는 60분 이상 열처리하여도 혈구잉집능력 및/또는 CEK 초대세포에서의 세포감염능이 우수한 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 야생형 바이러스는 7형 뉴캣슬병 바이러스 8006주 (7형 NDV-8006)일 수 있다.
또한 상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 게놈은, 야생형 뉴캣슬병 바이러스에서 병원성을 가지는 F 단백질을 암호화하는 유전자의 일부가 변이되어, 비병원성을 나타내도록 변이된 것일 수 있다. 구체적으로, 야생형 뉴캣슬병 바이러스의 F 단백질의 cleavage site 서열은 112번째부터 117번째까지의 아미노산이 112-RRQKRF-117이나, 본 출원에서 제조한 재조합 뉴캣슬병 바이러스 게놈은 112-GRQARL-117을 암호화하는 것으로 변이되어, 이 경우 2번 이상의 점돌연변이를 거쳐야 염기성 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변하여 병원성을 나타낼 수 있도록 하여, 안전성을 확보한 것일 수 있다. 이는 10년 이상 국내외 사용되어 안전성 및 유효성이 검증된 KBNP-C4152 바이러스의 서열과 동일한 것으로 매우 안전한 형태의 비병원성 아미노산을 암호화하는 코돈을 갖도록 디자인하여 합성한 것이다.
상기 서브타입 A형 및/또는 서브타입 B형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원은 닭으로부터 분리한 조류메타뉴모바이러스에서 유래된 것일 수 있다.
상기 서브타입 A형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원인 F 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 서브타입 B형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원인 F 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈은 3’에서 5’방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것이며,
1) 상기 서브타입 A형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원인 F 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴캣슬병 바이러스의 P 단백질을 암호화하는 유전자와 M 단백질을 암호화하는 유전자 사이에 위치하고, 및
상기 서브타입 B형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원인 F 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴캣슬병 바이러스의 M 단백질을 암호화하는 유전자와 F 단백질을 암호화하는 유전자 사이에 위치하는 것일 수 있다.
상기 키메라 바이러스는 기탁번호 KCTC13574BP를 갖는 서브타입 A형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원, 및 기탁번호 KCTC13575BP를 갖는 서브타입 B형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원을 발현하는 것일 수 있다.
상기 키메라 바이러스는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 키메라 바이러스는 기탁번호 KCTC14452BP를 갖는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 예는 상기 키메라 바이러스, 및 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 조류메타뉴모바이러스 감염증, 또는 조류메타뉴모바이러스 감염에 의한 조류 질병의 면역화용 조성물에 관한 것이다.
또 다른 예는, 상기 면역화용 조성물을, 조류에 투여하여 면역화를 유도하는 단계를 포함하는, 조류의 면역화 방법에 관한 것이다.
상기 면역화용 조성물은 조류메타뉴모바이러스로부터 발현되는 관심의 항원 또는 면역원에 대해 면역 반응을 유발시키는 임의의 조성물을 의미하는 것으로, 예를 들면, 대상에 투여될 후 관심의 표적 면역원 또는 항원에 대해 면역 반응을 유발시킬 수 있는 조성물이며, 예컨대 백신일 수 있다. 상기 백신은 생독백신, 사독백신, 서브유니트 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 및 DNA 백신으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 면역화용 조성물은 불활성화된 형태인 백신일 수 있다.
상기 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 당업계에 잘 알려져 있는 것으로, 예를 들면, 살균수, 식염수 용액 또는 인산염 완충액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 면역화용 조성물은 항원 보강제를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 항원 보강제는 알루미늄 유래 항원보강제, 사포닌, 미네랄 겔, 다가음이온, 플루로닉 폴리올, 사포닌 유도체, 리소레시틴 등의 표면 활성 물질, 글리코시드, 모든 유형의 오일 및 이들의 조합일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 면역화용 조성물은 수-중-유-중-수 에멀젼을 포함하는 것일 수 있다.
상기 면역화용 조성물은 조류메타뉴모바이러스 입자 그 자체로 사용할 수도 있지만, 수의학적으로 허용가능한 매개체 내에 장입하여 사용하거나, 부형제로서 선택적으로 어쥬번트(adjuvant)를 보충하여 사용할 수 있다. 상기 매개체로 아데노바이러스, 허피스바이러스, 폭스바이러스 등과 같은 전달매개체를 사용할 수 있으나 이에만 한정되는 것은 아니다. 상기 어쥬번트로 수산화알루미늄, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물 및 알케닐유도체의 중합체 등을 사용할 수 있다. 상기 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체는 당 또는 폴리알코올의 폴리알케닐 에테르로 가교결합된 것일 수 있다.
상기 백신은 o/w (oil in water) 에멀젼 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 상기 o/w 에멀젼은 액체 파라핀 경유; 스쿠알란, 스쿠알렌 등의 이소프레노이드 오일; 이소부텐 또는 데센의 존재 하에 알켄의 올리고머화로 얻어지는 오일; 선형 알킬기를 함유하는 산 또는 알코올의 에스테르; 식물유, 에틸올레이트, 프로필렌글리콜 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴트리(카프릴레이트/카프레이트), 또는 프로필렌글리콜 디올레이트; 분지형의 지방산 알코올 또는 산의 에스테르, 예컨대 이소스테아르산의 에스테르 등을 기본으로 할 수 있다.
에멀젼을 형성하기 위하여 상기 오일은 유화제와 혼합되어 사용될 수 있으며, 상기 유화제는 비이온성 계면활성제, 소르비탄, 만나이드, 글리세롤, 폴리글리세롤 또는 프로필렌글리콜의 에스테르, 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르; 선택적으로 에톡시화되어 있는 올레산, 이소스테아르산, 리신올레산; 또는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 면역화용 조성물이 투여되는 조류는, 조(Aves) 강에 속하는 임의의 모든 가내 및 야생 조류를 의미하는 것으로, 신조상목 및 치조상목을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 신조상목은 기러기목, 칼새목, 부세로포메스, 쏙독새목, 도요목, 황새목, 쥐새목, 비둘기목, 파랑새목, 뻐꾸기목, 매목, 갈벌리포메스, 닭목, 아미목, 두루미목, 무소파기포메스, 오피스토코미포메스, 참새목, 다라새목, 홍학목, 딱다구리목, 논병아리목, 바다제비목, 앵무목, 펭귄목, 올빼미목, 벌새목, 비단날개새목, 세가락메추라기목 및 후투티목 등을 포함할 수 있다. 치조상목은 키위새목, 화식조목, 공조목, 레아목, 타조목 및 티니아미포메스 등을 포함하며, 바람직하게는 닭일 수 있다. 상기 조류는 성숙 조류, 조류 새끼 및 조류 배아/난을 포함할 수 있다.
상기 면역원성 조성물은 발육종란내(In Ovo), 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 결막 및 피하경로로 이루어지는 군에서 선택되는 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 우수한 내열성을 갖기 때문에, 음용수를 통하는 것 또는 분무와 같이 농업적 목적을 위한 집단 투여의 경로에 적합할 수 있다.
상기 면역원성 조성물은 조류에게 접종(생독 접종(분무 또는 음수 접종) 또는 사독 접종(피하 또는 근육 접종)을 포함한다)하는 경우, 100.1 EID50 내지 1010.0 EID50, 100 EID50 내지 1010.0 EID50, 101.0 EID50 내지 1010.0 EID50, 102.0 EID50 내지 1010.0 EID50, 103.0 EID50 내지 1010.0 EID50, 104.0 EID50 내지 1010.0 EID50, 105.0 EID50 내지 1010.0 EID50, 106.0 EID50 내지 1010.0 EID50, 107.0 EID50 내지 1010.0 EID50, 108.0 EID50 내지 1010.0 EID50, 109.0 EID50 내지 1010.0 EID50, 100.1 EID50 내지 109.0 EID50, 100 EID50 내지 109.0 EID50, 101.0 EID50 내지 109.0 EID50, 102.0 EID50 내지 109.0 EID50, 103.0 EID50 내지 109.0 EID50, 104.0 EID50 내지 109.0 EID50, 105.0 EID50 내지 109.0 EID50, 106.0 EID50 내지 109.0 EID50, 107.0 EID50 내지 109.0 EID50, 108.0 EID50 내지 109.0 EID50, 100.1 EID50 내지 108.0 EID50, 100 EID50 내지 108.0 EID50, 101.0 EID50 내지 108.0 EID50, 102.0 EID50 내지 108.0 EID50, 103.0 EID50 내지 108.0 EID50, 104.0 EID50 내지 108.0 EID50, 105.0 EID50 내지 108.0 EID50, 106.0 EID50 내지 108.0 EID50, 107.0 EID50 내지 108.0 EID50, 100.1 EID50 내지 107.0 EID50, 100 EID50 내지 107.0 EID50, 101.0 EID50 내지 107.0 EID50, 102.0 EID50 내지 107.0 EID50, 103.0 EID50 내지 107.0 EID50, 104.0 EID50 내지 107.0 EID50, 105.0 EID50 내지 107.0 EID50, 106.0 EID50 내지 107.0 EID50, 100.1 EID50 내지 106.0 EID50, 100 EID50 내지 106.0 EID50, 101.0 EID50 내지 106.0 EID50, 102.0 EID50 내지 106.0 EID50, 103.0 EID50 내지 106.0 EID50, 104.0 EID50 내지 106.0 EID50, 105.0 EID50 내지 106.0 EID50, 100.1 EID50 내지 105.0 EID50, 100 EID50 내지 105.0 EID50, 101.0 EID50 내지 105.0 EID50, 102.0 EID50 내지 105.0 EID50, 103.0 EID50 내지 105.0 EID50, 104.0 EID50 내지 105.0 EID50, 100.1 EID50 내지 104.0 EID50, 100 EID50 내지 104.0 EID50, 101.0 EID50 내지 104.0 EID50, 102.0 EID50 내지 104.0 EID50, 103.0 EID50 내지 104.0 EID50, 100.1 EID50 내지 103.0 EID50, 100 EID50 내지 103.0 EID50, 101.0 EID50 내지 103.0 EID50, 102.0 EID50 내지 103.0 EID50, 100.1 EID50 내지 102.0 EID50, 100 EID50 내지 102.0 EID50, 101.0 EID50 내지 102.0 EID50, 100.1 EID50 내지 101.0 EID50, 100 EID50 내지 101.0 EID50, 또는 100.1 EID50 내지 100 EID50의 양으로 접종하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에 따른 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신은 서브타입 A형 및 B형의 aMPV의 F 표면항원을 동시에 발현한 것으로, 뉴캣슬병 바이러스의 병원성을 결정하는 F 단백질이 10년 이상 국내 외 사용되어 안전성 및 유효성이 검증된 KBNP-C4152 바이러스의 서열과 동일하여 안전하고, aMPV에 대한 항체 형성 효과가 우수하다.
도 1은 분리된 뉴캣슬병 바이러스 6종, NDW 바이러스 및 LaSota 바이러스의 열처리 후 혈구응집능을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 분리된 뉴캣슬병 바이러스 6종, NDW 바이러스 및 LaSota 바이러스의 열처리 후 세포감염능을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 7형 뉴캣슬병 바이러스의 RNA 게놈 염기서열 분석을 위한 프라이머의 해당 증폭부위를 나타낸다.
도 4는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 게놈 전사벡터의 프라이머 설계 부위를 나타낸다.
도 5는 transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응여부를 확인하기 위해, 재조합 뉴캣슬병 바이러스의 RT-PCR를 통한 바이러스 유무를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 재조합 뉴캣슬병 바이러스의 주요 항원부위를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 및 도 7b는 aMPV subtype A의 F 단백질을 암호화하는 유전자 및 대표 서열을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8c는 aMPV subtype B의 F 단백질을 암호화하는 유전자 및 대표 서열을 나타낸다.
도 9는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 발현벡터에 aMPV subtype A 및 B의 F 단백질을 암호화하는 유전자가 도입되는 위치를 나타낸다.
도 10은 최종 제작된 키메라 바이러스 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF의 게놈 구조를 나타낸다.
도 11은 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스를 발육란에서 20대까지 계대배양한 후 주요 단백질 부위의 변이가 없음을 확인한 결과이다.
도 12는 aMPV subtype A의 F 단백질을 암호화하는 합성유전자 서열을 나타낸다.
도 13은 aMPV subtype B의 F 단백질을 암호화하는 합성유전자 서열을 나타낸다.
도 14는 재조합 뉴캣슬병 바이러스의 작출 과정의 모식도를 나타낸다.
도 15는 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 재조합 ND 바이러스 작출을 확인한 것이다.
도 16은 재조합 ND 바이러스 주요 항원부위 확인 RT-PCR로 확인한 것이다.
도 17은 닭 적혈구 응집반응을 통하여 재조합 ND 바이러스 작출을 확인한 것이다.
하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1. 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터 제조.
실시예 1-1. 뉴캣슬병 바이러스의 선별.
2008년 5월 29일 경기도 용인시 처인구 소재 종계 농가(6계동, 37,000수 규모)에서 ㈜바이오포아 병성감정기관에 의뢰한 샘플로부터 7형 강병원성주의 항원성을 갖는 뉴캣슬병 바이러스를 분리하였다. (분리된 7형 뉴캣슬병 바이러스 6종: NDV-8006, NDV-0164, NDV-2108, NDV-5076, NDV-6014 및 NDV-4152.)
의뢰농가 6계동 전체에서 높은 폐사(매일 40여수씩 폐사 발생)와 함께 심한 산란율 저하가 보였으며(산란율이 68-70% 수준에서 정체됨) 수의사 현장부검 당시 암탉 2수, 수탉 1수 모두에 공통적으로 복막염과 선위출혈이 확인되었고 수탉에서는 청색증, 심한 기관지 출혈과 함께 기관내강에 저류된 삼출물이 관찰되었고 요산침착증 소견이 보였다. 현장부검에서 개체별로 채취한 기관 및 맹장편도를 멸균 PBS로 고형물이 10%가 되도록 유제한 후 NDV pathotyping RT-PCR을 실시한 결과 양성반응을 보였다. 유제액을 계태아 섬유아세포(CEF) 상에서 3회 플라크 정제를 수행하여 클로닝하였고, SPF 발육란에서 2회 계대배양하여 바이러스를 분리하였다.
상기 분리된 바이러스의 F 유전자 다양성부위(384bp)에 대해 Neighbor-Joining 법을 이용한 결과 7d 형에 속함을 확인하였다.
이 중에서, 분무용 생백신주로 사용하기 위해 발육란에서 증식성이 우수하고, 높은 온도(56℃)에서 열처리했을 경우에도 생존하는 내열성 바이러스를 선별하였다.
선별 방법으로, 분리된 바이러스 6종은 시판백신주인 NDW (Newcastle Disease virus Ulster strain, 내열성 뉴캣슬병 백신주로 알려짐.) 및 Lasota 바이러스와 함께 56℃로 열처리 후 1) 혈구응집능력을 평가하여 표면 단백질의 안정성을 비교하고 2) CEK 초대세포에서의 세포감염능을 비교하여 내열성을 최종적으로 확인하였다.
1) 뉴캣슬병 바이러스의 열처리 후 혈구응집능 비교
분리된 6종의 뉴캣슬병 바이러스를 56℃에서 열처리한 후, 닭의 적혈구에 대한 응집반응을 확인하여 표면 단백질의 열에 대한 안정성을 비교하였다. 이를 그래프로 표시하여 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 7형 뉴캣슬병 바이러스 중 NDV 8006 바이러스주(7형 NDV-8006)가 열처리 후 혈구응집능이 45분까지 유지되어, 분리된 7형 뉴캣슬병 바이러스 중 가장 우수할 뿐 아니라, 내열성 뉴캣슬병 백신주로 알려진 NDW 바이러스보다도 우수함을 확인하였다.
2) 뉴캣슬병 바이러스의 열처리 후 세포감염능 비교
분리된 6종의 뉴캣슬병 바이러스를 56℃에서 열처리한 후, CEK 초대세포(primary chicken embryo kidney cells)에 감염하고, 바이러스 증식에 의한 CPE(cytopathic effect, 세포병변효과)를 확인하여 열에 대한 안정성을 비교하였다. 이를 그래프로 표시하여 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, NDV 8006 바이러스주가 열처리 후 세포감염능이 40분까지 유지되어, 분리된 7형 뉴캣슬병 바이러스 중 가장 우수할 뿐 아니라, NDW 바이러스와 동등한 수준임을 확인하였다.
따라서 6종의 7형 뉴캣슬병 바이러스 중 NDV 8006 바이러스주(7형 NDV-8006)를 기본골격(backbone) 바이러스로 선정하였다.
실시예 1-2. 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터 제조.
발육란에서 고역가로 증식하며 내열성을 갖는 NDV 8006 바이러스주를 기본골격(backbone)으로 하는 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 제작하였다.
1) 7형 뉴캣슬병 바이러스의 RNA 게놈 염기서열 분석
GenBank에 등록되어 있는 7형 뉴캣슬병 바이러스 서열을 다중 정렬하여 공통적으로 특이적인 프라이머 세트를 제작하였다. 15,210bp 게놈을 6개의 중첩되는 단편으로 나누어 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 제작하였다. 바이러스 게놈 RNA의 3'-말단 및 5'-말단을 제외한 전체 부분을 각각의 프라이머를 이용하여, cDNA 합성 및 PCR 증폭한 후 폴리뉴클레오티드 서열을 분석하였고, 3' 및 5' 말단 폴리뉴클레오티드 서열은 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 방법을 사용하여 해당 부분에 대한 cDNA 합성 및 PCR 증폭하여 폴리뉴클레오티드 서열 분석을 진행하였다.
반응에 사용된 프라이머를 아래 표 1에 정리하였고, 염기서열 분석을 위한 프라이머의 해당 증폭부위를 도 3에 나타내었다.
Position Oligonucleotide Primer sequence (5' -> 3') 서열번호
3'-RACE NDV C7d-NP-754R CAAGTTGTAATATGTAGAGC 서열번호 4
751-3,570 NDV C7d-NP-801-F GAAGAAGTACATCCTTCATC 서열번호 5
NDV C7d-P gene-366R GTCGAGCATGGACAGAAGG 서열번호 6
NDV C7d-P-2268-F AGACCAGCGACACACAGCTC 서열번호 7
NDV-C7d-M-3621-R AGCTCGTGCCTGGGATTGTC 서열번호 8
3,443-5,101 NDV C7d-M-130F CAGCGTCTTGATTCGTGGAC 서열번호 9
NDV-C7d-F-realTime-R GTGTTCTGTTATATGCCTCC 서열번호 10
NDcomR/ptR TGCCACTGMTAGTTGYGATA 서열번호 11
4,723-7,613 NDcom156/f ATACACCTCRTCYCAGACAG 서열번호 12
NDV C7d-HN-62R CATGTGTTCTTTGCTTCTC 서열번호 13
NDV C7d-F 912F GACCTTATCTGTAAGTACA 서열번호 14
SF-7575R TTAGGTGGAATAGTCAGCACC 서열번호 15
7,053-9,616 NDV C7d-HN-7102-F AGCACTTGGTGTGCTTCGG 서열번호 16
NDV C7d-L gene 65R GAGGATAGATGTGACTCTGG 서열번호 17
NDV C7d-L gene 1212R GTATCCATTGATGATTGTTC 서열번호 18
8,520-11,945 NDV C7d-L-8569-F CGCTTCCTGATGAATGCG 서열번호 19
NDV-All-10772-R ATTATCACTGGCTTGATGCA 서열번호 20
NDV C7d-L-10018-F TGGAATACCTGACAACCCTC 서열번호 21
NDV C7d-L-11495-R CATCAGTCAGCTCTATATTGC 서열번호 22
11,598-14,992 NDVC7d-L-3193-F AGATTGCACTGACTAGGAGG 서열번호 23
NDV C7dCND-L-3512F ATCTTCCAAGCAATATAGA 서열번호 24
NDV C7dCND-L-5373R GATGCCTTATACCAAGA 서열번호 25
NDV C7dCND-L-5068F ATTGGTGCTCGAGTGAAAG 서열번호 26
C7d-Lgene-6588R CTTGGCAGCATTACCTATG 서열번호 27
5'-RACE NDV C7d-L-14931-F AGCGGTCCTGGGTATTACTA 서열번호 28
2) NDV 8006 바이러스주를 기본골격(backbone)으로 하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 게놈 전사 벡터 제조
분석된 NDV 8006 바이러스의 전체 유전자를 8개의 단편(S1 내지 S8)으로 나누어 인공적으로 합성하였다. 모든 합성유전자는 제조사로부터 pBHA vector에 클로닝되어 제공받았다. 각 단편에는 해당 위치의 뉴캣슬병 바이러스 단백질을 암호화하는 서열 및 발현벡터 도입에 필요한 제한효소 인식부위를 부가하였다.
진핵 발현 숙주세포 내에서 전사 및 해독 발현조절을 위해 S1 단편에는 T7 promoter와 3' UTR 서열을, S8 단편에는 5'UTR와 T7 terminator 서열을 추가로 부가하였다. 특히 NDV의 cDNA로부터 바이러스를 만들어낼 때 바이러스 게놈의 5'과 3' 양쪽 끝에 불필요한 염기의 첨가없이 바이러스 게놈과 똑같은 구조로 전사되도록 T7 프로모터를 전사개시부 바로 앞에 위치하도록 하였고, NDV 안티게놈 RNA 직후에는 간염 델타 바이러스(Hepatitis delta virus : HDV) ribozyme RNA 서열을 위치시켜 self cleavage가 일어날 수 있도록 하였으며, T7 promoter와 3' UTR 사이, 5'UTR과 T7 terminator 사이에는 바이러스 비전사 영역인 리더(leader, 20nt) 및 트레일러(trailer, 22nt)를 각각 위치시켜 게놈 RNA의 복제, 바이러스의 encapsidation 및 packaging을 제어하도록 하였다.
재조합 뉴캣슬병 바이러스의 F(fusion) 유전자의 절단부위(cleavage site) 서열은 10년 이상 국내외 사용되어 안전성 및 유효성이 검증된 KBNP-C4152 바이러스의 서열과 동일하게 매우 안전한 형태의 비병원성 아미노산을 암호화하는 코돈을 갖도록 디자인하여 합성하였다. 즉 절단부위 서열이 -112-GRQARL-117-으로, 비병원성 아미노산을 암호화하는 코돈을 갖도록 디자인하여 2번 이상의 점 돌연변이를 거쳐야 염기성 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변하여 병원성을 나타낼 수 있는 매우 안전한 형태로 합성하였다.
S2-S8까지 모든 합성유전자는 S1 pBHA vector 내 작성해 놓은 다중 제한효소 부위를 이용하여 순차적으로 도입하였고 각 도입단계마다 연결부위 전과 후에 위치하는 프라이머 조합으로 PCR하여 새롭게 도입된 유전자를 확인하였다. NDV 8006 바이러스 게놈 전사벡터 클로닝의 단계별 연결확인 프라이머 세트는 아래 표 2에 요약하였고, 프라이머 설계 부위를 도 4에 나타내었다. 연결부위가 확인된 NDV 게놈 전사 벡터는 표 3에 요약된 프라이머 세트로 전체 염기서열을 확인하였다.
연결확인부위 Oligonucleotide Primer sequence (5' -> 3') Amplicon
size(bp) 		서열번호
S1-S2 NDV C7d-178delta NgoMIV-IF TACCAATGGCCGCCCTCTGCCAACT 2,162 서열번호 29
NDV C7d-Pgene-366R GTCGAGCATGGACAGAAGG 서열번호 30
S2-S3 NDV C7d-NP-1576-F ATCCTGCACAGAGCACCA 2,044 서열번호 31
NDV-C7d-M-3621-R AGCTCGTGCCTGGGATTGTC 서열번호 32
S3-S4 NDcom156/f ATACACCTCRTCYCAGACAG 875 서열번호 33
NDV C7d+Ampv-8563R CCAGATCGGACTCTATACAG 서열번호 34
S4-S5 NDV C7d-HN-7102-F AGCACTTGGTGTGCTTCGG 1,863 서열번호 35
NDV-all-L-511R TGGACCATTTTGAGTGAA 서열번호 36
S5-S6 NDV C7d-L-10018-F TGGAATACCTGACAACCCTC 776 서열번호 37
NDV-All-10772-R ATTATCACTGGCTTGATGCA 서열번호 38
S6-S7 NDVC7d-L-3193-F AGATTGCACTGACTAGGAGG 2,080 서열번호 39
NDV C7dCND-L-5373R GATGCCTTATACCAAGA 서열번호 40
S7-S8 NDV C7dCND-L-5068F ATTGGTGCTCGAGTGAAAG 1,521 서열번호 41
C7d-Lgene-6588R CTTGGCAGCATTACCTATG 서열번호 42
Position Oligonucleotide Primer sequence (5' -> 3') 서열번호
NP T7-pro-new CTTAATACGACTCACTATAGG 서열번호 43
NP-P NDV C7d-NP-801-F GAAGAAGTACATCCTTCATC 서열번호 44
NDV C7d-NP-1576-F ATCCTGCACAGAGCACCA 서열번호 45
P NDV C7d-P-2268-F AGACCAGCGACACACAGCTC 서열번호 46
P-M NDV-C7d-M-339-R CATGGTGAGGCAGGCTCTC 서열번호 47
M NDV-C7d-M-1F ATGGACTCATCCAGGACA 서열번호 48
M-F NDV-C7d-M-856F CGGACTAAGCTACTTGCTCCT 서열번호 49
NDV-C7d-F-realTime-R GTGTTCTGTTATATGCCTCC 서열번호 50
F NDV-C7d-Fgene-7536F TATCCGTCTGACAAGCTCT 서열번호 51
F-HN NDV C7d-F-5704-F TGAGCGGCAACACATCAGC 서열번호 52
HN NDV-all-HN-948R AACTGGGAACCATACACG 서열번호 53
NDV C7d-HN-7102-F AGCACTTGGTGTGCTTCGG 서열번호 54
HN-L NDV C7d-HN-7834-F AGGTAGTGTCCCTTGCCAG 서열번호 55
L NDV C7d-L-8569-F CGCTTCCTGATGAATGCG 서열번호 56
NDV C7d-L-9288-F AGGTAATCAAGTCTATGATG 서열번호 57
NDV C7d-L-10018-F TGGAATACCTGACAACCCTC 서열번호 58
NDV C7d-11842R CTGTCAGGGGTGACCAGCT 서열번호 59
NDV C7d-L-11495-R CATCAGTCAGCTCTATATTGC 서열번호 60
NDV C7d-L-3106F CGTGTCGCACATGCTATCATGG 서열번호 61
NDV C7d-L-12507-F CGAGAAGCGCCTGTTGCGGT 서열번호 62
NDV C7d-L-13307-F CACTGAGTATCTACTGTCAG 서열번호 63
NDV C7d-L-6588 CTTGGCAGCATTACCTATGG 서열번호 64
L-T7 terminator NDV C7d-L-14931-F AGCGGTCCTGGGTATTACTA 서열번호 65
Vector-ori-AmpR pBHA-ORI-142F CTTACCGGATACCTGTCCGC 서열번호 66
T7 promoter-3-leader-NP NDV C7d-178delta NgoMIV-IR AGTTGGCAGAGGGCGGCCATTGGTA 서열번호 67
실시예 1-3. 재조합 뉴캣슬병 바이러스의 작출 및 확인
3) 재조합 뉴캣슬병 바이러스의 작출
Hep-2세포 주를 6well 플레이트에 80% 가량 키워놓은 후, vaccinia T7 바이러스를 감염시켰다. 이후 세포주에 T7 promoter에 의해 개시되어 단백질이 발현되는 pCR-TM-NP, pCR-TM-P, pCR-TM-L 플라스미드 벡터 3개와 T7 promoter에 의해 개시되어 HDV 라이보자임에 의해 스스로 절단되어 정확하고 완전한 전체 키메라 내열성 NDV 게놈을 만들어 낼 수 있는 플라스미드인 NDV C7d-H5N6-HANA pBHA을 준비하였다. 각각을 1:1:0.1:1 비율로 섞어 LipofectamineTM(Invitrogen. co)과 적정 비율로 혼합하여 트랜스펙션하였다. 이후 1ug/ml의 acetylated trypsin을 첨가하여 내열성 비병원성 재조합 바이러스가 생성되어 감염성을 갖도록 하였다. 2-3일간 37℃에서 배양한 후 6 well의 세포를 수확하여 11일령의 SPF 발육란에 접종하여 감염성 NDV를 얻었다.
4) 재조합 뉴캣슬병 바이러스의 확인 실험
11일령 SPF 발육란 접종 후 24시간마다 검란을 실시하여 중사란을 확인하고, 접종 72시간 후 접종란을 4℃ 냉장한 후 요막강액을 채취하여 바이러스 확인실험을 실시하였다.
요막강액 150㎕에 Viral Gene-spin™ Viral DNA/RNA Extraction Kit(intron) lysis buffer 150㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 실온에서 10분간 정치하였다. 여기에 다시 binding buffer 300㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 column에 loading하고 washing buffer A, B를 사용하여 차례로 column을 세척하고 elution buffer로 column에 부착되어있는 RNA를 용해시켰다.
추출한 재조합 뉴캣슬병 바이러스의 RNA 2㎕를 다음 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 ONE-STEP RT-PCR Kit(iNtRON)로 45℃/5min-(94℃/20sec-50℃/15sec-72℃/30sec) 30cycles 조건하에서 RT-PCR 하여 바이러스의 유무를 확인하였으며, transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응을 확인하기 위하여 추출한 RNA를 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 MG-taq polymerase(MGmed)로 하기의 조건하에서 PCR하여 확인하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다:
바이러스 NDV F 유전자 확인 RT-PCR:
45℃/5min-(94℃/20sec-50℃/15sec-72℃/30sec) 30cycles
False positive 확인 PCR:
(94℃/20sec-50℃/15sec-72℃/30sec) 30cycles
primer sequence (5’ -> 3’)
NDVcomF: ATACACCTCRTCYCAGACAG (서열번호 68)
NDVcomR: TGCCACTGMTAGTTGYGATA (서열번호 69)
상기 프라이머 세트로 NDV F 유전자에 대한 확인이 완료된 바이러스는 NDV 주요 항원부위에 대하여 4종 RT-PCR 후 염기서열 분석하여 확인하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 사용한 프라이머를 아래 표 4에 정리하였다. 확인이 완료된 바이러스는 BP-NDV-C7d라고 명명하고 KCTC 생물자원센터에 2019년 7월 23일자로 기탁하여 KCTC13595BP 기탁번호를 수여받았다.
바이러스 NDV F 유전자 확인 RT-PCR 조건:
45℃/5min-(94℃/20sec-50℃/20sec-72℃/1min 20sec) 30cycles
No. Oligonucleotide Sequence (5'->3’) 확인 부분 서열번호
P1 P480-NDV C7d-P-2268-F AGACCAGCGACACACAGCTC P->M M->P 서열번호 70
P550-NDV-C7d-M-3621-R AGCTCGTGCCTGGGATTGTC 서열번호 71
P2 P436-NDV-C7d-M-5168 CAATCTTGCGCTCAATGTCA M->F F->M 서열번호 72
P471-NDV C7d+Ampv-8563R CCAGATCGGACTCTATACAG 서열번호 73
P3 P753-NDV C7d-F 912F GACCTTATCTGTAAGTACA F->HN HN->F 서열번호 74
P754-NDV C7d-HN-62R CATGTGTTCTTTGCTTCTC 서열번호 75
P4 P482-NDV C7d-HN-6401-F GAACGGTCAGAGGAGCCAC HN 서열번호 76
P755-NDV C7d-HN gene end-R GCTCAATCGGCCACGTCTAG 서열번호 77
추출한 요막강액을 닭혈구와 반응하여 혈구응집반응을 통해 작출된 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 확인하였다. 뉴캣슬병 바이러스의 혈구응집반응 최초 작출 확인 이후 바이러스별로 종란에 2회, 3회 계대배양 후 혈구응집반응을 통해 바이러스의 배양을 확인하였다.
본 발명에 따른 BP-NDV-C7d 바이러스 작출 벡터는, 7형 NDV의 유전자를 도입하여 만든 벡터로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2013년 기탁한(KCTC12444BP로) BP-ACND와는 상이하며, 종래 Lasota 바이러스를 backbone으로 한 바이러스들에 비해 내열성이 향상되어 56℃ 온도에서 열처리 후 20분까지 HA 활성이 유지되나(Lasota 바이러스의 경우 10분) BP-NDV-C7d 바이러스는 이보다 내열성이 더욱 향상된 바이러스로 56 ℃ 온도에서 열처리 후 20분 이상, 25분 이상, 또는 30분이상, 바람직하게는 30분 내지 50분까지 HA (혈구응집반응) 활성이 유지되고 세포 감염능이 또한 유지됨을 확인하였다.
실시예 2. 서브타입 A형 및 B형 조류메타뉴모바이러스(aMPV)의 F 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 키메라 바이러스의 제조.
실시예 2-1. 조류메타뉴모바이러스(aMPV)의 항원 선정
조류메타뉴모바이러스의 감염 및 중화항체 유도에 중요한 표면항원 F 단백질에 대한 유전자정보를 수집하였다. 최근 국내 및 해외에서 유행하는 aMPV subtype A 및 subtype B의 F 단백질에 대한 유전자 정보를 Genbank로부터 수집하고 계통분석도 비교를 통해 subtype 별 대표 유전자를 선정하였다. Subtype A에 대해서는 총 12개 서열을, subtype B에 대해서는 총 29개 서열을 비교 분석하여 각각을 대표하는 2종의 유전자를 선정하여 바이오니아에 해당 유전자에 대한 유전자 합성을 의뢰하였다.
도입하는 유전자의 각각 양쪽 끝부분에는 도입에 필요한 제한효소 인식부위를 도입하였고 도입유전자가 NDV 발현 벡터 내에서 내부 유전자와 같은 방식으로 단백질로 발현될 수 있는 gene cassette 형태를 갖출 수 있도록 gene start sequence, gene end sequence, intergenic sequence를 맞추어 합성을 의뢰하였다.
아래에 aMPV의 subtype 별로 F 단백질을 암호화하는 유전자를 나타내었다.
aMPV subtype A의 F protein gene: 서열번호 1 (도 12)
aMPV subtype B의 F protein gene: 서열번호 2 (도 13)
실시예 2-2. 서브타입 A형 및 B형 aMPV의 F 단백질을 모두 발현하는 키메라바이러스 제조를 위한 발현 벡터 제조.
상기 실시예 1에서 제작된 재조합 뉴캣슬병 바이러스 발현벡터에 조류메타뉴모바이러스에 대한 인공 합성 유전자인 aMPV subtype A의 F 유전자 및 aMPV subtype B의 F 유전자를 도입하여 키메라 바이러스 제조를 위한 발현벡터를 제작하였다.
뉴캣슬병 바이러스의 각 유전자들은 개별적인 개시서열과 종결서열이 있어 RNA 의존 RNA 중합효소에 의해 각각의 mRNA로 전사되는데 transcriptional polarity에 의해 5'쪽 ORF 일수록 전사되는 mRNA가 감소하고 이에 따라 발현되는 단백질량이 저하되므로, 재조합 바이러스 증식성에는 영향을 미치지 않는 동시에 뉴캣슬병 바이러스 발현벡터 내 조류메타뉴모바이러스 F 유전자의 발현율을 높이기 위해 발현벡터 내 3'쪽에 위치하는 P-M 또는 M-F 사이에 서브타입 A형 및 B형 조류메타뉴모바이러스 F 유전자를 각각 도입하였다.
상기 실시예 1에서 제작된 재조합 뉴캣슬병 바이러스 발현벡터 내 aMPV F 유전자 도입에 필요한 AgeI, NgoMIV 및 NgoMIV-PshAI 제한효소 인식부위를 부가한 후, 재조합 뉴캣슬병 바이러스 발현벡터의 P 유전자와 M 유전자 사이(P-M)에 서브타입 A형 조류메타뉴모바이러스의 F 단백질 코딩서열을 도입하고, 재조합 뉴캣슬병 바이러스 발현벡터의 M 유전자와 F 유전자 사이(M-F)에 서브타입 B형 조류메타뉴모바이러스의 F 단백질 코딩서열을 도입하였다. 이를 도 9에 나타내었다.
도입이 완료된 NDV 게놈 전사 벡터는 아래 표 5에 요약된 프라이머 세트를 사용하여 도입유전자를 포함한 도입부위의 전, 후 및 NDV 게놈의 주요 항원부위(HN)의 염기서열을 확인하였다. 상기 PCR 반응에 사용된 염기서열 확인용 프라이머 세트를 아래 표 5에 나타내었다.
Position Primer Sequence 서열번호
P-AF NDV-C7d-Pgene-2788-F GGCATGATGAAAATTCTGGAC 서열번호 78
AF NDV-C7d-AGF-AF-GS-IF TacgggtagaaACCGCCACCATGGATGTAAGAATCTGTCT 서열번호 79
NDV-C7d-M-IR TCGAGGCACTTTGATTCTACCCGTAttttttcttaTGCTTA 서열번호 80
M NDV-C7d-M-3621-R AGCTCGTGCCTGGGATTGTC 서열번호 81
NDV-C7d-M-GS-IF TAAGCAtaagaaaaaaTACGGGTAGAATCAAAGTGCCTCGA 서열번호 82
NDV-C7d-M-NgoMIV-R GCCGGCTTGAATGATGACTT 서열번호 83
M-BF NDV-C7d-M-856F CGGACTAAGCTACTTGCTCCT 서열번호 84
NDV-C7d-M-857F GACTAAGCTACTTGCTCCTT 서열번호 85
BF NDV-C7d-AMPV-B-F-6024F GAACATAACATGTAATGATGG 서열번호 86
BF-NDV-F NDV-C7d-F-4317-R GGAGCAACTTGACTATGATT 서열번호 87
NDV-F NDV-C7d-Fgene-7536F TATCCGTCTGACAAGCTCT 서열번호 88
La-4941F acagcggcacagataacagca 서열번호 89
NDV-C7d-HN-62R CATGTGTTCTTTGCTTCTC 서열번호 90
HN NDV-C7d-7351R GTGGTGTCTAAGTCCTTCTCAT 서열번호 91
상기 방법에 따라 최종 제작된 서브타입 A형 및 B형 aMPV의 F 단백질을 모두 발현하는 키메라바이러스 제조를 위한 발현 벡터의 전체 염기서열은 서열번호 3의 염기서열로 표시하였다. 최종 제작된 키메라 바이러스는 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF라고 명명하였으며, 그 게놈 구조를 도 10에 나타내었다.
상기 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스는 2009년 상용화된 이후 현재까지 안전하고 효과적인 백신으로 사용되고 있는 KBNP-C4152와 동일한 F 단백질 분절서열을 가지고 있어 백신주로 안전한 바이러스이다.
실시예 2-3. 서브타입 A형 및 B형 aMPV의 F 단백질을 모두 발현하는 키메라 바이러스의 작출 및 확인
1) 재조합 뉴캣슬병 바이러스의 작출
Hep-2세포 주를 6well 플레이트에 80% 가량 키워놓은 후, vaccinia T7 바이러스를 감염시켰다. 이후 세포주에 T7 promoter에 의해 개시되어 단백질이 발현되는 pCR-TM-NP, pCR-TM-P, pCR-TM-L 플라스미드 벡터 3개와 T7 promoter에 의해 개시되어 HDV 라이보자임에 의해 스스로 절단되어 정확하고 완전한 전체 키메라 내열성 NDV 게놈을 만들어 낼 수 있는 플라스미드인 NDV-C7d-aMPV-ABF pBHA을 준비하였다. 각각을 1:1:0.1:1 비율로 섞어 LipofectamineTM(Invitrogen. co)과 적정 비율로 혼합하여 트랜스펙션하였다. 이후 1ug/ml의 acetylated trypsin을 첨가하여 내열성 비병원성 재조합 바이러스가 생성되어 감염성을 갖도록 하였다. 2-3일간 37℃에서 배양한 후 6 well의 세포를 수확하여 11일령의 SPF 발육란에 접종하여 감염성 NDV를 얻었다. 상기 과정을 도 14에 모식도로 나타내었다.
2) 재조합 뉴캣슬병 바이러스의 확인 실험
11일령 SPF 발육란 접종 후 24시간마다 검란을 실시하여 중사란을 확인하고, 접종 72시간 후 접종란을 4℃ 냉장한 후 요막강액을 채취하여 바이러스 확인실험을 실시하였다.
요막강액 150㎕에 Viral Gene-spin™ Viral DNA/RNA Extraction Kit(intron) lysis buffer 150㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 실온에서 10분간 정치하였다. 여기에 다시 binding buffer 300㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 column에 loading하고 washing buffer A, B를 사용하여 차례로 column을 세척하고 elution buffer로 column에 부착되어있는 RNA를 용해시켰다.
추출한 재조합 뉴캣슬병 바이러스의 RNA 2㎕를 다음 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 ONE-STEP RT-PCR Kit(iNtRON)로 45℃/5min-(94℃/20sec-50℃/15sec-72℃/30sec) 30cycles 조건하에서 RT-PCR 하여 바이러스의 유무를 확인하였으며, transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응을 확인하기 위하여 추출한 RNA를 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 MG-taq polymerase(MGmed)로 하기의 조건하에서 PCR하여 확인하고, 그 결과를 도 15에 나타내었다:
바이러스 NDV F 유전자 확인 RT-PCR:
45℃/5min-(94℃/20sec-50℃/15sec-72℃/30sec) 30cycles
False positive 확인 PCR:
(94℃/20sec-50℃/15sec-72℃/30sec) 30cycles
primer sequence (5’ -> 3’)
NDVcomF: ATACACCTCRTCYCAGACAG (서열번호 92)
NDVcomR: TGCCACTGMTAGTTGYGATA (서열번호 93)
상기 프라이머 세트로 NDV F 유전자에 대한 확인이 완료된 바이러스는 재조합 NDV 주요 항원부위에 대하여 5종 RT-PCR 후 염기서열 분석하여 확인하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다. 사용한 프라이머를 아래 표 6에 정리하였다. 확인이 완료된 바이러스는 BP- NDV-C7d-aMPV-ABF 라고 명명하고 KCTC 생물자원센터에 2021년 1월 19일자로 기탁하여 KCTC14452BP 기탁번호를 수여받았다.
재조합바이러스 주요 유전자 확인 RT-PCR 조건:
45℃/5min-(94℃/20sec-50℃/20sec-72℃/2min) 30cycles
No. Oligonucleotide Sequence (5'->3’) 확인 부분 서열번호
P1 NDV-C7d-Pgene-2640-F CATCCTTAAGTGATCTCCGG NDV-P-aMPV-AF 서열번호 94
aMPV-F-3614-R CCTAATGTGGATACTGCCTC 서열번호 95
P2 aMPV-F-3345-F TGGACCCAGCCTAATTGACAC aMPV-AF 서열번호 96
aMPV-F-4421-R TCAATGGTTATCGTGTCAGC 서열번호 97
P3 aMPV-F-4129-F GATGATTGTGAGGTAAGGGA aMPV-AF-NDV-M 서열번호 98
NDV C7d-M-5201-R CTCTCAGTGTTAGTTGCACT 서열번호 99
P4 NDV-C7d-M-857F GACTAAGCTACTTGCTCCTT NDV-M-aMPV-BF 서열번호 100
aMPV-F-1130R GGGGTTAAGGCTACCAT 서열번호 101
P5 aMPV-F-591F CAGAAGGTTCCTGAATGTGGTGAG aMPV-BF-NDV-F 서열번호 102
NDV C7d+Ampv-8563R CCAGATCGGACTCTATACAG 서열번호 103
추출한 요막강액을 닭혈구와 반응하여 혈구응집반응을 통해 작출된 재조합 NDV-C7d-aMPV-ABF 뉴캣슬병 바이러스를 확인하였다. 뉴캣슬병 바이러스의 혈구응집반응 최초 작출 확인 이후 바이러스별로 종란에 2회, 3회 계대배양 후 혈구응집반응을 통해 바이러스의 배양을 확인하였고, 이를 도 17에 나타내었다.
실시예 3. BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 특성 확인
실시예 3-1. BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 배양 및 증식성 확인
실시예 2에서 작출된 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스를 SPF 발육란에서 105.5 ~106.5EID50ml 접종하고, 37℃ 인큐베이터에서 72시간 배양 후 요막강액을 수확하는 방법으로 바이러스를 계대배양하였다. 안정적 배양이 확인된 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 SPF 발육란 및 CEK 세포에서의 증식성을 확인하였다.
1) EID50 산출방법
BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스를 37℃에 인산완충용액으로 10진 희석한 후 각각의 희석액을 5개씩의 9~10일령 SPF 발육란의 장뇨막강 내 0.1㎖씩 접종하였다. 접종 후 24시간 이내에 폐사한 것은 제외하고, 24시간 이후에 폐사한 것은 뉴캣슬병 바이러스에 의한 폐사임을 확인하고, 5일 후에 생존한 것에 대하여는 장뇨막강액의 닭 적혈구에 대한 응집성을 조사하였다. 닭 적혈구를 응집하는 것을 양성으로 인정하여 Reed-Muench식을 이용하여 EID50을 산출하였다.
2) TCID50 산출방법
96well plate에 배양 해 놓은 CEK 초대세포에 인산완충용액으로 10진 희석한 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스를 25ul씩 첨가한 후 37℃ CO2 incubator에서 7일간 배양하여 뉴캣슬병 바이러스에 의한 세포변성효과를 확인하고 상층액을 수확하여 닭 적혈구와 반응하여 응집하는 것을 양성으로 인정하여 TCID50를 산출하였다.
3) HA titer 산출방법
96well plate(A~F행 / 1~12열)에 모든 well에 50ul씩 1% PBS를 넣고, A~B번 첫 번째 칸에 1/2로 희석해 놓은 virus를 50ul씩 넣었다. D~E번 줄에 원액을 1/3로 희석해 놓은 virus를 50ul씩 넣었다. 1번 줄부터 10회 정도 pipetting하여 섞어준 뒤 50ul을 뒤로 넘기고 같은 방식으로 12 번째 칸까지 2진 희석하였다. 마지막 12번째 줄에서는 50ul를 덜어내어 최종 volume을 50ul로 맞추었다. C,F번 줄은 혈구 control로 virus를 넣지 않고 혈구만 넣었다. A~F부터 12번 줄까지 모든 well에 1%혈구를 25ul씩 넣었다. 2진 희석이 끝난 96well plate를 Microplate shaker로 10초간 섞었다. 상온에서 30min 반응시킨 후 결과를 판독하여 역가를 확인하였다.
BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 SPF 발육란 및 CEK 세포에서의 증식성 분석 결과를 아래 표 7에 나타내었다.
Strain EID50/ml (log10) TCID50/ml (log10) HA titer (log2)
BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 9.5 9.9 9.0
실시예 3-2. BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 병원성 확인
실시예 2에서 작출된 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 병원성을 확인하였다.
1) MDT(embryo mean death time) 측정
바이러스를 10-1~10-10으로 희석한 후 10일령 SPF 발육란 5개를 한 그룹으로 접종 당일 오전 9시와 오후 5시에 5개 종란에 바이러스 0.2ml씩 접종하고 7일간 37℃에서 배양하며 관찰하였다. 치사된 것은 4도 냉장고에서 4시간 이상 예냉하여 HA test 후 virus의 감염유무를 확인하였다.
최소치사량(Minimum lethal dose)에서의 평균 치사 시간(MDT, Mean Death Time)을 계산하는데 경과시간별로 (경과시간*치사수)를 산출하여 나온 합계를 치사된 총수로 나누어서 측정하였다. 강병원성 바이러스는 60시간 미만, 중병원성 60-90시간, 약병원성은 90시간 이상으로 측정된다.
[수학식 1]
MDT = {(X 시간의 치사수 * x 시간) + (Y 시간의 치사수 * y 시간) + (Z 시간의 치사수 * z 시간)}/총 치사수
측정한 결과를 아래 표 8에 나타내었다.
Strain MDT(h) Pathotype
BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 168hr < Avirulent
측정 결과, BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 계태아 최소 치사량에서 평균 치사시간은 150시간 이상으로 약병원성 바이러스로 측정되었다.
2) ICPI(Intra cerebral pathic index) 측정
1일령 SPF 병아리(미국 찰스리버에서 직수입하여 입고된 종란을 부화하여 사용) 10수에 병아리 1수당 바이러스 0.05ml을 뇌 내로 접종한 후 8일간 관찰하면서 병원성을 측정하였다.
Alexander의 방법에 따라 계산하여, 정상 병아리는 0, 병증을 보인 병아리는 1, 죽은 병아리는 2로 점수를 매겨 매일 합계를 내어 8일간의 총 점수를 80으로 나누었다. 강병원성 바이러스는 1.2 이상, 중병원성 0.6-1.2, 약병원성 0.6 이하로 측정된다.
측정 결과, BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 병원성 지수가 0.1이하로 약병원성 바이러스로 측정되었다.
실시예 3-3. BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 안전성
실시예 2에서 작출된 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 안전성을 확인하였다.
1일령 SPF 병아리 15수에 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스를 쓰리샤인 박스형 분무기(fine spray)를 사용하여 수당 106.5EID50가 되도록 접종한 후 (백신군), 2주간 호흡기 증상, 침울 및 설사 등의 임상증상 또는 폐사여부를 확인하였다.
관찰결과 백신군에서 임상증상 및 폐사가 관찰되지 않았으므로, BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 안전성을 확인하였다.
실시예 3-4. BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 유전적 안정성
실시예 2에서 작출된 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 유전적 안정성을 확인하였다.
BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스를 발육란에서 20대까지 계대배양한 후 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 F, HN 및 L 단백질에 대해 각각 PCR 후 염기서열 분석하여 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 유전적 안정성을 평가하였다. BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 도입 항원 및 NDV-F 단백질 부위 확인용 프라이머 세트를 아래 표 9에 나타내었다. (P: NDV의 P 유전자, AF: subtype A aMPV의 F 유전자, M: NDV의 M 유전자, BF: subtype B aMPV의 F 유전자, NDV-F: NDV의 F 유전자)
확인부분 Primer Sequence Amplicon size(bp) 서열번호
P-AF NDV-C7d-Pgene-2640-F CATCCTTAAGTGATCTCCGG 975 서열번호 104
aMPV-F-3614-R CCTAATGTGGATACTGCCTC 서열번호 105
AF aMPV-F-3345-F TGGACCCAGCCTAATTGACAC 1,077 서열번호 106
aMPV-F-4421-R TCAATGGTTATCGTGTCAGC 서열번호 107
AF-M aMPV-F-4129-F GATGATTGTGAGGTAAGGGA 1,073 서열번호 108
NDV C7d -M-5201-R CTCTCAGTGTTAGTTGCACT 서열번호 109
M-BF NDV-C7d-M-857F GACTAAGCTACTTGCTCCTT 1,494 서열번호 110
aMPV-F-1130R GGGGTTAAGGCTACCAT 서열번호 111
BF-NDV-F aMPV-AF-591F CAGAAGGTTCCTGAATGTGGTGAG 2,117 서열번호 112
NDV C7d+aMPV-8563R CCAGATCGGACTCTATACAG 서열번호 113
측정 결과, 20대 계대배양까지 해당 단백질 부위의 변이가 없음을 확인하였고 이를 도 11에 나타내었으며, BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 유전적 안정성을 확인하였다.
실시예 3-5. BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스의 효능 평가
미국 찰스리버로부터 직수입한 SPF 종란에서 부화한 1일령 병아리에 수당 106.5EID50 생독백신 바이러스를 분무접종하고 4주 후 수당 109.0EID50 사독백신 바이러스를 근육접종하였다. 생독백신 접종 후 4주 및 사독백신 접종 후 2주, 3주 및 4주차 채혈하여 NDV 및 aMPV에 대한 항체가를 확인하였다.
1) NDV 혈청역가시험
NDV에 대한 혈구응집억제 항체 역가(HIT)를 측정하기 위해 동일한 유전형 7형 바이러스인 NDV-C7d를 사용하였다. SPF 병아리에서 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스 접종군의 NDV-C7d에 대한 평균 혈구응집 항체 역가를 아래 표 10에 나타내었다.
시험그룹 HA Ag(NDV-C7d)
평균 HI 역가±SD(log2)
1차 분무백신 후 4주 7.3±1.6
2차 사독백신 접종 후 2주 11.6±0.5
2차 사독백신 접종 후 3주 11.8±0.4
2차 사독백신 접종 후 4주 11.8±0.4
무 접종 대조군 0.0
상기 표 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, NDV-C7d에 대한 면역이 높게 형성되는 것을 확인하였다.
2) aMPV-ELISA 측정
SPF 병아리에서 BP-NDV-C7d-aMPV-ABF 바이러스 접종군에 대하여, aMPV에 대한 항체를 검출할 수 있는 시판 ELISA Kit(BioChek ART ELISA 키트)를 사용하여 aMPV에 대한 항체의 형성 여부를 측정하였다. 그 결과를 아래 표 11에 나타내었다.
시험그룹 ELISA 양성률(%)
1차 분무접종 후 4주 70.0
2차 사독백신 접종 후 2주 100.0
2차 사독백신 접종 후 3주 100.0
2차 사독백신 접종 후 4주 100.0
무 접종 대조군 0.0
상기 표 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 항체 형성 여부를 확인한 결과 2차 사독백신에 의한 항체 양성률이 100%임을 확인하였다.
3) aMPV-중화항체 측정
Subtype B형의 aMPV(SC1509, Journal of Bacteriology and Virology 39(4):373-382)에 대한 중화항체가를 측정하였다.
56℃에서 30분간 비동화시킨 혈청을 세포유지용 배지로 2배씩 희석하고 100~1,000 TCID50 중화용 바이러스(SC1509)를 동량 혼합하여 37℃에서 1시간 감작하였다. 각 혼합액을 베로 세포(vero cell, KCTC 생물자원센터에서 입수)에 접종하고 37℃에서 7일간 배양하여 중화지수를 산출하였다.
그 결과를 아래 표 12에 나타내었다.
시험그룹 중화항체 양성률(%)
1차 분무접종 후 4주 60.0
2차 사독백신 접종 후 2주 70.0
2차 사독백신 접종 후 3주 100.0
2차 사독백신 접종 후 4주 100.0
무 접종 대조군 0.0
상기 표 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 중화항체 형성 여부를 확인한 결과 2차 사독백신 3주차 이후 중화항체 양성률이 100%임을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC13574BP 20180710 한국생명공학연구원 KCTC13575BP 20180710 한국생명공학연구원 KCTC13595BP 20180723 한국생명공학연구원 KCTC14452BP 20210119
<110> BioPoA, Inc. <120> Avian metapneumovirus vaccine with high tilter using Newcastle virus vector <130> DPP20210238KR <160> 113 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1617 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV subtype A F protein gene <400> 1 atggatgtaa gaatctgtct cctattgttc cttatatcta atcctagtag ctgcatacaa 60 gaaacataca atgaagaatc ctgcagtact gtaactagag gttataagag tgtgttaagg 120 acagggtggt atacgaatgt atttaacctc gaaataggga atgttgagaa catcacttgc 180 aatgatggac ccagcctaat tgacactgag ttagtactca caaagaatgc tttgagggag 240 ctcaaaacag tgtcagctga tcaagtggct aaggaaagca gactatcctc acccaggaga 300 cgtagatttg tactgggtgc aattgcactt ggtgttgcga cagctgctgc cgtaacagct 360 ggtgtagcac ttgcaaagac aattagatta gagggagagg tgaaggcaat taagaatgcc 420 ctccggaaca caaatgaggc agtatccaca ttagggaatg gtgtgagggt actagcaact 480 gcagtcaatg acctcaaaga atttataagt aaaaaattga ctcctgctat taaccagaac 540 aaatgcaata tagcagatat aaagatggca attagttttg gccaaaataa cagaaggttc 600 ctgaatgtgg tgaggcaatt ctctgatagt gcaggtatca catcagctgt gtctcttgat 660 ttaatgacag atgatgaact tgttagagca attaacagaa tgccaacttc atcaggacag 720 attagtttga tgttgaacaa tcgtgccatg gttagaagga aggggtttgg tatattgatt 780 ggtgtttatg atggaacggt cgtttatatg gtacaactgc ccatattcgg cgtgattgag 840 acaccttgtt ggagggtggt ggcagcacca ctctgtagga aagagaaagg caattatgct 900 tgtatactga gagaagatca agggtggtac tgtacaaatg ctggctctac agcttattat 960 cctaatgaag atgattgtga ggtaagggat gattatgtat tttgtgacac agcagctggc 1020 attaatgtgg ccctagaagt tgaacagtgc aactataaca tatcgacttc taaataccca 1080 tgcaaagtca gcacaggtag acaccctgtc agtatggtag ccttaacccc cctagggggt 1140 ctagtgtctt gttatgagag tgtaagttgc tccataggta gcaataaagt agggataata 1200 aaacagctag gcaaagggtg cacccacatt cccaacaacg aagctgacac gataaccatt 1260 gataacactg tgtaccaatt gagcaaggtt gtaggcgaac agaggaccat aaaaggagct 1320 ccagttgtga acaattttaa cccaatatta ttccctgagg atcagttcaa tgttgcactt 1380 gaccaagtat ttgagagtat agatagatct caggacttaa tagataagtc taacgacttg 1440 ctaggtgcag atgccaagag caaggctgga attgctatag caatagtagt gctagtcatt 1500 ctaggaatct tctttttact tgcagtgata tattactgtt ccagagtccg gaagaccaaa 1560 ccaaagcatg attacccggc cacgacaggt catagcagca tggcttatgt cagttaa 1617 <210> 2 <211> 1617 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV subtype B F protein gene <400> 2 atgtacctca aactgctact aataatttat ttggtggtcg gggccagtgg gaagatacaa 60 gaaacttaca gtgaagaatc atgcagcact gtaaccaggg gttacaaaag tgtgctcaga 120 acgggttggt atacaaatgt gttcaaccta gaaataggga atgtggagaa cataacatgt 180 aatgatggtc ctagccttat cagcactgaa ttgtcactaa ctcagaatgc cttgcaggag 240 cttagaactg tttctgccga tcagattaca aaggagaatc gaatcctttc ccataggaag 300 aagaggtttg tgttgggtgc aattgccctt ggagtggcca ccacagctgc tgtaacagcc 360 gccgtagctt tagctaaaac aataagatta gaaggggagg tgaaagccat caagctagct 420 ttgcgcagta caaatgaggc tgtgtccaca ttaggcaatg gcgttcgcat cttggcaaca 480 gctgttaatg acctaaaaga atttataagc aagaaattaa cccctgcaat aaaccaaaac 540 aaatgcaaca tagcagacat aaggatggca atcagctttg gacagaacaa cagaaggttt 600 ctaaatgtgg tgagacaatt ttctgacagt gcaggaataa cttccgcagt gtctttagat 660 cttatgacag atgcagaatt ggttaaagcc atcaaccgaa tgccaacttc gtctggtcag 720 attagcctca tgctgaacaa tagagcaatg gttaggagga aagggtttgg aatacttata 780 ggtgtttacg gggggactgt agtgtatatg gtgcaactcc caatatttgg agttatagag 840 acaccctgct ggagagtggt agctgcaccc ctctgtagac atgagaggga gagttatgct 900 tgtctgctgc gggaagatca ggggtggtac tgcactaatg caggatcaac tgcttactac 960 ccaaatgaag atgactgcga ggtaagagat gactatgtgt tctgtgatac tgcagcaggt 1020 ataaatgttg catcagaggt ggagcagtgc aaccaaaaca tatcaacctc tacttaccct 1080 tgcaaagtta gcacagggag acaccctgta agcatggtag ccttaacccc cttgggaggt 1140 ttagtatcat gttatgaagg tgtgagttgc tccattggca gcaacaaagt cgggatcatt 1200 aaacaactca acaaaggatg cacacacata cccaataatg aggcagacac aataactata 1260 gacaacacaa tttatcaact cagcaaggtg gtgggtgagc aaaggaccat caaaggagct 1320 ccggtggtaa ataatttcaa ccctctactg ttccctgagg atcaatttaa cgtagcctta 1380 gatcaagtat ttgagagtgt tgataaatca aaagacctga ttgacaagtc taatgactta 1440 ctggacatag aggttaagag taatataggt gctgcattag ccatcacaat tttagtagtg 1500 cttagcatgt caatcatagt gggcatagct tactatgtgg ttaaaaagag gaaagccaaa 1560 gcatccaatg gatatcctaa aacaacaggg caaagcaaca tgggctacat cagttga 1617 <210> 3 <211> 18504 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BP-NDV-C7d-aMPV-ABF whole genome <400> 3 accaaacaga gaatctgtga ggtacgataa aaggcgaaga agcaatcgag atcgtacggg 60 tagaaggtgt gaaccccgag cgcgaggccg aagcttgaac ctgagggaac cttctaccaa 120 tggccgccct ctgccaacta tgtcgtctgt tttcgacgaa tacgagcagc tccttgctgc 180 tcagacccgc cctaacggag ctcatggagg gggagagaaa gggagcactt taaaggttga 240 ggtcccagta tttaccctaa acagtgatga tccagaggat agatggaact ttgcggtatt 300 ctgtcttcgg attgctgtta gcgaggatgc caacaaacca ctcaggcaag gtgctcttat 360 atccctctta tgctcccatt ctcaggtgat gagaaaccat gttgcccttg cagggaaaca 420 gaatgaggcc acactggctg ttcttgaaat cgatggtttt gctaacagtg tgccccagtt 480 caacaatagg agtggggtgt ccgaggaaag agcacagaga ttcatggtaa tcgcaggatc 540 tctccctcgg gcatgcagca acggtactcc gtttgtcacg gctggggttg aagatgatgc 600 accagaagat atcactgaca ctctagaaag gatcctatct gtccaagtcc aggtatgggt 660 cacggtagca aaggccatga ctgcatatga gacagcagat gagtcagaaa caagaagaat 720 aaataagtat atgcagcaag gtagagttca gaagaagtac atccttcatc ctgtatgcag 780 gagtgcaatt caactcacaa tcagacattc tctggcagtc cgtattttcc tggttagtga 840 gctcaagagg ggccgtaata cagcaggtgg gagctctaca tattacaact tggtcgggga 900 tgtagactca tacatcagaa acaccgggct tactgcattt ttcctaacac tcaaatatgg 960 aatcaatacc aagacgtcag ccctcgcgct cagcagcctc acaggtgata tccaaaaaat 1020 gaaacagctc atgcgtttat atcggatgaa aggtgaaaat gcaccataca tgacattgtt 1080 aggtgacagt gaccagatga gctttgcacc agccgaatat gcacaacttt attcttttgc 1140 catgggcatg gcatcagtct tagataaggg aactggcaag taccaatttg ccagggactt 1200 tatgagcaca tcattctgga gacttggagt agagtatgct caggctcagg gaagtagtat 1260 caatgaggac atggctgctg agttaaaact aaccccggca gcaaggagag gcctggcagc 1320 tgctgcccaa cgagtatctg aagaaatcgg cagcatggac attcctactc aacaagcagg 1380 agtcctcacc gggctcagtg acgaaggccc ccgaactcca cagggcggat caaacaagct 1440 gcaagggcaa ccagatgctg gggatgggga gacccaattc ctggatttca tgagagcagt 1500 ggcgaacagc atgcgggaag cgccaaatcc tgcacagagc accacccatc tagagcctcc 1560 cccaacccct ggggcatccc aagacaacga cactgactgg gggtactgat cgactacacc 1620 cagcctgcct tcacaggatc acatcaaacc ctccgcccaa aaccctccca caccccctga 1680 cccacaaccc cgcacgaccc caccaataaa agctcccccc caccctctcc cccactccca 1740 gccacacgat cccacccacc cgggacaaca caggcacagc tcggccagtc aacaatccgc 1800 ccagagtcca aggtattaga aaaaaatacg ggtagaagag agacatccag agaccaggac 1860 gggtcactaa gttctctgtt ctcccttcta cccggtgagt tagggtgaag atggctactt 1920 ttacagatgc ggagatagat gacatatttg agaccagtgg gactgtcatt gacagcataa 1980 ttacggccca gggcaaatca gctgagaccg tcggaagaag cgcgatcccg cagggcaaga 2040 ccaaagctct aagcacagca tgggagaagc acgggagtgt ccagccacat gccagtcagg 2100 acgcccctga ccaacaagac agaacagaaa aacagccatc cacacctgag caggcgactc 2160 cacacaacaa cccgccgatc acatccactg aaccgccccc cactcaggcc gcaagcgaga 2220 ccagcgacac acagctcaaa accggagcaa gcaactccct tctgtccatg ctcgacaaat 2280 tgagcaataa atcgtctaat gctaaaaagg gcccatggtc gggtcctcaa gaagggcatc 2340 accaatctcc ggcccaacaa cacgggaacc agccgagcta tggaagcaac cagggaagac 2400 cacagcacca ggccaaggcc gtccctggaa accggggcat agacgagaac acagcatatc 2460 atggacaacg gaaggagtca caaccatcag ctggtgcaac ccctcatgcg ccccagtcag 2520 ggcagagcca agacaatatt cctgtacctg tggatcgtgt ccagctacct gccgactttg 2580 cgcaggtgat gatgtctatg atggaggcat tatcacagaa ggtaagtaaa gttgatcatc 2640 agctggacct agtcttgaaa cagacatcct ccattcctat gatgcgatct gaaatccaac 2700 agctcaagac atctgttgcg atcatggaag ctaacttagg catgatgaaa attctggacc 2760 ctggttgtgc taacgtttca tccttaagtg atctccgggc agtagcccga tcccacccag 2820 tcctagtttc aggccccgga gacccatctc cttacgtgac acaagggggt gaaatgacgc 2880 tcaataaact ctcacaaccg gtgcagcacc cctctgaatt gattaagtct gccactgcaa 2940 gcgggcctga catgggagtg gagaaggaca ctgtccgcgc attaatcacc tcgcgcccga 3000 tgcatccgag ctcctcggct aagctcctga gcaagctaga tgcagccagg tcaattgaag 3060 agatcaggaa gatcaaacgc cttgcgctga atggttgatg gccatcacaa ctcataacag 3120 gctcccgtca cttcagcgtc acacggaatc ccctgggggc ccccccttgc aaatccacgc 3180 ttcaacaccc caaacaacag ccctctctca ccccccccaa tcccccgaat gatagcacaa 3240 ctgcaaccaa tccagcagca ttagaaatta agaaaaaata cgggtagaaa ccgccaccat 3300 ggatgtaaga atctgtctcc tattgttcct tatatctaat cctagtagct gcatacaaga 3360 aacatacaat gaagaatcct gcagtactgt aactagaggt tataagagtg tgttaaggac 3420 agggtggtat acgaatgtat ttaacctcga aatagggaat gttgagaaca tcacttgcaa 3480 tgatggaccc agcctaattg acactgagtt agtactcaca aagaatgctt tgagggagct 3540 caaaacagtg tcagctgatc aagtggctaa ggaaagcaga ctatcctcac ccaggagacg 3600 tagatttgta ctgggtgcaa ttgcacttgg tgttgcgaca gctgctgccg taacagctgg 3660 tgtagcactt gcaaagacaa ttagattaga gggagaggtg aaggcaatta agaatgccct 3720 ccggaacaca aatgaggcag tatccacatt agggaatggt gtgagggtac tagcaactgc 3780 agtcaatgac ctcaaagaat ttataagtaa aaaattgact cctgctatta accagaacaa 3840 atgcaatata gcagatataa agatggcaat tagttttggc caaaataaca gaaggttcct 3900 gaatgtggtg aggcaattct ctgatagtgc aggtatcaca tcagctgtgt ctcttgattt 3960 aatgacagat gatgaacttg ttagagcaat taacagaatg ccaacttcat caggacagat 4020 tagtttgatg ttgaacaatc gtgccatggt tagaaggaag gggtttggta tattgattgg 4080 tgtttatgat ggaacggtcg tttatatggt acaactgccc atattcggcg tgattgagac 4140 accttgttgg agggtggtgg cagcaccact ctgtaggaaa gagaaaggca attatgcttg 4200 tatactgaga gaagatcaag ggtggtactg tacaaatgct ggctctacag cttattatcc 4260 taatgaagat gattgtgagg taagggatga ttatgtattt tgtgacacag cagctggcat 4320 taatgtggcc ctagaagttg aacagtgcaa ctataacata tcgacttcta aatacccatg 4380 caaagtcagc acaggtagac accctgtcag tatggtagcc ttaacccccc tagggggtct 4440 agtgtcttgt tatgagagtg taagttgctc cataggtagc aataaagtag ggataataaa 4500 acagctaggc aaagggtgca cccacattcc caacaacgaa gctgacacga taaccattga 4560 taacactgtg taccaattga gcaaggttgt aggcgaacag aggaccataa aaggagctcc 4620 agttgtgaac aattttaacc caatattatt ccctgaggat cagttcaatg ttgcacttga 4680 ccaagtattt gagagtatag atagatctca ggacttaata gataagtcta acgacttgct 4740 aggtgcagat gccaagagca aggctggaat tgctatagca atagtagtgc tagtcattct 4800 aggaatcttc tttttacttg cagtgatata ttactgttcc agagtccgga agaccaaacc 4860 aaagcatgat tacccggcca cgacaggtca tagcagcatg gcttatgtca gttaagcata 4920 agaaaaaata cgggtagaat caaagtgcct cgattgcacc aaaatggact catccaggac 4980 aatcgggctg tactttgatt ctgccctccc ttccagcagc ctattagcat ttccgattat 5040 cttacaagac acaggagacg ggaagaaaca aatcacccca caatacagga tccagcgtct 5100 tgattcgtgg acagacagta aggaagactc ggtatttatc accacctacg ggttcatctt 5160 tcaagttggg aatgaagaag ccaccgtcgg tgtgatcaat gacaatccca ggcacgagct 5220 actctcttcc gcaatgctct gcttagggag tgtcccgaac aacggagatc ttgttgagct 5280 ggcgagagcc tgcctcacca tggtggtaac ctgcaagaag agtgcaacta acactgagag 5340 aatagtcttc tcagtagtgc aggcacctcg ggtgctgcaa aattgtatgg ttgtgtcgaa 5400 taggtactca tcagtgaatg cagtgaagca tgtgaaggcg cccgaaaaga tccctgggag 5460 cggaacccta gagtataaag tgaattttgt ctctttgact gtggtgccga gaagggatgt 5520 ctacaggatc ccaactgcag tattgaaagt gtctggctca agcctgtaca atcttgcgct 5580 caatgtcact attgatgtgg acgtggatcc gaagagcccg ctagtcaaat ccctttctaa 5640 gtctgatagc ggatactatg cgaatctttt tctgcatatc gggcttatgt ccactgtaga 5700 taagagagga aagaaagtga catttgacaa gatagaggaa aagataagga gactcaatct 5760 atctgttggg ctcagtgatg tgctcggacc ctctgtgctt gtgaaggcga gaggtgcacg 5820 gactaagcta cttgctcctt tcttctctag cagtgggaca gcctgctatc ctatagcaaa 5880 tgcctctccc caggttgcca agatactctg gagccagacc gcgcacctgc ggagcgtgaa 5940 agtcatcatt caagccggca ctcagcgtgc tgtcgcagtg accgctgatc atgaggtaac 6000 ctccactaag atagagagga ggcacgccat tgctaaatac aatcctttca ggaaataagt 6060 tgcatcccta agactgcagt tcacctgctt tcctgaatca ccatgacacc agataatgat 6120 ccatctcgac tgcttatagt tagttcacct gtctagcaaa ttagaaaaaa cacgggtaga 6180 aaccatgtac ctcaaactgc tactaataat ttatttggtg gtcggggcca gtgggaagat 6240 acaagaaact tacagtgaag aatcatgcag cactgtaacc aggggttaca aaagtgtgct 6300 cagaacgggt tggtatacaa atgtgttcaa cctagaaata gggaatgtgg agaacataac 6360 atgtaatgat ggtcctagcc ttatcagcac tgaattgtca ctaactcaga atgccttgca 6420 ggagcttaga actgtttctg ccgatcagat tacaaaggag aatcgaatcc tttcccatag 6480 gaagaagagg tttgtgttgg gtgcaattgc ccttggagtg gccaccacag ctgctgtaac 6540 agccgccgta gctttagcta aaacaataag attagaaggg gaggtgaaag ccatcaagct 6600 agctttgcgc agtacaaatg aggctgtgtc cacattaggc aatggcgttc gcatcttggc 6660 aacagctgtt aatgacctaa aagaatttat aagcaagaaa ttaacccctg caataaacca 6720 aaacaaatgc aacatagcag acataaggat ggcaatcagc tttggacaga acaacagaag 6780 gtttctaaat gtggtgagac aattttctga cagtgcagga ataacttccg cagtgtcttt 6840 agatcttatg acagatgcag aattggttaa agccatcaac cgaatgccaa cttcgtctgg 6900 tcagattagc ctcatgctga acaatagagc aatggttagg aggaaagggt ttggaatact 6960 tataggtgtt tacgggggga ctgtagtgta tatggtgcaa ctcccaatat ttggagttat 7020 agagacaccc tgctggagag tggtagctgc acccctctgt agacatgaga gggagagtta 7080 tgcttgtctg ctgcgggaag atcaggggtg gtactgcact aatgcaggat caactgctta 7140 ctacccaaat gaagatgact gcgaggtaag agatgactat gtgttctgtg atactgcagc 7200 aggtataaat gttgcatcag aggtggagca gtgcaaccaa aacatatcaa cctctactta 7260 cccttgcaaa gttagcacag ggagacaccc tgtaagcatg gtagccttaa cccccttggg 7320 aggtttagta tcatgttatg aaggtgtgag ttgctccatt ggcagcaaca aagtcgggat 7380 cattaaacaa ctcaacaaag gatgcacaca catacccaat aatgaggcag acacaataac 7440 tatagacaac acaatttatc aactcagcaa ggtggtgggt gagcaaagga ccatcaaagg 7500 agctccggtg gtaaataatt tcaaccctct actgttccct gaggatcaat ttaacgtagc 7560 cttagatcaa gtatttgaga gtgttgataa atcaaaagac ctgattgaca agtctaatga 7620 cttactggac atagaggtta agagtaatat aggtgctgca ttagccatca caattttagt 7680 agtgcttagc atgtcaatca tagtgggcat agcttactat gtggttaaaa agaggaaagc 7740 caaagcatcc aatggatatc ctaaaacaac agggcaaagc aacatgggct acatcagttg 7800 agcataagaa aaaacacggg tagaagagtc tggatcccga ccggcacatt caggacacag 7860 catgggctcc aaaccttcta ccaggatccc agcacctcta atgctgatca ctcggattat 7920 gctgatattg agctgtatcc gtctgacaag ctctcttgac ggcaggcccc ttgcagctgc 7980 aggaattgta gtaacaggag ataaggcagt caatgtatac acctcgtctc agacagggtc 8040 aatcatagtc aagttgctcc cgaatatgcc cagagataag gaggcatgtg caaaagcccc 8100 attggaggca tataacagaa cactgactac tctgctcact cctcttggcg actccatccg 8160 caagatccaa gggtctgtgt ccacgtccgg aggggggaga caggcacgcc ttataggtgc 8220 tgttattggc agtgtagctc ttggggttgc aacagcggca cagataacag cagctgcggc 8280 cctaatacaa gccaaacaga atgccgccaa catcctccgg ctgaaggaga gcattgctgc 8340 aaccaatgaa gctgtgcatg aagtcaccga cggattatca caactatcag tggcagttgg 8400 gaagatgcag cagtttgtca atgaccagtt aaataatacg gcgcgagaat tggactgtat 8460 aaaaatcaca caacaggtcg gtgtagaact caacctatac ctaactgaat tgactacagt 8520 attcgggcca cagatcacct cccctgcatt aactcagctg accatccagg cactttataa 8580 tttagctggt ggcaatatgg attacttatt aactaagtta ggtataggaa acaatcaact 8640 cagctcatta attggtagcg gcctgatcac tggttaccct atactgtatg actcacatac 8700 tcaactcttg ggcatacaag taaatctgcc ctcagtcggg aacttaaata atatgcgtgc 8760 cacctatttg gagaccttat ctgtaagtac aaccaaagga tatgcctcag cacttgtccc 8820 gaaagtagtg acacaagtcg gttctgtgat agaagagctt gacacctcat actgtataga 8880 gtccgatctg gatttatatt gtactagaat agtgacattc cccatgtccc caggtattta 8940 ctcctgtttg agcggcaaca catcagcttg catgtattca aagactgaag gcgcactcac 9000 tacgccgtat atggccctta gaggctcagt tattgccaat tgtaagataa caacatgcag 9060 atgtacagac cctcctggta tcatatcgca aaattacgga gaagctgtat ccctgataga 9120 tagacattca tgcaatgtct tatcattaga cggaataact ctgaggctca gtggggaatt 9180 tgatgcaact tatcaaaaga acatctcaat tttagattct caagtcatcg tgacaggcaa 9240 tcttgatata tcaactgaac ttggaaacgt caacaattca atcagcaatg ccttggatag 9300 gttggcagaa agcaacagca agctagaaaa agtcaatgtc agactaacta gcacatctgc 9360 tctcattacc tatattgttc taactgtcat ttccctaatt ttcggtgcac ttagtctggt 9420 tttagcgtgt tacctgatgt acaaacagaa ggcacaacag aagaccttgc tatggcttgg 9480 gaataatacc ctcgatcaga tgagagccac cacaagagca tgaatgcaga taagaggtgg 9540 acagataccc aacagcagcc tgtgtgtcaa ttccgataac ctgtcaagta gaagacttaa 9600 gaaaaaatta ctgggaacaa gcaaccaaag agcaatgcac gggtagaacg gtcagaggag 9660 ccacccttca atcgaaaatt aggcttcaca acattcgttc taccacatca ccaacaacaa 9720 gagtcaatca tggaccgcgc ggttaacaga gtcgtgctgg agaatgagga aagagaagca 9780 aagaacacat ggcgcctagt tttccggatc gcagtcttac ttttaatggt aatgactcta 9840 gctatctccg cggctgccct ggcacacagc atgggggcca gtacgccgca cgacctcgca 9900 ggcatatcga ctgtgatctc caagacagaa gacaaggtta cgtctttact cagttcaagt 9960 caagatgtga tagataggat atacaagcag gtagctcttg aatccccgct ggcactacta 10020 aacaccgaat ctataattat gaatgcaata acctctcttt cttatcaaat taacggggct 10080 gagaacaata gcggatgtgg tgcgcctgtt catgacccag attatatcgg ggggataggc 10140 aaagaactca tagtggacga catcagtgat gtcacatcat tttatccttc tgcatatcaa 10200 gaacacttga atttcatccc ggcgcctact acgggatccg gttgcactcg gataccctca 10260 tttgacatga gcaccaccca ttattgttat actcacaatg tgatactatc tggttgcaga 10320 gatcactcac actcacatca atacttagca cttggtgtgc ttcggacatc tgcaacaggg 10380 agggtattct tttctactct gcgctccatc aatttagatg acacccaaaa tcggaagtcc 10440 tgcagtgtga gtgcaacccc tttaggttgt gatatgctgt gctctaaggt cacagggact 10500 gaagaggagg attacaagtc agttgccccc acatcaatgg tgcacggaag gctagggttt 10560 gacggtcaat accatgagaa ggacttagac accacggtct tatttaagga ttgggtggca 10620 aattacccgg gagtgggagg agggtctttt attgacggcc gtgtatggtt cccagtttac 10680 ggagggctca aacccaattc acccagtgac gctgcacaag aagggaaata tgtaatatac 10740 aagcgtcata acaacacatg ccccgatgaa caagattacc aaattcggat ggctaagtcc 10800 tcatataaac ccgggcgatt tggtggaaag cgcgtgcagc aagccatctt atccatcaaa 10860 gtgtcaacat ccctgggtaa ggacccggtg ctgactattc cacctaatac aatcacactc 10920 atgggagctg aaggcagaat cctcacagta gggacatctc acttcttgta ccaacgaggg 10980 tcttcatatt tctcccctgc cttattgtat cccatgacag taaataacaa aacggctaca 11040 ctccatagtc cttacatgtt taatgctttc actcggccag gtagtgtccc ttgccaggca 11100 tcagcaagat gccccaactc atgcattact ggggtctata ccgatccata tcccttaatc 11160 ttccatagga atcatactct acgaggggtc ttcgggacga tgcttgatga tgaacaagcg 11220 aggcttaacc ccgtatctgc agtatttgac aacatatctc gcagtcgtgt cacccgggtg 11280 agttcaagca gcaccaaggc agcatacacg acatcgacat gttttaaagt tgtcaagacc 11340 aataaagctt attgtcttag tatcgcagaa atatccaata ccctattcgg ggaatttagg 11400 atcgttccct tactagttga gatcctcaag gatgatagag tttaagaagc tagacgtggc 11460 cgattgagcc aatcatagga tggttgggaa gacgacaccg cgccaatcat ctcccataat 11520 gcttagagtc aagctgaata ttaacataag ccaggatccc gtgttgtcgg gcaaccacaa 11580 tctgacaatg ctgatatgat tattctgagt ctcgcccact gtcactttat taagaaaaaa 11640 cacaagaagc attgacatat aagggaaaac aaccaacaag ggagaacacg ggtaggacat 11700 ggcgggctcc ggtcccgaaa gggcagagca ccagatcatc ctaccagagt cacatctatc 11760 ctctccattg gtcaagcaca aattgctata ctactggaaa ttgactgggc taccgcttcc 11820 tgatgaatgc gactttgacc atctcattat cagcaggcaa tggaagagaa tactggagtc 11880 ggccactcct gacacagaga gaatgataaa actcgggcgg gcagtgcacc agactctcaa 11940 ccacaattcc aagataaccg gagtgctcca tcccaggtgt ttagaagaac tggctagtat 12000 tgaggtccca gattcaacta acaaattccg gaagattgaa aagaagatcc agattcacaa 12060 cacaaggtat ggagacctgt tcacaaagct gtgcacgcat gttgagaaga aattgctagg 12120 atcgtcccgg tctaataatg tcccacgatc agaggaattc agtagtatcc gtacagatcc 12180 ggcattctgg tttcactcaa aatggtccag agccaagttc gcgtggctcc atataaaaca 12240 agtccaaagg catctgattg tagcagcaag gacaaggtct gcagtcaaca agttagtaac 12300 attaagtcat aagataggcc acgtctttgt tactcctgag cttgtcattg tgacacatac 12360 agatgagaac aagttcacat gcctcaccca ggaacttgta ttgatgtatg cggatatgat 12420 ggaaggcagg gacatggtca atataatatc ttctacagca gcacatctca ggaacctatc 12480 cgagaaaatt gatgatattc tgcggttagt agatgctctg gcaaaggact taggtaatca 12540 agtctatgat gttgtagcat taatggaggg attcgcatac ggtgccgttc agctgcttga 12600 accatcaggt acatttgcag gagatttctt cgcatttaac ctacaggagc tcaaaaacac 12660 gttaatcgaa ctcctcccaa ataatatagc ggaagcagta actcacgcta ttgccactgt 12720 attctccggc ttagaacaga atcaagcagc tgagatgttg tgcttgctgc gtttgtgggg 12780 tcatccattg cttgagtctc gtagtgcagc aagagcagtc aggagccaga tgtgcgcacc 12840 aaagatggta gacttcgata tgatcctcca ggtattatct ttctttaaag gaacaatcat 12900 caatggatac agaaagaaga actcaggtgt gtggccgcgt gtcaaagtag atacaatata 12960 tggaaatatc attgggcagc tacatgctga ttcagcagag atctcacatg atgtcatgtt 13020 gagggagtac aagagtttat ctgctcttga atttgagcca tgtatagatt atgaccctgt 13080 taccaatcta agcatgttcc taaaagacaa ggcaatcgca catcctagtg ataactggct 13140 cgcctcattt aggcggaacc tactctctga ggaccagaag aaacagataa aagaggcaac 13200 ttcaactaac cgcctcctga tagagttctt agaatcaaat gattttgatc catataaaga 13260 aatggaatac ctgacaaccc tcgagtacct aagagatgac agtgtggcag tatcgtactc 13320 actcaaagag aaagaggtga aagtgaatgg gcggattttt gctaaattaa caaagaaact 13380 aaggaactgc caggtaatgg cagaaggaat tctagctgac cagattgcac ctttctttca 13440 gggaaatggg gtcattcaag atagcatatc cttgacaaag agtatgttag cgatgagtca 13500 actgtccttt aacagcaata agaaacgtat cactgactgc aaagagaggg tttcctcaaa 13560 ccgcaatcat gatcccaaga gcaagaatcg tagaagagtt gccactttta tcacgactga 13620 cctacaaaag tattgtctta actggagata tcagacagtc aaactattcg cccatgccat 13680 caatcagctg atgggcctac ctcatttctt tgagtggatt catcttaggc tgatggacac 13740 tacaatgttt gtaggggatc ctttcaatcc tccaagtgac ccgactgact gtgatctatc 13800 aagagtccca aatgatgata tatatattgt cagtgctaga gggggcattg agggactctg 13860 tcagaagcta tggacgatga tctcaattgc tgcaatccaa cttgctgcag caagatctca 13920 ttgtcgagtt gcctgcatgg tacaaggtga caatcaagta atagctgtaa cgagagaggt 13980 gagatcagat gattccccgg atatggtatt gacgcagttg catcaagcta gtgataattt 14040 cttcaaggaa ttgattcatg tcaatcatct gattggccat aacctgaagg atcgtgaaac 14100 cattagatca gacacattct tcatatacag taaacgaata ttcaaagatg gaacaatact 14160 cagtcaggtc ctcaaaaatt catctaaatt ggtgctaata tcaggtgacc ttagcgaaaa 14220 cactgtaatg tcctgtgcca acattgcatc cactgtagca cgactatgtg agaatgggct 14280 tcctaaggac ttctgttact atttgaacta cctaatgagt tgcgtgcaga catactttga 14340 ttcggagttt tctattaccc acagctcgca gtcagattcc aaccaatcct ggatcgagga 14400 tatctctttc gtacactcat acgtattaac ccctgcccag ctggggggac tgagcaacct 14460 tcaatactca aggctctaca caaggaatat tggtgaccca gggaccactg cttttgcaga 14520 ggtcaagcga ctagaagcag tggggttgtt gagtcccagc atcatgacta acatcttaac 14580 caggccacct ggcaatggag attgggccag cctatgcaac gacccatact cttttaattt 14640 tgagactgtt gcaagcccaa atattgtcct caagaaacat acacagaaag tcctatttga 14700 gacatgttca aaccccttat tatccggggt acatacagag gacaatgagg cagaagagaa 14760 agcattggct gaattcttac tcaatcaaga agtgattcac ccacgtgtcg cacatgctat 14820 catggaagca agctctgtgg gtaggagaaa gcaaattcaa gggcttgttg acacaacgaa 14880 cactgtgatt aagattgcac tgactaggag gcccctcggt atcaaaagac tgatgcggat 14940 aatcaattac tcgagcatgc atgcaatgtt gttcagagat gatattttct tatccaatag 15000 atccaaccac ccattagttt cttctaatat gtgctcgctg acgctagcag attatgcccg 15060 gaacagaagc tggtcacccc tgacaggggg caggaaaata ctgggtgtat ccaaccccga 15120 taccatagaa cttgtggagg gagagattct cagcgtcagt ggagggtgca caaaatgtga 15180 cagcggagat gagcagttta cttggttcca tcttccaagc aatatagagc tgactgatga 15240 caccagcaaa aatcccccga tgagagtgcc atatctcggg tcgaagactc aagagaggag 15300 agccgcctcg cttgcgaaaa tagcccacat gtcaccacat gtgaaagcag cactaagggc 15360 atcatccgtg ttaatctggg cttatgggga caacgaagtg aactggactg ctgctcttaa 15420 tattgcaagg tctcgatgca acataagctc agagtatctt cggctattgt cacccctgcc 15480 cacagctggg aatctccaac atagattgga tgatggcata acccagatga catttacccc 15540 tgcatctctc tacagagtgt cgccttacgt tcacatatcc aatgattctc aaaggttatt 15600 caccgaagaa ggggtcaaag agggaaacgt ggtttaccaa caaattatgc tcttggggtt 15660 atctctaatt gaatcactct tcccaatgac aacaaccaga acatatgatg agatcacatt 15720 acacctccac agtaaattta gctgctgtat ccgagaagcg cctgttgcgg ttcctttcga 15780 gctcttcggg ctggcaccgg aattaaggat ggtaacctca aataagttca tgtatgatcc 15840 tagccctata tcagagaggg attttgcgag acttgactta gctatcttca agagttatga 15900 gcttaatttg gaatcatatt ccacgctgga gctaatgaac attctttcga tatctagcgg 15960 gaaattgatt ggccaatccg tggtttctta tgatgaagat acttctataa agaatgatgc 16020 tataatagtg tatgacaaca cacgaaattg gattagtgag gcacagaact cagatgtggt 16080 ccgcctgttt gagtatgcag cactcgaagt gctccttgac tgtgcttatc aactctacta 16140 tctgagggta aggggtctaa acaacatcgt cctatacatg aatgacttat ataagaacat 16200 gccagggatc ctactctcca atattgcggc cacgatatcc caccccctca ttcactcaag 16260 gttgaatgca gtaggtctaa ttaatcatga cgggtcacac cagcttgcag atatagactt 16320 cgtcgaggtg tctgcaaaat tgttagtctc ttgcactcga cgcgtggtct caggcttata 16380 tgcagggaat aagtacgatc tgctgtttcc atctgtctta gatgataacc tgaatgagaa 16440 gatgcttcaa ctgatttccc ggttatgctg tctgtacaca gtgctctttg ctacaacaag 16500 agaaatccca aaaataaggg gtctatcggc agaagagaaa tgctcaatac tcactgagta 16560 tctactgtca gatgctgtaa aaccattgct taggcccgaa caagtgagtt ctatcatgtc 16620 tcccaacata atcacgttcc cagccaatct atattacatg tctaggaaga gccttaattt 16680 gatcagagaa cgagaggaca gagatactat cttgtcattg ttgttccctc aggaaccact 16740 gcttgagctt cgcccagtac gagacattgg tgctcgagtg aaagacccgt ttacccggca 16800 acccgcatca ttcatacaag agctagatct gagtgcccca gcaaggtacg acgcatttac 16860 actgagtaag gtttgcttcg agcatacatt accgaaccca aaggaagatt acctagtacg 16920 gtacttgttc agaggaatag ggactgcttc atcttcttgg tataaggcat ctcatcttct 16980 atccgtacct gaggtcaggt gtgcaagaca tgggaactcc ttatacttag cggaaggaag 17040 cggagccatc atgagtcttc ttgaattgca tataccacat gagactatct attacaatac 17100 acttttctcg aatgagatga accctccaca gcgacatttc ggacctacac caacacagtt 17160 tctaaactcg gtcgtttata ggaatctaca agcggaagtg ccatgtaaag atggatatgt 17220 ccaggagttc tgcccattat ggagagagaa tgcagaagaa agtgacctga cctcagataa 17280 ggcagttgga tatatcacat ctgtggtacc ctacaggtct gtatcattac tacattgtga 17340 cattgagatt cctccagggt ccaatcaaag cttattagat caactggcta ctaatttatc 17400 cctgattgcc atgcattctg tgagggaggg cggggtagtg atcatcaaag tactgtatgc 17460 aatggggtac tacttccatt tactcatgaa tttattcact ccatgttcca cgaaaggata 17520 tacactctcc aatggctatg cctgtagagg ggatatggag tgttacctga tattcgttat 17580 gggctgctta ggcgggccca ctttcgtgca cgaagtggta aggatggcaa aaactctaat 17640 acaacgacac ggtacacttc tatctaaatc agatgaaatc acattgacta agctatttac 17700 ctcacagcag cgtcgtgtaa cagatctcct atccagccct ttaccgaagc taatgaagct 17760 cttaagtgaa aatattgatg ctgcactaat tgaagccggg ggacagcccg tccgtccatt 17820 ctgtgcagaa agtttggtga gcacactaac aaatatgacc cagacaactc agatcattgc 17880 cagccacatt gacacagtca ttcggtccgt gatttacatg gaggctgagg gtgacctcgc 17940 cgacacagtg ttcttattta ctccttacaa tctatccaca gacggtaaaa agagaacatc 18000 acttaagcag tgcaccaaac agatcttgga agtcacaata ctgggtctca gagccaaaga 18060 tatcaataaa gtaggtgatg taatcagctt agtactcaga ggtgcggttt ccctagagga 18120 cctcatccca ttaaggacat acctgaagcg cagtacctgc cctaaatacc tgaaagcggt 18180 cctgggtatt actaaactca aagaaatgtt cacagatacc tcgttactgt acttgactcg 18240 cgctcaacaa aaattctaca tgaaaaccat aggtaatgct gccaagggat attacagtaa 18300 taatgactct taaaggcaat cgtacgccaa tcagttatct tcttagctga tgactccctc 18360 actgacttaa ttataccaga ttagaaaaaa gttaaattcc gactctttgg aactcgtatt 18420 cggattcagt tagttaactt taagcaaaaa tgcgcaaagt cgtctctaat tatagttatg 18480 tcattcacca aatctctgtt tggt 18504 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-NP-754R <400> 4 caagttgtaa tatgtagagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-NP-801-F <400> 5 gaagaagtac atccttcatc 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-P gene-366R <400> 6 gtcgagcatg gacagaagg 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-P-2268-F <400> 7 agaccagcga cacacagctc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-M-3621-R <400> 8 agctcgtgcc tgggattgtc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-M-130F <400> 9 cagcgtcttg attcgtggac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-F-realTime-R <400> 10 gtgttctgtt atatgcctcc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDcomR/ptR <400> 11 tgccactgmt agttgygata 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDcom156/f <400> 12 atacacctcr tcycagacag 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-HN-62R <400> 13 catgtgttct ttgcttctc 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-F 912F <400> 14 gaccttatct gtaagtaca 19 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF-7575R <400> 15 ttaggtggaa tagtcagcac c 21 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-HN-7102-F <400> 16 agcacttggt gtgcttcgg 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L gene 65R <400> 17 gaggatagat gtgactctgg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L gene 1212R <400> 18 gtatccattg atgattgttc 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-8569-F <400> 19 cgcttcctga tgaatgcg 18 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-All-10772-R <400> 20 attatcactg gcttgatgca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-10018-F <400> 21 tggaatacct gacaaccctc 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-11495-R <400> 22 catcagtcag ctctatattg c 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDVC7d-L-3193-F <400> 23 agattgcact gactaggagg 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7dCND-L-3512F <400> 24 atcttccaag caatataga 19 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7dCND-L-5373R <400> 25 gatgccttat accaaga 17 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7dCND-L-5068F <400> 26 attggtgctc gagtgaaag 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C7d-Lgene-6588R <400> 27 cttggcagca ttacctatg 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-14931-F <400> 28 agcggtcctg ggtattacta 20 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-178delta NgoMIV-IF <400> 29 taccaatggc cgccctctgc caact 25 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-Pgene-366R <400> 30 gtcgagcatg gacagaagg 19 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-NP-1576-F <400> 31 atcctgcaca gagcacca 18 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-M-3621-R <400> 32 agctcgtgcc tgggattgtc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDcom156/f <400> 33 atacacctcr tcycagacag 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d+Ampv-8563R <400> 34 ccagatcgga ctctatacag 20 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-HN-7102-F <400> 35 agcacttggt gtgcttcgg 19 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-all-L-511R <400> 36 tggaccattt tgagtgaa 18 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-10018-F <400> 37 tggaatacct gacaaccctc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-All-10772-R <400> 38 attatcactg gcttgatgca 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDVC7d-L-3193-F <400> 39 agattgcact gactaggagg 20 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7dCND-L-5373R <400> 40 gatgccttat accaaga 17 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7dCND-L-5068F <400> 41 attggtgctc gagtgaaag 19 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C7d-Lgene-6588R <400> 42 cttggcagca ttacctatg 19 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7-pro-new <400> 43 cttaatacga ctcactatag g 21 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-NP-801-F <400> 44 gaagaagtac atccttcatc 20 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-NP-1576-F <400> 45 atcctgcaca gagcacca 18 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-P-2268-F <400> 46 agaccagcga cacacagctc 20 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-M-339-R <400> 47 catggtgagg caggctctc 19 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-M-1F <400> 48 atggactcat ccaggaca 18 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-M-856F <400> 49 cggactaagc tacttgctcc t 21 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-F-realTime-R <400> 50 gtgttctgtt atatgcctcc 20 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-Fgene-7536F <400> 51 tatccgtctg acaagctct 19 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-F-5704-F <400> 52 tgagcggcaa cacatcagc 19 <210> 53 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-all-HN-948R <400> 53 aactgggaac catacacg 18 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-HN-7102-F <400> 54 agcacttggt gtgcttcgg 19 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-HN-7834-F <400> 55 aggtagtgtc ccttgccag 19 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-8569-F <400> 56 cgcttcctga tgaatgcg 18 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-9288-F <400> 57 aggtaatcaa gtctatgatg 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-10018-F <400> 58 tggaatacct gacaaccctc 20 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-11842R <400> 59 ctgtcagggg tgaccagct 19 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-11495-R <400> 60 catcagtcag ctctatattg c 21 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-3106F <400> 61 cgtgtcgcac atgctatcat gg 22 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-12507-F <400> 62 cgagaagcgc ctgttgcggt 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-13307-F <400> 63 cactgagtat ctactgtcag 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-6588 <400> 64 cttggcagca ttacctatgg 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-L-14931-F <400> 65 agcggtcctg ggtattacta 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBHA-ORI-142F <400> 66 cttaccggat acctgtccgc 20 <210> 67 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-178delta NgoMIV-IR <400> 67 agttggcaga gggcggccat tggta 25 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDVcomF <400> 68 atacacctcr tcycagacag 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDVcomR <400> 69 tgccactgmt agttgygata 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P480-NDV C7d-P-2268-F <400> 70 agaccagcga cacacagctc 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P550-NDV-C7d-M-3621-R <400> 71 agctcgtgcc tgggattgtc 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P436-NDV-C7d-M-5168 <400> 72 caatcttgcg ctcaatgtca 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P471-NDV C7d+Ampv-8563R <400> 73 ccagatcgga ctctatacag 20 <210> 74 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P753-NDV C7d-F 912F <400> 74 gaccttatct gtaagtaca 19 <210> 75 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P754-NDV C7d-HN-62R <400> 75 catgtgttct ttgcttctc 19 <210> 76 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P482-NDV C7d-HN-6401-F <400> 76 gaacggtcag aggagccac 19 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P755-NDV C7d-HN gene end-R <400> 77 gctcaatcgg ccacgtctag 20 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-Pgene-2788-F <400> 78 ggcatgatga aaattctgga c 21 <210> 79 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-AGF-AF-GS-IF <400> 79 tacgggtaga aaccgccacc atggatgtaa gaatctgtct 40 <210> 80 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-M-IR <400> 80 tcgaggcact ttgattctac ccgtattttt tcttatgctt a 41 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-M-3621-R <400> 81 agctcgtgcc tgggattgtc 20 <210> 82 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-M-GS-IF <400> 82 taagcataag aaaaaatacg ggtagaatca aagtgcctcg a 41 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-M-NgoMIV-R <400> 83 gccggcttga atgatgactt 20 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-M-856F <400> 84 cggactaagc tacttgctcc t 21 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-M-857F <400> 85 gactaagcta cttgctcctt 20 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-AMPV-B-F-6024F <400> 86 gaacataaca tgtaatgatg g 21 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-F-4317-R <400> 87 ggagcaactt gactatgatt 20 <210> 88 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-Fgene-7536F <400> 88 tatccgtctg acaagctct 19 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> La-4941F <400> 89 acagcggcac agataacagc a 21 <210> 90 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-HN-62R <400> 90 catgtgttct ttgcttctc 19 <210> 91 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-7351R <400> 91 gtggtgtcta agtccttctc at 22 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDVcomF <400> 92 atacacctcr tcycagacag 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDVcomR <400> 93 tgccactgmt agttgygata 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-Pgene-2640-F <400> 94 catccttaag tgatctccgg 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV-F-3614-R <400> 95 cctaatgtgg atactgcctc 20 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV-F-3345-F <400> 96 tggacccagc ctaattgaca c 21 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV-F-4421-R <400> 97 tcaatggtta tcgtgtcagc 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV-F-4129-F <400> 98 gatgattgtg aggtaaggga 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d-M-5201-R <400> 99 ctctcagtgt tagttgcact 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-M-857F <400> 100 gactaagcta cttgctcctt 20 <210> 101 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV-F-1130R <400> 101 ggggttaagg ctaccat 17 <210> 102 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV-F-591F <400> 102 cagaaggttc ctgaatgtgg tgag 24 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d+Ampv-8563R <400> 103 ccagatcgga ctctatacag 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-Pgene-2640-F <400> 104 catccttaag tgatctccgg 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV-F-3614-R <400> 105 cctaatgtgg atactgcctc 20 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV-F-3345-F <400> 106 tggacccagc ctaattgaca c 21 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV-F-4421-R <400> 107 tcaatggtta tcgtgtcagc 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV-F-4129-F <400> 108 gatgattgtg aggtaaggga 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d -M-5201-R <400> 109 ctctcagtgt tagttgcact 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV-C7d-M-857F <400> 110 gactaagcta cttgctcctt 20 <210> 111 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV-F-1130R <400> 111 ggggttaagg ctaccat 17 <210> 112 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aMPV-AF-591F <400> 112 cagaaggttc ctgaatgtgg tgag 24 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDV C7d+aMPV-8563R <400> 113 ccagatcgga ctctatacag 20

Claims (16)

  1. 뉴캣슬병 바이러스 게놈; 및
    서브타입(subtype) A형의 조류메타뉴모바이러스(aMPV)의 표면항원인 F 단백질을 암호화하는 유전자 및 서브타입(subtype) B형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원인 F 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하며,
    상기 서브타입 A형 및 서브타입 B형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원을 모두 발현하는, 키메라 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조류메타뉴모바이러스의 표면항원은 닭으로부터 분리한 조류메타뉴모바이러스로부터 유래된 것인, 키메라 바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈은, 뉴캣슬병 바이러스 게놈의 3’에서 5’방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것인, 키메라 바이러스.
  4. 제3항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈은,
    1) 상기 NP 단백질을 암호화하는 유전자의 5’말단에 연결된 T7 프로모터, 리더 서열, 및 3’UTR 서열; 및
    2) 상기 L 단백질을 암호화하는 유전자의 3’말단에 5’UTR, 트레일러 서열, 및 T7 종결 서열을 추가로 포함하는 것인, 키메라 바이러스.
  5. 제1항에 있어서, 상기 서브타입 A형의 조류메타뉴모바이러스의 F 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 및
    상기 서브타입 B형의 조류메타뉴모바이러스의 F 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것인, 키메라 바이러스.
  6. 제1항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈은 3’에서 5’방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것이며,
    1) 상기 서브타입 A형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원인 F 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴캣슬병 바이러스의 P 유전자와 M 유전자 사이에 위치하고, 및
    상기 서브타입 B형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원인 F 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴캣슬병 바이러스의 M 유전자와 F 유전자 사이에 위치하는 것인;
    키메라 바이러스.
  7. 제1항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스는 기탁번호 KCTC13595BP를 갖는 것인, 키메라 바이러스.
  8. 제1항에 있어서, 상기 키메라 바이러스는 기탁번호 KCTC13574BP를 갖는 서브타입 A형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원, 및 기탁번호 KCTC13575BP를 갖는 서브타입 B형의 조류메타뉴모바이러스의 표면항원을 발현하는 것인, 키메라 바이러스.
  9. 제1항에 있어서, 상기 키메라 바이러스는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 것인, 키메라 바이러스.
  10. 제1항에 있어서, 상기 키메라 바이러스는 기탁번호 KCTC14452BP를 갖는 것인, 키메라 바이러스.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 키메라 바이러스, 및 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 조류메타뉴모바이러스 감염증, 또는 조류메타뉴모바이러스 감염에 의한 조류 질병의 면역화용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 생백신, 사독백신, 서브유니트 백신, 벡터 백신, 키메라 백신, 및 DNA 백신으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 면역화용 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 불활성화된 형태인 백신인 것을 특징으로 하는, 면역화용 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 항원 보강제를 추가로 포함하는 것인, 면역화용 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 발육종란내(in ovo), 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 결막 및 피하경로로 이루어지는 군에서 선택되는 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는, 면역화용 조성물.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 키메라 바이러스, 및 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 조류메타뉴모바이러스 감염증, 또는 조류메타뉴모바이러스 감염에 의한 조류 질병의 면역화용 조성물을,
    조류에 투여하여 면역화를 유도하는 단계를 포함하는, 조류의 면역화 방법.
KR1020210037426A 2021-03-23 2021-03-23 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신 KR102532698B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210037426A KR102532698B1 (ko) 2021-03-23 2021-03-23 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신
PCT/KR2022/004093 WO2022203404A1 (ko) 2021-03-23 2022-03-23 뉴캐슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210037426A KR102532698B1 (ko) 2021-03-23 2021-03-23 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220132295A KR20220132295A (ko) 2022-09-30
KR102532698B1 true KR102532698B1 (ko) 2023-05-16

Family

ID=83397694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210037426A KR102532698B1 (ko) 2021-03-23 2021-03-23 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102532698B1 (ko)
WO (1) WO2022203404A1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102154794B1 (ko) 2019-10-18 2020-09-22 주식회사 바이오포아 조류 인플루엔자 바이러스 h9n2의 표면항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 발현 시스템 및 이를 이용한 조류 백신
KR102154796B1 (ko) 2019-10-18 2020-09-22 주식회사 바이오포아 변이 뉴캣슬병 바이러스 및 상기 바이러스를 이용한 조류 백신

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101636683B1 (ko) * 2013-08-28 2016-07-07 주식회사 바이오포아 내열성이 향상된 뉴캣슬병 바이러스 ｂｐ ａｃｎｄｍ

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102154794B1 (ko) 2019-10-18 2020-09-22 주식회사 바이오포아 조류 인플루엔자 바이러스 h9n2의 표면항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 발현 시스템 및 이를 이용한 조류 백신
KR102154796B1 (ko) 2019-10-18 2020-09-22 주식회사 바이오포아 변이 뉴캣슬병 바이러스 및 상기 바이러스를 이용한 조류 백신

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Scientific Reports. 2017, Vol.7, No. 4025, pp. 1-8.

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220132295A (ko) 2022-09-30
WO2022203404A1 (ko) 2022-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6845266B2 (ja) 多価組換型鳥ヘルペスウイルス及び鳥類を免疫化するためのワクチン
KR101715418B1 (ko) 뉴캐슬 질환 바이러스-벡터를 이용한 조류 백신
CN105567648B (zh) 用于免疫接种水禽物种的重组禽疱疹病毒载体和疫苗
JP5508252B2 (ja) 鳥インフルエンザ遺伝子を含有する組み換え七面鳥ヘルペスウイルス
US11305007B2 (en) Composite multi-epitope expression cassette, a recombinant virus composed thereof and application thereof
JP6210998B2 (ja) ベクターワクチンおよび生ワクチンの併用による感染症の予防方法
JP2012509308A (ja) 遺伝子組み換え不活性化ウィルスベクターワクチン
CN114292823A (zh) 携带基因VII型新城疫病毒F和HN基因的重组LaSota疫苗株及其构建方法和应用
KR102154796B1 (ko) 변이 뉴캣슬병 바이러스 및 상기 바이러스를 이용한 조류 백신
KR102154794B1 (ko) 조류 인플루엔자 바이러스 h9n2의 표면항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 발현 시스템 및 이를 이용한 조류 백신
KR101102271B1 (ko) 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 및 이를 포함하는 닭전염성 기관지염 백신
KR102532698B1 (ko) 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신
US20130129780A1 (en) Modified infectious laryngotracheitis virus (iltv) and uses thereof
KR102154795B1 (ko) 조류 인플루엔자 바이러스 h5n6의 표면항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 발현 시스템 및 이를 이용한 조류 백신
JP2020537507A (ja) パラミクソウイルス科の発現系
WO2009143332A2 (en) Poultry viral materials and methods related thereto
KR20210035676A (ko) 뉴캐슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신
KR20210035675A (ko) 뉴캐슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신
WO2003074552A1 (en) An infectious bursal disease virus variant
KR101073991B1 (ko) 국내사육 닭에서 유행하는 신규한 ｂ형 조류메타뉴모바이러스 ｓｃ1509주 및 이의 용도
US9370563B2 (en) Newcastle disease virus and the use thereof as a vaccine
US11033616B2 (en) Recombinant viral vector systems expressing exogenous feline paramyxovirus genes and vaccines made therefrom
US10201602B2 (en) Recombinant vaccine against PRRS in a viral vector
MXPA00007313A (en) A recombinant newcastle disease virus for in ovo vaccination

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant