KR101715418B1 - 뉴캐슬 질환 바이러스-벡터를 이용한 조류 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자조작된 뉴캐슬 질환 바이러스 (Newcastle Disease Virus: NDV) 백신 또는 조성물을 포함한다. 백신 또는 조성물은 재조합 백신일 수 있다. 본 발명은 또한 조류 병원균 항원, 더욱 특히 조류 독감 단백질, 에피토프 또는 면역원을 코딩하고 발현하는 재조합 벡터를 포함한다. 이러한 백신 또는 조성물은 질환에 대항하여 동물, 특히 조류를 보호하기 위해 사용될 수 있다.
Description
참조에 의한 인용
본 출원은 2009 년 4 월 3 일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/166,481 호의 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 NDV-벡터를 이용한 조류 백신 또는 조성물, 특히 조류 독감 백신을 포함한다. 백신은 유전자조작된 조류 백신일 수 있다.
최근 몇 년 동안의 여러 연구가 조류 질환에 대한 백신 벡터로서 사용되어지는 뉴캐슬 질환 바이러스 (Newcastle Disease Virus: NDV) 의 잠재력을 강조하고 있다 (Krishnamurthy et al., Virology 278, 168-182,2000; Huang et al., J. Gen. Virol. 82, 1729-1736, 2001; Nakaya et al., J. Virol. 75, 11868-11873, 2001; Park et al. PNAS 103, 8203-8208, 2006; Veits et al PNAS 103, 8197-8202, 2006; Ge et al. J. Virol. 81, 150-158, 2007; Romer-Oberdoerfer et al. Vaccine 26, 2307-2313, 2008).
NDV 는 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae) 과 아불라바이러스 (Avulavirus) 속에 속한다. NDV 는 호흡 및 위장관에서, 난관에서, 그리고 일부 단리물의 경우에는, 신경계에서 복제된다. 전염은 흡입성이고 구강 및 배설물 경로에 의해 이루어진다. NDV 는 모든 종의 새에 영향을 주는 고도로 전염성이고 치명적인 질환을 야기하며, 일부 포유류 종을 감염시킬 수 있다. 질환은 바이러스 균주 및 숙주 종에 따라, 임상적으로 명백하지 않은 형태에서 매우 악성인 형태까지 다양할 수 있다. NDV 균주에 의해 보여지는 독성의 연속적인 스펙트럼은 이들을 3 가지 상이한 병원형인 약독형, 중간독형, 및 강독형으로 그룹을 나눌 수 있다 (Alexander, D. J., Diseases of Poultry, Iowa State Uni. Press, Ames IA, 541-569, 1997). 약독형 균주는 통상적으로는 성체 닭에서 질환을 야기하지 않으며, 미국 및 다른 국가의 양계업에서 생 백신으로서 널리 사용된다. 중간 독성의 바이러스는 중간독형으로 불리는 반면, 높은 폐사율을 야기하는 바이러스는 강독형으로 불린다. 질환은 전세계적인 분포를 가지며 소비적 가금류 생산에 끊임없는 큰 위협을 주고 있다.
NDV 게놈은 대략 15 kb 의 RNA 의 비-분절 (-) 가닥이다. 게놈성 RNA 는 하기 단백질을 다음과 같은 순서로 코딩하는 6 개의 유전자를 함유한다: 뉴클레오캡시드 단백질 (NP), 인단백질 (P), 매트릭스 단백질 (M), 융합 단백질 (F), 적혈구응집소-뉴라미니다아제 (HN) 및 대형 폴리머라아제 단백질 (L). 알려지지 않은 기능의 2 개의 부가적인 단백질인 V 및 W 는 P 유전자 전사 동안의 RNA 편집에 의해 생산된다 (Steward et al., 1993, Journal of General Virology 74:2539-2547).
최근에 성립된, 클로닝된 cDNA 로부터 전체적으로 비-분절 (-) RNA 바이러스를 회수하기 위한 방법의 개발은 NDV 를 포함하는 상기 바이러스 그룹을 유전적으로 조작하는 가능성을 열어두었다 (Conzelmann, K.K., Ann. Rev. Genet. 32, 123-162, 1998; Roberts and Rose, Virology 247, 1-6, 1998). "역 유전학" 이라고 불리는 상기 독특한 분자 유전학 방법론은 다양한 바이러스-코딩된 유전자의 기능을 연구하기 위한 것일 뿐 아니라 (Palese et al., PNAS 93, 11354-11358, 1996; Nagai, Y., Rev. Med. Virol. 9, 83-99, 1999), 이종 유전자를 발현시키기 위해 상기 바이러스를 사용하는 것을 허용하기 위한 수단을 제공한다 (Bukreyev et al., J. Virol. 70, 6634-6641, 1996; Mebatsion et al., PNAS 93, 7310-7314, 1996; Schnell et al., PNAS 93, 11359-11365, 1996; Hasan et al., J. Gen. Virol. 78, 2813-2820, 1997; He et al., Virology 237, 249-260, 1997; Sakai et al., FEBS Lett. 45, 221-226, 1999). 이것은 개선된 백신 및 백신 벡터의 신규한 생성 방법을 제공한다.
NDV 의 약독형 백신 균주 (LaSota) 에 근거한, 클로닝된 cDNA 로부터의 회수 시스템은 1999 년에 2 개의 독립된 그룹에 의해 동시에 보고되었다 (Peeters et al., 1999; Romer-Oberdorfer et al., 1999). 첫번째 보고된 시스템에서, LaSota 균주 (ATCC-VR699) 로부터의 전장 NDV cDNA 는 T7 DNA-의존성-RNA 폴리머라아제 프로모터를 함유하는 pOLTV5 전사 벡터 내에 조립되었다. NDV 전사효소 복합체의 개별적인 클론 (NP, P, 및 L) 을 진핵 발현 벡터에서 클로닝하였다. 동시-트랜스펙션 프로토콜은 감염된 단층 내에 여러 개의 감염성 중심을 발생시켰다 (Peeters et al., J. Virol. 73, 5001-5009, 1999). 클로닝된 cDNA 로부터 약독형 NDV 를 회수하는 것에 대해 보고된 두번째 시스템은 본질적으로, 전장 반-게놈성 발현 플라스미드 및 지지체 플라스미드를 조립하는 동일한 전략을 사용하였다 (Romer-Oberdorfer et al., Journal of General Virology, 80, 2987-2995, 1999). 최근, 약독형 Hitchner B1 (Nakaya et al., 2001) 또는 NDV 의 LaSota 균주 (Huang et al., 2001) 를 회수하기 위한 다른 시스템이 개발되었다. 재조합 중간독형 NDV 의 회수에 이용가능한 유일한 시스템은 문헌 [Krishnamurthy et al. (2000)] 에 의해 기재되어 있다. 상기 시스템은 트랜스펙션을 위해 백시니아 바이러스 재조합체 (MVA) 및 HEP-2 세포를 이용하였다. 중간독형 균주 Beaudette C 의 전장 클론 및 동일한 균주로부터의 지지체 플라스미드 (N, P, 및 L) 를 트랜스펙션에 사용하였다. CAT 리포터 유전자를 코딩하는 부가적인 전사 유닛을 HN 과 L 유전자 사이에 두었다. CAT 유전자를 발현하는 rNDV 의 성장이 지연되었고, 바이러스는 약화되었다. CAT 리포터 유전자는 세포 배양 시 여러 계대 동안 안정하게 발현되었다.
종종 조류 플루라고도 불리고 통상적으로 새 플루로서 인지되는 조류 독감 (AIV) 은 새에 적응된 독감 바이러스에 의해 야기된 독감을 말한다. AIV 는 오르소믹소비리다에 (Orthomyxoviridae) 과에 속하는 분절된, 단일-가닥, (-) 센스 RNA 바이러스이고, 유형 A 독감 바이러스로 분류된다. 유형 A 바이러스는 동물 및 인간 독감의 가장 흔한 원인이다. 상기 유형은 2 개의 표면 지질-외피 (enveloped) 막 단백질, 적혈구응집소 (HA) 및 뉴라미니다아제 (NA) 를 주로 근거로 하여 구별되는 수 많은 균주 또는 서브유형에서 일어난다. HA 는 숙주 세포 내로의 바이러스의 도입을 용이하게 하고, NA 는 감염된 세포로부터의 자손 바이러스의 방출을 돕는다 (de Jong et al., J Clin Virol. 35(1):2-13, 2006). 독감 유형 A 바이러스는 특이적인 HA 및 NA 함량에 근거하여 서브유형으로 나뉜다. 16 가지의 상이한 HA 서브유형과, 9 가지의 상이한 NA 서브유형이 있다. HA 와 NA 단백질의 많은 상이한 조합이 가능하다. 독감 A 바이러스의 서브유형은 그들의 HA 및 NA 표면 단백질에 따라 명명된다. 예를 들어, "H7N2 바이러스" 는 H7 서브유형의 HA 단백질 및 N2 서브유형으로부터의 NA 단백질을 갖는 독감 A 서브유형으로 지정된다. 유사하게는, "H5N1" 바이러스는 H5 서브유형의 HA 및 N1 서브유형으로부터의 NA 를 갖는다. H5N1 서브유형은 아시아, 러시아, 중동, 유럽 및 아프리카에서의 최근의 발발과 특이적으로 관련이 있다 (Olsen et al., Science 21;312(5772):384-8, 2006).
독감 A 바이러스는 인간, 돼지, 말, 바다표범, 고래, 가금류, 고양이, 개, 족제비 (페렛) 및 다른 동물을 감염시킬 수 있으나, 야생 새가 이들의 자연적 숙주이다. 물새는 바이러스 계통이 이들의 숙주, 예를 들어, 인간, 돼지 및 말 독감으로 진전되고 적응될 주요 독감 병원소가 된다. 숙주 특이성은 절대적이지 않으며, 인간, 고양이, 개 및 돼지 종을 감염시키는 고도로 병원성인 조류 독감 (HPAI) H5N1 서브유형의 능력에 의해 예증되는 바와 같이 교차-종 전염이 일어날 수 있다.
고도로 병원성인 독감 A 바이러스 서브유형 H5N1 바이러스는 잠재적인 유행병 위협으로서 국제적인 우려 사안인 최근 발발한 조류 독감 바이러스이다. H5N1 은 아시아, 유럽 및 아프리카 전역에 걸쳐 증가하는 수의 국가에서 수백만 마리의 가금류를 치사시켰다. 유형 B 독감과 달리, 유형 A 독감은 항원 변이 (2 가지 이상의 상이한 바이러스 균주가 조합되어 신규 서브유형을 형성함) 를 겪고, 역학자, 감염성 질환 연구자, 및 다른 건강 전문가는 인간 플루 바이러스 및 조류 플루 바이러스 (특히 H5N1) 의 공존이 유전 물질로 하여금 종-특이적 바이러스 사이에서 교환되게 되는 기회를 제공할 수 있고, 가능하게는 인간에게 쉽게 전염가능하고 치명적인 신규 악성 독감 균주가 창조될 가능성을 몹시 우려하고 있다 (Food Safety Research Information Office. "A Focus on Avian Influenza". Created May 2006, Updated November 2007).
첫번째 H5N1 발병이 1997 년에 일어났으므로, 임상적으로 심각하고 치명적인 인간 감염을 야기하는 HPAI H5N1 의 새에서 인간으로의 전염 횟수가 증가하였다. 그러나, 새와 인간 사이에 존재하는 유의한 종 장벽이 있기 때문에, 바이러스는 쉽게 인간으로 넘어서지 못한다. 발견 이래로 수백만 마리의 새가 바이러스로 감염되게 되었지만, 오직 약 200 명의 인간만이 인도네시아, 라오스, 베트남, 루마니아, 중국, 터키 및 러시아 연방에서 조류 플루로 사망하였다.
AIV 에 대한, 인간을 비롯한 동물의 감수성을 고려하면, AIV 감염 예방 및 동물 보호 수단이 필수적이다. 따라서, 독감에 대한 효과적인 백신에 대한 필요성이 있다.
본 출원 중의 임의의 문헌의 언급 또는 고지가 이러한 문헌이 본 발명에 대한 종래 기술로서 이용가능하다는 승인은 아니다.
발명의 요약
본 발명은 일부분, 뉴캐슬 질환 바이러스 (Newcastle Disease Virus: NDV) 의 장향성 AVINEW® 균주에 의해 발현된 AIV 적혈구응집소 유전자가 조류에서 고도로 면역원성이었다는 본 출원인의 발견에 근거한다.
본 발명은 특정 조류 항원, 더욱 특히 조류 독감 항원, 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클을 가지고 있고 발현하는 내재성 장 향성을 갖는, 유효량의 유전자조작된 NDV 벡터를 포함할 수 있는 NDV-벡터를 이용한 조류 백신 또는 조성물에 관한 것이다. 장향성 NDV 는 메리얼 리미티드 [Merial Limited] 에서 시판되는 AVINEW® 개질 생 백신의 NDV 균주일 수 있다.
조류 독감 항원은 적혈구응집소일 수 있다. 조류 독감 HA 항원은 H5 서브유형으로부터의 HA 일 수 있다.
본 발명은 또한 유효량의 재조합 NDV 벡터 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클을 포함할 수 있는 유효량의 백신을 조류에게 투여하는 것을 포함하는 조류를 백신접종하는 방법에 관한 것이다. 투여는 알 내, 점안액, 스프레이, 식수에 의한 것 또는 비경구 (피하, 근육내, 경피) 투여일 수 있다.
Avinew® NDV 게놈의 비-필수 영역 내의 단리된 폴리뉴클레오티드를 Avinew NDV 게놈 내에 도입하는 것을 포함하는, 유전자조작된 Avinew NDV 를 제조하기 위한 Avinew NDV 의 게놈의 개질 방법에 관한 것이다. 비필수 영역은 비필수 단백질을 코딩하는 개방형 해독 프레임 또는 개방형 해독 프레임의 비-필수 부분; 또는 NP 유전자 업스트림, 또는 2 개의 유전자 사이 (유전자간 영역), 또는 Avinew NDV 게놈의 L 유전자로부터의 다운스트림에 위치한 미번역 (또는 비-코딩) 영역일 수 있다.
또한 본 발명은 프라임-부스트 프로토콜을 사용하는 백신 또는 조성물의 투여에 관한 것이다. 본 발명은 유효량의 유전자조작된 NDV 벡터 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클을 포함할 수 있는 본 발명의 백신의 투여 전에 조류 독감 백신으로 조류를 프라임 접종 (priming) 하는 것에 관한 것이다. 대안적으로는, 본 발명은 또한 조류 독감 백신의 투여 전에 본 발명의 백신 (하나 이상의 조류 독감 항원을 발현하는 유전자조작된 NDV 벡터 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체) 으로 프라임 접종하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 또한 재조합 독감 면역학적 조성물 또는 백신, 또는 비활성화된 면역학적 조성물 또는 백신 중 임의의 하나를 포함할 수 있는 면역 반응을 도출 또는 유도하는 방법을 수행하기 위한 키트, 및 방법을 수행하기 위한 지침을 포함한다.
따라서, 본 출원인이 권리를 유보하고 이에 의해 임의의 미리 공지된 제품, 공정, 또는 방법의 권리 포기를 명시하는 식으로 본 발명 내에 임의의 미리 공지된 제품, 제품의 제조 공정, 또는 제품의 사용 방법을 포함하지 않는 것이 본 발명의 목적이다. 본 발명이, 본 출원인이 권리를 유보하고 이에 의해 임의의 미리 기재된 제품, 제품의 제조 공정, 또는 제품의 사용 방법의 권리 포기를 명시하는 식으로, USPTO (35 U.S.C. §112, 첫째 단락) 또는 EPO (EPC, 제 83 조) 의 기재요건 및 실시가능요건을 충족시키지 못하는, 임의의 제품, 공정 또는 제품의 제조 또는 제품의 사용 방법을 본 발명의 범주 내에 포함하는 것으로 의도되지 않음이 추가로 명시된다.
이들 및 다른 구현예가 기재되거나, 하기 상세한 설명으로부터 명백해지고 상세한 설명에 의해 포함된다.
예로 제시되었으나, 본 발명이 단지 기재된 특정 구현예에만 제한되는 것으로 의도되지 않는 하기 상세한 설명은 하기 첨부 도면과 함께 최적으로 이해될 수 있다:
도 1A 는 전장 NDV 게놈의 유전학 맵을 나타낸다; 도 1B 는 전장 NDV 게놈 내의 2 개의 대표적 이식유전자 삽입 부위 내로 독감 HA 삽입을 가진 2 개의 유전자조작된 NDV 의 유전학 맵을 보여주는 맵을 나타낸다; 도 1C 는 NDV 역 유전학 시스템의 흐름도의 예이다; 도 1D 는 NDV 역 유전학을 사용하는 유전자조작된 NDV 감염성 입자를 회수하기 위한 방식을 나타낸다.
도 2 는 역 유전학 개발을 위해 전사 플라스미드 내로 AVINEW 전체 게놈의 클로닝 및 P 와 M 유전자 사이의 이식유전자의 용이한 클로닝을 가능하게 하는 독특한 제한 부위 (PacI & FseI) 의 삽입의 도식을 나타낸다.
도 3 은 플라스미드 pIV029 의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 4a-4o 는 플라스미드 pIV0291 의 삽입체의 서열을 나타낸다. 이태리체는 비 AVINEW® 서열을 나타내고, 밑줄친 이태리체는 P 와 M 유전자 사이의 내부 PacI-FseI 삽입을 나타내고, 이태리체는 HDV 리보자임 (3' 말단) 을 나타내고, 밑줄친 이태리체는 T7 프로모터 (5' 말단) 및 터미네이터 (3' 말단) 를 나타낸다. 전사 시작 서열 (GS=Gene Start) 및 전사 종결 서열 (GE=Gene End) 이 맵에 표시되어 있고 서열이 밑줄쳐 있다. 동그라미 쳐진 T (도 4c 에서 위치 3190) 는 둘러싸진 뉴클레오티드 (PacI-FseI 삽입 전) 를 말하며: 이것은 전사 벡터 내에 조립된 AVINEW® 게놈 중의 T (SEQ ID NO:24 의 위치 3190) 이다 (T 는 PacI 및 FseI 제한 부위를 제작하기 위해 사용되는 프라이머로부터 유래한다). 공통 AVINEW® 게놈 (SEQ ID NO:1) 에서, 상응하는 위치 3150 에서의 뉴클레오티드는 C 이다.
도 5 는 플라스미드 pIV32 의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 6 은 플라스미드 pIV33 의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 7 은 플라스미드 pIV034 의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 8 은 플라스미드 pNS151 의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 9 는 NDV 삽입 카세트를 통해 NDV 게놈 내로 AIV HA 유전자를 도입하기 위한 도식적인 방법을 나타낸다.
도 10 은 플라스미드 pIV039 의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 11A 및 11B 는 유전자조작된 NDV vAVW02 에 의한 HA 발현을 나타낸다. 삽입체를 함유하지 않는 vAVW01 은 음성 대조군으로서 사용된다. HA 발현은 바이러스-접종된 발육란의 요막액 내 웨스턴 블롯 (도 11A 의 왼쪽 패널) 또는 감염된 CHO 세포 용해물로부터의 웨스턴 블롯 (도 11A 의 오른쪽 패널) 에 의해, 또는 감염된 CHO 세포 상에 항-H5 양성 닭 혈청을 사용하는 감염된 CHO 세포 내 면역형광 (도 11B) 에 의해 검출된다.
도 12 는 DNA 및 단백질 서열에 배정된 SEQ ID NO 를 나타내는 표이다.
도 13 은 상이한 그룹의 백신접종된 SPF 층의 1 일령 닭 자손 내 항-NDV 및 항-AI (H5N1 C12 또는 H5N9LP 항원에 대한) 모체 유래 항체 (Maternally Derived Antibody: MDA) HI 적정 농도를 나타낸다.
도 14 는 SPF 닭에서 유전자조작된 NDV 에 의해 유도된 조류 독감 보호의 평가를 위한 백신접종/접종 시간표 및 프로토콜을 나타낸다.
도 15 는 vAVW01 (v01 또는 01; 삽입된 유전자 없음) 또는 vAVW03 (v03 또는 03; AI HA 삽입체) 으로 해당 날짜 일령에 백신접종된, MDA (SPF) 또는 NDV MDA 가 없는 (21A), 또는 NDV 및 H5 MDA 와 또는 H5 오직 MDA 만 있는 (21B) 닭의 폐사율의 동역학 챠트를 보여준다.
도 16 은 vAVW01 또는 vAVW03 으로 백신접종된 MDA 가 없는 (SPF) 또는 있는 닭의 구강 (A & C) 및 배설강 (B & D) 의 면봉 채취 표본으로부터 AIV 방출의 비교를 나타낸다. C 및 D 에서의 결과는 접종 후 상이한 시점에 vAVW01-면역화된 닭의 HPAI H5N1 접종 방출 평균 수준과 vAVW03-면역화된 닭의 HPAI H5N1 접종 방출 평균 수준 사이의 log10 의 비율로서 표현된다.
도 17 은 백신접종 후 (D21) 및 접종 후 (D35) vAVW03-유도된 AIV HI 적정 농도 (H5N9 (A) 또는 H5N1 계통군 2.2 (B) 항원 사용) 에 대한 NDV MDA 효과 (SPF: MDA 없음; NDV: 항-NDV MDA) 를 나타낸다. 그림에 적힌 숫자는 양성 혈청/시험된 총 수에 해당한다. NDV MDA 의 존재하에서, AIV HI 적정 농도는 백신접종 후에 높아졌으며, NDV MDA 가 없는 SPF 병아리에서의 결과와 비교하여 접종 후에 증가하지 않았다.
도 18 은 MDA 가 없는 (SPF), AI H5N9 및 NDV MDA (H5N9+NDV), NDV MDA (NDV) 또는 AI H5N1 (H5N1) MDA 가 있는 닭에서 vAVW01 또는 vAVW03 으로의 백신접종 후 (D0 에) D21 NDV HI 적정 농도를 나타낸다; NDV MDA 는 vAVW01 또는 vAVW03 에 의해 유도된 NDV HI 적정 농도의 수준에 대해 부정적인 영향을 주지는 않았다.
도 19 는 D0 및 D21 에서 AVINEW(G1), vAVW02(G2) 및 vAVW03(G3) 으로의 2 회 백신접종 후 NDV HI 적정 농도를 나타낸다.
도 20 은 D0 및 D21 에서 vAVW02(G2) 또는 vAVW03(G3) 으로의 2 회 백신접종 후 AI H5N1 HI 적정 농도를 나타낸다.
도 21 은 D0 및 D21 에서 vAVW02(G2) 또는 vAVW03(G3) 으로의 2 회 백신접종 후 AI H5N1 SN 적정 농도를 나타낸다.
도 22A 및 22B 는 vAVW03 의 1 회 (D0 에) 또는 2 회 (D0 및 D14 에) 점안액 투여에 의해 유도되는, NDV HI 적정 농도 및 AIV SN 적정 농도를 각각 나타낸다.
도 23A-23D 는 제 28 일에 HPAI H5N1 단리물로 접종된 비백신접종된 (그룹 1) 또는 백신접종된 (그룹 2: D0 에 vAVW03 의 1 회 투여; 그룹 3: D0 및 D14 에 vAVW03 의 2 회 투여; 그룹 4: D0 에 vFP89 로, D14 에 vAVW03 으로 프라임-부스트 투여) 사향 오리 새끼로부터의 입인두 (A 및 C) 및 배설강 (B 및 D) 의 면봉 채취 표본 내 바이러스 적하량 (A 및 B) 및 양성 샘플의 % (C 및 D) 의 동역학을 나타낸다.
도 24A-24D 는 제 42 일에 HPAI H5N1 단리물로 접종된 비백신접종된 (그룹 1) 또는 백신접종된 (그룹 2: D0 에 vAVW03 의 1 회 투여; 그룹 3: D0 및 D14 에 vAVW03 의 2 회 투여; 그룹 4: D0 에 vFP89 로, D14 에 vAVW03 으로 프라임-부스트 투여) 사향 오리 새끼로부터의 입인두 (A 및 C) 및 배설강 (B 및 D) 의 면봉 채취 표본 내 바이러스 적하량 (A 및 B) 및 양성 샘플의 % (C 및 D) 의 동역학을 나타낸다.
도 25 는 아미노산 수준에서의 조류 독감 HA 단백질과 서열 일치성 % 사이의 서열 정렬을 제공한다.
도 26 은 핵산 수준에서의 조류 독감 HA 단백질과 서열 일치성 % 사이의 서열 정렬을 제공한다.
도 1A 는 전장 NDV 게놈의 유전학 맵을 나타낸다; 도 1B 는 전장 NDV 게놈 내의 2 개의 대표적 이식유전자 삽입 부위 내로 독감 HA 삽입을 가진 2 개의 유전자조작된 NDV 의 유전학 맵을 보여주는 맵을 나타낸다; 도 1C 는 NDV 역 유전학 시스템의 흐름도의 예이다; 도 1D 는 NDV 역 유전학을 사용하는 유전자조작된 NDV 감염성 입자를 회수하기 위한 방식을 나타낸다.
도 2 는 역 유전학 개발을 위해 전사 플라스미드 내로 AVINEW 전체 게놈의 클로닝 및 P 와 M 유전자 사이의 이식유전자의 용이한 클로닝을 가능하게 하는 독특한 제한 부위 (PacI & FseI) 의 삽입의 도식을 나타낸다.
도 3 은 플라스미드 pIV029 의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 4a-4o 는 플라스미드 pIV0291 의 삽입체의 서열을 나타낸다. 이태리체는 비 AVINEW® 서열을 나타내고, 밑줄친 이태리체는 P 와 M 유전자 사이의 내부 PacI-FseI 삽입을 나타내고, 이태리체는 HDV 리보자임 (3' 말단) 을 나타내고, 밑줄친 이태리체는 T7 프로모터 (5' 말단) 및 터미네이터 (3' 말단) 를 나타낸다. 전사 시작 서열 (GS=Gene Start) 및 전사 종결 서열 (GE=Gene End) 이 맵에 표시되어 있고 서열이 밑줄쳐 있다. 동그라미 쳐진 T (도 4c 에서 위치 3190) 는 둘러싸진 뉴클레오티드 (PacI-FseI 삽입 전) 를 말하며: 이것은 전사 벡터 내에 조립된 AVINEW® 게놈 중의 T (SEQ ID NO:24 의 위치 3190) 이다 (T 는 PacI 및 FseI 제한 부위를 제작하기 위해 사용되는 프라이머로부터 유래한다). 공통 AVINEW® 게놈 (SEQ ID NO:1) 에서, 상응하는 위치 3150 에서의 뉴클레오티드는 C 이다.
도 5 는 플라스미드 pIV32 의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 6 은 플라스미드 pIV33 의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 7 은 플라스미드 pIV034 의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 8 은 플라스미드 pNS151 의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 9 는 NDV 삽입 카세트를 통해 NDV 게놈 내로 AIV HA 유전자를 도입하기 위한 도식적인 방법을 나타낸다.
도 10 은 플라스미드 pIV039 의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 11A 및 11B 는 유전자조작된 NDV vAVW02 에 의한 HA 발현을 나타낸다. 삽입체를 함유하지 않는 vAVW01 은 음성 대조군으로서 사용된다. HA 발현은 바이러스-접종된 발육란의 요막액 내 웨스턴 블롯 (도 11A 의 왼쪽 패널) 또는 감염된 CHO 세포 용해물로부터의 웨스턴 블롯 (도 11A 의 오른쪽 패널) 에 의해, 또는 감염된 CHO 세포 상에 항-H5 양성 닭 혈청을 사용하는 감염된 CHO 세포 내 면역형광 (도 11B) 에 의해 검출된다.
도 12 는 DNA 및 단백질 서열에 배정된 SEQ ID NO 를 나타내는 표이다.
도 13 은 상이한 그룹의 백신접종된 SPF 층의 1 일령 닭 자손 내 항-NDV 및 항-AI (H5N1 C12 또는 H5N9LP 항원에 대한) 모체 유래 항체 (Maternally Derived Antibody: MDA) HI 적정 농도를 나타낸다.
도 14 는 SPF 닭에서 유전자조작된 NDV 에 의해 유도된 조류 독감 보호의 평가를 위한 백신접종/접종 시간표 및 프로토콜을 나타낸다.
도 15 는 vAVW01 (v01 또는 01; 삽입된 유전자 없음) 또는 vAVW03 (v03 또는 03; AI HA 삽입체) 으로 해당 날짜 일령에 백신접종된, MDA (SPF) 또는 NDV MDA 가 없는 (21A), 또는 NDV 및 H5 MDA 와 또는 H5 오직 MDA 만 있는 (21B) 닭의 폐사율의 동역학 챠트를 보여준다.
도 16 은 vAVW01 또는 vAVW03 으로 백신접종된 MDA 가 없는 (SPF) 또는 있는 닭의 구강 (A & C) 및 배설강 (B & D) 의 면봉 채취 표본으로부터 AIV 방출의 비교를 나타낸다. C 및 D 에서의 결과는 접종 후 상이한 시점에 vAVW01-면역화된 닭의 HPAI H5N1 접종 방출 평균 수준과 vAVW03-면역화된 닭의 HPAI H5N1 접종 방출 평균 수준 사이의 log10 의 비율로서 표현된다.
도 17 은 백신접종 후 (D21) 및 접종 후 (D35) vAVW03-유도된 AIV HI 적정 농도 (H5N9 (A) 또는 H5N1 계통군 2.2 (B) 항원 사용) 에 대한 NDV MDA 효과 (SPF: MDA 없음; NDV: 항-NDV MDA) 를 나타낸다. 그림에 적힌 숫자는 양성 혈청/시험된 총 수에 해당한다. NDV MDA 의 존재하에서, AIV HI 적정 농도는 백신접종 후에 높아졌으며, NDV MDA 가 없는 SPF 병아리에서의 결과와 비교하여 접종 후에 증가하지 않았다.
도 18 은 MDA 가 없는 (SPF), AI H5N9 및 NDV MDA (H5N9+NDV), NDV MDA (NDV) 또는 AI H5N1 (H5N1) MDA 가 있는 닭에서 vAVW01 또는 vAVW03 으로의 백신접종 후 (D0 에) D21 NDV HI 적정 농도를 나타낸다; NDV MDA 는 vAVW01 또는 vAVW03 에 의해 유도된 NDV HI 적정 농도의 수준에 대해 부정적인 영향을 주지는 않았다.
도 19 는 D0 및 D21 에서 AVINEW(G1), vAVW02(G2) 및 vAVW03(G3) 으로의 2 회 백신접종 후 NDV HI 적정 농도를 나타낸다.
도 20 은 D0 및 D21 에서 vAVW02(G2) 또는 vAVW03(G3) 으로의 2 회 백신접종 후 AI H5N1 HI 적정 농도를 나타낸다.
도 21 은 D0 및 D21 에서 vAVW02(G2) 또는 vAVW03(G3) 으로의 2 회 백신접종 후 AI H5N1 SN 적정 농도를 나타낸다.
도 22A 및 22B 는 vAVW03 의 1 회 (D0 에) 또는 2 회 (D0 및 D14 에) 점안액 투여에 의해 유도되는, NDV HI 적정 농도 및 AIV SN 적정 농도를 각각 나타낸다.
도 23A-23D 는 제 28 일에 HPAI H5N1 단리물로 접종된 비백신접종된 (그룹 1) 또는 백신접종된 (그룹 2: D0 에 vAVW03 의 1 회 투여; 그룹 3: D0 및 D14 에 vAVW03 의 2 회 투여; 그룹 4: D0 에 vFP89 로, D14 에 vAVW03 으로 프라임-부스트 투여) 사향 오리 새끼로부터의 입인두 (A 및 C) 및 배설강 (B 및 D) 의 면봉 채취 표본 내 바이러스 적하량 (A 및 B) 및 양성 샘플의 % (C 및 D) 의 동역학을 나타낸다.
도 24A-24D 는 제 42 일에 HPAI H5N1 단리물로 접종된 비백신접종된 (그룹 1) 또는 백신접종된 (그룹 2: D0 에 vAVW03 의 1 회 투여; 그룹 3: D0 및 D14 에 vAVW03 의 2 회 투여; 그룹 4: D0 에 vFP89 로, D14 에 vAVW03 으로 프라임-부스트 투여) 사향 오리 새끼로부터의 입인두 (A 및 C) 및 배설강 (B 및 D) 의 면봉 채취 표본 내 바이러스 적하량 (A 및 B) 및 양성 샘플의 % (C 및 D) 의 동역학을 나타낸다.
도 25 는 아미노산 수준에서의 조류 독감 HA 단백질과 서열 일치성 % 사이의 서열 정렬을 제공한다.
도 26 은 핵산 수준에서의 조류 독감 HA 단백질과 서열 일치성 % 사이의 서열 정렬을 제공한다.
본 명세서에서, 특히 청구항 및/또는 단락에서, "~ 을 포함한다", "~ 이 포함되는", "~ 을 포함함" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어, 이들은 "~ 에 포함된다", "~ 에 포함되는", "~ 에 포함됨" 등을 의미할 수 있고; "~ 로 본질적으로 이루어지는" 및 "~ 로 본질적으로 이루어지다" 와 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 갖고, 예를 들어, 이들은 명백하게 언급되지 않은 요소를 포함하나, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특성에 영향을 미치는 요소는 배재한다는 점에 유의한다.
다르게 설명되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수형 관사에는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 복수의 지시대상이 포함된다. 유사하게는, "또는" 이라는 단어는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 "및" 이 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명에서, AVINEW 백신 균주가 벡터로서 사용된다. AVINEW 는 전세계적으로 널리 사용되고 있는 생 NDV 백신 (메리얼 리미티드: Merial Limited) 이다. 상기 백신 균주는 자연적으로 비병원성이고, 이중 호흡 및 장 향성을 나타낸다. 게다가, AVINEW 균주는 오리를 감염시킬 수 있는 NDV 유전자형 그룹 (클래스 II, 유전자형 I) 에 속한다. 그 향성이 본질적으로 호흡기 관에 대한 것인 LaSota 와는 반대로, 이것은 호흡기 부작용을 유도하지 않는다.
본 발명은 유효량의 유전자조작된 NDV 벡터 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클을 포함할 수 있는 조류 백신에 관한 것이다.
본 발명은 조류와 같은 동물에서 면역원성 반응을 도출하는 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 발현하는 임의의 유전자조작된 NDV 벡터를 포함한다. 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은 조류와 같은 동물에서 반응을 도출, 유도하거나 자극하는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 이의 절편(들) 과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 독감 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원일 수 있다.
"동물" 은 포유류, 새 등을 의미한다. 동물 또는 숙주에는 포유류 및 인간이 포함된다. 동물은, 말류 (예를 들어, 말), 개류 (예를 들어, 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼), 고양이류 (예를 들어, 사자, 호랑이, 집고양이, 들고양이, 기타 큰 고양이, 및 치타 및 스라소니를 비롯한 기타 고양이과), 양류 (예를 들어, 양), 소류 (예를 들어, 소), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 조류 (예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치, 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조), 영장류 (예를 들어, 원원류, 안경원숭이, 원숭이, 긴팔원숭이, 유인원), 및 생선으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. "동물" 이라는 용어에는 또한 배아 및 태아 단계를 비롯한, 모든 발달 단계의 개개의 동물이 포함된다.
하나의 구현예에서, 조류 독감 면역학적 조성물 또는 백신은 유전자조작된 벡터 및 약학적 또는 수의학적 허용가능 부형제, 담체 또는 비히클을 포함한다. 유전자조작된 벡터는 독감 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는 NDV 발현 벡터일 수 있다. 독감 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은, 적혈구응집소, 매트릭스 단백질, 뉴라미니다아제, 비구조적 단백질, 핵단백질, 폴리머라아제, 또는 이들의 임의의 절편일 수 있다.
또다른 구현예에서, 독감 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은 독감 또는 조류 독감 균주로 감염된 조류로부터 유래될 수 있다. 조류 독감 단백질, 항원, 에피토프 또는 면역원은 적혈구응집소 (HA), 예컨대, 제한 없이, HA 전구체, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, 또는 H16 단백질, 매트릭스 단백질 (예컨대, 매트릭스 단백질 M1 또는 M2, 이에 제한되지 않음), 뉴라미니다아제 (예컨대, NA1, NA2, NA3, NA4, NA5, NA6, NA7, NA8, 또는 NA9, 이에 제한되지 않음), 비구조적 (NS) 단백질 (예컨대, NS1 또는 NS2, 이에 제한되지 않음), 핵단백질 (NP) 및 폴리머라아제 (예컨대, PA 폴리머라아제, PB1 폴리머라아제 1 또는 PB2 폴리머라아제 2, 이에 제한되지 않음) 일 수 있다.
조류 독감 항원은 적혈구응집소, 예컨대 H5 HA 일 수 있다. 하나의 구현예에서, H5 는 H5N1 A/칠면조/터키/1/2005 (계통군 2.2), A/닭/인도네시아/7/2003 (계통군 2.1), A/오리/라오스/3295/2006 (계통군 2.3), A/닭/서자바/PWT-WIJ/2006 (계통군 2.1) 균주로부터 단리된다.
또다른 구현예에서, 조류 독감 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은 독감으로 감염된 조류 또는 임의의 서브유형의 최근 단리물로부터 유래된 조류 독감 균주로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항원" 또는 "면역원" 이라는 용어는 숙주 동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 전체 유기체 (치사된, 약화된 또는 살아있는 것); 유기체의 서브유닛 또는 일부; 면역원성 특성을 갖는 에피토프, 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 또는 이의 절편을 발현하는 삽입체를 함유하는 재조합 벡터; 숙주 동물에 제시되었을 때 면역 반응을 유도할 수 있는 핵산의 조각 또는 절편; 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 에피토프, 합텐, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "면역원성 단백질 또는 펩티드" 라는 용어에는 또한 일단 숙주에 투여된다는 의미에서 면역학적으로 활성인 펩티드 및 폴리펩티드가 포함되고, 이것은 단백질에 대해 체액성 및/또는 세포성 유형의 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 바람직하게는 단백질 절편은 총 단백질과 실질적으로 동일한 면역학적 활성을 갖는 것이다. 그러므로, 본 발명에 따른 단백질 절편은 하나 이상의 에피토프 또는 항원 결정소를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. 또한 항원 결정소라고도 알려져 있는 에피토프라는 용어는 면역계에 의해 인지되는 거대분자의 부분이고 체액성 유형 (B 세포) 및/또는 세포성 유형 (T 세포) 의 면역 반응을 유도할 수 있다.
"면역원성 단백질 또는 펩티드" 라는 용어는 폴리펩티드가 본원에 정의된 바와 같은 면역학적 반응을 생성하는 기능을 하기만 한다면, 결실, 부가 및 치환을 추가로 포함한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 사실상 보전성일 것이다 (즉, 아미노산 계통 내에서 일어나는 치환). 예를 들어, 아미노산은 일반적으로 하기 네 가지 계통으로 나뉜다: (1) 산성 -- 아스파르테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성 -- 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 무극성 -- 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비전하 극성 -- 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스틴, 세린 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 종종 방향족 아미노산으로 분류된다. 류신을 이소류신 또는 발린으로 (또는 서로 반대로); 아스파르테이트를 글루타메이트로 (또는 서로 반대로); 트레오닌을 세린으로 (또는 서로 반대로) 고립된 대체; 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로 유사한 보존적 대체를 하는 것이 생물학적 활성에 주요한 영향을 가지지 않을 것이라고 합리적으로 예상할 수 있다. 그러므로, 참조 분자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 주지 않는 미미한 아미노산 치환을 갖는 단백질이 참조 폴리펩티드의 정의 내에 있다.
에피토프라는 용어는 면역계에 의해 인지되는 거대분자의 부분이고 체액성 유형 (B 세포) 및/또는 세포성 유형 (T 세포) 의 면역 반응을 유도할 수 있다. 상기 용어는 또한 "항원 결정소" 또는 "항원 결정소 부위" 와 호환적으로 사용된다. 동일한 에피토프를 인지하는 항체는 하나의 항체가 표적 항원에 대한 또다른 항체의 결합을 차단하는 능력을 보여주는 간단한 면역학적검정법으로 확인될 수 있다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 반응" 은 관심의 조성물 또는 백신에 대한 세포성 및/또는 항체-매개 면역 반응의 숙주에서의 전개이다. 통상, "면역학적 반응" 에는 관심의 조성물 또는 백신에 포함되는 항원(들) 에게 특이적으로 대항하는, 항체, B 세포, 조력자 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생성이라는 효과 중 하나 이상이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 숙주는 새로운 감염에 대한 저항성이 향상될 것이고/거나 질환의 임상적 심각성이 감소되는 식의, 치료적 또는 보호적 면역학적 반응을 나타낼 것이다. 이러한 보호는 감염된 숙주에 의해 정상적으로 나타나는 증상의 감소 또는 결핍, 감염된 숙주에서 보다 빠른 회복 시간 및/또는 보다 낮은 바이러스 적정 농도에 의해 증명될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드는 또한 상기 기술된 바와 같은 면역학적 반응을 도출하는 아미노산 서열을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드에는 단백질의 전장 서열, 이의 유사체, 또는 이의 면역원성 절편이 포함된다. "면역원성 절편" 은 하나 이상의 에피토프가 포함되므로 상기 기재된 면역학적 반응을 도출하는 단백질의 절편을 의미한다. 이러한 절편은 당업계에 잘 알려진 많은 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996)] 를 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어, 고체 지지체 상에 다수의 펩티드를 동시에 합성하고 (펩티드는 단백질 분자의 일부에 상응함), 펩티드가 지지체 상에 여전히 부착될 동안 펩티드와 항체를 반응시킴으로써 결정될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 전체가 참조로서 본원에 모두 인용된 미국 특허 제 4,708,871 호; 문헌 [Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986] 에 기재되어 있다. 유사하게는, 형태적 에피토프는 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명에 의해 아미노산의 공간적 형태를 측정함으로써 쉽게 확인된다. 예를 들어, 상기 문헌 [Epitope Mapping Protocols, supra] 을 참조한다. T. parva 의 단백질에 특히 적용가능한 방법은 그 전체가 본원에 참조로서 인용된 PCT 출원 일련 번호 PCT/US2004/022605 호에 완전히 기재되어 있다.
합성 항원은 또한 정의 내에, 예를 들어, 폴리에피토프, 측면 에피토프, 및 기타 재조합 또는 합성적으로 유래된 항원을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998] 를 참조한다. 본 발명의 목적을 위해 면역원성 절편에는 통상적으로 분자의 약 3 개 이상의 아미노산, 바람직하게는 약 5 개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 15 개 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 약 15 내지 25 개의 아미노산 또는 그 이상의 아미노산이 포함될 것이다. 단백질 서열의 전장을 거의 포함할 수 있는 절편, 또는 심지어 단백질의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 융합 단백질의 길이에 대해 결정적인 상한은 없다.
따라서, 에피토프를 발현하는 폴리뉴클레오티드의 최소 구조는, 독감 단백질 또는 다단백질의 에피토프 또는 항원 결정소를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어지는 것이다. 총 단백질 또는 다단백질의 절편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 더욱 유리하게는, 총 단백질 또는 다단백질을 코딩하는 서열의 최소 15 개의 뉴클레오티드, 유리하게는 약 30 내지 45 개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 45 내지 75 개, 57 개, 87 개 또는 150 개 이상의 연속 또는 근접 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. 에피토프 결정 방법, 예컨대 중복 펩티드 라이브러리 생성 (Hemmer et al., 1998), 펩스캔 (Pepscan) (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) 및 알고리즘 (De Groot et al., 1999), 및 전체가 참조로써 본원에 모두 인용되어 있는 PCT 출원 인련 번호 PCT/US2004/022605 호가, 과도한 실험 없이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 본원에 언급되고 인용된 다른 문헌은 또한 면역원 또는 항원의 에피토프 및 그러므로 이러한 에피토프를 코딩하는 핵산 분자를 결정하는 방법에 도움을 줄 수 있다.
"폴리뉴클레오티드" 는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및 유사체를 임의의 조합으로 함유하는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태이다. 폴리뉴클레오티드는 3 차원 구조를 가질 수 있고, 공지된 또는 비공지된 임의의 기능을 수행할 수 있다. "폴리뉴클레오티드" 라는 용어에는 이중-, 단일-가닥, 및 삼중-가닥 나선형 분자가 포함된다. 다르게 구체화되거나 요구되지 않는다면, 폴리뉴클레오티드인 본원에 기재된 발명의 임의의 구현예는 DNA, RNA 또는 혼성 분자의 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 알려지거나 예상되는 2 개의 상보적 형태 각각 및 이중 가닥 형태를 모두 포함한다.
"코돈 최적화" 라는 용어는 선택된 숙주에서 발현/번역을 위해 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프, 도메인 또는 절편을 코딩하는 핵산 서열을 최적으로 구성하는 공정을 말한다. 일반적으로, 유전자 발현 수준은 프로모터 서열 및 조절 요소와 같은 많은 인자에 따라 다르다. 가장 중요한 인자 중 하나는 전사체 유전자의 코돈 선호도를 숙주의 전형적인 코돈 선호도에 적용시키는 것이다 (Lithwich, G. and Margalit, H., Genome Res. 13, 2665-2673, 2003). 그러므로, 번역 선택 하에서 원핵 게놈 내의 고도로 발현된 유전자는 확연한 코돈 선호도 편향을 갖는다. 이것은 이들이 가장 풍부한 tRNA 종에 의해 인지되는 코돈의 적은 서브세트를 사용하기 때문이다 (Ikemura, T., J. Mol. Biol. 151, 389-409, 1981). 상기 코돈 적응을 조절하는 힘은 번역 선택이라 부르고, 그 세기는 급속 성장하는 박테리아에 있어 중요하다 (Rocha, E.P., Genome Res. 14, 2279-2286, 2004; Sharp, P.M. et al., Nucleic Acids Res. 33, 1141-1153). 유전자가 숙주에 의해 흔히 사용되지 않는 코돈을 함유하는 경우, 그 발현 수준은 최대가 아닐 것이다. 이것은 이종 단백질 발현 (Gustafsson, C. et al., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004) 및 DNA 백신 개발 (Ivory, C. and Chadee, K., Genet. Vaccines Ther. 2, 17, 2004) 의 한계 중 하나일 수 있다. 많은 수의 합성 유전자가 발현 수준을 증가시키기 위해 재디자인되어왔다. 합성 유전자 데이터베이스 (Synthetic Gene Database: SGDB) (Wu, G. et al., Nucleic Acids Res. 35, D76-D79, 2007) 는 합성 유전자에 대해 200 회를 초과하는 공개된 실험으로부터의 정보를 보유하고 있다. 특정 단백질을 최적 양으로 발현하도록 새로운 숙주 내에 삽입될 핵산 서열의 디자인 과정에서, 코돈 선호도 최적화는 통상적으로 제 1 단계 중 하나이다 (Gustafsson, C., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004). 코돈 선호도 최적화는 기본적으로, 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않고 숙주의 코돈 선호도를 더욱 밀접하게 반영하도록 표적 유전자에서 흔치 않은 코돈을 변경시키는 것을 수반하고 있다 (Gustafsson, C., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004). 그러므로 최적화 과정에 통상적으로 사용되는 정보는 최적화될 DNA 또는 단백질 서열 및 숙주의 코돈 선호도 표 (참조 세트) 이다.
당업자에 의해 몇몇 종류의 코돈 최적화를 가능하게 하는 여러 개의 공개 웹 서버 및 단독 실행 어플리케이션이 있다. 'GeneDesign' (Richardson, S.M. et al., Genome Res. 16, 550-556, 2006), 'Synthetic Gene Designer' (Wu , G. et al., Protein Expr. Purif. 47, 441-445, 2006) 및 'Gene Designer' (Villalobos, A. et al., BMC Bioinformatics 7, 285, 2006) 는 코돈 최적화 단계를 비롯한 합성 유전자 디자인에 대한 플랫폼을 제공하는 패키지이다. 각각의 서버 또는 프로그램에서 이용가능한 코돈 선호도 최적화에 대한 방법과 관련하여, 개발된 첫번째 프로그램은 '1 아미노산-1 코돈' 접근법만을 사용하였다. 더욱 최근의 프로그램 및 서버에는 이제 일부 코돈 선호도 가변성을 제작하기 위한 추가의 방법이 포함된다. 상기 가변성은 자연적인 고도로 발현된 유전자의 코돈 선호도 가변성을 반영하고, 최적화 과정에 도입될 부가적인 기준 (예컨대, 제한 부위의 회피) 을 가능하게 한다. 본원에 기재된 대부분의 어플리케이션 및 웹 서버는, 모든 코돈의 완전한 최적화, 몬테 카를로 (Monte Carlo) 접근법을 사용하는 참조 세트의 상대적인 코돈 선호도 빈도에 근거한 최적화 및 의문 및 최적화된 서열 사이에 변화를 최소화로 하면서 최적화를 최대화하기 위해 디자인된 신규 접근법인, 3 가지 방법의 코돈 최적화를 제공한다. 본원에서의 하나의 구현예에서, NDV 의 단백질 보체를 코딩하는 서열은 조류 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이고, 바람직한 구현예에서 NDV P, L 및 NP 를 코딩하는 핵산 서열은 조류 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 또다른 구현예에서, 재조합 단백질, 항원, 펩티드, 폴리펩티드, 절편, 도메인, 또는 에피토프를 코딩하는 핵산 서열은 조류에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 또다른 구현예에서, 코돈 최적화된 서열은 조류 발현에 대해 AIV 단백질, 항원, 펩티드, 폴리펩티드, 절편, 도메인, 또는 에피토프를 코딩한다. 또다른 구현예에서, 코돈 최적화된 서열은 조류 발현에 대해 AIV HA 및/또는 N 단백질, 항원, 펩티드, 폴리펩티드, 절편, 도메인, 또는 에피토프를 코딩한다.
다음은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 절편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 개질된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 우라실, 기타 당 및 연결기, 예컨대 플루오로리보스 및 티올레이트, 및 뉴클레오티드 분지를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 예컨대 표지 성분과의 공액에 의해, 중합 후 추가로 개질될 수 있다. 본 정의에 포함되는 다른 유형의 개질은 캡, 자연 발생적 뉴클레오티드 중 하나 이상의 유사체로의 치환, 및 폴리뉴클레오티드를 단백질, 금속 이온, 표지 성분, 기타 폴리뉴클레오티드 또는 고체 지지체에 부착시키는 수단의 도입이다. 폴리뉴클레오티드는 화학 합성에 의해 수득되거나 미생물로부터 유래될 수 있다.
본 발명은 또한 독감 단백질, 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 상보적인 가닥을 포함한다. 상보적인 가닥은 중합체성이고 임의의 길이일 수 있고, 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및 유사체를 이들의 임의의 조합으로 함유할 수 있다.
"단백질", "펩티드", "폴리펩티드" 및 "폴리펩티드 조각" 이라는 용어는 임의의 길이의 아미노산 잔기의 중합체를 말하는 것으로 본원에서 호환되게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 개질 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있고, 아미노산 이외의 화학적 부분이 삽입될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 하기와 같은 개입에 의해 개질된 아미노산 중합체를 포함한다; 예를 들어 디설피드 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 개질, 예컨대 표지 또는 생활성 성분과의 공액.
"단리된" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 그의 고유의 환경에서는 연관되어 있는 물질이 실질적으로 없는 것이다. "실질적으로 없다" 는 것은, 상기 물질의 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이 없는 것을 의미한다.
혼성화 반응은 상이한 "엄격함" 의 조건 하에서 수행될 수 있다. 혼성화 반응의 엄격함을 증가시키는 조건은 잘 알려져 있다. 예를 들어 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 제 2 판 (Sambrook et al., 1989)] 를 참조한다. 관련 조건의 예에는 하기 조건들이 포함된다 (엄격함을 증가시키는 순서로): 인큐베이션 온도 25℃, 37℃, 50℃, 및 68℃; 완충제 농도 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC (SSC 는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트레이트 완충제임) 및 다른 완충제 시스템을 사용하는 이들의 등가물; 포름아미드 농도 0%, 25%, 50%, 및 75%; 인큐베이션 시간 5 분 내지 24 시간; 1, 2 회 이상의 세척 단계; 세척 인큐베이션 시간 1, 2, 또는 15 분; 및 세척액 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC, 또는 탈이온수.
본 발명은 독감 폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체 및 유도체, 및 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 고유의 특성을 향상시킬 수 있는, 감소시킬 수 있는 또는 유의하게 영향을 주지 않을 수 있는 이의 기능적으로 동등한 절편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 기능적으로 동등한 변이체, 유도체 및 절편은 독감 활성을 보유하는 능력을 나타낸다. 예를 들어, 코딩된 아미노산 서열을 변화시키지 않는 DNA 서열에서의 변화 뿐 아니라, 아미노산 잔기의 보존성 치환, 1 또는 수 개의 아미노산 결실 또는 첨가, 및 아미노산 유사체에 의한 아미노산 잔기의 치환을 야기하는 DNA 서열에서의 변화가 코딩된 폴리펩티드의 특성에 유의하게 영향을 주지 않을 DNA 서열에서의 변화이다. 보존성 아미노산 치환은 글리신/알라닌; 발린/이소류신/류신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 세린/트레오닌/메티오닌; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신/트립토판이다. 하나의 구현예에서, 변이체는 관심의 독감 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성 또는 일치성을 갖는다.
하나의 양상에서, 본 발명은 독감 폴리펩티드, 특히 조류 독감 폴리펩티드를 제공한다. 또다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO:15, 17, 19, 21, 또는 23 에 언급된 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 이의 변이체 또는 절편을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 조류 HA 폴리펩티드, 특히 SEQ ID NO:15, 17, 19, 21, 또는 23 에 언급된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 잘 알려진 분자 생물학 기술을 사용하여 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있는 상기 확인된 독감 폴리펩티드의 절편 및 변이체 (SEQ ID NO:15, 17, 19, 21 및 23) 를 제공한다.
변이체는 본 발명의 항원 폴리펩티드에 대해, 특히 SEQ ID NO:15, 17, 19, 21, 또는 23 에 언급된 아미노산 서열에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 일치성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 상동 폴리펩티드이다.
독감 폴리펩티드의 면역원성 절편에는 SEQ ID NO:2, 4, 5, 8, 10, 12, 또는 14 에 언급된 서열을 갖는, 8, 10, 15, 또는 20 개 이상의 연속 아미노산, 21 개 이상의 아미노산, 23 개 이상의 아미노산, 25 개 이상의 아미노산, 또는 30 개 이상의 아미노산의 독감 폴리펩티드, 또는 이의 변이체가 포함된다. 또다른 구현예에서, 독감 폴리펩티드의 절편에는 전장 독감 폴리펩티드 상에서 발견되는 특이적 항원 에피토프가 포함된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 독감 HA 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 SEQ ID NO:15, 17, 19, 21, 또는 23 에 언급된 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO:15, 17, 19, 21, 또는 23 에 언급된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드 중 하나의 8 개 이상 또는 10 개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 보존성 변이체, 대립 형질 변이체, 상동 또는 면역원성 절편, 또는 상기 폴리펩티드의 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 독감 HA 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 특이적 동물 종에서의 발현에 대해 코돈-최적화될 수 있다. HA 단백질은 고도로 병원성인 조류 독감 서열 (복합 염기성 아미노산: RERRRKKR - SEQ ID NO:25) 에서 낮은 병원성인 조류 독감 서열 (RETR - SEQ ID NO:26) 까지의 분할 부위에서 개질될 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO:14, 16, 18, 21, 22 에 언급된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변이체를 제공한다. 또다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO:14, 16, 18, 21, 22 에 언급된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나에 대해 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변이체를 제공한다.
본 발명의 목적을 위해, 서열 일치성 또는 상동성은 서열 갭을 최소화하면서 중복 및 일치성을 최대화하도록 정렬되는 경우 서열을 비교함으로써 결정된다. 특히, 서열 일치성은 다수의 수학적 알고리즘 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다. 2 개의 서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 비제한적인 예는 1990 년의 Karlin 등의 알고리즘으로, 이것을 1993 년에 Karlin 등이 개질한 알고리즘이다.
서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 또다른 예는 1988 년의 Myers 등의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내에 통합된다. 아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 패널티: 12, 및 갭 패널티: 4 가 사용될 수 있다. 국부적 서열 유사성 및 정렬의 영역을 확인하기 위한 또다른 유용한 알고리즘은 1988 년 Pearson 등에 기재된 바와 같은 FASTA 알고리즘이다.
일반적으로, 아미노산 서열의 비교는 공지된 구조의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 미공지된 구조의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 정렬시킴으로써 달성된다. 그 다음 서열 중의 아미노산을 비교하고 상동인 아미노산 그룹을 함께 그룹으로 묶는다. 이 방법으로 폴리펩티드의 보존된 영역을 검출하고 아미노산 삽입 및 결실을 확인한다. 아미노산 서열간의 상동성은 시판되는 알고리즘 (또한 상기 상동성 설명 참조) 을 사용하여 결정될 수 있다. 본원에 상기 다르게 언급된 것 외에도, 미국 생물기술 정보 센터 [National Center for Biotechnology Information] 에 의해 제공되는 프로그램 BLAST, 갭 BLAST, BLASTN, BLASTP, 및 PSI-BLAST 도 역시 언급된다. 상기 프로그램은 본 목적을 위해 당업계에서 널리 사용되고, 2 개의 아미노산 서열의 상동 영역을 정렬시킬 수 있다.
실행 중인 모든 검색 프로그램에서, 갭 정렬 루틴은 데이터베이스 검색 그 자체에 필수적이다. 필요하다면 갭핑은 끌 수 있다. 길이 1 의 갭에 대한 디폴트 패널티 (Q) 는 단백질 및 BLASTP 에 대해 Q=9 이고, BLASTN 에 대해 Q=10 이나, 임의의 정수로 변경될 수 있다. 갭 확장을 위한 잔기 당 디폴트 패널티 (R) 은 단백질 및 BLASTP 에 대해 R=2 이고, BLASTN 에 대해 R=10 이나, 임의의 정수로 변경될 수 있다. 서열 갭을 최소화하면서 중복 및 일치성을 최대화하도록 서열을 정렬시키기 위해 Q 및 R 에 대한 값의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 디폴트 아미노산 비교 매트릭스는 BLOSUM62 지만, PAM 과 같은 다른 아미노산 비교 매트릭스를 이용할 수 있다.
대안적으로는 또는 부가적으로는, 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 관련하여 "상동성" 또는 "일치성" 이라는 용어는 2 개의 서열 사이의 상동성의 양적 측정값을 나타낼 수 있다. % 서열 일치성은 (N ref - N dif )* 100/N ref (식 중, N dif 는 정렬되는 경우 2 개의 서열 내의 비-동일 잔기의 총 수이고, N ref 는 서열 중 하나 내의 잔기의 수임) 로서 계산될 수 있다. 그러므로, DNA 서열 AGTCAGTC 는 서열 AATCAATC 와 75% 의 서열 일치성을 가질 것이다 (N ref = 8; N dif = 2).
대안적으로는 또는 부가적으로는, 서열과 관련된 "상동성" 또는 "일치성" 은 2 개의 서열의 보다 짧은 것 중의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수로 나뉘어진, 일치하는 뉴클레오티드 또는 아미노산이 있는 위치의 수를 말할 수 있으며, 2 개의 서열의 정렬은 예를 들어, 윈도우 크기: 20 개의 뉴클레오티드, 단어 길이: 4 개의 뉴클레오티드, 및 갭 패널티: 4 를 사용하는 Wilbur and Lipman 알고리즘 (Wilbur et al., 1983, 참조로서 본원에 인용됨) 에 따라 결정될 수 있으며, 정렬을 비롯한 서열 데이터의 컴퓨터-조력 분석 및 해석은 시판 프로그램 (예를 들어, Vector NTI Software ™, Invitrogen Inc. CA, USA) 을 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. RNA 서열이 유사한 것, 또는 DNA 서열과 서열 일치성 또는 상동성 정도를 갖는다고 언급될 때, DNA 서열 내의 티미딘 (T) 은 RNA 서열 내의 우라실 (U) 과 동등한 것으로 간주된다. 그러므로, DNA 서열 내의 티미딘 (T) 이 RNA 서열 내의 우라실 (U) 과 동등한 것으로 간주됨으로써, RNA 서열은 본 발명의 범주 내에 있고, DNA 서열로부터 유래될 수 있다.
그리고, 과도한 실험 없이, 당업자는 % 상동성을 측정하기 위한 많은 다른 프로그램 또는 참조를 찾아볼 수 있다.
본 발명은 또한 벡터 분자 또는 발현 벡터에 함유되어 있고, 프로모터 요소 및 임의로 인핸서에 작동가능하게 연결되어 있는 독감 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"벡터" 는 시험관 내 또는 생체 내에서 표적 세포로 전달될 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA 또는 RNA 플라스미드, 박테리오파지, 또는 바이러스를 말한다. 이종 폴리뉴클레오티드는 예방 또는 치료 목적을 위해 관심의 서열을 포함할 수 있고, 임의로 발현 카세트의 형태일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 벡터는 궁극적인 표적 세포 또는 대상에서 복제가 가능해야할 필요는 없다. 용어에는 바이러스 벡터 뿐 아니라 클로닝 벡터가 포함된다.
"유전자조작된" 또는 "재조합체" 라는 용어는 자연에서 발견되지 않는 배치로의 또다른 폴리뉴클레오티드에 연결되거나 자연에서 발생하지 않는 반합성, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"이종" 이라는 용어는 비교되어 지는 실재의 나머지와 일반적으로 구별되는 실재로부터 유래하는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 유전학 유전자조작 기술에 의해 상이한 근원으로부터 유래된 플라스미드 또는 벡터 내로 도입될 수 있고, 그러므로 이종 폴리뉴클레오티드이다. 고유의 코딩 서열로부터 제거되고 고유의 서열 이외의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 프로모터이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 부가적인 서열, 예컨대 동일한 전사 단위 내의 부가적인 코딩 서열, 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 5'UTR, 3'UTR, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위, 동일 또는 상이한 프로모터의 조절 하의 부가적인 전사 단위, 숙주 세포의 클로닝, 발현, 상동 재조합, 및 형질전환을 가능하게 하는 서열, 및 본 발명의 구현예를 제공하는데 바람직할 수 있는 임의의 이러한 구축물을 포함할 수 있다.
독감 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원의 발현을 위한 요소가 유리하게는 본 발명의 벡터 내에 존재한다. 최소의 방식으로, 이것은 플라스미드 및 특정 바이러스 벡터, 예를 들어, 폭스바이러스 이외의 바이러스 벡터와 같은 특정 벡터에 대한 개시 코돈 (ATG), 중지 코돈 및 프로모터, 및 임의로 또한 폴리아데닐화 서열을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. 폴리뉴클레오티드가 (유리하게는, 벡터에서) 다단백질 절편, 예를 들어, 독감 펩티드를 코딩하는 경우, ATG 는 해독 프레임의 5' 에 놓여있고, 중지 코돈은 3' 에 놓여있다. 발현 조절을 위한 다른 요소, 예컨대 인핸서 서열, 안정화 서열, 예컨대 인트론 및 또는 미번역된 5' 또는 3' 서열 및 단백질의 분비를 가능하게 하는 신호 서열이 존재할 수 있다.
생체 내 또는 시험관 내에서 본 발명의 유전자의 유전자 생성물의 발현을 위한 벡터 또는 재조합체 또는 플라스미드의 제조 방법 및/또는 투여 방법은 임의의 기재된 방법, 예를 들어, 하기 언급된 문헌에 의한 방법 또는 하기 문헌에 기재된 방법과 유사한 방법, 또는 하기에 언급된 문헌에 기재된 방법에 의해 이루어질 수 있다: 미국 특허 번호 4,603,112; 4,769,330; 4,394,448; 4,722,848; 4,745,051; 4,769,331; 4,945,050; 5,494,807; 5,514,375; 5,744,140; 5,744,141; 5,756,103; 5,762,938; 5,766,599; 5,990,091; 5,174,993; 5,505,941; 5,338,683; 5,494,807; 5,591,639; 5,589,466; 5,677,178; 5,591,439; 5,552,143; 5,580,859; 6,130,066; 6,004,777; 6,130,066; 6,497,883; 6,464,984; 6,451,770; 6,391,314; 6,387,376; 6,376,473; 6,368,603; 6,348,196; 6,306,400; 6,228,846; 6,221,362; 6,217,883; 6,207,166; 6,207,165; 6,159,477; 6,153,199; 6,090,393; 6,074,649; 6,045,803; 6,033,670; 6,485,729; 6,103,526; 6,224,882; 6,312,682; 6,348,450; 6,312,683, 및 6,596,279; 1986 년 10 월 16 일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 920,197; WO 90/01543; W091/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0 370 573; Andreansky et al., 1996; Ballay et al., 1993; Felgner et al., 1994; Frolov et al., 1996; Graham, 1990; Grunhaus et al., 1992; Ju et al., 1998; Kitson et al., 1991; McClements et al., 1996; Moss, 1996; Paoletti, 1996; Pennock et al., 1984; Richardson (Ed), 1995; Smith et al., 1983; Robertson et al., 1996; Robinson et al., 1997; 및 Roizman, 1996. 본 발명의 실시에 유용한 벡터의 예를 제공하는 것 외에도 참조 문헌에 의해 본원에 언급되고 인용된 것이 또한 본 발명의 조성물 중의, 또는 조성물에 포함된 벡터(들) 에 의해 발현되게 되는 이의 비-독감 펩티드 또는 절편에 대한 공급원을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 벡터, 예컨대 발현 벡터, 예를 들어, 예방 또는 치료 조성물을 포함하는 제제에 관한 것이다. 제제는 독감 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원 중 하나 이상을 포함하는, 이들로 본질적으로 이루어지는, 또는 이들로 이루어지는 (유리하게는 이들을 발현하는), 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 발현 벡터, 예컨대 생체 내 발현 벡터를 포함할 수 있거나, 이들로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이들로 이루어질 수 있다. 벡터는 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 비히클 내에 독감 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하는 (유리하게는 이들을 발현하는) 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 함유하고 발현한다. 그러므로, 본 발명의 구현예에 따르면, 제제 내의 다른 벡터(들) 은 독감 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원 (예를 들어, 적혈구응집소, 뉴라미니다아제, 핵단백질) 의 하나 이상의 기타 단백질 또는 이의 절편을 적합한 환경 하에서 발현하는 발현하는 벡터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다.
또다른 구현예에 따르면, 제제 내의 벡터(들) 은 독감 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원의 하나 이상의 단백질 또는 이의 절편(들) 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들) 을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다 (벡터(들) 은 폴리뉴클레오티드(들) 을 발현함). 본 발명의 제제는 상이한 단백질에 대해 및/또는 동일한 단백질을 코딩하는 상이한 독감 단리물로부터의 폴리뉴클레오티드를 적합한 조건 또는 적절한 조건 하 생체 내에서 또는 적합한 숙주 세포에서 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어지는, 그리고 유리하게는 또한 이들을 발현하는 2 개 이상의 벡터를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. 제제는 독감 폴리펩티드, 항원, 융합 단백질 또는 이의 에피토프를 코딩하는, 유리하게는 생체 내에서 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어지는 하나 이상의 벡터를 함유한다. 본 발명은 또한 닭, 칠면조, 오리 및 거위를 비롯한 조류 종 뿐 아니라 인간, 말, 돼지, 바다표범, 고래와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 상이한 종으로부터의 상이한 독감 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원, 예를 들어, 독감 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하고, 발현하는 것을 함유하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어지는 벡터의 혼합물에 관한 것이다.
"플라스미드" 라는 용어는 원하는 숙주 또는 표적의 세포(들) 에서 생체 내 발현에 필요한 요소 및 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 DNA 전사 단위를 포함하고; 이와 관련하여, 플라스미드의 선형 형태뿐 아니라, 슈퍼코일 플라스미드 및 이의 모든 위상이성질체, 개방-환형 플라스미드가 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다는 것을 유념한다.
각각의 플라스미드는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있거나, 프로모터의 조절하에 있거나, 프로모터와는 독립적으로, 이종 펩티드 서열, 변이체, 유사체 또는 절편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 임의로 융합된 재조합 단백질, 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 부가적으로 포함하거나 함유하거나, 이들로 본질적으로 이루어진다. 일반적으로, 진핵 세포에서 기능하는 강한 프로모터를 사용하는 것이 유리하다. 바람직한 강한 프로모터는 인간 또는 쥣과 기원의, 또는 임의로 래트 또는 기니아 피그와 같은 또다른 기원을 갖는 즉각적인 초기 사이토메갈로바이러스 프로모터 (CMV-IE) 이다. CMV-IE 프로모터는 인핸서 분절과 연관될 수 있거나 될 수 없는 실제 프로모터 분절을 포함할 수 있다. EP-A-260 148, EP-A-323 597, 미국 특허 제 5,168,062 호, 제 5,385,839 호, 및 제 4,968,615 호 뿐 아니라, PCT 출원 번호 WO87/03905 를 참조할 수 있다. CMV-IE 프로모터는 유리하게는 인간 CMV-IE (Boshart et al., 1985) 또는 쥣과 CMV-IE 이다.
더욱 일반적인 용어로, 프로모터는 바이러스 또는 세포 기원의 것이다. 본 발명의 실시에 통상적으로 사용될 수 있는 CMV-IE 이외의 강한 바이러스 프로모터는 SV40 바이러스의 초기/후기 프로모터 또는 Rous 육종 바이러스의 LTR 프로모터이다. 본 발명의 실시에 통상적으로 사용될 수 있는 강한 세포 프로모터는 세포골격의 유전자의 프로모터, 예컨대 예를 들어, 데스민 프로모터 (Kwissa et al., 2000), 또는 액틴 프로모터 (Miyazaki et al., 1989) 이다.
상기 프로모터의 기능적인 서브 절편, 즉, 충분한 촉진 활성을 유지하는 상기 프로모터의 일부가 본 발명에 포함되며, 예를 들어, PCT 출원 번호 WO98/00166 또는 미국 특허 제 6,156,567 호에 따른 절단된 CMV-IE 프로모터가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 실시에서의 프로모터에는, 충분한 촉진 활성을 유지하여, 바람직하게는, 예를 들어, 전장 CMV-IE 프로모터의 활성에 대해 미국 특허 제 6,156,567 호의 절단된 CMV-IE 프로모터의 활성과 흡사한, 유도체 또는 서브 절편이 유래된 실제 또는 전장 프로모터와 실질적으로 유사한 활성을 촉진하는 프로모터로서 기능하는, 전장 프로모터의 유도체 및 서브 절편이 포함된다. 그러므로, 본 발명의 실시에서의 CMV-IE 프로모터는 전장 프로모터의 프로모터 부분 및/또는 전장 프로모터의 인핸서 부분 뿐 아니라, 유도체 및 서브 절편을 포함할 수 있거나, 이들로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이들로 이루어질 수 있다.
바람직하게는, 플라스미드는 다른 발현 조절 요소를 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진다. 안정화 서열(들), 예를 들어, 인트론 서열(들), 바람직하게는 hCMV-IE 의 첫번째 인트론 (PCT 출원 번호 WO89/01036), 토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 II (van Ooyen et al., 1979) 를 도입하는 것이 특히 유리하다.
폭스바이러스 이외의 플라스미드 및 바이러스 벡터에 대한 폴리아데닐화 신호 (poly A) 에 대해서는, 소 성장 호르몬 (bGH) 유전자의 poly(A) 신호 (미국 특허 제 5,122,458 호를 참조함), 또는 토끼 β-글로빈 유전자의 poly(A) 신호 또는 SV40 바이러스의 poly(A) 신호가 더욱 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 발현 벡터는 적합한 세포 시스템 내에서의 단백질의 시험관 내 발현에 사용되는 발현 벡터이다. 발현된 단백질은 분비 후에 또는 그 밖에 (분비가 없는 경우, 세포 용해가 전형적으로 일어나거나 수행됨), 배양 상청액에서 또는 배양 상청액으로부터 수확될 수 있고, 임의로 초여과와 같은 농축 방법에 의해 농축되고/거나 친화성, 이온 교환 또는 젤 필터-유형 크로마토그래피 방법과 같은 정제 수단에 의해 정제될 수 있다.
"숙주 세포" 는 유전학적으로 변형된 원핵 또는 진핵 세포를 나타내거나, 재조합 플라스미드 또는 벡터와 같은 외생 폴리뉴클레오티드의 투여에 의해 유전학적으로 변형될 수 있다. 유전학적으로 변형된 세포를 언급할 때, 용어는 본래 변형된 세포와 이의 자손까지 모두 언급한다. 유리한 숙주 세포에는 아기 햄스터 신장 (Baby Hamster Kidney: BHK) 세포, 대장암종 (Caco-2) 세포, COS7 세포, MCF-7 세포, MCF-10A 세포, 마딘-다비 (Madin-Darby) 개 신장 (MDCK) 세포주, 밍크 폐 (Mv1Lu) 세포, MRC-5 세포, U937 세포 및 VERO 세포가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 클로닝 또는 발현 벡터 내로 삽입할 수 있고, 그 후 벡터를 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 관심의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 직접 섭취, 세포내이입, 트랜스펙션, f-교배, 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 성분을 사용하는 트랜스펙션; 미세입자 투사법; 리포펙션; 및 감염 (벡터는 감염성, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터임) 을 비롯한 다수의 적합한 수단에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 따라 다를 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 벡터는 뉴캐슬 질환 바이러스 (Newcastle Disease Virus: NDV) 벡터이다. 또한 조류 파라믹소바이러스 1 (APMV1, 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae) 과, 파라믹소비리나에 (Paramyxovirinae) 아과, 아불라바이러스 (Avulavirus) 속) 로도 지정되는 뉴캐슬 질환 바이러스는 병원체의 자연 발생적 균주가 광범위한 질환 심각성을 나타내는 조류 병원체이다. NDV 는 벡터 그 자체가 필요한 가금류 백신으로서 담당하기 때문에 수의과 용도를 위한 백신 벡터로서 특히 유리하다. NDV 균주 병원형은 무증상 장 (예를 들어, Ulster 2C, Queensland V4), 약독형 (예를 들어, Hitchner B1, F (예를 들어, Asplin), La Sota), 중간독형 (예를 들어, 균주 H, Mukteswar, Roakin, Beaudette C) 또는 강독형 (예를 들어, Texas GB, NY parrot 70181, Italien, Milano, Herts 33/56) 이다. NDV 벡터에 근거한 조류 독감 벡터 백신의 장점에는 (1) 체액성, 세포성 및 점막성 반응을 비롯한 광대한 면역력을 유도함 (2) NP 및 M 단백질을 발현하지 않으므로, DIVA (백신접종된 동물로부터 감염된 분화체: Differentiate Infected from Vaccinated Animals) 전략과 양립될 수 있음, (3) 면역력의 빠른 개시를 유도함, (4) 2 가 항체임 (bivalent) 및 (5) 돌발 방출의 경우 비활성화된 백신보다 생산이 환경에 대해 위험이 적다는 것이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
NDV 의 특정한 특징이 외래 바이러스 단백질을 발현하는 재조합 NDV (rNDV) 또는 유전자조작된 NDV 가 매우 양호한 백신 후보자일 것이라는 제안을 하게 했다. NDV 는 많은 세포주 및 알에서 매우 높은 적정 농도로 성장하고, 이것은 생체 내에서 강한 체액성 및 세포성 면역 반응을 도출한다. NDV 는 호흡기 및 소화관 점액 표면을 통해 감염되어, AIV 와 같은 호흡기 질환 병원체의 보호성 항원을 전달하는데 특히 유용하도록 한다. 또한, 시판되는 생 NDV 백신은 미국 및 대부분의 다른 국가에서 널리 사용된다. 생 NDV 재조합체에 근거한 백신은 또한 다른 생 재조합 백신 벡터에 대해 장점을 가질 수 있다. 먼저, 외래 단백질은 오직 몇 개의 NDV 단백질로 발현된다. 반대로, 수두 및 헤르페스 바이러스 벡터는 그들의 큰 크기의 게놈으로부터 다수의 부가적인 단백질을 발현한다. 백신 적용에서 특이적인 면역 반응의 발생을 위해, 오직 제한된 수의 단백질 만을 발현시키는 것이 유리할 수 있다. 두번째로, NDV 는 DNA 상 없이 감염된 세포의 세포질 내에서 복제되고, 이것은 바이러스 게놈의 숙주 세포 DNA 내로의 통합 문제를 없앤다. 바이러스는 검출가능한 유전학 재조합을 겪지 않는다.
역 유전학의 또다른 적용은 본원에 기재된 더욱 효과적이고 더욱 양호한 NDV 백신을 개발하려는 것이다. 현행 NDV 백신은 자연 발생적 약독형 균주, 예컨대 Hitchner B1 및 LaSota 를 이용한다. 다른 생 약화 백신과 마주하면, 현행 NDV 백신은 병독성에 대한 회귀로 인해 여전히 질환을 야기할 수 있다. Hitchner B1 NDV 균주로 보고된 첫번째 데이터가 실망스러웠으므로 벡터로서의 NDV 백신 균주의 선택은 중요하다. 이후, LaSota NDV 균주로 수득된 데이터가 유망하였고, 상기 균주에 근거하는 백신 후보가 중국 및 멕시코 현장에서 사용되고 있다.
본원의 발명은, 재조합-유래 항원을 조류에 전달하기 위한 벡터로서 NDV AVINEW® 백신 균주의 본 출원의 용도를 기재하고 있다. 더욱 구체적으로는 항원은 조류 독감 바이러스 (AIV) 항원일 수 있다. AVINEW® 은 전세계적으로 사용되는 메리얼 리미티드 [Merial Ltd.] 에서 개발된 생 NDV 백신이다. 상기 백신 균주는 자연적으로 비병원성이고, 이중 호흡 및 장 향성을 나타낸다. 조류에서의 다양한 향성은 NDV 그 자체에 대한 모체 유래 항체 (Maternally-Derived Antibodies: MDA) 로부터의 방해와 관련하여 조류에서의 유전자 전달을 위해 AVINEW® 백본을 이용하는 재조합 NDV (rNDV) 또는 유전자조작된 NDV 백신에 대해 독특한 생물학적 특성을 부여할 수 있다. MDA 에 대한 이러한 내성은 유의한 수준의 NDV-특이적 MDA 를 내재적으로 가질 수 있고, 그렇지 않으면 더욱 통상적인 재조합 NDV 면역화가 어려울 수 있는 시판 및 야생형 조류의 활성 면역화를 허용할 수 있다.
게다가, AVINEW® 균주는 오리를 감염시킬 수 있는 NDV 유전자형 그룹 또는 유형 (클래스 2, 유전자형 I) 에 속한다. 그 향성이 본질적으로 호흡기 관에 대한 것인 LaSota 와는 반대로, AVINEW® 균주는 호흡기 부작용을 유도하지 않는다.
하나의 구현예에서, NDV 벡터는 NDV AVINEW® 이다. NDV 벡터는 또한 미국 특허 제 5,118,502 호의 벡터, 특히 ATCC No. VR 2239 로서 기탁된 균주일 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예는 AVINEW 의 게놈 DNA 서열 및 코딩된 단백질 서열을 제공한다. AVINEW NDV 균주의 게놈 DNA 서열은 SEQ ID NO:1 에 언급된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다. AVINEW 게놈 cDNA 서열 (SEQ ID NO:1) 은 VG/GA 서열 (GenBank 접근 번호 EU289028) 과 상이하다. AVINEW (SEQ ID NO:1) 와 VG/GA (EU289028) 게놈 서열 사이의 서열 일치성은 89.6% 이다. Avinew 균주와 VG/GA 균주의 단백질 사이의 아미노산 서열 일치성은, NP 단백질에 대해 95.9% (Avinew 의 SEQ ID NO:3 및 GenBank No. ABZ80386), P 단백질에 대해 89.7% (Avinew 의 SEQ ID NO:5 v. GenBank ABZ80387), M 단백질에 대해 94.2% (Avinew 의 SEQ ID NO:7 v. GenBank No. ABZ80388), F 단백질에 대해 92.4% (Avinew 의 SEQ ID NO:9 v. GenBank No. ABZ80389), HN 단백질에 대해 88.1% (Avinew 의 SEQ ID NO:11 v. GenBank No. ABZ80390), 및 L 단백질에 대해 96.9% (Avinew 의 SEQ ID NO:13 v. GenBank No. ABZ80391) 이다. Avinew 균주와 VG/GA 균주의 유전자 사이의 핵산 서열 일치성은, NP 유전자에 대해 90.6% (Avinew 의 SEQ ID NO:2 v. EU289028 의 122-1591bp), P 유전자에 대해 88.6% (Avinew 의 SEQ ID NO:4 v. EU289028 의 1887-3074bp), M 유전자에 대해 90.1% (Avinew 의 SEQ ID NO:6 v. EU289028 의 3290-4384bp), F 유전자에 대해 90.0% (Avinew 의 SEQ ID NO:8 v. EU289028 의 4544-6205bp), HN 유전자에 대해 84.7% (Avinew 의 SEQ ID NO:10 v. EU289028 의 6412-8145bp), 및 L 유전자에 대해 90.9% (Avinew 의 SEQ ID NO:12 v. EU289028 의 8381-14995bp) 이다. 완전한 게놈 및 개별적인 유전자 서열과 다른 이용가능한 NDV 참조 서열과의 비교는 AVINEW NDV 균주가 Australian 약독형 균주 98-1154 및 Queensland V4 와 유전학적으로 밀접하게 관련되어 있다는 것을 보여주었다. NDV 98-1154 완전한 게놈의 서열이 GenBank AY935491 에 기재되어 있다. ANIVEW (SEQ ID NO:1) 와 AY935491 게놈 서열 사이의 서열 일치성은 98.8% 이다. Avinew 균주와 VG/GA 균주의 단백질 사이의 아미노산 서열 일치성은, NP 단백질에 대해 99.8% (Avinew 의 SEQ ID NO:3 v. GenBank No. AAX45376), P 단백질에 대해 97.7% (Avinew 의 SEQ ID NO:5 v. GenBank No. AAX45377), M 단백질에 대해 98.4% (Avinew 의 SEQ ID NO:7 v. GenBank No. AAX45378), F 단백질에 대해 98.7% (Avinew 의 SEQ ID NO:9 v. GenBank No. AAX45379), HN 단백질에 대해 92.4% (Avinew 의 SEQ ID NO:11 v. GenBank No. AAX45380), 및 L 단백질에 대해 99.5% (Avinew 의 SEQ ID NO:13 v. GenBank No. AAX45381) 이다. Avinew 균주와 VG/GA 균주의 유전자 사이의 핵산 서열 일치성은, NP 유전자에 대해 99.0% (Avinew 의 SEQ ID NO:2 v. AY935491 의 122-1591bp), P 유전자에 대해 98.2% (Avinew 의 SEQ ID NO:4 v. AY935491 의 1887-3074bp), M 유전자에 대해 98.6% (Avinew 의 SEQ ID NO:6 v. AY935491 의 3290-4384bp), F 유전자에 대해 98.8% (Avinew 의 SEQ ID NO:8 v. AY935491 의 4544-6205bp), HN 유전자에 대해 93.1% (Avinew 의 SEQ ID NO:10 v. AY935491 의 6412-8154bp), 및 L 유전자에 대해 98.8% (Avinew 의 SEQ ID NO:12 v. AY935491 의 8381-14995bp) 이다. Queensland V4 에 대해서 GenBank 에서는 오직 일부분의 서열이 이용가능하다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 24 에 언급된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 이의 변이체 또는 절편을 제공한다. 본 발명은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 대한 상보성 가닥을 추가로 포함한다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 또는 13 에 언급된 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 이의 변이체 또는 절편을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:24 에 언급된 서열을 갖는 AVINEW 의 게놈 cDNA 를 제공한다. 또다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:24 에 언급된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 역방향 상보성 가닥이다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 역방향 상보성 가닥은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:24 에 언급된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 또는 13 에 언급된 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 같은 AVINEW 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 절편을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 또는 13 에 언급된 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드 중 하나의 8 개 이상 또는 10 개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 보존성 변이체, 대립 형질 변이체, 상동 또는 면역원성 절편, 또는 상기 폴리펩티드의 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 24 에 언급된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변이체를 제공한다. 또다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 24 에 언급된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 역방향 상보성 가닥이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 24 에 언급된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에 대해 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 역방향 상보성 가닥, 또는 이의 변이체를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 백신 또는 조성물로 접종된 숙주 동물에서 면역학적 반응을 유도하기 위한 약학 조성물 또는 백신에 관한 것으로, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및 개질 AVINEW 재조합 바이러스를 포함한다. 본 발명의 또다른 양상에서, 유전자조작된 AVINEW 바이러스에는 바이러스 게놈의 비-필수 영역 내에, 숙주에게 투여되는 경우 백신이 병원체에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 면역학적 반응을 유도할 수 있는 병원체로부터 유래된 항원 단백질을 코딩하는 이종 DNA 서열이 포함된다.
"비필수 영역" 이라는 용어는 조직 배양 시 바이러스의 복제 및 증식에 필수적이지 않고, 그의 결실 또는 비활성화가 다양한 동물 시스템에서 병독성을 감소시킬 수 있는 바이러스 게놈의 영역을 말한다. 이의 임의의 비필수 영역 또는 부분은 AVINEW 게놈으로부터 결실될 수 있고, 또는 외래 서열이 그 내부에 삽입될 수 있고, 결실 또는 삽입으로부터 기인하는 유전자조작된 AVINEW 의 생존력 및 안정성은 그의 결실된 영역 또는 부분이 실제로 비필수적인지를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 또다른 구현예에서, AVINEW 게놈의 비필수 영역은 P 유전자와 M 유전자 사이의 영역, 또는 AVINEW 게놈의 M 유전자와 F 유전자 사이의 영역이다. 또다른 구현예에서, 비필수 영역은 SEQ ID NO:1 의 3075nt - 3289nt 또는 4385nt - 4543nt, SEQ ID NO:24 의 3115nt - 3353nt 또는 4449nt - 4607nt 의 영역에 있을 수 있다.
본 발명의 하나의 양상은 조류 항원을 발현하는 NDV 벡터에 관한 것이다. 항원은 조류 독감 항원일 수 있다. 조류 독감 항원은 H5 HA 와 같은 적혈구응집소일 수 있다.
조류 독감 유전자를 발현하는 NDV 벡터, 예컨대 HPAIV 야생 새 단리물로부터의 야생형 및 돌연변이 HA 개방형 해독 프레임 (ORF) 을 모두 가지고 있는 H5 서브유형 조류 독감 바이러스 (AIV) 적혈구응집소 (HA) 를 발현하는 NDV 의 구축물, LaSota NDV 백신 균주의 P 와 M 유전자 사이의 유전자간 영역 내에 삽입된 A/인도기러기/칭하이성/3/2005 (H5N1) (예를 들어, Ge et al., Journal of Virology, Jan. 2007, vol. 81, no. 1, pp. 105-158), GenBank 의 접근 번호 AF375823 으로 제출된 독감 바이러스를 발현하는 뉴캐슬 질환 바이러스 (Newcastle disease virus: NDV) 백신 균주 Hitchner B1 의 완전한 cDNA 클론 (예를 들어, Nakaya et al., Journal of Virology, Dec. 2001, pp. 11868-11873 참조), HPAIV A/닭/베트남/P41/05 (H5N1) 의 H5 단백질을 발현하는 NDV 재조합체 (NDVH5Vm) (예를 들어, Roemer-Oberdoerfer et al., Vaccine. 2008 May 2;26(19):2307-13. Epub 2008 Mar 18 참조), 조류 독감 바이러스 (AIV) A/닭/NY/13142-5/94 (H7N2) 로부터의 적혈구응집소 (HA) 유전자가 삽입된 약독형 파라믹소바이러스 유형 1 벡터 (NDV B1 균주) 를 사용하여 구축된 rNDV-AIV-H7 (예를 들어, Swayne et al., Avian Diseases 47:1047-1050, 2003 참조), 역방향 유전학에 의해 구축된 서브유형 H5 의 NDV-발현 조류 독감 바이러스 (AIV) 적혈구응집소 (HA) (예를 들어, Veits et al., PNAS, May 23, 2006, vol. 103, no. 21, pp. 8197-8202 참조) 및 약독형 NDV 백신 균주 클론 30 에 근거하는 AIV A/닭/베트남/P41/2005 (H5N1) 의 HA 유전자를 발현하는 재조합체 NDV-H5 (예를 들어, Veits et al., Vaccine (2008) 26, 1688-1696 참조) 가 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 또다른 구현예에서, NDV 유전자를 발현하는 조류 독감 바이러스, 예컨대 H5N1 조류 독감 바이러스의 뉴라미니다아제 단백질 대신 NDV 의 적혈구응집소-뉴라미니다아제 유전자의 엑토도메인을 발현하는 키메라 조류 독감 바이러스 또는 융합생성되고 약화된 NDV 유전자 내에 H7 조류 독감 바이러스 적혈구응집소의 엑토도메인을 발현하는 (NDV 의 F 단백질로부터 유래된 막관통 및 세포질 도메인과 함께, 오직 그의 엑토도메인 만을 함유함) 이가 백신 (예를 들어, Park et al., PNAS, May 23, 2006, vol. 103, no. 21, pp. 8203-8308 참조) 이 또한 포함된다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 표적 세포에서 단백질, 항원, 에피토프 또는 면역원의 전달 및 발현을 위한 치료학적 유효량의 제형의 투여를 제공한다. 예방학적 또는 치료학적 유효량의 결정은 당업자의 정규적인 실험에 따른다. 또다른 구현예에서, 제형은 독감 항원, 에피토프 또는 면역원 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 비히클 또는 부형제를 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또다른 구현예에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 비히클 또는 부형제는 트랜스펙션을 용이하게 하고/하거나 벡터 또는 단백질의 보존을 향상시킨다.
약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 살균수, 0.9% NaCl (예를 들어, 식염수) 용액 또는 인산염 완충액일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 기타 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제에는 폴리-(L-글루타메이트) 또는 폴리비닐피롤리돈이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 벡터 (또는 시험관 내에서 본 발명의 벡터로부터 발현되는 단백질) 의 투여를 용이하게 하는 임의의 화합물 또는 화합물의 조합일 수 있고; 유리하게는, 담체, 비히클 또는 부형제는 트랜스펙션을 용이하게 하고/하거나 벡터 (또는 단백질) 의 보존을 향상시킬 수 있다. 투여량 및 투여 부피는 일반적 설명에서 본원에 기재되어 있고 또한 임의의 과도한 실험 없이 당업계의 지식과 함께 해독되는 본 명세서로부터 당업자에 의해 결정될 수 있다.
플라스미드에 유리하게는 그러나 배타적인 것은 아닌 적합한 4 차 암모늄 염을 함유하는 양이온성 지질은, 유리하게는 하기 화학식을 가진 것이다:
(식 중, R1 은 탄소수 12 내지 18 의 포화 또는 불포화 직쇄 지방족 라디칼이고, R2 는 탄소수 2 또는 3 의 또다른 지방족 라디칼이고, X 는 아민 또는 히드록실기, 예를 들어, DMRIE 임). 또다른 구현예에서, 양이온성 지질은 중성 지질, 예를 들어, D0PE 와 결부될 수 있다.
상기 양이온성 지질 중에서, 유리하게는 중성 지질, 유리하게는 D0PE (디올레오일-포스파티딜-에탄올 아민; Behr, 1994) 과 결부되어 DMRIE-D0PE 를 형성하는, DMRIE (N-(2-히드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판 암모늄; WO96/34109) 가 바람직하다.
유리하게는, 아쥬반트와의 플라스미드 혼합물이 즉흥적으로, 그리고 유리하게는 제제의 투여와 동시에 또는 제제의 투여 직전에 형성되고; 예를 들어, 투여 직전 또는 전에, 유리하게는 복합체를 형성하기 위해 혼합물에 대한 투여 전 충분한 시간을 제공하도록, 예를 들어, 투여 약 10 내지 약 60 분 전, 예컨대 투여 대략 30 분 전에 플라스미드-아쥬반트 혼합물이 형성된다.
D0PE 가 존재하는 경우, DMRIE:D0PE 몰비는 유리하게는 약 95:약 5 내지 약 5:약 95, 더욱 유리하게는 약 1:약 1, 예를 들어, 1:1 이다.
DMRIE 또는 DMRIE-D0PE 아쥬반트: 플라스미드 중량비는 약 50:약 1 내지 약 1:약 10, 예컨대 약 10:약 1 내지 약 1:약 5, 유리하게는 약 1:약 1 내지 약 1:약 2, 예를 들어, 1:1 내지 1:2 일 수 있다.
또다른 구현예에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클은 유중수 에멀젼일 수 있다. 적합한 유중수 에멀젼의 예에는 하기: 항원-함유 수상 6 내지 50 v/v %, 바람직하게는 12 내지 25 v/v %, 전체적으로 또는 부분적으로 비-대사성 오일 (예를 들어, 광유, 예컨대 파라핀 오일) 및/또는 대사성 오일 (예를 들어, 식물성 오일, 또는 지방산, 폴리올 또는 알코올 에스테르) 을 함유하는 유상 50 내지 94 v/v %, 계면활성제 0.2 내지 20 p/v %, 바람직하게는 3 내지 8 p/v % 를 함유하고 4℃ 에서 안정하고 유체인 오일계 유중수 백신 에멀젼이 포함되는데, 상기 계면활성제는 전체적으로 또는 부분적으로, 또는 혼합물에서 폴리글리세롤 에스테르로 있고, 상기 폴리글리세롤 에스테르는 바람직하게는 폴리글리세롤 (폴리)리시놀레에이트, 또는 폴리옥시에틸렌 리신 오일 또는 그 밖의 수소화된 폴리옥시에틸렌 리신 오일이다. 유중수 에멀젼에 사용될 수 있는 계면활성제의 예에는 에톡시화 소르비탄 에스테르 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트 (Tween 80®), AppliChem, Inc., Cheshire, CT 사제) 및 소르비탄 에스테르 (예를 들어, 소르비탄 모노올레에이트 (Span 80®), Sigma Aldrich, St. Louis, MO 사제) 가 포함된다. 또한, 유중수 에멀젼과 관련해서는, 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제 6,919,084 호, 예를 들어, 그의 실시예 8 을 참조한다. 일부 구현예에서, 항원-함유 수상은 하나 이상의 완충제를 포함하는 식염수를 포함한다. 적합한 완충액의 예는 인산염 완충 식염수이다. 유리한 구현예에서, 유중수 에멀젼은 수/유/수 (W/O/W) 삼중 에멀젼 (예를 들어, 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제 6,358,500 호를 참조함) 일 수 있다. 다른 적합한 에멀젼의 예는 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제 7,371,395 호에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 면역학적 조성물 및 백신은 하나 이상의 아쥬반트를 포함할 수 있거나 이들로 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 아쥬반트는 (1) 아크릴 또는 메타크릴산의 중합체, 말레 무수물 및 알케닐 유도체 중합체, (2) 면역자극 서열 (ISS), 예컨대 하나 이상의 비-메틸화 CpG 단위를 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열 (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) 수중유 에멀젼, 예컨대 문헌 ["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995] 의 p 147 에 기재되어 있는 SPT 에멀젼, 및 상기 동일 문헌의 p 183 에 기재되어 있는 에멀젼 MF59, (4) 4 차 암모늄 염을 함유하는 양이온 지질, 예를 들어, DDA (5) 사이토카인, (6) 수산화 알루미늄 또는 인산염 알루미늄, (7) 사포닌 또는 (8) 본 출원에 참조로서 언급되고 인용되는 임의의 문헌에서 논의되는 기타 아쥬반트, 또는 (9) 이의 임의의 조합 또는 혼합물이다.
바이러스 벡터에 특히 적합한 수중유 에멀젼 (3) 은, 경질 액체 파라핀 오일 (유럽 약전 유형), 이소프레노이드 오일, 예컨대 스쿠알란, 스쿠알렌, 알켄, 예를 들어, 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로부터 수득되는 오일, 직쇄 알킬기를 갖는 산 또는 알코올의 에스테르, 예컨대 식물성 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜, 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세롤 트리(카프릴레이트/카프레이트) 및 프로필렌 글리콜 디올레에이트, 또는 분지형, 지방 알코올 또는 산의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르에 근거할 수 있다.
오일은 유화제와 조합으로 사용되어 에멀젼을 형성한다. 유화제는 비이온성 계면활성제, 예컨대: 한편으로는 소르비탄, 만나이드 (예를 들어, 무수만니톨 올레에이트), 글리세롤, 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 및 다른 한편으로는 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르일 수 있고, 상기 에스테르는 임의로 에톡시화된, 또는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 예컨대 Pluronic, 예를 들어, L121 이다.
유형 (1) 아쥬반트 중합체 중에서, 가교 결합된 아크릴 또는 메타크릴산 (특히 당 또는 폴리알코올의 폴리알케닐 에테르에 의해 가교 결합된) 의 중합체가 바람직하다. 상기 화합물은 카르보머라는 명칭으로 알려져 있다 (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996). 또한 당업자는 3 개 이상의 히드록실기, 바람직하게는 8 개 이하의 히드록실기를 갖는 폴리히드록실 화합물 (3 개 이상의 히드록실기의 수소 원자는 2 개 이상의 탄소 원자를 갖는 불포화, 지방족 라디칼로 대체됨) 에 의해 가교 결합된 아크릴 중합체를 제공하는, 미국 특허 제 2,909,462 호를 언급할 수 있다. 바람직한 라디칼은 탄소수 2 내지 4 의, 예를 들어, 비닐, 알릴 및 기타 에틸렌성 불포화기를 함유하는 라디칼이다. 불포화된 라디칼은 또한 메틸과 같은 다른 치환기를 함유할 수 있다. 상표명 Carbopol 로 판매되는 제품 (BF Goodrich, Ohio, USA) 이 특히 적합하다. 이들은 알릴 사카로오스 또는 알릴 펜타에리트리톨에 의해 교차 결합된다. 이 중에서, Carbopol 974P, 934P 및 971P 를 참조한다.
말레 무수물-알케닐 유도체 공중합체로서, 직쇄 또는 가교 결합된 에틸렌-말레 무수물 공중합체인 EMA (Monsanto) 가 바람직하고, 이들은 예를 들어, 디비닐 에테르에 의해 가교 결합된다. 또한 문헌 [J. Fields et al., 1960] 를 참조한다.
구조와 관련하여, 아크릴 또는 메타크릴산 중합체 및 EMA 는 바람직하게는 하기 화학식을 갖는 기본 단위에 의해 형성된다:
[식 중:
- 동일 또는 상이할 수 있는 R1 및 R2 는 H 또는 CH3 을 내타내고
- x = 0 또는 1, 바람직하게는 x = 1 이고,
- y = 1 또는 2 로서, x + y = 2 임].
EMA 의 경우, x = 0 및 y = 2 이고, 카르보머의 경우 x = y = 1 이다.
상기 중합체는 물 또는 생리학적 염 용액 (20 g/1 NaCl) 에 용해되고, pH 는 예를 들어, 탄산수 (NaOH) 에 의해 7.3 내지 7.4 로 조정될 수 있어, 발현 벡터(들) 이 도입될 수 있는 아쥬반트 용액을 제공한다. 최종 면역학적 또는 백신 조성물 중의 중합체 농도는 0.01 내지 1.5% w/v, 0.05 내지 1% w/v 또는 0.1 내지 0.4% w/v 의 범위일 수 있다.
사이토카인(들) (5) 는 면역학적 또는 백신 조성물 내에서 단백질 형태로 있을 수 있고, 또는 이의 면역원(들) 또는 에피토프(들) 과 숙주 내에서 동시-발현될 수 있다. 이의 면역원(들) 또는 에피토프(들) 을 발현하는 동일한 벡터에 의한, 또는 이의 별도의 벡터에 의한 사이토카인(들) 의 동시-발현이 바람직하다.
본 발명은 예를 들어, 활성 성분, 유리하게는 아쥬반트, 담체, 사이토카인, 및/또는 희석제와 함게 혼련함으로써, 이러한 조합 조성물을 제조하는 것에 관한 것이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 사이토카인에는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구/대식 세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론 α (IFNα), 인터페론 β (IFNβ), 인터페론 γ (IFNγ), 인터류킨-1α (IL-1α), 인터류킨-1β (IL- 1β), 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨-5 (IL-5), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-7 (IL-7), 인터류킨-8 (IL-8), 인터류킨-9 (IL-9), 인터류킨-10 (IL-10), 인터류킨-11 (IL-11), 인터류킨-12 (IL-12), 종양 괴사 인자 α (TNFα), 종양 괴사 인자 β (TNFβ), 및 형질전환 성장 인자 β (TGFβ) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 사이토카인은 본 발명의 면역학적 또는 백신 조성물과 동시 투여되고/되거나 연속으로 투여될 수 있다는 것으로 이해된다. 그러므로, 예를 들어, 본 발명의 백신은 또한 생체 내에서 적합한 사이토카인, 예를 들어, 백신접종되는 상기 숙주에 매칭되거나 면역학적 반응이 도출되는 사이토카인 (예를 들어, 조류에 투여되는 제제에 대한 조류 사이토카인) 을 발현하는 외생 핵산 분자를 함유할 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 문헌 [Stauffer et al. (Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 1, 291-296, 2006)] 에 기재된 화학적 또는 물리적 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 비활성화 기술의 일부는 하기 표에 요약되어 있다.
하나의 구현예에서, 백신의 투여는 닭, 오리, 거위, 칠면조, 기니닭, 자고새 또는 타조와 같은 조류에 대해 이루어진다. 닭에는 산란계, 종계, 육계, 팬시 닭, 및 교배 암닭이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 오리에는 북경오리, 사향오리, 뮬 오리 및 야생오리가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 조류가 오리 또는 닭보다 큰 조류인 구현예에서, 더 많은 투여량이 고려될 수 있다. 예를 들어, 투여가 점안액에 의해 이루어지는 구현예에서, 투여량은 대략 약 1 닭 투여량, 2 닭 투여량, 3 닭 투여량, 4 닭 투여량, 5 닭 투여량, 6 닭 투여량, 7 닭 투여량, 8 닭 투여량, 9 닭 투여량 및 유리하게는 10 닭 투여량에 이르고 필요하다면 복용량을 약 20 에서 약 100 닭 투여량까지 올릴 수 있다. 참조의 편의를 위해, 5.5 log10 50% 계란 감염성 투여량 (Egg Infective Dose: EID50) 가 대략 1 닭 투여량이다.
또다른 구현예에서, 복용량은 평균 배아 감염성 투여량 (embryo infectious doses: EID50) 일 수 있다. 하나의 구현예에서, 복용량은 약 101 EID50, 약 102 EID50, 103 EID50, 약 104 EID50, 약 105 EID50, 약 106 EID50, 약 107 EID50, 또는 약 108 EID50 일 수 있다.
본 발명에 따른 면역학적 조성물 및/또는 백신은 본원에 논의된 하나 이상의 발현 벡터 및/또는 폴리펩티드의 보호 또는 치료 반응을 도출하기 위한 유효량을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어지며; 유효량은 과도한 실험 없이, 본원에 인용된 문헌 및 당업계의 지식을 비롯하여 본 기재로부터 결정될 수 있다.
유리하게는, 항원이 적혈구응집소인 경우, 복용량은 적혈구응집반응 단위 (hemagglutination unit: HAU) 또는 ㎍ 으로 측정된다. 유리한 구현예에서, 복용량은 약 100 적혈구응집반응 단위 (HAU)/투여량, 약 1000 HAU/투여량 또는 약 10000 HAU/투여량일 수 있다. 특정 구현예에서, 복용량은 1 내지 100 ㎍ 이다. 복용량 부피는 약 0.02 ㎖ 내지 2 ㎖, 유리하게는 0.03 ㎖ 내지 1 ㎖, 더욱 유리하게는 0.03 ㎖ 내지 0.5 ㎖ 일 수 있고, 특히 유리한 구현예에서, 부피는 약 0.03 ㎖ 내지 약 0.3 ㎖ 일 수 있다.
본 발명의 백신은 조류 알 내에, 식수, 스프레이, 에어로졸, 비강 점적 주입, 점안액, 부리 담금을 통해, 날개-망 찌름, 경피, 피하 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 유리하게는, 백신은 피하, 알 내, 점안액, 스프레이 또는 식수에 의해 투여된다.
또다른 구현예에서, 백신은 부화 1 내지 3 일 전에 알 내에, 또는 1 일령, 2 일령, 3 일령, 4 일령, 5 일령, 6 일령, 7 일령, 8 일령, 9 일령, 10 일령, 11 일령, 12 일령, 13 일령, 14 일령, 15 일령, 16 일령, 17 일령, 18 일령, 19 일령, 20 일령 또는 21 일령 닭에 투여될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 하나 이상의 공통의 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 사용하는 하나 이상의 프라임 투여 및 하나 이상의 부스트 투여로 구성되는 프라임-부스트 섭생이 사용될 수 있다. 프라임 투여에 사용된 면역학적 조성물 또는 백신은 부스트로서 사용되는 것과 사실상 상이하다. 그러나, 동일한 조성물이 프라임 투여 및 부스트로서 사용될 수 있다는 것을 유념한다. 상기 투여 프로토콜을 "프라임-부스트" 라고 부른다.
본 발명의 프라임-부스트 프로토콜의 또다른 양상에서, 유전자조작된 조류 독감 Avinew NDV 백신 또는 조성물을 포함하는 조성물을 투여한 후, 생체 내에서 조류 독감 항원을 함유하고 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 조류 독감 항원을 포함하는 비활성화된 바이러스 백신 또는 조성물, 또는 조류 독감 서브유닛 (단백질) 을 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 조류 독감 항원을 함유하거나 발현하는 DNA 플라스미드 백신 또는 조성물을 투여한다. 마찬가지로, 프라임-부스트 프로토콜은 생체 내에서 조류 독감 항원을 함유하고 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 조류 독감 항원을 포함하는 비활성화된 바이러스 백신 또는 조성물, 또는 조류 독감 서브유닛 (단백질) 을 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 조류 독감 항원을 함유하거나 발현하는 DNA 플라스미드 백신 또는 조성물을 투여한 후, 유전자조작된 조류 독감 Avinew NDV 백신 또는 조성물을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 추가로, 프라임 및 이차 투여 모두가 유전자조작된 조류 독감 Avinew NDV 백신 또는 조성물을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다는 것을 유념한다.
프라임-부스트 프로토콜은 하나 이상의 공통의 항원을 사용하는 하나 이상의 프라임-투여 및 하나 이상의 부스트 투여를 포함한다. 프라임-투여에 사용되는 백신 또는 조성물은 이후 부스트 백신 또는 조성물로서 사용되는 것과 사실상 상이할 수 있다. 프라임-투여는 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다. 유사하게는, 부스트 투여는 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다.
다양한 투여가 바람직하게는 약 1 내지 약 6 주 간격으로, 또는 약 2 내지 약 4 주 간격으로 수행된다. 매 2 내지 6 주 반복된 부스트 또는 연간 부스트가 또한 고려된다. 동물은 바람직하게는 첫번째 투여 시에 1 일령 이상이다.
면역학적 조성물 및/또는 백신은 투여량 당 약 104 내지 약 1011, 유리하게는 약 105 내지 약 1010, 더욱 유리하게는 약 106 내지 약 109 바이러스 입자의, 독감 항원, 에피토프 또는 면역원을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 함유한다. 폭스바이러스에 근거한 면역학적 조성물 및/또는 백신의 경우에, 투여량은 약 102 pfu 내지 약 109 pfu 일 수 있다. 면역학적 조성물 및/또는 백신은 투여량 당 약 102 내지 약 107, 유리하게는 약 103 내지 약 105 pfu 의, 독감 항원, 에피토프 또는 면역원을 발현하는 폭스바이러스 또는 헤르페스바이러스 제조합체를 함유한다.
조류 면역학적 조성물 또는 백신이 비활성화된 조류 바이러스인 구현예에서, 오일-에멀젼 백신의 제조에 사용되는 다양한 종자 바이러스로부터 유도될 수 있는 비활성화된 조류 바이러스에는 Ulster 2C, B1, LaSota 또는 Roakin 이 포함될 수 있다. 비활성화된 조류 독감 바이러스는 또한 고전적으로 비활성화될 수 있다 (부화된 SPF 계란에 대해 번식된 H5N9 유라시아 단리물 A/닭/이탈리아 22A/98 을 함유하는 전체 바이러스 베타-프로피오락톤 (beta-propiolactone: BPL)-비활성화 백신 (H5N9-It)). 아쥬반트가 있는, 기타 비활성화 백신에는 서브유형 H5N2 및 H5N9 의 현장 바이러스 또는 유전학적 유전자조작에 의해 유래된 재조합 H5N3 바이러스 (H5N3 바이러스는 A/닭/베트남/C58/04 의 개질된 HA 유전자 (H5N1), A/오리/독일/1215/73 의 뉴라미니다아제 유전자 (H2N3) 및 A/PR/8/34 의 내부 유전자 (H1N1) 를 함유함) 에 근거한 시판되는 전체 바이러스 제제 (Fort Dodge Animal Health, Intervet International, Merial Italia) 가 포함된다.
바이러스 벡터는 약화된 조류폭스 발현 벡터일 수 있다. 하나의 구현예에서, 조류폭스 발현 벡터는 계두 벡터, 예를 들어, TROVAC® 일 수 있다. 또다른 구현예에서, 조류폭스 발현 벡터는 카나리아폭스 벡터, 예를 들어, ALVAC® 일 수 있다. 독감 항원, 에피토프 또는 면역원은 적혈구응집소, 예컨대 H5 일 수 있다. 계두 벡터는 vFP89 (US 2008/0107681 및 US 2008/0107687 참조) 또는 vFP2211 (US 2008/0107681 및 US 2008/0107687 참조) 일 수 있다. 카나리아폭스 벡터는 vCP2241 (US 2008/0107681 및 US 2008/0107687 참조) 일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다른 바이러스에는 백시니아 바이러스, 예컨대 약화된 백시니아 바이러스, 예를 들어 NYVAC, 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
백신의 효율은 치명적 독감 균주, 예를 들어, 독감 H5N1, H5N8 또는 H5N9 균주로 조류와 같은 동물을 접종시킴으로써 최종 면역화 약 2 내지 4 주 후에 시험할 수 있다. 상동 및 이종 균주 모두는 백신의 효율을 시험하기 위한 접종에 사용할 수 있다. 동물을 스프레이에 의해, 비강 내로, 점안액에 의해, 안구-비강으로, IM, 기관 내로, 및/또는 경구로 접종할 수 있다. 접종 바이러스는 투여 경로에 따라 부피가 약 103 내지 약 108 EID50 일 수 있다. 예를 들어, 투여가 스프레이에 의해 이루어지는 경우, 바이러스 현탁액은 약 1 내지 100 ㎛ 액적을 생성하도록 에어로졸화되고, 투여가 비강 내, 기관 내 또는 경구로 이루어지는 경우, 접종 바이러스의 부피는 약 0.05 내지 약 5 ㎖ 이다. 표적 종에 대한 조성물의 투여량 부피, 예를 들어, 조류 조성물의 투여량 부피는, 알 내의 경우 약 50 ㎕, 점안액의 경우 약 20 내지 약 50 ㎕, 스프레이의 경우 약 0.25 ㎖ 내지 약 1 ㎖ 일 수 있다. 임상적 징후 및 폐사율에 대해 접종 후 14 일 동안 동물을 매일 관찰할 수 있다. 또한, 동물 그룹을 안락사시키고 병리학적 발견에 대해 평가할 수 있다. 입인두, 기관 또는 배설강의 면봉 채취 표본을, 접종 후 모든 동물로부터 바이러스 검출을 위해 수집할 수 있다. 조직 내 바이러스 항원의 존재 또는 부재를 면역조직화학, 바이러스 단리 또는 적정, 또는 핵산 검출, 예컨대 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCR) 에 의해 평가할 수 있다. 혈액 샘플을 접종 후에 수집할 수 있고, 항-독감 H5N1 바이러스-특이적 항체의 존재에 대해 분석할 수 있다.
당업자는 본원의 설명이 예로 제공되지만 본 발명이 이에 제한되는 것이 아니라는 것으로 이해해야만 한다. 본원의 설명 및 당업계의 지식으로부터, 당업자는 임의의 과도한 실험 없이, 각각의 면역화 프로토콜에 사용되어지는 투여 횟수, 투여 경로 및 투여량을 결정할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따라 제조된 치료학적 조성물의 유효량을 동물에게 1 회 이상 투여하는 것을 고려한다. 본 투여는 근육내 (IM), 피내 (ID) 또는 피하 (SC) 주사 또는 비강내, 알 내, 또는 경구 투여를 통한, 그러나 이에 제한되지 않는 다양한 경로를 통해 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 치료학적 조성물은 또한 바늘이 없는 장치 (예를 들어 Pigjet, Dermojet, Biojector, Vetjet 또는 Vitajet 장치 (Bioject, Oregon, USA)) 에 의해 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 동물은 조류이다.
본 발명의 또다른 구현예는 재조합 NDV 면역학적 조성물 또는 백신 또는 비활성화된 독감 면역학적 조성물 또는 백신을 포함하는 동물에서 독감에 대한 면역학적 또는 보호 반응을 유도하는 방법을 수행하기 위한 키트 및 동물에서 면역 반응을 도출하기 위해 유효량으로 전달하는 방법을 수행하기 위한 지침이다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 더욱 상세히 설명된다.
실시예
DNA 삽입체, 플라스미드 및 재조합 바이러스 벡터의 구축을 문헌 [J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)] 에 기재된 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수행하였다.
실시예 1 AVINEW® (NDV) 균주의 역 유전학의 개발 및 이종 유전자를 발현하는 NDV 돌연변이체의 생성
본 실시예의 목적은 이종 유전자를 발현하는 유전자조작된 NDV 돌연변이체를 생성하기 위한 AVINEW NDV 균주의 역 유전학을 개발하는 것이었다.
NDV 는 도 1A 에서 묘사된 바와 같이 6 개의 주요 유전자 (NP, P, M, F, HN 및 L) 를 함유하는 (-) RNA 바이러스이다. 유전학적으로 개질된 NDV 바이러스의 생성은 역 유전학 시스템을 필요로 한다. 역 유전학 시스템은 NDV 의 AVINEW 백신 균주에 근거하여 본 출원인에 의해 개발되었다. 본 시스템은 도 1B 에 묘사된 바와 같이 외래 유전자, 예컨대 독감의 적혈구응집소 (HA) 를 발현하는 개질된 뉴캐슬 질환 바이러스의 생성을 가능하게 한다.
실시예 1.1: 전사 플라스미드 내로의 전체 AVINEW NDV 게놈의 클로닝 및 서열 분석
AVINEW NDV 균주의 게놈을 서열분석하기 위한 목적으로, AVINEW 균주의 전체 게놈을 "전사 플라스미드" (도 1C 에서 1 참조) 로서 지칭되는 플라스미드 내로 클로닝할 필요가 있다. 전사 플라스미드는 NDV 의 AVINEW 균주의 전체 게놈에 해당하는 (+) RNA 의 생성을 가능하게 한다. 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCR) 에 의해 AVINEW 추출된 RNA 로부터 증폭된 10 개의 중복 cDNA 절편 세트를 연속적으로 연결시키는 AVINEW 게놈 클로닝 전략은 도 2 에 제시된다. pIV029 라고 지칭되는 상기 최종 플라스미드 (도 3 참조) 는 T7 RNA 폴리머라아제 전사 신호 (업스트림에 위치한 T7 프로모터) 의 통제하에 있고, 진본 NDV 게놈 말단에서 RNA 를 분할하는데 사용되는 델타 간염 바이러스 (Hepatitis Delta Virus: HDV) 리보자임 다음의, T7 터미네이터에 의해 종결되는, AVINEW 의 완전한 게놈 서열을 함유한다. 이식유전자를 삽입하기 위해 제한 부위를 P 와 M 유전자 사이에 삽입하였다 (도 2 & 3 참조).
AVINEW® 균주의 전체 게놈은 서열 분석되었다. AVINEW® 게놈은 뉴클레오캡시드 단백질 결합 모티프에 근거하여 예상되는 바와 같이 6 개 뉴클레오티드의 배수인, 길이 15186 bp 이다.
pIV029 의 삽입체의 주석을 단 서열은 도 4A-4O 에 제시되고, 플라스미드 맵은 도 3 에 제시된다. 도 4A-4O 에서, Avinew 균주 (NP, P, M, F, HN 및 L) 의 6 개의 개방형 해독 프레임 (ORF) 이 이들의 아미노산 서열로 번역된다. 각각의 ORF 는 GS 및 GE 로 표시된 "유전자 시작" 업스트림 및 "유전자 중지" 다운스트림 서열이 측면에 있다. T7 프로모터 및 T7 터미네이터 서열이 표시된다.
실시예 1.2: AVINEW NDV 의 NP, P 및 L 유전자를 함유하는 발현 플라스미드의 구축
역 유전학 시스템에서, T7 RNA 폴리머라아제 프로모터의 통제 하에서 뉴클레오캡시드 (NP), 인단백질 (P) 및 대형 폴리머라아제 단백질 (L) 을 코딩하는 "발현 플라스미드" 로 지칭되는 플라스미드가 구축될 필요가 있다 (도 1C 참조). 상기 3 개의 단백질은 바이러스 RNA 와 결부되어 NDV 의 최소 감염성 단위를 나타내는 리보핵단백질 (RiboNucleoProtein: RNP) 을 형성한다. NP, P, 및 L 단백질로 구성된 복합체는 RNA 의존성 RNA 폴리머라아제 활성을 나타낸다.
발현 플라스미드 pIV32 (도 5), pIV33 (도 6) 및 pIV34 (도 7) 가 구축되었고, T7 RNA 폴리머라아제 프로모터 및 구제역 바이러스 (Foot and Mouth Disease Virus: FMDV) 내재 리보솜 진입 부위 (Internal Ribosome Entry Site: IRES) 의 통제 하에서 AVINEW 의 NP, P 및 L 유전자를 각각 함유한다.
실시예 1.2.1: AVINEW NDV 의 NP 유전자를 함유하는 발현 플라스미드 pIV32 의 구축
발현 플라스미드 pIV32 의 맵은 도 5 에 제시된다. 상기 플라스미드는 T7 RNA 폴리머라아제 프로모터 및 구제역 바이러스 (FMDV) 내재 리보솜 진입 부위 (IRES) 의 통제 하에서 뉴캐슬 질환 바이러스 AVINEW® 백신 균주의 뉴클레오캡시드 (NP) 유전자의 개방형 해독 프레임 (ORF) 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하였다. NDV ORF NP (1467 bp, SEQ ID NO:2) 는 489 개의 아미노산 폴리펩티드 (SEQ ID N0:3) 를 코딩한다. 단백질 NP 는 뉴클레오캡시드의 주요한 구조적 구성요소이다. 단백질은 대략 58 kDa 이다. 총 2600 NP 분자는 게놈 RNA 를 단단하게 단백질막으로 싼다. NP 는 여러 개의, 다른 바이러스-코딩 단백질과 상호작용하며, 모두 복제 (NP-NP, NP-P, NP-(PL), 및 NP-V) 조절에 관여한다. NP 는 NDV 게놈 RNA 와 결부되며, 단백질 P 및 L 은 NDV 게놈의 감염성 형태인 NDV 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 구성한다.
실시예 1.2.2: AVINEW NDV 의 P 유전자를 함유하는 발현 플라스미드 pIV33 의 구축
발현 플라스미드 pIV33 의 맵은 도 6 에 제시된다. 상기 플라스미드는 T7 RNA 폴리머라아제 프로모터 및 구제역 바이러스 (FMDV) 내재 리보솜 진입 부위 (IRES) 의 통제 하에서 뉴캐슬 질환 바이러스 AVINEW® 백신 균주의 인단백질 (P) 유전자의 ORF 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하였다. 상기 플라스미드는 역 유전학 방법론을 사용하는 백신 벡터로서 재조합 NDV AVINEW® 의 생성을 위해 디자인되었다.
NDV ORF P (1185 bp, SEQ ID NO:4) 는 395 개의 아미노산 폴리펩티드인 구조적 인단백질 (P) (SEQ ID NO:5) 을 코딩한다. 상기 단백질은 SDS-PAGE 로 측정된 바와 같이 53 내지 56 kDa 의 분자량을 갖는다. 단백질 P 는 그것이 대형 서브유닛 L 과 함께 형성하는 RNA 폴리머라아제 복합체의 활성에 필수적이다. 폴리머라아제의 모든 촉매적 활성이 L 서브유닛과 결부되어 있지만, 그 기능은 P 와의 특이적 상호작용을 필요로 한다. 단백질 L 및 NP 와, NDV 게놈 RNA 와 결부된 P 는 NDV 게놈의 감염성 형태인 NDV 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 구성한다.
또한, P 유전자는 SDS-PAGE 상에서 36 내지 38 kDa 의 겉보기 분자량을 가진 단백질 V (알려지지 않은 기능) 를 코딩한다. P 및 V 단백질은 동일한 아미노 말단을 공유하나, 이들은 자신의 C-말단에서 갈라진다. 이 차이는 하나의 비-주형 G 잔기가 P-유전자-유래 mRNA 내로 삽입되는 RNA-편집 메카니즘에 의해 발생된다. 미편집된 전사체는 P 단백질을 코딩하는 반면, 편집된 전사체는 V 단백질을 코딩한다. 인단백질인 P 및 V 모두는 전체 길이를 통틀어 세린 및 트레오닌 잔기가 풍부하다. 또한, V 단백질은 C-말단에 시스테인 잔기가 풍부하다. 뿐만 아니라, P 유전자는 SDS-PAGE 상에서 28 내지 33 kDa 의 겉보기 분자량을 가진 단백질 W (알려지지 않은 기능) 를 코딩한다. 상기 단백질은 또한 1 개의 비-주형 G 잔기 대신에 2 개가 P-유전자-유래 mRNA 내로 삽입되는 RNA-편집 메카니즘에 의해 생성된다.
실시예 1.2.3: AVINEW NDV 의 L 유전자를 함유하는 발현 플라스미드 pIV034 의 구축
발현 플라스미드 pIV34 의 맵은 도 7 에 제시된다. 상기 플라스미드는 T7 RNA 폴리머라아제 프로모터 및 구제역 바이러스 (FMDV) 내재 리보솜 진입 부위 (IRES) 의 통제 하에서 뉴캐슬 질환 바이러스 AVINEW® 백신 균주의 대형 폴리머라아제 단백질 (L) 유전자의 ORF 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하였다. 상기 플라스미드는 역 유전학 방법론을 사용하는 백신 벡터로서 재조합 NDV AVINEW® 의 생성을 위해 디자인되었다.
NDV L 유전자 (6612 bp, SEQ ID NO:12) 는 L 단백질 (SEQ ID NO:13) 인 2204 개의 아미노산 폴리펩티드를 코딩한다. 다른 비-분절 (-) 가닥 RNA 바이러스와 달리 파라믹소비리다에는 2 개의 서브유닛인 대형 단백질 L 및 인단백질 P 로 구성된 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제를 갖는다. L 단백질은 복합체에 RNA 폴리머라아제 활성을 부여하는 반면, P 단백질은 전사 인자로서 작용한다. 단백질 P 및 NP 와, NDV 게놈 RNA 와 결부된 단백질 L 은 NDV 게놈의 감염성 형태인 NDV 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 구성한다.
실시예 1.3: T7 RNA 폴리머라아제의 발현을 가능하게 하는 발현 플라스미드의 구축
역 유전학 시스템은 T7 RNA 폴리머라아제가, NDV 바이러스가 재생될 세포에서 발현될 것을 필요로 한다 (도 1C 참조). 벡터로서 재조합 바이러스 (예를 들어, 조류폭스) 의 사용, 효소를 구성적으로 발현하는 세포의 사용, 또는 발현 플라스미드를 사용하는 일시적 발현을 비롯한 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하기 위해 상이한 시스템이 사용될 수 있다. 발현 플라스미드 용액이 선택되었고, HCMV IE 프로모터 하에서 T7 RNA 폴리머라아제를 코딩하는 발현 플라스미드 (pNS151 로 지칭됨) 가 구축되었다. T7 RNA 폴리머라아제는 상기 기재된 발현 플라스미드로부터 NP, P 및 L 단백질의 전사/발현을 허용할 뿐 아니라, NDV 게놈 (전사 플라스미드에 존재함) 을 (+) 센스 RNA 내로 전사한다. 플라스미드의 맵은 도 8 에 제시된다.
실시예 1.4: 역 유전학 시스템을 사용하는 NDV 바이러스의 회수
상기 기재된 5 개의 플라스미드 (NDV 게놈을 함유하는 1 개의 전사 플라스미드, NDV NP, P 및 L 을 발현하는 3 개의 발현 플라스미드, 및 T7 폴리머라아제를 발현하는 발현 플라스미드) 를 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary: CHO) 세포 내로 함께 동시-트랜스펙션시켰다. 도 1C 는 역 유전학 시스템의 메카니즘을 설명하는 대표 도식이다. 도식이 보여주는 바와 같이 세포의 도입 시, T7 RNA 폴리머라아제가 발현되고, 이것이 이후에 전사 플라스미드로부터 NDV 게놈을 (+) 센스 RNA (RNA(+)) 게놈으로 전사시킨다 (뿐만 아니라 개개의 발현 플라스미드로부터의 NP, P 및 L 유전자로도). 그 후 NP, P 및 L 단백질 전사체가 발현된 NP, P 및 L 단백질으로서 번역된 다음, 이것이 조립되어 게놈 RNA(+) 와 함께 RNP 를 형성한다. 상기 RNP 복합체가 (-) 센스 RNA 게놈 (RNA(-)) 을 합성한 다음, 이것이 감염성 입자의 발생을 용이하게 하는 NDV 바이러스의 정상적인 복제 사이클을 개시한다. 트립신 또는 단서가 되는 계란 요막에 의해 제공되는 바와 같은 다른 외생 프로테아제가 생성된 바이러스의 F 단백질을 분할하기 위해 배지에 첨가될 수 있다.
상기 시스템을 사용하여, AVINEW NDV 의 감염성 입자가 성공적으로 수득되었다. 간략하게는, 필요한 상이한 플라스미드 (pIV029, pIV32, pIV33, pIV034 및 pNS151) 를 CHO 세포 내로 트랜스펙션하였다. 72 시간 후에, 바이러스를 증폭시키기 위해, CHO 상청액을 10 일령 발육란에 접종하였다. 3 일 후, 요막액을 수확하고 닭 적혈구 세포를 사용하여 적혈구응집반응 활성 (HA) 에 대해 확인하였다. 수득된 역 유전학 AVINEW 돌연변이체를 vAVW01 로 지칭하였다. 이것은 P 와 M 유전자 사이에 도입된 2 개의 독특한 제한 부위 (PacI & FseI) 를 제외한 AVINEW 모체 바이러스와 동일한 서열을 함유한다 (도 2 참조).
실시에 1.5: 역 유전학 시스템을 사용하는 외래 유전자를 발현하는 NDV 바이러스의 발생
외래 항원을 발현하는 개질 NDV 바이러스를 생성하기 위해, 삽입 유전자좌가 선택될 필요가 있다. 상이한 유전자좌가 NP 유전자의 업스트림을 포함하고 2 개 유전자 사이에서 선택될 수 있다. 본 실시예에서, AVINEW® NDV 의 P 및 M 유전자 사이의 부위가 도 9 에서 제시된 바와 같이 외래 유전자를 삽입하기 위해 선택되었다. 외래 유전자는 필요한 "시작" 및 "중지" 전사 서열과 함께 삽입될 필요가 있고, 삽입된 뉴클레오티드의 수는 개질된 NDV 게놈 내의 뉴클레오티드의 총 수가 6 의 배수로 남아있도록 디자인될 필요가 있다.
본 실시예는 조류 독감으로부터 적혈구응집소 (HA) 유전자를 발현하는 AVINEW 돌연변이체의 발생을 상세히 설명한다. pIV029 의 PacI 및 FseI 독특한 제한 부위 내에 외래 유전자 및 측면 서열의 삽입을 가능하게 하는 전이 플라스미드 내로 HA 유전자가 먼저 삽입되었다. 전이 플라스미드의 구조는 도 9 (박스 내) 에 제시되어 있다. 이것은 왼쪽에서 오른쪽으로 PacI 부위, PacI 부위로부터의 P 다운스트림의 3' UTR, P 의 유전자 말단 (또는 STOP) 서열, P/M 유전자간, M 의 유전자 시작 (또는 START) 서열, M 의 5' UTR, 복합 클로닝 부위, P 의 3' UTR (PacI 부위로부터 업스트림) 및 FseI 부위를 함유한다. HA 유전자를 도 9 에 기재된 전이 플라스미드의 복합 클로닝 부위 내로 클로닝한 다음, 전체 PacI/FseI 삽입체를 pIV029 의 동일한 제한 부위 내로 클로닝하여 (도 3), 외래 유전자를 함유하는 전사 플라스미드를 발생시킨다. 이러한 전사 플라스미드의 예 (pIV039) 를 도 10 에 제시한다. 본 실시예에서, 분할 부위에서 개질된 A/닭/인도네시아/7/2003 고도로 병원성인 H5N1 조류 독감 바이러스의 HA 유전자의 아미노산 서열을 코딩하는 합성 유전자를 전사 플라스미드 내에 삽입하였다.
전사 플라스미드 pIV039 를 역 유전학 (실시예 1.4 참조) 에 의한 AVINEW 돌연변이체의 발생에 필요한 4 개의 부가적인 발현 플라스미드와 함께 사용하여, A/닭/인도네시아/7/2003 고도로 병원성인 (HP) H5N1 조류 독감 (AI) 바이러스로부터의 HA 유전자를 발현하는 vAVW02 로 지칭되는 AVINEW® 돌연변이체를 발생시켰다.
상이한 HPAI H5N1 또는 낮은 병원성 AI (LPAI) H9N2 로부터의 HA 유전자를 발현하는 상이한 AVINEW 돌연변이체를 발생시키기 위해 동일한 방법을 사용하였다. 상이한 H5N1 및 H9N2 AI 단리물로부터의 삽입체 HA 유전자의 서열을 도 12 에 제시된 바와 같은 SEQ ID NO 로 지정하고, DNA 및 단백질 서열 모두가 서열 목록에 포함되어 있다. 본 출원과 함께 제출된 전자 서열 목록의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 인용된다.
상이한 HPAI H5N1 또는 낮은 병원성 AI (LPAI) H9N2 로부터의 HA 유전자를 발현하는 감염성 AVINEW 돌연변이체의 회수에 상기 기재된 절차가 성공적으로 사용되었다 (표 1 참조).
표 1. 상이한 조류 독감 단리물로부터 합성 HA 유전자를 발현하고 발생된 상이한 조류 돌연변이체. HPAI H5N1 로부터의 모든 HA 유전자는 LPAI H5 단리물의 분할 부위의 서열에 부합하도록 분할 부위에서 돌연변이되었다
실시예 1.6: 역 유전학 시스템을 사용하는 외래 유전자를 발현하는 NDV 바이러스의 제조 및 특징 분석
모든 유전자조작된 AVINEW 돌연변이체를 발육란 상의 연이은 계대에 의해 증폭시키고 특징을 분석하였다. 재조합 바이러스는 본래 AVINEW® 바이러스와 유사한 적정 농도 (8 내지 10 log10 EID50/㎖) 까지 성장하였으며, 이는 외래 유전자 삽입이 발육란에서의 바이러스의 복제에 대해 유의한 영향을 주지 않았음을 암시한다. 발육란 상의 2 또는 3 계대에서 수득된 감염성 적정 농도의 예를 표 2 에 제시한다.
H5 이식유전자의 발현을 감염된 CHO 세포 상의 간접 면역형광에 의해, 그리고 요막액 상 및 CHO 감염된 세포 용해물 상의 면역블롯 (웨스턴 블롯 (Western Blot: WB) 에 의해 확인하였다 (예로서 vAVW02 에 대해 도 11A 및 11B 참조). H5 의 전기영동 프로파일은 예상했던 대로였다. 요막액 내 프로테아제의 존재로 인해, 적합한 HA 분할 생성물, 즉 HA1 (50kDa) 및 HA2 (28kDa) 가 검출되었다. 계란-성장된 바이러스로 감염된 CHO 세포 (트립신의 부재 하에) 에서, 본 출원인은 오직 HA0 형태 (75kDa) 만을 검출하였다 (도 11A).
NDV 비리온의 표면에서의 외래 HA 단백질의 발현을, 예로서 vAVW02 를 사용하는 면역전자 현미경법에 의해 확인하였다 (도 2B 참조).
표 2. 상이한 조류 독감 단리물로부터의 합성 HA 유전자를 발현하고 발생된 Avinew 돌연변이체의 발현 수율 및 통제.
실시예 2 닭 연구 1: 닭에서 유전자조작된 AVINEW 돌연변이체에 의해 유도된 뉴캐슬 질환 및 ND 에 대한 보호 및 AI HI 적정 농도
본 연구의 목적은 AVINEW 균주의 게놈 내로의 외래 유전자의 도입이 뉴캐슬 질환 (ND) 에 대해 닭을 보호하는 능력을 감소시키지 않았다는 것을 입증하기 위한 것이었다. 백신접종 계획은 도 3A 의 상부 패널에 제시된다. AVINEW 백신 및 2 개의 유전자조작된 AVINEW 변이체 (어떠한 삽입체도 함유하지 않은 vAVW01 (표 1 참조) 및 HPAI H5N1 HA 삽입체를 함유하는 vAVW03) 에 의해 유도된 보호 % 가 도 3A 의 하부 표에 제시된다. 2 가지 시험된 투여량의 3 회 백신에 의해 유사한 수준의 ND 보호가 유도되었고, 이는 시험된 조건에서, Herts33 균주로의 강독형 NDV 접종에 대해 보호하는 벡터의 능력에 대해 HA 삽입의 부정적인 영향이 없다는 것을 증명한다.
실시예 3 NDV 및/또는 AI 에 대한 모체에서 유래된 항체 (MDA) 가 있는 또는 없는 SPF 닭에서 유전자조작된 AVINEW 돌연변이체에 의해 유도된 H5N1 HPAI 에 대한 보호
실시예 3.1: 닭 연구 2: SPF 닭에서 유전자조작된 AVINEW 돌연변이체의 1 회 투여에 의해 유도된 헝가리 (2006) H5N1 HPAI 단리물에 대한 보호
HPAI H5N1 접종에 대한 유전자조작된 AVINEW 돌연변이체 vAVW03 의 효율을 SPF (특이적 병원체가 없는) 닭에서 평가하였다. 8 마리의 1 일령 SPF 닭에 점안액 (ED) 및 비강 내 (IN) 경로에 의해 105 EID50 을 백신접종하였다 (D0). H5N1 접종 (새 1 마리 당 H5N1 계통군 2.2 A/오리/헝가리/11804/2006 단리물, 6 log10) 을 백신접종 4 주 후 (D28) 및 6 주 후 (D42) 에 수행하였다. 접종 후 2 주 동안 닭을 추적 연구하였다. 결과를 하기 표 3 및 표 A 에 제시한다.
표 3. 닭 연구 2: SPF 병아리에서 HPAI H5N1 (A/오리/헝가리/11804/2006) 접종에 대한 유전자조작된 vAVW03 돌연변이체에 의해 유도된 보호 효능을 평가하는 백신접종-접종 연구로부터의 임상 보호 결과
표 A: 닭 연구 2: SPF 병아리에서 HPAI H5N1 (A/오리/헝가리/11804/2006) 접종에 대한 유전자조작된 vAVW03 돌연변이체에 의해 유도된 보호 효능을 평가하는 백신접종-접종 연구로부터의 방출에 대한 보호 결과
D28 및 D42 에 각각, 완전한 및 부분적인 (75%) 임상 보호가 유도되었다. 검출가능한 양의 접종 바이러스를 방출하는 닭의 수는 백신접종된 그룹에서 감소하였다. 게다가 2 dpc 에 백신접종된 그룹 (2 및 4) 에서의 방출 수준은 접종 후 D28 및 D42 에 각각, 대조군 그룹에서보다 3 log10 초과 약 2 log10 미만이었다. 전체적으로, 상기 결과는 HPAI HA 유전자를 발현하는 Avinew 벡터가 SPF 닭에서 보호적이라는 것을 나타낸다.
실시예 3.A: 닭 연구 A: SPF 닭에서 유전자조작된 AVINEW 돌연변이체의 1 회 투여에 의해 유도된 이집트 (2006) H5N1 HPAI 단리물에 대한 보호
이집트 HPAI H5N1 접종에 대한 유전자조작된 AVINEW 돌연변이체 vAVW03 의 효능을 SPF (특이적 병원체가 없는) 닭에서 평가하였다. 10 마리의 1 일령 SPF 닭에 점안액 (ED) 및 비강 내 (IN) 경로에 의해 106 EID50 을 백신접종하였다 (D0). H5N1 접종 (새 1 마리 당 H5N1 계통군 2.2 A/닭/이집트/06959-NLQP/2006 단리물, 6 log10) 을 백신접종 3 주 후 (D21) 에 수행하였다. 접종 후 2 주 동안 닭을 추적 연구하였다. 결과를 하기 표 B 에 제시한다.
표 B. 닭 연구 A: SPF 병아리에서 HPAI H5N1 (A/닭/이집트/06959-NLQP/2006) 접종에 대한 유전자조작된 vAVW03 돌연변이체에 의해 유도된 보호 효능을 평가하는 백신접종-접종 연구로부터의 임상 보호 결과
상기 이집트 HPAI H5N1 단리물에 대해 D21 에 우수한 (90%) 임상적 보호가 유도되었고 이는, HPAI HA 유전자를 발현하는 Avinew 벡터가 SPF 닭에서 보호를 유도한다는 것을 확인시켜주었다.
실시예 3.B: 닭 연구 B: SPF 닭에서 유전자조작된 AVINEW 돌연변이체 또는 프라임-부스트 섭생의 1 또는 2 회 투여에 의해 유도된 헝가리 (2006) H5N1 HPAI 단리물에 대한 보호
Hugarian (2006) HPAI H5N1 접종에 대한 비활성화된 백신으로의 1, 2 회 투여 또는 프라임-부스트 섭생 후 유전자조작된 AVINEW 돌연변이체 vAVW03 의 효능을 SPF (특이적 병원체가 없는) 닭에서 평가하였다. 그룹 당 8 마리의 1 일령 SPF 병아리에 D0 (그룹 2, 3 및 4) 및 D14 (그룹 3) 에 점안액 (ED) 및 비강 내 (IN) 경로에 의해 105 EID50 을 백신접종하였다. 그룹 3 의 닭에 H5N9 A/닭/이탈리아/A22/1998 LPAI 단리물 (0.5 ㎖/병아리) 로 제조된 비활성화된 백신을 주었다. H5N1 접종 (닭 1 마리 당 H5N1 계통군 2.2 A/오리/헝가리/11804/2006 단리물, 6 log10) 을 제 2 백신접종 4 주 후 (D42) 에 수행하였다. 접종 후 2 주 동안 닭을 추적 연구하였다. 결과를 하기 표 C 에 제시한다.
표 C. 닭 연구 B: SPF 닭에서 HPAI H5N1 (A/오리/헝가리/11804/2006) 접종에 대한 vAVW03 돌연변이체를 포함하는 상이한 백신접종 계획에 의해 유도된 보호 효능을 평가하는 백신접종-접종 연구로부터의 보호 결과
3 개의 백신접종된 그룹에서 우수한 임상적 보호가 유도되었다. 또한 방출 닭의 수 뿐 아니라 접종 바이러스의 방출 수준에서의 감소가 백신접종에 의해 유도되었다. 최적의 보호적 성능은 프라임-부스트 섭생을 받은 그룹 4 의 닭에서 수득되었다. 상기 결과는 HPAI HA 유전자를 발현하는 Avinew 벡터가 SPF 닭에서 보호를 유도하고, 보호 수준이 프라임-부스트 전략에 의해 향상될 수 있다는 것을 나타낸다는 것을 확인시켜준다.
실시예 3.C: 닭 연구 C: SPF 닭에서 유전자조작된 AVINEW 돌연변이체를 포함하는 상이한 백신접종 계획에 의해 유도된 변이체 이집트 (2008) H5N1 HPAI 단리물에 대한 보호
2008 (A/닭/이집트/1709-6/2008) 로부터 변이체 이집트 단리물을 사용하는 HPAI H5N1 접종에 대한 상이한 백신접종 계획 (표 D 참조) 에 포함된 유전자조작된 AVINEW 돌연변이체 vAVW03 의 효능을 1 일령 SPF (특이적 병원체가 없는) 닭에서 평가하였다. 백신접종 계획은 표 D 에 제시되어 있다. vAVW03 백신을 D0 (그룹 2 및 3) 및 D14 (그룹 2 및 4) 에 안구 내 (50 ㎕) 및 비강 내 (50 ㎕) 경로에 의해 106 EID50/100 ㎕ 의 투여량으로 투여하였다. 그룹 3 으로부터의 닭에 H5N1 계통군 2.3 A/오리/안후이성/1/2006 LPAI 단리물 (0.5 ㎖/병아리) 로부터의 HA (분할 부위에서 개질됨) 및 NA 를 함유하는 역 유전학 H5N1 균주로 제조된 비활성화된 백신을 주었다. 그룹 4 로부터의 닭에 D0 에, 마렉 (Marek) 병 백신 희석액 (Merial 의 소유 제품) 에 희석된 H5N8 HPAI A/칠면조/아일랜드/1378/1983 단리물 (TROVAC-AIV H5 백신, US 2008/0107681 및 US 2008/0107687 참조) 로부터의 HA 를 발현하는 계두 재조합체 vFP89 의 피하 경로 (목덜미) 에 의해 상업적 투여량 (대략 3.5 log10 TCID50/200 ㎕) 을 주었다. 제 2 백신접종 2 주 후 (D28) 에 H5N1 접종 (새 1 마리 당 H5N1 계통군 2.2 A/닭/이집트/1709-6/2008 단리물, 5 log10) 을 수행하였다. 접종 후 10 일 동안 닭을 추적 연구하였다. 결과를 하기 표 D 에 제시한다.
표 D. 닭 연구 C: SPF 닭에서 HPAI H5N1 (A/닭/이집트/1709-6/2008) 접종에 대한 vAVW03 돌연변이체를 포함하는 상이한 백신접종 계획에 의해 유도된 보호 효능을 평가하는 백신접종-접종 연구로부터의 임상 보호 결과
상이한 백신접종 계획에 의해 유도된 HI 적정 농도를 표 D 에 제시한다. 예상되는 바와 같이, 비활성화된 백신으로의 부스트 후에 그룹 3 에서 보다 높은 HI 적정 농도가 수득되었다. 3 개의 백신접종된 그룹에서 우수한 임상적 보호 (93~100%) 가 유도되었다. A/닭/이집트/1709-6/2008 단리물 (GenBank: ACD65000.1 로 이용가능한 HA 단백질 서열) 이, 최근에 이집트에서 출현되고 상업적인 비활성화된 H5 백신이 이전의 이집트 균주에 대해 보다 적은 보호를 제공하는 H5N1 항원 변이체 중 하나라는 것을 언급할만 하다. 상기 결과는 HPAI HA 유전자를 발현하는 Avinew 벡터가 항원 변이체 H5N1 이집트 단리물에 대해 SPF 닭에서 보호를 유도한다는 것을 확인시켜준다.
실시예 3.2: 닭 연구 3: NDV 및/또는 AI MDA 가 있는 그리고 없는 닭에서 유전자조작된 AVINEW 돌연변이체에 의해 유도된 H5N1 HPAI 에 대한 보호
본 연구의 목표는 SPF 닭에서 H5N1 HPAI HA 유전자를 발현하는 AVINEW 돌연변이체 vAVW03 에 의해 유도된 HPAI H5N1 보호의 수준을 평가하고, NDV 벡터 및/또는 AI 에 대한 모체에서 유래된 항체 (MDA) 의 가능한 간섭을 평가하기 위한 것이었다.
AI 보호에 대한 MDA 의 효과를 평가하기 위해, SPF 종계는 표 4 에서 제시된 바와 같은 상이한 백신접종 계획으로 면역화시켜야만 했다. 3 개 그룹의 종계가 있었다: 제 1 그룹 (G1) 을 NDV (AVINEW 의 3 회 투여 및 비활성화된 (또는 치사된) 백신의 1 회 투여) 및 AI (H5N9 A/닭/이탈리아/A22/1998 LPAI 단리물에 근거한 비활성화된 백신의 3 회 투여) 에 대해 백신접종시켰고; 제 2 그룹 (G4) 을 오직 NDV 에 대해서만 백신접종시키고 (그룹 1 과 동일한 면역화 계획) 및 제 3 그룹 (G5) 을 오직 AI 에 대해서만 백신접종시켰다 (A/거위/관둥/1996 단리물로부터의 HA 및 NA 유전자를 함유하는 H5N1 돌연변이체에 근거한 비활성화된 백신의 2 회 투여) (세부사항은 표 4 참조).
표 4. ND 및/또는 AI MDA 가 있는 1 일령 닭을 생성하는데 사용되는 SPF 종계의 백신접종 계획
상기 면역화된 종계가 낳은 알에서 닭이 부화되었고, MDA 가 있는 상기 병아리에서 vAVW03 에 의해 유도된 HPAI H5N1 효능을 MDA 가 없는 SPF 닭에서 유도된 것과 비교하였다.
도 13 은 표 4 에 기재된 면역화된 종계로부터 부화된 1 일령 닭에서 관찰된 평균 NDV 및 AI HI 적정 농도 (log2) 를 보여준다. NDV 적정 농도는 ND-백신접종된 종계로부터의 두 그룹 (G1 & G4) 에서 매우 높았었다. H5N1 계통군 2.2 (A/오리/헝가리/11804/2006) 및 H5N9 (A/닭/이탈리아/A22/1998) 항원으로 측정된 AI HI 적정 농도는 비활성화된 H5N1 백신으로 백신접종된 G5 종계의 닭 자손에서 더 높았다. 상기 결과는 백신접종된 SPF 종계로부터 부화된 해당 날짜 일령 병아리의 혈청에서 예상되는 MDA 의 존재를 확인시켜주었다.
도 14 는 MDA 가 있는 또는 없는 SPF 닭의 면역화 및 접종 프로토콜에 대한 시간표를 나타낸다. 정규적 SPF 떼 또는 백신접종된 SPF 종계로부터의 1 일령 닭을 A/칠면조/터키/1/2005 HPAI H5N1 단리물로부터의 HA 유전자를 발현하는 vAVW03 (10 마리 동물) 또는 임의의 HA 삽입체를 함유하지 않아 대조군으로서 사용되었던 vAVW01 (10 마리 동물) 을 105 EID50 으로 안구-비강 경로에 의해 면역화하였다. 백신접종 3 주 후에, 모든 닭을 안구내 경로에 의해 HPAI H5N1 A/오리/헝가리/11804/2006 단리물 6 log10 으로 접종하였다. 접종 후 2 주 동안 임상적 징후 및 폐사율에 대해 닭을 관찰하였다. 표 5 에는 백신접종 계획 및 조류 독감 보호 결과를 요약한다.
표 5. SPF 닭 및 다양한 MDA 가 있는 닭에서 H5N1 HA 를 발현하는 AVINEW® 돌연변이체 (vAVW03) 에 의해 유도된 AI 보호
vAVW01 로 백신접종된 AI MDA 가 없는 닭 (그룹 1 및 5) 의 급속한 폐사율 (3.6-3.8 일의 죽음에 이르는 평균 시간) 로 접종이 입증되었다 (표 5 및 도 15 참조). 1 일령 SPF 닭에서 vAVW03 의 1 회 점막 투여 후 HPAI H5N1 보호 수준이 닭의 90% 를 보호하였다. 놀랍게도, 오직 NDV 만으로 백신접종된 (그룹 6) 종계로부터 부화된 모든 vAVW03-면역화된 닭 (표 4 에서의 G4) 은 HPAI 접종으로부터 예방되었고, AI 보호에 대한 항-벡터 NDV MDA 간섭이 없었음을 나타낸다. 오직 7/10 및 1/10 의 닭이 대조군 그룹 (그룹 3 및 7) 에서 접종 후에 죽었으므로 AIV MDA 의 효과는 평가하기가 더욱 어려우나; vAVW03 으로 백신접종된 7/9 의 새 (그룹 4) 가 보호되었다는 것은 NDV 및 AI MDA 모두의 존재하에서 보호가 유도될 수 있다는 것을 나타낸다. 접종 후에 죽은 백신접종된 닭은 비백신접종된 새에 비해 나중에 죽었다 (죽음에 이르는 평균 시간에 대해서는 표 5 및 폐사율의 동역학에 대해서는 도 15 를 참조). 표 6 은 구강 또는 배설강 배출에 대해 양성인 닭의 수를 보여주고, 도 16 은 접종 후 구강 (16A) 및 배설강 (16B) 배출 동역학을 보여준다. vAVW01/vAVW03 에서의 방출 수준 사이의 비가 또한 구강 (16C) 및 배설강 (16D) 의 면봉 채취 표본에 대해 도 16 에서 제시된다. 훨씬 더 적은 바이러스를 방출한 vAVW03-백신접종된 닭 및 양성의 면봉 채취 표본의 수는 vAVW01-백신접종된 닭과 비교하여 접종 후에 저하되었다.
표 6. 8 개의 시험 그룹에서의 H5N1 방출을 H5N1 HPAI 접종 2, 4, 및 7 일 후 (dpc) 에 구강 및 배설강의 면봉 채취 표본에서 매트릭스 유전자를 표적하는 실시간 역전사효소 PCR (RRT-PCR) 에 의해 평가하였다.
도 17 은 백신접종 (D21) 후 및 접종 (D35) 후 vAVW03-유도된 AIV HI 적정 농도 (H5N1 계통군 2.2 (A/오리/헝가리/11804/2006) 및 H5N9 (A/닭/이탈리아/A22/1998) 항원 사용) 에 대한 NDV MDA 효과를 나타낸다. NDV MDA (NDV) 의 존재하에서, 제 21 일 (백신접종 후, 접종 전) 에, 백신접종 후 보다 높은 평균 AIV HI 적정 농도와, 두 항원에 대한 검출가능한 HI 적정 농도를 갖는 보다 많은 수의 닭이 있었다. 제 35 일 (접종 후) 에, 오직 NDV 로만 백신접종된 종계의 자손에서 AIV 접종 후 AIV HI 적정 농도 부스트가 없었고, 10/10 의 닭이 보호되었다 (SPF 그룹 내 9/10 의 닭과 비교). MDA 가 없는 SPF 닭에서, 접종 후 AIV HI 적정 농도의 명백한 증가는 접종 바이러스가 이러한 닭에서 다소 복제되었다는 것을 암시하였다. 결과는 NDV MDA 가 있는 닭에서의 예상치 못한 양호한 AIV 항체 유도 및 보호를 암시한다.
도 18 은 백신접종 후 (D21) NDV HI 적정 농도를 나타낸다. 제 21 일에, vAVW01-유도된 NDV 적정 농도는 vAVW03 에 의해 유도된 적정 농도보다 통상적으로 높았다. 제 21 일에, NDV HI 적정 농도와 관련하여 NDV MDA 가 있는 (G1 (H5+NDV) 또는 G4 (NDV) 종계로부터) 또는 없는 (SPF 또는 G5 (H5N1) 종계로부터) 닭에서 차이가 없었으며, 이는 NDV MDA 가 vAVW01 또는 vAVW03-유도된 NDV HI 적정 농도를 간섭하지 않았다는 것을 나타낸다.
전체적으로 본 연구의 결과는 비교적 적은 투여량 (5 log10 EID50) 의 AVINEW 유전자조작된 돌연변이체 vAVW03 의 1 일령 닭에 대한 1 회 점막 투여가 HPAI H5N1 접종에 대해 우수한 수준의 보호를 유도하였다는 것이 명백하게 나타난다. 항-벡터 (NDV) MDA 의 존재는 AI 보호에 부정적인 영향을 주지 않았다. 대조적으로 그리고 놀랍게는, 보호 및 AI 항체 데이터는 NDV MDA 가 vAVW03 백신접종 시간에 1 일령 닭에서 존재하였던 경우 양호한 AI 보호를 암시한다. 상기 결과는 또한 AI 보호가 NDV 및 AI 모체 항체 모두를 가진 새에서 vAVW03 에 의해 유도될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4 오리 새끼에서 유전자조작된 AVINEW 돌연변이체에 의해 유도되는 H5N1 HPAI 에 대한 보호
오리는 자연적으로 NDV 에 감염될 수 있으며, 조류 독감 A 바이러스에 대한 보균소를 나타낸다. 이들은 심지어 고도로 병원성인 균주로의 AI 감염 후에도 임상적 징후를 반드시 보이지 않을 수 있으나, 고도로 민감한 닭에 바이러스를 전염시킬 수 있다. 이것이 왜 오리가 AI 의 트로이 목마라고 불리는 지의 이유이다. 본 연구의 목표는 오리에서 독감에 대한 벡터 백신으로서 유전자조작된 NDV 를 사용하기 위한 가능성을 연구하는 것이었다.
실시예 4.1: 14 일령 사향 오리 새끼에서의 오리 연구 1
본 연구의 목적은, 통상의 사향 오리 새끼에서의 모체 Avinew 균주와 (1) 면역원성 및 (2) 2 가지 상이한 H5N1 계통군 (vAVW02 는 계통군 2.1 A/닭/인도네시아/7/2003 의 HA 유전자를 발현하고, vAVW03 은 계통군 2.2 A/칠면조/터키/1/2005 로부터의 HA 를 발현함) 으로부터의 합성 HA 유전자를 발현하는 2 개의 AVINEW 유전자조작된 돌연변이체에 의해 유도되는 H5N1 효능을 비교하는 것이었다.
실시예 4.1.1: 오리 연구 1: 오리 새끼에서 유전자조작된 Avinew 돌연변이체의 면역원성
1 일령 사향 오리 새끼를 NDV 및 AIV 혈청학에 대해 시험하였고, 놀랍게도 7/10 오리 새끼가 평균 HI 적정 농도 3.9 log2 로 NDV 에 대해 혈청 반응 양성인 것으로 발견되었다. 모든 혈청은 AI HI 시험에 대해 음성이었다. 10 마리의 오리에서 13 일령에서 채취한 또다른 혈액 샘플은 음성 ND HI 적정농도를 제공하였으며, 오리가 14 일령이었을 때 연구를 시작하였다. 각각 10 마리의 백신접종된 오리 새끼 및 7 마리의 접촉 대조군 오리 새끼가 있는 3 개의 그룹을 설정하였다. 접촉은 백신접종 날짜 (D0 & D21) 와 분리하였고, 다음 날 그룹 내로 돌려보냈다. 5 마리의 비백신접종된 대조군의 제 4 그룹을 포함시켰다 (표 7 참조).
표 7. 오리 연구 1: HA 를 발현하는 AVINEW 돌연변이체의 면역원성의 평가를 위한 그룹 설정.
MDCK 세포에 적응된 M6 11804 H5N1 HPAI 헝가리 균주를 사용하는 NDV 및 AI HI 시험 및 AI SN 시험을 위해 D0, D21 & D42 에 혈액 샘플을 채취하였다. D4, D7 & D12 에 백신접종된 동물에서 그리고 D7 & D12 에 접촉 동물에서 목구멍 및 배설강의 면봉 채취 표본을 NDV-특이적 실시간 PCR (프라이머 M4100 & M4220 및 탐침 M4169) 을 위해 채취하였다 (Wise et al. (2004) J. Clin Microbiol 42, 329-348).
결과는 부작용이 관찰되지 않았음을 보여주었으며, 상기 실험 조건에서 3 개의 백신이 안전하였다는 것을 나타낸다. 그룹 4 (비백신접종된 대조군) 로부터의 모든 샘플은 PCR & 혈청학에 대해 음성이었다. 그룹 1 내지 3 에서의 비백신접종된 접촉 새로부터의 모든 샘플은 PCR & 혈청학에 대해 음성이었고, 백신이 백신접종된 새에서 접촉된 새로 전파되지 않았음을 나타낸다. NDV HI 적정 농도가 도 19 에 제시된다. D21 에, G1 의 HI 적정 농도 (3.6 log2; 100% 3 log2) 는 G2 (100% <3 log2) 및 G3 (3/10 3 log2) 의 농도보다 유의하게 높았다 (ANOVA; p=0.004). 그러나, 제 2 투여 3 주 후, 평균 NDV HI 적정 농도는 3 개의 백신접종된 그룹 (그룹 1, 2 및 3 에서 각각, 5.1, 5.7 및 6.1 log2) 에서 유사하였다 (ANOVA; p=0.682).
AI H5N1 HI 적정 농도가 도 20 에 제시된다. G2 및 G3 으로부터의 오리에서 제 1 백신접종 후 D21 에, G2 에서 1 마리의 오리가 4 log2 HI 적정 농도를 보였던 것을 제외하고는, 검출가능한 HI 적정 농도 (<3 log2) 가 관찰되지 않았다. 제 2 투여 후, 모든 오리의 HI 적정 농도는 대략 4 log2 의 평균 적정 농도로, 3 log2 였다. 모든 시간에서 2 가지 AVINEW 돌연변이체 vAVW02 & 03 에 의해 유도되는 AI HI 적정 농도에서의 유의한 차이는 없었다.
AI H5N1 혈청중화 (seroneutralizing: SN) 적정 농도를 도 21 에 제시한다. G2 및 G3 으로부터의 오리에서 제 1 백신접종 후 D21 에, G3 에서 2 마리의 오리가 2 또는 3 log2 SN 적정 농도를 보였던 것을 제외하고는, 검출가능한 SN 적정 농도 (<2 log2) 가 관찰되지 않았다. 제 2 투여 후, 모든 오리의 HI 적정 농도는 대략 6.2 log2 의 평균 적정 농도로, 4 log2 였다. 모든 시간에서 2 가지 AVINEW 돌연변이체 vAVW02 & 03 에 의해 유도되는 AI HI 적정 농도에서의 유의한 차이는 없었다.
NDV PCR: NDV PCR 의 결과를 표 8 에 제시한다. 그룹 1 및 3 에서의 제 1 및 제 2 백신접종 후 오직 몇 마리의 오리만이 양성인 것으로 밝혀졌다. 모든 양성 샘플은 D28 에 그룹 3 에서 1 개의 면봉 채취 표본을 제외하고는, 목구멍의 면봉 채취 표본으로부터 기원하였다. AVINEW 의 제 2 투여 후 D25 에 양성인 2 마리의 오리가 D3 및 D7 두 시기에 제 1 투여 후 양성인 유일한 새였다. 항-ND 및 항-AI 항체의 유도에도 불구하고, 그룹 2 에서의 모든 샘플은 음성이었다.
표 8. 오리 연구 1: 목구멍 및 배설강의 면봉 채취 표본에서 시험한 NDV 실시간 PCR 의 결과 (양성 오리의 수/총 수)
요약하면, 본 연구는 AVINEW 의 안정성을 확인시켜주었고, AVINEW-AI 돌연변이체 내로의 HA 유전자의 삽입이 오리 새끼에서 부작용을 유도하지 않았음을 보여주었다. AVINEW 는 2 개의 시험된 AVINEW-AI 돌연변이체보다 제 1 투여 후 유의하게 보다 높은 NDV HI 적정 농도를 유도하였으며, HA 유전자의 삽입이 NDV 복제를 살짝 손상시켰음을 암시한다. AVW-AI 돌연변이체의 10 닭 투여량의 2 회의 점안액 투여는 모든 오리에서 양성 NDV 및 AI HI 적정 농도 뿐 아니라, AI SN 적정 농도를 유도하는데 필요하였다. 2 가지 상이한 계통군 (vAVW02 에서는 계통군 2.1 및 vAVW03 에서는 계통군 2.2) 으로부터의 HA 유전자의 존재에도 불구하고 2 가지 시험된 AVINEW-AI 돌연변이체의 계통군 2.2 H5N1 항원에 대한 면역원성에 차이가 없었다. AVINEW 및 vAVW03 으로 백신접종된 오직 몇 마리의 새 만이 목구멍의 면봉 채취 표본 내로 주로 바이러스를 방출하였다. 그러나, 상기 방출은 백신 바이러스를, 전체 연구 동안 음성으로 남아있던 접촉 오리 새끼로 전염시키기에는 불충분하였다. 이후 본 연구의 일부 오리를 H5N1 헝가리 단리물로 접종시켰고; 접종 결과는 실시예 4.1.2 에 제시된다.
실시예 4.1.2: 오리 연구 1: 사향 오리 새끼에서 유전자조작된 Avinew 돌연변이체에 의해 유도된 H5N1 보호
vAVW02 또는 vAVW03 으로 백신 접종된 몇 마리의 오리에서 H5N1 접종 연구를 수행하였다 (실시예 4.1.1 참조). vAVW02 또는 03 으로의 점안액에 의해 2 회 백신 접종된 오리 4 마리를 9 주령에 접종하였다. 그룹 1 의 2 마리의 오리 (AVINEW) 를 음성 대조군으로서 사용하였다. vAVW02 & 03 백신접종된 그룹에서 평균 H5 HI 적정 농도는 5.5 log2 (4 마리의 오리 5 log2 및 4 마리의 오리 6 log2) 였고, 평균 SN 적정 농도는 4.0 log2 (1 마리 3 log2 SN 적정 농도, 6 마리 4 log2 SN 적정 농도 및 1 마리 5 log2 SN 적정 농도) 였다. 8 마리의 백신 접종된 오리 및 2 마리의 대조군 오리에 HPAI H5N1 A/오리/헝가리/11804/2006 (M6 11804) 균주 4.7 log10 EID50 을 IM 투여에 의해 접종하였다. 배설강 및 목구멍의 면봉 채취 표본을 접종 2, 7 및 10 일 후에 채취하고, 부검 시 심장, 췌장, 뇌 및 비장을 샘플링하고 PCR 및 조직병리학에 의해 시험하였다.
결과를 표 9 에 요약한다. 2 마리의 대조군이 감염 후 48 시간 내에 죽었다. 구비강 및 배설강의 면봉 채취 표본 뿐 아니라, 뇌, 췌장, 심장 및 비장은 PCR 에 의해 H5N1 에 대해 양성이었다. 상이한 기관의 조직병리학은 과급성 H5N1 감염의 징후를 보였다. 10 일의 관찰 기간 동안 8 마리의 백신 접종된 오리에서 임상적 징후는 관찰되지 않았다. 접종 3 일 후에 8 마리의 백신 접종된 오리 중 3 마리 오리 (G2 에서 2 마리 및 G3 에서 1 마리) 의 목구멍의 면봉 채취 표본에서 오직 방출만이 검출되었다. 상기 양성 오리 중 1 마리 (G3 에서 1 마리) 가 또한 배설강의 면봉 채취 표본에서 AI PCR 에 대해 양성이었다. 모든 다른 면봉 채취 표본 및 기관은 음성이었다. 백신 접종된 오리의 기관에서 병변은 찾을 수 없었다.
표 9. 오리 연구 1: 14 일령 사향 오리 새끼에서 AVINEW 벡터 백신에 의해 유도된 보호 결과의 요약.
결과는 IM 접종이 2 마리의 대조군 새에서는 매우 심각하였음을 보여주었다. H5N1 단리물로부터의 합성 H5 유전자를 발현하는 AVINEW 벡터 백신이 있는 점안액에 의해 2 회 백신 접종된 8 마리의 오리에서 완전한 임상적 및 부분적인 방출 보호가 관찰되었다.
실시예 4.2: 1 일령 사향 오리 새끼에서의 오리 연구 2
본 실시예의 오리 연구의 목적은 해당 날짜 일령 사향 오리 새끼에서 계통군 2.2 A/칠면조/터키/1/2005 로부터의 합성 HA 유전자를 발현하는 vAVW03 AVINEW 돌연변이체의 1 또는 2 회 투여에 의해 유도되는 면역원성 (실시예 4.2.1) 및 효능 (실시예 4.2.2) 을 비교하기 위한 것이었다.
실시예 4.2.1: 오리 연구 2: 1 일령 오리 새끼에서 유전자조작된 avinew 돌연변이체의 면역원성
본 연구에서 사용되는 동물은 모두 NDV (HI) 및 AIV (HI & SN) 혈청학에 대해 음성인 것으로 밝혀졌던 1 일령 사향 오리 새끼였다. 각각 10 마리의 백신접종된 오리 새끼 및 5 마리의 접촉 대조군 오리 새끼가 있는 3 개의 그룹을 설정하였다. 접촉은 백신접종 날짜 (D0 & D21) 와 분리하였고, 다음 날 그룹 내로 돌려보냈다. 5 마리의 비백신접종된 대조군의 제 3 그룹을 포함시켰다 (표 10 참조). 그룹 1 및 2 로부터의 10 마리의 백신접종된 오리 새끼를 D0 (그룹 1 및 2) 및 D14 (오직 그룹 2 만) 에 6.5 log10 EID50 vAVW03 을 함유하는 50 ㎕ 의 점안액에 의해 백신접종하였다.
표 10. 오리 연구 2: HA 를 발현하는 AVINEW 돌연변이체 vAVW03 의 1 또는 2 회 투여의 면역원성을 평가하기 위해 설정된 그룹.
D0, D14 & D35 에 혈액 샘플을 채취하고, HI 시험으로 NDV (La Sota 항원) 및 AI (M6 11804 HPAI H5N1 헝가리/2006 항원) 항체에 대해, 그리고 MDCK 세포에 적응된 M6 11804 H5N1 HPAI 헝가리 균주를 사용하는 SN 시험에 의해 AI 에 대해 시험하였다.
부작용이 관찰되지 않았으며, 해당 날짜 일령 사향 오리 새끼에 대한 vAVW03 의 안전성을 확인시켜주었다. NDV HI 적정 농도 및 AI SN 적정 농도를 도 22 A 및 B 에 각각 제시한다. d14 에, vAVW03 의 제 1 투여 2 주 후에, 오직 10/20 의 백신접종된 오리만이 검출가능한 NDV HI 적정 농도 (3 log2) 를 보였고, 오직 8/20 만이 검출가능한 H5N1 SN 적정 농도 (1 log2) 를 보였다. d35 에, HI 및 SN 적정 농도는 그룹 1 에서 유사하게 낮게 유지되었고 (NDV HI 시험으로 6/10 양성 (평균 2.9 log2) 및 SN H5N1 시험으로 8/10 양성 (평균 1.3 log2)), vAVW03 의 제 2 투여 후 그룹 2 에서 증가하였다. 대조군 그룹 (그룹 3) 으로부터의 모든 샘플은 NDV HI 시험 및 H5N1 SN 시험 모두에 대해 음성이었다. 그룹 1 및 2 에서의 비백신접종된 접촉 오리로부터의 모든 혈청은 또한, NDV (3 log2) 로 및 SN H5N1 (1 log2) 로 혈청변환되는 그룹 2 내의 1 마리 오리를 제외하고는, NDV HI 및 H5N1 SN 에 대해 음성이었다. 이것은 vAVW03 백신이 그룹 2 에서 백신접종된 오리로부터 5 마리의 비백신접종된 접촉 오리 중 1 마리로 퍼져나갔다는 것을 암시한다. 이어서 본 연구의 일부 오리를 H5N1 헝가리 단리물로 접종하였고; 접종 결과를 실시예 4.2.2 에 제시한다.
결과는 vAVW03 의 안정성이 1 일령 오리 새끼에서 확인되었음을 보여주었다. 1 일령 사향 오리 새끼에서 6.5 log10 EID50 의 vAVW03 의 1 회 점안액 투여는 오직 40-50% 새에서만 검출가능한 낮은 NDV HI 적정 농도 및 H5N1 SN 적정 농도를 유도하였다. vAVW03 의 제 2 점안액 투여 후 NDV 및 SN H5N1 적정 농도에서의 명백한 부스트 효과가 관찰되었다. D0 및 D14 에 2 회 백신접종된 그룹 2 의 오리와 접촉된 1 마리의 비백신접종된 오리에서의 낮은 항-NDV 및 항-H5N1 항체의 검출은 이전 연구와는 반대로, 수평적 전염이 시험된 조건에서 낮은 빈도로 일어날 수 있을 것이라는 것을 암시한다.
실시예 4.2.2: 오리 연구 2: 1 일령 오리 새끼에서 유전자조작된 AVINEW-AI 돌연변이체의 AI H5N1 효능
계통군 2.2 의 HA 유전자를 발현하는 vAVW03 AVINEW-AI 돌연변이체로 1 또는 2 회 백신접종된 몇 마리의 오리에서 H5N1 접종 연구를 수행하였다 (실시예 4.2.1 참조).
그룹 1 (D0 에 1 회 투여) 및 2 (D0 및 D14 에 2 회 투여) 로부터의 5 마리의 오리 뿐 아니라, 그룹 1 및 2 의 새와 접촉된 2 마리의 비백신접종된 오리 및 그룹 3 으로부터의 2 마리의 비백신접종된 오리를 5 주령에 접종하였다. 10 마리의 백신접종된 오리, 4 마리의 접촉 오리 및 2 마리의 대조군 오리를 HPAI H5N1 A/오리/헝가리/11804/2006 (M6 11804) 균주 4.7 log10 EID50 의 구비강 투여에 의해 접종하였다. 배설강 및 목구멍의 면봉 채취 표본을 제 4 일 및 제 7 일 및 폐사 날짜에 채취하였다. 접종 10 일 후 또는 폐사 날짜에, 부검 시 심장, 췌장, 뇌, 간 및 비장을 샘플링하고 PCR 및 조직병리학에 의해 시험하였다.
개별적인 결과를 표 11 에 제시한다. 그룹 2 로부터의 2 마리의 대조군이 감염 후 48 시간 내에 죽었다. 구비강 및 배설강의 면봉 채취 표본 뿐 아니라, 뇌, 췌장, 심장 및 비장은 PCR 에 의해 H5N1 에 대해 양성이었다. 상이한 기관의 조직병리학은 과급성 H5N1 감염의 징후를 보였다. 10 일의 관찰 기간 동안 그룹 1 및 2 의 10 마리의 백신접종된 오리에서 임상적 징후는 관찰되지 않았다. 그룹 1 내의 1 마리의 오리 (#402) 는 검출가능한 NDV 및 H5N1 항체를 가지지 않았고, 또다른 오리 (#403) 가 오직 낮은 NDV HI 적정농도만을 보였다. 이 결과는 상기 항체 시험이 임상적 보호의 측면에서 완전히 예측적이지는 않을 것이라는 것을 나타내었다. D4 에 그룹 1 의 5 마리의 오리 중 3 마리 (두 종류의 면봉 채취 표본에서 2 마리 및 목구멍의 면봉 채취 표본에서만 1 마리) 및 그룹 2 의 오직 1 마리의 오리 (오직 목구멍의 면봉 채취 표본만) 에서 방출이 검출되었다. D7 에는, 그룹 1 및 그룹 2 의 오직 1 마리의 오리만이 목구멍의 면봉 채취 표본에서 방출에 대해 양성이었다. 모든 다른 면봉 채취 표본 및 기관은 음성이었다. 백신 접종된 오리의 기관에서 병변은 찾을 수 없었다. 그룹 1 및 그룹 2 의 백신접종된 새와 접촉을 하고 있던 모든 비백신접종된 오리는 2 또는 3 일 내에 죽었으며, 완전히 보호되었던 그룹 2 로부터의 1 마리의 접촉 오리 (#429) 를 제외하고는, 그룹 3 으로부터의 대조군 오리와 같이 면봉 채취 표본 및 기관에서 PCR 분석에 의해 양성이었다. 흥미롭게도, 접종 시 낮은 수준의 NDV 및 H5N1 항체를 보였던 것은 오직 접촉 오리였고, 백신이 백신접종된 오리에서 상기 접촉 오리로 전염되었다는 것을 암시한다. 상기 오리는 임의의 임상적 징후를 보이지 않았고, 면봉 채취 표본 및 기관에서 PCR 에 의해 음성이었다. 접종 후 죽은 오리의, 뇌 (초기 림프성 뇌염), 간 (급성인, 실질의 복합 초점 괴사가 있는 장액 간염), 심장 (사이질 부종, 심근 내 점상출혈), 췌장 (충혈, 사이질 부종), 소장 (충혈, 점막 내 부종), 비장 (충혈, 말피기 소체 내 림프구 고갈), 폐 (충혈, 사이질 부종, 초기 초점 사이질 폐렴), 기관 (점막 내 부종) 을 포함하는, 상이한 기관 내 조직병리학적 병반의 연구를 수행하였다. 결과는 상이한 기관에서 뇌염, 부종, 충혈 및 간세포의 괴사를 비롯한 경미한 조직병리학적 변화를 보였다.
표 11. 오리 연구 2: 해당 날짜 일령 사향 오리 새끼에서 1 회 (D0) 또는 2 회 (D0 및 D14) 제공된 vAVW03 으로 수행된 오리 연구 2 에서의 개별적인 보호 결과 *T=양성 목구멍의 면봉 채취 표본; C=양성 배설강의 면봉 채취 표본
결과는 비교적 적은 투여량 (4.7 log10 EID50) 을 사용하였음에도 불구하고 구비강 접종이 매우 격심하였다는 것을 보여주었으며, 상기 헝가리 H5N1 단리물 (오리로부터 단리됨) 이 사향오리에 대해 높은 수준의 병독성을 갖는다는 것을 암시한다. 완전한 임상적 보호가 모든 백신접종된 오리에서 (심지어 접종 5 주 전, 해당 날짜 일령에 vAVW03 의 오직 1 회 투여만을 받았고 낮은 또는 비검출가능한 NDV HI 또는 H5N1 SN 적정농도를 갖지 않았던 오리도) 관찰되었다. 오직 1 회의 투여만을 받은 그룹 1 (3/5) 과 비교하여 2 회의 백신 투여를 받은 그룹 2 (1/5) 에서는 소수의 오리에서 방출이 관찰되었다. 흥미롭게도, 백신접종된 오리로부터 vAVW03 백신의 수평적 전염으로 인한 것으로 보이는 접종 전 검출가능한 NDV 및 H5N1 항체 적정 농도를 가졌던 오직 접촉 오리만이 완전히 보호되었다.
실시예 4.3 1 일령 사향 오리 새끼에서의 오리 연구 3
본 실시예에서의 오리 연구의 목적은 1 일령 SPF 사향 오리 새끼에서 또다른 H5N1 HPAI 단리물에 대한 다른 백신과 연관된 또는 vAVW03 단독에 의해 유도된 H5N1 보호를 확인하는 것이었다.
연구 디자인은 표 12 에 제시된다. 단일 vAVW03 투여의 면역원성을, vAVW03 의 2 회 투여 및 피하 경로에 의한 10 닭 투여량 (약 4.5 log10 TCID50/투여량) 을 사용하는 TROVAC-AIV H5 벡터 백신 (HPAI H5N8 A/칠면조/아일랜드/1378/1983 단리물의 고유의 HA 유전자를 발현하는 계두 재조합체 vFP89; USA 에서 허가를 받음) 으로의 D0 에 프라임 투여 후 점막 경로에 의해 투여된 D14 에 vAVW03 으로 이루어지는 이종 프라임-부스트 계획 (표 12 의 세부사항을 참조) 의 면역원성을 비교하였다. D28 및 D42 에, 각각의 그룹의 5 마리의 오리를 French HPAI H5N1 계통군 2.2 A/백조/프랑스/06299/06 단리물 (106 EID50/오리) 로 접종하였다.
표 12. 오리 연구 3 디자인 및 보호 결과
모든 비-백신접종된 오리는 접종 후 4 일 내에 임상적 징후를 보였고 죽었다. 백신접종된 오리는 임상적 징후를 보이거나 죽지 않았다 (표 12 참조). 입인두 및 배설강의 면봉 채취 표본을 접종 후 상이한 시간 (접종 2.5, 4.5, 6.5, 9.5, 및 11.5 일 후) 에 샘플을 취득하였다. 바이러스 적하량을 [Spackman et al (2002) J Clin Microbiol 40:3256-3260] 에 근거한 M-기반 실시간 RT PCR 에 의해 측정하였다. D28 및 D42 에의 접종 결과를 도 23a-d 및 24a-d 에 각각 나타낸다.
방출 데이터는 백신접종된 오리가 비-백신접종된 대조군보다 적게 바이러스를 방출하였고, 양성 새의 % 는 또한 D28 (도 23a-d) 및 D42 (도 24a-d) 에서의 양 접종 후 감소되었음을 명백하게 나타내었다. 그룹 2 및 3 으로부터의 샘플 사이의 차이가 없었고, 연령 날짜에서의 1 회 vAVW03 투여가 상기 조건의 D0 및 D14 에서 2 회의 vAVW03 면역화와 동일한 보호를 제공하였음을 나타내었다. 양성 % 뿐 아니라, 바이러스 적하량은 특히 D28 에 접종에 대해 그룹 2 및 3 의 오리와 비교하여 이종 프라임-부스트 섭생을 받은 그룹 4 의 오리에서 더욱 낮았다. 이 결과는 vAVW03 전에 투여된 동일한 서브유형으로부터의 또다른 HA 유전자를 발현하는 계두 재조합체로 프라임 접종하는 것이 vAVW03 의 1 또는 2 회 투여와 비교하여 보호 수준을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
AI HI 적정 농도를 항원으로서 (표 13 참조) HPAI H5N1 (접종 균주와 근접한 French 단리물 06167i H5N1 계통군 2.2.1) 을 사용하는, D28 및 D42 에 각각 접종 전 (D28 및 D40) 및 접종 후 (D42 및 D57) 에 샘플을 채취한 혈청에서 측정하였다. 그룹 4 의 오직 몇 마리의 오리만이 D28 에 검출가능한 HI 적정 농도를 보였다. 접종 시 AI 에 대한 검출가능한 혈청 전환의 부재에도 불구하고, 모든 백신화된 오리가 심각한 HPAI 접종에 대해 보호되었다는 점을 주목하는 것이 흥미롭다. 이 결과는 HI 시험이 이러한 유전자조작된 NDV AI 백신의 효능을 예상하는데 사용될 수 없다는 것을 나타내는 이전의 하나의 결과를 확인시켜준다.
D28 에 접종 후 14 일에, HPAI H5N1 HI 적정 농도는 그룹 2 및 3 에서 D28 에 0 에서 D42 에 7.2 log2 로 증가한 반면, 그룹 4 에서 이들은 2.3 (D28) 에서 6.0 (D42) 으로 증가하였다. 그룹 2 및 3 과 비교한 그룹 4 에서의 접종 후 HI 적정 농도의 보다 적은 증가는 접종 바이러스가 상기 그룹에서 덜 복제되었다는 것을 암시하였다. 그룹 4 의 오리에서 접종 바이러스 복제의 이러한 감소는 D28 에 접종 후 방출 데이터에서 관찰되었다 (상기 및 도 23a-d 참조).
표 13. 오리 연구 3. 접종 전 후에 평균 AI HI 적정 농도 (log2)
요약하면, 1 일령 사향 오리 새끼에 투여된 vAVW03 의 1 회 (D0) 또는 2 회 (D0 및 D14) 점막 전달은 D28 및 D42 에 수행된 HPAI H5N1 접종에 대해 오리 새끼를 보호하였다. vAVW03 투여 전 H5N8 단리물로부터 HA 를 발현하는 계두 재조합체로의 이종 프라임 접종은 D28 에 초기 접종에 대한 보호를 향상시켰다.
실시예 4.4: 오리 연구 4 - 1 일령 사향 오리 새끼에서의 면역성 지속기간
본 실시예의 오리 연구의 목적은 vAVW03 의 1 회 투여에 의해 유도된 면역성의 지속기간 또는 오리 연구 3 에서 시험된 이종 TROVAC-AIV H5/vAVW03 프라임-부스트 계획에 의해 유도된 면역성의 지속기간을 평가하는 것이었다.
표 14. 오리 연구 4 디자인 및 임상적 보호 결과
접종 전에 HP H5N1 06167i 계통군 2.2.1 항원 (접종 균주와 가까움) 에 대한 검출가능한 AI HI 항체가 전개된 새는 없었다.
후기 접종이 100% 폐사율을 유도하였고 대부분의 비백신접종된 대조군 오리 (오직 1 마리의 병든 새만이 D86 에 후기 접종에서 생존하였다; 표 14 참조) 가 치사되었으므로 이들 후기 접종은 유효하였다. vAVW03 으로 백신접종된 대부분의 새가 보호되었다; 오직 1/8 만이 경미한 임상적 징후를 보였고, D65 접종에서 생존하였고, 1/9 가 임상적 징후를 보였고, D86 접종에 죽었다. 프라임-부스트 (D2 에 TROVAC AIV-H5 및 D15 에 vAVW03) 그룹으로부터의 모든 새가 양 접종으로부터 생존하였고; 오직 1 마리의 새만이 초기 (D65) 접종에서 임상적 징후를 보였다. 비활성화된 Re5 백신으로 백신접종된 그룹 4 로부터의 새 중 어느 것도 임상적 징후를 보이거나 죽지 않았다.
접종 후에 입인두 및 배설강 방출을 또한 조사하였다. 모든 대조군 새가 높은 수준 (입인두 및 배설강 경로에 의해, 각각 6.8 및 4.9 당량 EID50/mL) 으로 그리고 9.5 일 이상 (생존자의 경우) 동안 바이러스를 방출하였다. 그룹 2 및 3 에서, 방출 수준은 낮았고 (각각, 약 1 및 2 log10 이하), 이것은 대조군 그룹보다 빠르게 감소하였다. 그룹 4 의 방출 프로파일은 그룹 3 에서 관찰된 것에 근접하였다.
요약하면, 사향 오리 새끼 (2 일령) 에 대한 vAVW03 의 1 회 투여는 84 일령 까지 양호한 수준의 보호적 면역성을 제공하였다. 계두 벡터 후 NDV 벡터로의 프라임-부스트 섭생은 NDV 벡터의 1 회 투여보다 양호한 보호적 면역 반응 및 비활성화된 Re5 백신과 유사한 보호적 반응을 제공한다.
실시예 4.5: 오리 연구 5 - 북경오리 새끼에서의 vAVW003 효능
본 연구의 목적은 HPAI H5N1 접종에 대한 북경오리에서의 vAVW03 의 효능을 평가하는 것이었다. 7 일령 북경오리 새끼에 표 15 에 제시된 바와 같이 백신접종하였다. 접종 균주는 HPAI H5N1 계통군 2.2 A/칠면조/터키/1/2005 단리물이었고; 6 및 7 log10 EID50 은 각각 D28 및 D42 에 안구-비강 경로에 의해 투여되었다. 임상적 징후 (이환률) 및 폐사 (폐사율) 을 접종 후에 기록하였다. 접종 2, 5, 및 8 일 후 (dpc) 에 취득된 볼 및 배설강의 면봉 채취 표본 내 실시간 RT-PCR 를 사용하여 접종 후 방출을 측정하였다. 연구 디자인 및 예방 결과를 표 15 에 제시한다.
표 15. 오리 연구 5 디자인 및 예방 결과
결과는 비백신접종된 새의 오직 약 절반이 접종 후 임상적 징후를 보이거나 죽었으므로 북경오리가 H5N1 접종에 대해 비교적 내성이 있다는 것을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 이들 중 대부분은 접종 균주의 활성 복제를 나타내는 검출가능한 양의 바이러스를 방출하였다. 모든 백신접종된 오리는 모든 접종 날짜에 임상적으로 보호되었고, 비백신접종된 대조군과 비교하여 바이러스를 방출하는 새의 수가 감소되었다. 이들 결과는 북경오리 새끼에서 vAVW03 에 의해 유의한 보호가 유도될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 4.6: 오리 연구 6 - NDV MDA 를 가진 1 일령 북경오리 새끼에서의 vAVW003 효능
오리 연구 6 의 목적은 vAVW03-유도된 효능에 대한 NDV MDA 의 효과를 평가하기 위해 NDV 항원을 함유하는 비활성화된 콤보 백신으로 백신접종된 종계로부터 태어난 북경 오리에서 vAVW03 의 1 회 투여에 의해 유도된 HPAI H5N1 효능을 평가하기 위한 것이었다. NDV MDA 를 가진 2 일령 북경 오리 새끼를 본 연구에 사용하였다. 접종을 입증하기 위해 SPF 사향 오리 새끼를 또한 사용하였다. 연구 디자인 및 보호 데이터를 표 16 에 제시한다.
표 16. 오리 연구 6 디자인 및 HPAI H5N1 접종에 대한 보호 결과
HPAI H5N1 접종은 대조군으로서 사용된 비백신접종된 사향 오리 새끼의 조속한 폐사율 (모두 접종 3.5 일 후에 죽었음) 에 의해 입증되었다. 그러나, 오직 3/5 만이 임상적 징후를 보였고, 오직 1/5 만이 접종 6.5 일 후에 죽었으므로, 비백신접종된 북경오리가 H5N1 접종에 훨씬 더 내성이 있었다. 이환률에 대한 부분적인 예방 (67 에서 89% 까지) 이 vAVW03 에 의해 유도되었고, 북경 오리 새끼에서 명백한 투여량- 또는 투여 경로-효과는 없었다.
모든 대조군 북경 오리는 입인두 경로에 의해 바이러스를 방출하였다. 백신접종된 그룹에서 적하량, 시간 및 양성 새의 수에서 방출이 감소되었다.
본 연구는 AI 보호가 NDV MDA 를 가진 북경오리에서 vAVW03 의 1 회 투여에 의해 유도될 수 있음을 보여준다.
***
본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기재하였으므로, 상기 단락에 의해 정의된 본 발명이 이의 많은 명백한 변형이 본 발명의 취지 또는 범주로부터 벗어남 없이 가능하므로, 상기 설명에 언급된 특정 설명에 제한되지 않는 것으로 이해된다.
출원 언급 문헌에 언급되거나 참조된 모든 문헌, 및 본원에 언급되거나 참조된 모든 문헌 ("본원에 언급된 문헌"), 및 본원에 언급된 문헌에 언급되거나 참조된 모든 문헌은, 본원에 참조에 의해 인용된 임의의 문헌에 또는 본원에 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조자의 지침, 설명, 제품 설명서, 및 제품 시트와 함께, 참조에 의해 본원에 인용되고, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
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accaaacaga gaatccgtga ggtacgatag aaggcgaagg agcaatcgaa gtcgtacggg 60
tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagctcaaac tcgagagagc cttctgccaa 120
aatgtcttct gtattcgatg agtacgagca gctcctcgcg gctcagactc gccccaatgg 180
agctcatggc ggaggagaga aggggagcac cttaaaggta gaagtcccgg tattcactct 240
caacagtgat gacccagaag atagatggaa ctttgcagtg ttttgtcttc ggattgctgt 300
tagcgaggat gccaacaaac cacttaggca aggtgctctc atatctctct tatgttccca 360
ctctcaagtg atgaggaacc atgttgccct tgcggggaaa cagaatgagg ccacactggc 420
tgttcttgag atcgatggtt ttaccaacgg cgtgccccag ttcaacaaca ggagtggagt 480
gtctgaagag agagcacaga gatttatgat gatagcaggg tctctccctc gggcatgcag 540
caacggtacc ccgttcgtca cagctggggt tgaagatgat gcaccagaag acattactga 600
taccctggag aggatcctct ctatccaggc tcaagtatgg gtcacggtgg caaaggccat 660
gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaagaaga atcaataagt acatgcagca 720
aggcagggtc cagaagaagt acatcctcca ccccgtatgc aggagcgcaa tccaactcac 780
aatcagacag tctctggcgg tccgcatctt tttggttagc gagcttaaga gaggccgcaa 840
cacggcaggt gggacctcca cctattacaa cttggtgggg gatgtagact catacatcag 900
gaacactggg ctaactgcat tcttcctgac acttaaatat ggaattaaca ccaagacatc 960
agcccttgca cttagcagcc tctcaggcga tatccagaaa atgaagcagc tcatgcgctt 1020
gtatcggatg aaaggagata atgcgccgta catgacattg ctcggtgaca gtgaccagat 1080
gagctttgca cctgccgagt atgcacaact ttactccttt gccatgggta tggcatcagt 1140
cctagataaa ggaactagca aataccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 1200
gagacttgga gtagagtacg ctcaggctca aggaagtagc atcaatgagg atatggccgc 1260
cgagctaaag ctaaccccag cagcaaggag aggcctggca gctgctgccc aaagagtgtc 1320
tgaggagacc agcagcatgg acatgcccac ccaacaagcc ggggtcctca ctggactcag 1380
cgacggaggc tcccaagccc cccaaggtgc actgaacaga tcacaagggc aaccggacac 1440
cggggatggg gagacccaat ttctggatct gatgagagcg gtggcaaata gcatgagaga 1500
agcgccaaac tctgcgcagg gcacccctca accggggcct cccccaaccc ctgggccctc 1560
tcaagacaat gacaccgact gggggtactg accgacagca cccagtttgc ttctatgagg 1620
tcatcccaat tcctctgccc acaccccacc cctcaatccg caatcccgca tggccaaacc 1680
cacaaacgaa cccccctgtc tccctcctct cccccagccc cacaacccca cctgcccagg 1740
gcaacatagg tacaatgcga cccactaata atcaatacag ggccaaagaa attagaaaaa 1800
agtacgggta gaagggagac attcagagat cagggcgagt cacccgggtc tctgctctcc 1860
cttctaccta gtggattagg atggagatgg ccacctttac agatgcggag atcgacgagc 1920
tatttgagac cagtggaact gtcattgaca gcataattac ggcccaggga aaaccagtag 1980
agactgttgg aaggagtgca atcccacaag gcaaaactaa ggctttgagc gcagcatggg 2040
agaagcatgg gagcatccag tcaccagcca gccaagacac ccctgatcga caggacagat 2100
cagataaaca actgtccaca cccgagcaag cgagtccaaa cgacagcccc ccagccacat 2160
ccactgacca gcctcccact caggctgcag atgaggccgg cgatacacag ctcaagaccg 2220
gagcaagcaa ctctctgctg tcgatgcttg ataaactcag caataagtca tctaatgcta 2280
aaaagggccc agggtcgagc cctcaagaaa ggcatcatca acgtctgact caacaacagg 2340
ggagtcaaca aagccgcgga aacagccaag agagaccgca gaaccaggcc aaggccatcc 2400
ctggaaacca ggtcacagac gcgaacacag catatcatgg acaatgggag gagtcacaac 2460
tatcagctgg tgcaacccat catgctctcc gatcagagca gagccaagac aatactcctg 2520
cacctgtgga tcatgtccag ctacctgtcg actttgtgca ggcgatgatg tctatgatgg 2580
aggcgatatc acagagggta agtaaagttg actatcagct ggaccttgtc ttgaaacaga 2640
catcttctat ccccatgatg cggtctgaaa tccagcagct gaaaacgtct gttgcggtca 2700
tggaagccaa tttgggcatg atgaagatcc tggaccctgg ttgtgccaac gtttcatctc 2760
taagtgatct acgggcagtt gcccgatccc acccggtttt aatttctggc cccggagacc 2820
catctcctta tgtgacccaa gggggcgaaa tggcactcaa taaactttcg caaccggtgc 2880
aacacccctc tgaattgatt aaacccgcca cggcaagcgg gcctgatata ggagtggaga 2940
aagacactgt ccgtgcattg atcatgtcac gccctatgca tccgagctct tcagctaggc 3000
tcttgagcaa actggacgca gccggatcga ttgaggaaat cagaaaaatc aagcgccttg 3060
cactgaatgg ctaatcacca ccgcaacccg cagcagatcc ctgtccaccc agcaccacac 3120
ggtatctgca ccaagctcct ctctgcaaac ccaaggtcca acaccccgag cgacaaccct 3180
gtcctgcttc ctctgcccca ctaaatgatc gcgcagctgc aatcaattca gctatattaa 3240
ggattaagaa aaaatacggg tagaatcgga gtgccccgat tgtgccaaga tggactcatc 3300
taggacaatc gggctgtact ttgattctac ccttccttct agcaacctgc tagcattccc 3360
gatagtccta caagacacag gggacgggaa gaagcaaatc gccccgcaat acaggatcca 3420
gcgtcttgac tcgtggacag acagcaaaga agactcggta ttcatcacca cctatggatt 3480
catctttcag gttgggaatg aagaagccac tgtcggcatg atcaatgata atcccaagcg 3540
cgagttactt tccactgcca tgctatgcct agggagtgta ccaaatgtcg gagatcttgt 3600
tgagctggca agggcctgcc tcactatggt ggtaacatgc aagaagagtg caactaacac 3660
cgagagaatg gtcttctcag tagtgcaggc accccaggtg ctgcaaagct gtagggttgt 3720
ggcaaacaaa tactcgtcgg tgaatgcagt caagcacgtg aaagcaccag agaagattcc 3780
tgggagcgga accctagagt acaaagtgaa ctttgtctct ctgaccgtgg tgccaagaaa 3840
ggacgtctac aagataccaa ctgcagcact taaggtctct ggctcaagtc tgtacaatct 3900
tgcgctcaat gtcactattg atgtggaggt agacccgaag agcccgttgg tcaaatccct 3960
ttccaagtcc gacagtgggt actatgctaa tctcttctta catattgggc ttatgtccac 4020
tgtagataag aaggggaaga aagtgacatt tgacaagctg gaaaggaaga taaggagact 4080
tgatctatct gtagggctta gtgacgtgct cggaccttcc gtgcttgtaa aggcgagagg 4140
tgcacggact aagctgctgg cacctttctt ctctagcagt gggacagcct gctatcccat 4200
agcaaatgcc tctcctcagg tggccaagat actctggagc caaaccgcgt acctgcggag 4260
tgtaaaagtc attatccaag cgggcaccca gcgtgctgtc gcagtgaccg ccgaccacga 4320
ggttacctct actaagctgg agaaggggca taccattgcc aaatacaatc ccttcaagaa 4380
ataggctgca tctctgagat tgcactccgc ccatcttccc ggatcaccat gacactaaat 4440
aatgatctgt cttgattact tatagttagt tcgcctgtct atcaaattag aaaaaacacg 4500
ggtagaagat tctggatccc ggttggcgcc ttcaaggtgc aagatgggct ccagatcttc 4560
taccaggatc ccagtacctc ttatgctgac cgtccgagtc atgttggcac tgagttgcgt 4620
ctgtccgacc agcgcccttg atggcaggcc tcttgcagct gcagggattg tggtaacagg 4680
agacaaagca gtcaacatat acacctcatc tcagacaggg tcaatcataa tcaagttact 4740
cccaaatatg cccaaggata aagaggcgtg tgcaaaagcc ccgttggagg catacaacag 4800
gacattgact actttgctca ccccccttgg tgattctatc cgtaggatac aagagtctgt 4860
gaccacgtcc ggaggaggga aacagggacg tcttataggc gccattatcg gtggtgtagc 4920
tctcggggtt gcaaccgctg cacagataac agcagcctcg gctctgatac aagccaatca 4980
aaatgctgcc aacatactcc ggctaaaaga gagcattgct gcaaccaatg aggctgtgca 5040
cgaggtcact aatggattat cacaactagc agtggcagtt gggaagatgc agcaatttgt 5100
taatgaccag tttaataaaa cagctcagga attggactgt ataaaaatta cacagcaggt 5160
tggtgtagaa ctcaacctgt acctaactga attgactaca gtattcgggc cacaaatcac 5220
ttcccctgcc ttaactcagc tgactatcca ggcgctttac aatctagctg gtgggaatat 5280
ggattacttg ttgactaagt taggtgtggg gaacaaccaa ctcagctcat taattagtag 5340
tggcctgatc accggcaacc ctattctgta cgactcacag actcaactct tgggtataca 5400
ggtaacccta ccctcagtcg ggaacctaaa taatatgcgt gccacctacc tggaaacctt 5460
gtctgtaagt acaaccaaag gatttgcctc agcacttgtc ccaaaagtag tgacacaggt 5520
cggttccgtg atagaagagc ttgacacctc gtactgtata gagaccgatt tggatctata 5580
ttgtacaaga atagtgacat tccctatgtc tcctggtatt tattcctgtt tgagtggcaa 5640
tacatctgct tgcatgtact caaagactga aggcgcactc actacgccgt atatgaccct 5700
caaaggctca gttattgcta actgtaagat gacaacatgt agatgtgcag accccccggg 5760
tatcatatcg caaaattatg gagaagctgt gtctctaata gataggcaat catgcaatat 5820
cttatcctta gacgggataa ctttgaggct cagtggggaa tttgatgcaa cttatcaaaa 5880
gaatatctca atacaagatt ctcaagtaat agtgacaggc aatcttgata tctcgactga 5940
gcttgggaat gtcaacaact cgataagtaa tgctttggat aagttagagg aaagcaacag 6000
caaactagat aaggtcaatg tcaaactgac cagcacatcc gctcttatta cctatatcgt 6060
tttaactgtc atatctcttg tatgtggtat acttagcctg gttctagcat gctacctgat 6120
gtacaagcaa aaggcgcaac agaagacctt gttgtggctt gggaataata ccctagacca 6180
gatgagggcc actacaaaaa tgtgaatgcg gatgagaggc agaaacatcc ccaatagcag 6240
tttgtgtgta aagtctgaca gcctgttaat tagaagaatt aagaaaaaac taccggatgt 6300
agatgaccaa agggcgatat acgggtagaa cggtcgggga ggccgtccct caatcgggag 6360
ccgggcctca caacatccgt tctaccgcat caccaatagc agttttcagt catggaccgc 6420
gcagttagcc aagttgcgct agagaatgat gaaagagagg caaagaatac atggcgcttg 6480
gtattccgga tcgcaatcct actctcaacg gtggtgacct tagccatctc tgcagccgcc 6540
cttgcatata gcatggaggc cagcacacct agcgatcttg taggcatacc gactgcgatc 6600
tctagagcag aggaaaagat tacatctgca ctcggttcca atcaagatgt agtagatagg 6660
atatataagc aggtggccct cgaatctcca ctggcattgc taaacaccga atctacaatt 6720
atgaacgcaa taacgtctct ctcttatcga atcaatgggg ccgcaaatag cagcggatgt 6780
ggagcaccca ttcatgatcc agattatatt ggaggaatag gtaaagaact tattgtagat 6840
gatgctagcg acgtcacatc atactatccc tctgcgttcc aagaacacct gaactttatc 6900
ccggcgccta ctacaggatc aggttgcact cggataccct catttgacat gagcgctacc 6960
cactactgtt atactcacaa tgtgatatta tctggctgca gagatcactc gcactcacat 7020
caatatttag cacttggtgt gcttcggaca tctgcaacag ggagggtatt cttttccact 7080
ctgcgttcca tcaatctgga tgacacccaa aatcggaagt cttgcagtgt gagtgcaacc 7140
cccttgggtt gtgatatgct gtgctctaaa gtcacagaga ctgaagaaga ggattataac 7200
tcagctatcc ccacgtcgat ggtacatgga aggttagggt tcgacggcca ataccacgag 7260
aaggacctag atgtcacaac actattcgag gactgggtgg caaactaccc aggagtaggg 7320
ggcgggtctt ttattgacaa ccgcgtatgg ttcccagttt acggagggct aaaacccaat 7380
tcgcccagtg acaccgcaca agaagggaaa tatgtaatat acaagcgata caatgacaca 7440
tgtccagatg agcaagatta tcagattcaa atggctaagt cttcatataa gcctgggcgg 7500
tttggaggga aacgcgtaca gcaggccatc ttatctatca aagtgtcaac atccttgggc 7560
gaggacccgg tactgactgt accgcccaac acagtaacac tcatgggggc cgaaggcaga 7620
gttctcacag tagggacatc tcatttcctt tatcagcgag ggtcatcata cttctcccct 7680
gccctactat atcctatgat agtcagcaac aaaacagcca ctcttcatag tccttataca 7740
ttcaatgcct tcactcgacc aggtagtgtc ccttgccagg cttcagcaag atgccctaac 7800
tcatgtgtta ccggagtcta tactgatcca tatcccttgg tcttctatag gaaccacacc 7860
ttgcgagggg tattcgggac gatgcttgat gataaacaag caagactcaa ccctgtatct 7920
gcagtatttg acagcatatc ccgcagtcgc ataacccggg tgagttcaag cagcaccaag 7980
gcagcataca caacatcaac atgttttaaa gttgtaaaga ccaataaaac ctattgtctc 8040
agcattgccg aaatatccaa taccctcttc ggggaattca gaatcgtccc tttactagtt 8100
gagattctca aggatgatgg ggttagagaa gccaggtcta gccggttgag tcaactgcga 8160
gagggttgga aagatgacat tgtatcacct atcttttgcg acgccaagaa tcaaactgaa 8220
taccggcgcg agctcgagtc ctacgctgcc agttggccat aatcagctag tgctaatgtg 8280
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ataaggcaaa acaactcaag gaggatagca cgggtaggac atggcgagct ccggtcccga 8400
gagggcggag catcagatta tcctaccaga gtcacacctg tcttcaccat tagtcaagca 8460
caaactactc tattactgga aattaactgg gctaccactc cctgacgagt gtgacttcga 8520
ccacctcatt ctcagccgac aatggaagaa aatacttgaa tcggcctccc ctgacactga 8580
gagaatgata aaacttggaa gggcagtgca ccagactctc aaccacaatt ccaagataac 8640
cggagtactc catcccaggt gtttagaaga attggctagt attgaggttc ctgactcaac 8700
caacaagttt cggaagatcg agaagaaaat ccaaattcac aacacaaggt atggagaact 8760
gttcacaaga ctgtgcacgc atgtagagaa gaaattgttg ggatcatctt ggtctaataa 8820
tgtcccccgg tcagaagagt tcaacagcat ccgtacagat ccggcattct ggtttcactc 8880
aaaatggtcc acaactaagt ttgcatggct ccatataaaa cagattcaaa ggcatctgat 8940
tgtggcagca agaacaaggt ccgcagccaa caaattggtg acgctgaccc ataaggtagg 9000
ccaagtcttt gttactcctg agcttgtcat tgtgacacat acagatgaga acaagttcac 9060
gtgtcttacc caggaacttg tgttgatgta tgcagatatg atggagggca gagatatggt 9120
caacataata tcatccacgg cggcacatct caggagccta tcagagaaaa ttgatgacat 9180
tctgcggtta gtagatgccc tggcaaaaga tctgggtaat caagtctacg atgttgtagc 9240
actcatggag ggatttgcat acggcgccgt ccagctgctt gagccgtcag gtacattcgc 9300
aggggatttc ttcgcattca acctgcagga gctcaaagac actttgatcg gcctccttcc 9360
taaggatata gcagaatctg tgactcacgc aatagccact gtattctctg gcttagaaca 9420
aaatcaagcg gctgagatgc tgtgcctgtt gcgtctatgg ggccacccat tacttgagtc 9480
ccgtattgcg gcaaaagcag taaggagcca aatgtgcgca ccaaaaatgg tagactttga 9540
tatgatcctc caggtattgt ctttctttaa aggaacaatc atcaacggat acagaaagaa 9600
gaatgcaggt gtttggccac gtgtcaaagt agatacgata tacgggaagg tcattgggca 9660
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tctaaaagac aaggcgatcg cacacccgaa agacaactgg ctcgccgcgt ttaggcgaaa 9840
ccttctctct gaggaccaga agaaacatgt aaaggaggca acctctacta accgtctctt 9900
gatagagttc ttagagtcaa atgattttga tccatataag gagatggaat atctgacgac 9960
ccttgagtac ctaagagatg acaatgtggc agtatcatac tcgctcaagg agaaggaagt 10020
gaaggttaat gggcggattt ttgctaagct aacaaagaaa ttaaggaact gtcaagtgat 10080
ggcggaaggg atcttagctg accagattgc acctttcttt caagggaatg gggtcattca 10140
ggatagcata tctttaacca agagtatgct agcgatgagt caattgtctt tcaacagcaa 10200
taagaaacgt atcactgact gcaaagaaag agtagcctca aaccgcaatc acgatcaaaa 10260
gagcaagaat cgtcggagag ttgccacttt tataacgact gacctgcaaa agtactgtct 10320
taattggaga tatcagacaa tcaaactgtt cgctcatgcc atcaatcagc tgatgggctt 10380
acctcacttc ttcgaatgga ttcatctaag actaatggat actacgatgt ttgtaggaga 10440
ccctttcaat cccccaagtg acccaactga ctgtgatctc tcaagagtcc caaatgatga 10500
catatatatt gtcagtgcta gagggggtat tgagggatta tgtcagaagc tatggacaat 10560
gatctcaatt gctgcaatcc aacttgctgc agcaagatca cattgtcgcg tcgcctgtat 10620
ggtacagggt gacaatcaag taatagctgt aacgagagag gtaaggtcag atgactcccc 10680
ggaaatggtg ttaacacaat tgcatcaagc cagtgataat ttcttcaagg aattgattca 10740
tgttaatcat ttgattggcc ataatttgaa ggatcgtgaa acaatcagat cagacacatt 10800
cttcatatac agcaaacgaa tattcaaaga tggagcaata ctcagtcaag tcctcaaaaa 10860
ttcatctaaa ttagtgctaa tatcaggcga ccttagtgaa aacaccgtaa tgtcctgtgc 10920
caacattgca tctactatag cacggctgtg cgagaacggg cttccaaagg atttctgtta 10980
ttacttaaac tacctgatga gttgcgtgca gacatacttt gattctgagt tttccatcac 11040
taacagctcg caccccgatt ctaaccagtc gtggattgaa gacatctctt ttgtgcactc 11100
atatgtcctg acccctgccc agctaggggg actgagcaac ctccaatact caaggctcta 11160
cacgaggaac atcggtgacc cgggaactac tgcttttgca gagatcaagc gattagaagc 11220
agtggggtta ctaagtccta gtattatgac taacatctta actaggccgc ctggaaatgg 11280
agattgggcc agtctgtgta acgaccctta ctctttcaat tttgagactg tcgcgagtcc 11340
aaatattgtc cttaagaaac atacacaaag agtcctattt gaaacttgtt caaatccctt 11400
attatctggc gtgcatacag aggataatga ggcagaagag aaggcgttgg ctgaattttt 11460
actcaatcaa gaagtaattc atccacgtgt cgcacatgct atcatggaag caagctctat 11520
aggtaggagg aagcagattc aagggcttgt tgacacaaca aacaccgtaa tcaagattgc 11580
attgactagg aggccacttg gcatcaagag gctgatgcgg atagttaact actcgagcat 11640
gcatgcaatg ctgtttagag acgatgtttt ctcatctaac aggtctaacc accccttagt 11700
ttcctctaat atgtgttctc tgacgctagc agactatgca cggaatagaa gctggtcacc 11760
attgacgggg ggtagaaaga tactgggtgt atctaatcct gatactatag aacttgtaga 11820
gggtgagatc cttagcgtca gcggaggatg cacaagatgt gacagcggag atgaacaatt 11880
cacttggttc catcttccga gcaatataga actgaccgat gacaccagca agaatcctcc 11940
gatgagagtg ccgtacctcg ggtcaaagac tcaagagagg agggccgcct cgcttgcgaa 12000
aatagctcat atgtcaccac atgtgaaagc tgctctaagg gcatcatccg tgttgatctg 12060
ggcttatgga gacaacgaag taaattggac tgctgctctt aaaattgcaa gatctcggtg 12120
caatataaac tcagagtatc ttcgactatt gtccccctta cccacagctg ggaatctcca 12180
acatagactg gatgacggca taactcagat gacattcacc cctgcatctc tctacagggt 12240
gtcaccttat attcacatat ccaatgattc tcaaaggtta ttcacggaag aaggagtcaa 12300
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cttcccgatg acgacaacca ggacatacga tgagatcaca ttgcacctcc acagtaaatt 12420
tagctgctgt atcagggaag caccggttgc agttcctttc gagttactcg ggatggcacc 12480
agaactaagg acagtgacct caaataagtt tatgtatgat cctagtcctg tatcggaggg 12540
tgactttgcg agacttgact tagctatctt taagagttat gagcttaatc tagaatcata 12600
tcccacaata gagctaatga acattctttc aatatccagc gggaagttaa tcggccagtc 12660
tgtggtttct tatgatgaag atacctccat aaagaatgac gccataatag tgtatgacaa 12720
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agacaatatc gtgttgtata tgagtgactt atataagaat atgccaggaa ttctactttc 12900
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aggcttatct gcagaagaga agtgttcagt acttactgag tacctactgt cagatgctgt 13260
gaaaccatta cttagttctg agcaagtgag ctctatcatg tctcctaaca tagttacgtt 13320
cccagctaat ctatattaca tgtctcggaa gagccttaat ttgattaggg aaagagagga 13380
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tctcgaactg catgtgccgc atgagactat ctattacaat acgctcttct caaacgagat 13800
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tttggt 15186
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> NP gene of NDV avinew
<400> 2
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gctcatggcg gaggagagaa ggggagcacc ttaaaggtag aagtcccggt attcactctc 120
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tctcaagtga tgaggaacca tgttgccctt gcggggaaac agaatgaggc cacactggct 300
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gacggaggct cccaagcccc ccaaggtgca ctgaacagat cacaagggca accggacacc 1320
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<211> 489
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> NP protein of NDV avinew
<400> 3
Met Ser Ser Val Phe Asp Glu Tyr Glu Gln Leu Leu Ala Ala Gln Thr
1 5 10 15
Arg Pro Asn Gly Ala His Gly Gly Gly Glu Lys Gly Ser Thr Leu Lys
20 25 30
Val Glu Val Pro Val Phe Thr Leu Asn Ser Asp Asp Pro Glu Asp Arg
35 40 45
Trp Asn Phe Ala Val Phe Cys Leu Arg Ile Ala Val Ser Glu Asp Ala
50 55 60
Asn Lys Pro Leu Arg Gln Gly Ala Leu Ile Ser Leu Leu Cys Ser His
65 70 75 80
Ser Gln Val Met Arg Asn His Val Ala Leu Ala Gly Lys Gln Asn Glu
85 90 95
Ala Thr Leu Ala Val Leu Glu Ile Asp Gly Phe Thr Asn Gly Val Pro
100 105 110
Gln Phe Asn Asn Arg Ser Gly Val Ser Glu Glu Arg Ala Gln Arg Phe
115 120 125
Met Met Ile Ala Gly Ser Leu Pro Arg Ala Cys Ser Asn Gly Thr Pro
130 135 140
Phe Val Thr Ala Gly Val Glu Asp Asp Ala Pro Glu Asp Ile Thr Asp
145 150 155 160
Thr Leu Glu Arg Ile Leu Ser Ile Gln Ala Gln Val Trp Val Thr Val
165 170 175
Ala Lys Ala Met Thr Ala Tyr Glu Thr Ala Asp Glu Ser Glu Thr Arg
180 185 190
Arg Ile Asn Lys Tyr Met Gln Gln Gly Arg Val Gln Lys Lys Tyr Ile
195 200 205
Leu His Pro Val Cys Arg Ser Ala Ile Gln Leu Thr Ile Arg Gln Ser
210 215 220
Leu Ala Val Arg Ile Phe Leu Val Ser Glu Leu Lys Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ala Gly Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Asn Leu Val Gly Asp Val Asp
245 250 255
Ser Tyr Ile Arg Asn Thr Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Thr Leu Lys
260 265 270
Tyr Gly Ile Asn Thr Lys Thr Ser Ala Leu Ala Leu Ser Ser Leu Ser
275 280 285
Gly Asp Ile Gln Lys Met Lys Gln Leu Met Arg Leu Tyr Arg Met Lys
290 295 300
Gly Asp Asn Ala Pro Tyr Met Thr Leu Leu Gly Asp Ser Asp Gln Met
305 310 315 320
Ser Phe Ala Pro Ala Glu Tyr Ala Gln Leu Tyr Ser Phe Ala Met Gly
325 330 335
Met Ala Ser Val Leu Asp Lys Gly Thr Ser Lys Tyr Gln Phe Ala Arg
340 345 350
Asp Phe Met Ser Thr Ser Phe Trp Arg Leu Gly Val Glu Tyr Ala Gln
355 360 365
Ala Gln Gly Ser Ser Ile Asn Glu Asp Met Ala Ala Glu Leu Lys Leu
370 375 380
Thr Pro Ala Ala Arg Arg Gly Leu Ala Ala Ala Ala Gln Arg Val Ser
385 390 395 400
Glu Glu Thr Ser Ser Met Asp Met Pro Thr Gln Gln Ala Gly Val Leu
405 410 415
Thr Gly Leu Ser Asp Gly Gly Ser Gln Ala Pro Gln Gly Ala Leu Asn
420 425 430
Arg Ser Gln Gly Gln Pro Asp Thr Gly Asp Gly Glu Thr Gln Phe Leu
435 440 445
Asp Leu Met Arg Ala Val Ala Asn Ser Met Arg Glu Ala Pro Asn Ser
450 455 460
Ala Gln Gly Thr Pro Gln Pro Gly Pro Pro Pro Thr Pro Gly Pro Ser
465 470 475 480
Gln Asp Asn Asp Thr Asp Trp Gly Tyr
485
<210> 4
<211> 1185
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> P gene of NDV Avinew
<400> 4
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gccagccaag acacccctga tcgacaggac agatcagata aacaactgtc cacacccgag 240
caagcgagtc caaacgacag ccccccagcc acatccactg accagcctcc cactcaggct 300
gcagatgagg ccggcgatac acagctcaag accggagcaa gcaactctct gctgtcgatg 360
cttgataaac tcagcaataa gtcatctaat gctaaaaagg gcccagggtc gagccctcaa 420
gaaaggcatc atcaacgtct gactcaacaa caggggagtc aacaaagccg cggaaacagc 480
caagagagac cgcagaacca ggccaaggcc atccctggaa accaggtcac agacgcgaac 540
acagcatatc atggacaatg ggaggagtca caactatcag ctggtgcaac ccatcatgct 600
ctccgatcag agcagagcca agacaatact cctgcacctg tggatcatgt ccagctacct 660
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gttgactatc agctggacct tgtcttgaaa cagacatctt ctatccccat gatgcggtct 780
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<212> PRT
<213> artificial sequence
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<223> P protein of NDV Avinew
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20 25 30
Thr Val Gly Arg Ser Ala Ile Pro Gln Gly Lys Thr Lys Ala Leu Ser
35 40 45
Ala Ala Trp Glu Lys His Gly Ser Ile Gln Ser Pro Ala Ser Gln Asp
50 55 60
Thr Pro Asp Arg Gln Asp Arg Ser Asp Lys Gln Leu Ser Thr Pro Glu
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Gln Ala Ser Pro Asn Asp Ser Pro Pro Ala Thr Ser Thr Asp Gln Pro
85 90 95
Pro Thr Gln Ala Ala Asp Glu Ala Gly Asp Thr Gln Leu Lys Thr Gly
100 105 110
Ala Ser Asn Ser Leu Leu Ser Met Leu Asp Lys Leu Ser Asn Lys Ser
115 120 125
Ser Asn Ala Lys Lys Gly Pro Gly Ser Ser Pro Gln Glu Arg His His
130 135 140
Gln Arg Leu Thr Gln Gln Gln Gly Ser Gln Gln Ser Arg Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Arg Pro Gln Asn Gln Ala Lys Ala Ile Pro Gly Asn Gln Val
165 170 175
Thr Asp Ala Asn Thr Ala Tyr His Gly Gln Trp Glu Glu Ser Gln Leu
180 185 190
Ser Ala Gly Ala Thr His His Ala Leu Arg Ser Glu Gln Ser Gln Asp
195 200 205
Asn Thr Pro Ala Pro Val Asp His Val Gln Leu Pro Val Asp Phe Val
210 215 220
Gln Ala Met Met Ser Met Met Glu Ala Ile Ser Gln Arg Val Ser Lys
225 230 235 240
Val Asp Tyr Gln Leu Asp Leu Val Leu Lys Gln Thr Ser Ser Ile Pro
245 250 255
Met Met Arg Ser Glu Ile Gln Gln Leu Lys Thr Ser Val Ala Val Met
260 265 270
Glu Ala Asn Leu Gly Met Met Lys Ile Leu Asp Pro Gly Cys Ala Asn
275 280 285
Val Ser Ser Leu Ser Asp Leu Arg Ala Val Ala Arg Ser His Pro Val
290 295 300
Leu Ile Ser Gly Pro Gly Asp Pro Ser Pro Tyr Val Thr Gln Gly Gly
305 310 315 320
Glu Met Ala Leu Asn Lys Leu Ser Gln Pro Val Gln His Pro Ser Glu
325 330 335
Leu Ile Lys Pro Ala Thr Ala Ser Gly Pro Asp Ile Gly Val Glu Lys
340 345 350
Asp Thr Val Arg Ala Leu Ile Met Ser Arg Pro Met His Pro Ser Ser
355 360 365
Ser Ala Arg Leu Leu Ser Lys Leu Asp Ala Ala Gly Ser Ile Glu Glu
370 375 380
Ile Arg Lys Ile Lys Arg Leu Ala Leu Asn Gly
385 390 395
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<223> M gene of NDV Avinew
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gcaactaaca ccgagagaat ggtcttctca gtagtgcagg caccccaggt gctgcaaagc 420
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<213> artificial sequence
<220>
<223> M protein of NDV Avinew
<400> 7
Met Asp Ser Ser Arg Thr Ile Gly Leu Tyr Phe Asp Ser Thr Leu Pro
1 5 10 15
Ser Ser Asn Leu Leu Ala Phe Pro Ile Val Leu Gln Asp Thr Gly Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Gln Ile Ala Pro Gln Tyr Arg Ile Gln Arg Leu Asp Ser
35 40 45
Trp Thr Asp Ser Lys Glu Asp Ser Val Phe Ile Thr Thr Tyr Gly Phe
50 55 60
Ile Phe Gln Val Gly Asn Glu Glu Ala Thr Val Gly Met Ile Asn Asp
65 70 75 80
Asn Pro Lys Arg Glu Leu Leu Ser Thr Ala Met Leu Cys Leu Gly Ser
85 90 95
Val Pro Asn Val Gly Asp Leu Val Glu Leu Ala Arg Ala Cys Leu Thr
100 105 110
Met Val Val Thr Cys Lys Lys Ser Ala Thr Asn Thr Glu Arg Met Val
115 120 125
Phe Ser Val Val Gln Ala Pro Gln Val Leu Gln Ser Cys Arg Val Val
130 135 140
Ala Asn Lys Tyr Ser Ser Val Asn Ala Val Lys His Val Lys Ala Pro
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Glu Lys Ile Pro Gly Ser Gly Thr Leu Glu Tyr Lys Val Asn Phe Val
165 170 175
Ser Leu Thr Val Val Pro Arg Lys Asp Val Tyr Lys Ile Pro Thr Ala
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Ala Leu Lys Val Ser Gly Ser Ser Leu Tyr Asn Leu Ala Leu Asn Val
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Thr Ile Asp Val Glu Val Asp Pro Lys Ser Pro Leu Val Lys Ser Leu
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Ser Lys Ser Asp Ser Gly Tyr Tyr Ala Asn Leu Phe Leu His Ile Gly
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Leu Met Ser Thr Val Asp Lys Lys Gly Lys Lys Val Thr Phe Asp Lys
245 250 255
Leu Glu Arg Lys Ile Arg Arg Leu Asp Leu Ser Val Gly Leu Ser Asp
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275 280 285
Leu Leu Ala Pro Phe Phe Ser Ser Ser Gly Thr Ala Cys Tyr Pro Ile
290 295 300
Ala Asn Ala Ser Pro Gln Val Ala Lys Ile Leu Trp Ser Gln Thr Ala
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Val Ala Val Thr Ala Asp His Glu Val Thr Ser Thr Lys Leu Glu Lys
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<223> F protein of NDV Avinew
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Leu Leu Pro Asn Met Pro Lys Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro
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85 90 95
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Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Ser Ser Gly Leu Ile Thr Gly Asn
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gcatcatccg tgttgatctg ggcttatgga gacaacgaag taaattggac tgctgctctt 3720
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tacctactgt cagatgctgt gaaaccatta cttagttctg agcaagtgag ctctatcatg 4920
tctcctaaca tagttacgtt cccagctaat ctatattaca tgtctcggaa gagccttaat 4980
ttgattaggg aaagagagga cagggacact atcttggcat tgttgttccc ccaagagcca 5040
ctacttgagt tccccttagt acaagatatt ggcgctcgag tgaaagatcc attcacccga 5100
caacctgcgg cgtttttaca agaattagat ttgagcgctc cagcaaggta tgacgcattt 5160
acacttagtc aggttcattc tgaacacaca tcaccaaatc cggaggacga ctacttagta 5220
cgatacctgt tcagaggaat agggaccgcg tcctcctctt ggtataaggc atctcacctt 5280
ctttctgtac ctgaggtcag atgtgcaagg cacgggaatt ccttatactt ggcagaagga 5340
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acgctcttct caaacgagat gaacccccca cagcggcatt tcggaccgac cccaacacag 5460
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gacattgaga ttcctccagg atccaatcaa agcttactgg atcaactggc taccaatctg 5700
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<211> 2204
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> L protein of NDV Avinew
<400> 13
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100 105 110
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130 135 140
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Pro Ala Phe Trp Phe His Ser Lys Trp Ser Thr Thr Lys Phe Ala Trp
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Leu Arg Ser Leu Ser Glu Lys Ile Asp Asp Ile Leu Arg Leu Val Asp
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Leu Ala Ala Phe Arg Arg Asn Leu Leu Ser Glu Asp Gln Lys Lys His
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His Gln Leu Ala Asp Thr Asp Phe Ile Glu Met Ser Ala Lys Leu
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Asn Lys Tyr Asp Leu Leu Phe Pro Ser Val Leu Asp Asp Asn Leu
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Tyr Tyr Phe His Leu Leu Met Asn Leu Phe Thr Pro Cys Ser Thr
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Lys Gly Tyr Ile Leu Ser Asn Gly Tyr Ala Cys Arg Gly Asp Met
1940 1945 1950
Glu Cys Tyr Leu Val Phe Val Met Gly Tyr Arg Gly Gly Pro Thr
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1970 1975 1980
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Ala Leu Ile Glu Ala Gly Gly Gln Pro Val Arg Pro Phe Cys Ala
2030 2035 2040
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<223> codon-optimized HA gene coding for Influenza H5N1
A/Duck/Laos/3295/2006 (ABG67978)
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cgcaacgtgg tgtggctgat caagaagaac aacacctacc ccaccatcaa gcgcagctac 540
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gccgagcaga ccaagctgta ccagaacccc accacctaca tcagcgttgg cacaagcacc 660
ctcaaccaga ggctggtgcc caagatcgcc acccgcagca aggtgaacgg ccagagcggc 720
aggatggact tcttctggac catcctgaag cccaacgacg ccatcaactt cgagagcaac 780
ggcaacttta tcgcccccga gtacgcctac aagatcgtga agaagggcga cagcgccatc 840
atcaagagcg aggtggagta cggcaactgc aacaccaagt gccagacccc catcggcgcc 900
atcaacagca gcatgccctt ccacaacatc caccccctga ccatcggcga gtgccccaag 960
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gacgggtggt acggctacca ccactccaac gagcagggca gcggctacgc cgccgacaaa 1140
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<212> PRT
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<220>
<223> H5N1 A/Duck/Laos/3295/2006 (ABG67978) with modified cleavage site
<400> 15
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<211> 1698
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> codon-optimzied gene coding for HA from Influenza H5N1
A/Turkey/Turkey/1/2005 (ABQ58921) with modified cleavage site
<400> 16
atggaaaaga tcgtgctgct gctggccatc gtgagcctgg tgaagagcga ccagatctgc 60
atcggctacc acgccaacaa cagcaccgag caggtggaca ccatcatgga aaagaatgtg 120
accgtgaccc acgcccagga catcctggaa aagacccaca acggcaagct gtgcgacctg 180
gacggcgtga agcccctgat cctgagggac tgcagcgtgg ccggctggct gctgggcaac 240
cccatgtgcg acgagtttct gaacgtgccc gagtggagct acatcgtgga gaagatcaac 300
cccgccaacg acctgtgcta ccccggcaac ttcaacgact acgaggaact gaagcacctg 360
ctgtccagga tcaaccactt cgagaagatc cagatcatcc ccaagagcag ctggtccgac 420
cacgaggcct ctgctggcgt gagcagcgcc tgcccatacc agggccgcag cagcttcttc 480
cgcaacgtgg tgtggctgat caagaaggac aacgcctacc ccaccatcaa gcgcagctac 540
aacaacacca accaggaaga tctgctggtc ctgtggggca tccaccaccc caacgacgcc 600
gccgagcaga ccaggctgta ccagaacccc accacctaca tcagcgtcgg cacctctacc 660
ctgaatcaga ggctggtgcc caagatcgcc acccgcagca aggtgaacgg ccagagcggc 720
aggatggaat tcttctggac catcctgaag cccaacgatg ccatcaactt cgagagcaac 780
ggcaacttta tcgcccccga gaacgcctac aagatcgtga agaagggcga cagcaccatc 840
atgaagagcg agctggaata cggcaactgc aacaccaagt gccagacccc catcggcgcc 900
atcaacagca gcatgccctt ccacaacatc caccccctga ccatcggcga gtgccccaag 960
tacgtgaaga gcagcaggct ggtgctggcc accggcctga ggaacagccc ccagcgcgag 1020
acaaggggcc tgttcggcgc tatcgccggc ttcatcgagg gcggctggca gggcatggtg 1080
gacgggtggt acggctacca tcactctaac gaacaaggca gcggctacgc cgccgacaaa 1140
gagagcaccc agaaggccat cgacggcgtc accaacaagg tgaacagcat catcgacaag 1200
atgaacaccc agttcgaggc cgtgggccgc gagttcaaca acctggaaag gcgcatcgag 1260
aacctgaaca agaaaatgga agatggcttc ctggacgtgt ggacctacaa cgccgagctg 1320
ctcgtgctga tggaaaacga gaggaccctg gacttccacg acagcaacgt gaagaacctg 1380
tacgacaaag tgcgcctgca gctgagggac aacgccaaag agctgggcaa cggctgcttc 1440
gagttctacc accgctgcga caacgagtgc atggaaagcg tgaggaacgg cacctacgac 1500
tacccccagt acagcgagga agccaggctg aagcgcgaag agatcagcgg agtgaagctg 1560
gaaagcatcg gcacctacca gatcctgagc atctacagca ccgtggctag ctctctggcc 1620
ctggccatca tggtggccgg actgagcctg tggatgtgca gcaacggcag cctgcagtgc 1680
aggatctgca tctgatga 1698
<210> 17
<211> 564
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> HA protein from Influenza H5N1 A/Turkey/Turkey/1/2005 (ABQ58921)
with modified cleavage site
<400> 17
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Lys Ile Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
130 135 140
Ala Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Arg Ser Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asp Asn Ala Tyr Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
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Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
210 215 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225 230 235 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Asn Ala Tyr Lys Ile
260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
275 280 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Ser Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
340 345 350
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
355 360 365
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
370 375 380
Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
385 390 395 400
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu
405 410 415
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
420 425 430
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
435 440 445
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
450 455 460
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe
465 470 475 480
Glu Phe Tyr His Arg Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met
530 535 540
Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
545 550 555 560
Arg Ile Cys Ile
<210> 18
<211> 1695
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> codon-optimized HA gene coding for HA from Influenza H5N1
A/chicken/Indonesia/7/2003 with modified cleavage site
<400> 18
atggagaaaa tcgtgctgct gctggccatc gtgagcctgg tgaaaagcga tcagatctgc 60
atcggctacc acgccaacaa cagcacagag caagtggaca caatcatgga aaagaacgtg 120
accgtgacac acgcccagga catcctggaa aagacacaca acgggaagct gtgcgatctg 180
gatggagtga agcctctgat cctgagagat tgcagcgtgg ccggatggct gctggggaac 240
ccaatgtgcg acgaattcat caacgtgccc gaatggagct acatcgtgga gaaggccaac 300
ccagccaacg acctgtgcta cccagggaac ctgaacgact acgaagaact gaaacacctg 360
ctgagcagaa tcaaccactt tgagaaaatc cagatcatcc ccaaaagcag ctggtccgat 420
cacgaagcca gcagcggagt gagcagcgcc tgcccatacc agggaaagtc cagctttttt 480
agaaacgtgg tgtggctgat caaaaagaac agcgcctacc caacaatcaa gagaagctac 540
aacaacacca accaggaaga tctgctggtg ctgtggggga tccaccaccc taacgatgcc 600
gccgagcaga caaggctgta ccagaaccca accacctaca tctccgtggg gacaagcaca 660
ctgaaccaga gactggtgcc aaaaatcgcc atcagatcca aagtgaacgg gcagagcgga 720
agaatggagt tcttctggac aatcctgaaa cccaacgatg ccatcaactt cgagagcaac 780
ggaaacttca tcgccccaga atacgcctac aaaatcgtga agaaagggga cagcgccatc 840
atgaaaagcg aactggaata cggcaactgc aacaccaagt gccagacccc aatgggggcc 900
atcaacagca gcatgccatt ccacaacatc caccctctga ccatcgggga atgccccaaa 960
tacgtgaaaa gcaacagact ggtgctggcc accgggctga gaaacagccc tcagagagag 1020
accagaggac tgtttggagc catcgccggc tttatcgagg gaggatggca gggaatggtg 1080
gatggctggt acggatacca ccacagcaac gagcagggga gcggatacgc cgccgacaaa 1140
gaatccaccc agaaggccat cgacggcgtg accaacaaag tgaacagcat catcgacaaa 1200
atgaacaccc agtttgaggc cgtgggaagg gagtttaaca acctggaaag gagaatcgag 1260
aacctgaaca agaagatgga ggacggattc ctggatgtgt ggacctacaa cgccgaactg 1320
ctggtgctga tggaaaacga gagaaccctg gactttcacg acagcaacgt gaagaacctg 1380
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agaatctgca tctga 1695
<210> 19
<211> 568
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> HA protein from Influenza H5N1 A/chicken/Indonesia/7/2003 with
modified cleavage site
<400> 19
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Leu Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
130 135 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
180 185 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
210 215 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Ile Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225 230 235 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
275 280 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
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Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile
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Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr
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Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys
370 375 380
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser
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Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp
420 425 430
Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met
435 440 445
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu
450 455 460
Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly
465 470 475 480
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu
485 490 495
Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala
500 505 510
Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly
515 520 525
Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala
530 535 540
Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly
545 550 555 560
Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 20
<211> 1695
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> codon-optimized HA gene from Influenza H5N1 A/chicken/West
Java/PWT-WIJ/2006 strain (EU124148) with modified cleavage site
<400> 20
atggaaaaga tcgtgctgct gctggccatc gtgtccctgg tgaagagcga ccagatctgc 60
atcggctacc acgccaacaa cagcaccgag caggtggaca ccattatgga aaagaacgtg 120
accgtgaccc atgctcagga catcctggaa aagacccaca acggcaagct gtgcgacctg 180
gacggcgtga agcccctgat cctgagagac tgcagcgtgg ccggctggct gctgggcaac 240
cccatgtgcg acgagttcat caaggtgcag gaatggtcct acatcgtcga gaaggccagc 300
cccaccaacg acctgtgcta ccccggcagc ttcaacgact acgaggaact gaagcacctg 360
ctgtccagaa tcaagcactt cgagaagatc cgcatcatcc ccaagagcga ttggagcgac 420
cacgaggcca gcctgggcgt gagcagcgcc tgcccctacc tgggcagccc cagcttcttc 480
agaaacgtgg tgtggctgat caagaagaac agcacctacc ccaccatcaa gaagagctac 540
aagaacacca accaggaaga tctgctggtc ctgtggggca tccaccacag caacaacgtg 600
gaggaacaga ccagactgta ccagaacccc atcacctaca tcagcatcgg caccagcacc 660
ctgaaccaga gactggtgcc caagatcgcc acccgcagca aggtgcacgg ccagagcggc 720
agaatggact tcttctggac catcctgaac cccaacgaca ccatcaactt cgagagcaac 780
ggcaacttta tcgcccccga gtacgcctac aagatcgtga agaagggcga cagcgccatc 840
atgaagagcg agctggaata cggcgactgc aacaccaagt gccagacccc catgggcgcc 900
atcaacagca gcatgccctt ccacaacatc caccccctga ccatcggcga gtgccctaag 960
tacgtgaaga gcaacagact ggtgctggcc accggcctga gaaacagccc ccagagagag 1020
acaagaggcc tgttcggcgc tatcgccggc ttcatcgagg gcggctggca gggcatggtg 1080
gacgggtggt acggctacca ccactccaac gagcagggca gcggctacgc cgccgacaaa 1140
gagagcaccc agaaggccat cgacggcgtc accaacaaag tgaacagcat catcgacaag 1200
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aacctgaaca agaaaatgga agatggcttc ctggacgtgt ggacctacaa cgccgagctg 1320
ctggtgctga tggaaaacga gagaaccctg gacttccacg acagcaacgt gaagaacctg 1380
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agaatctgca tctga 1695
<210> 21
<211> 564
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> HA protein from Influenza H5N1 A/chicken/West Java/PWT-WIJ/2006
strain (EU124148) with modified cleavage site
<400> 21
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Lys Val Gln Glu Trp Ser Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Lys Ala Ser Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Lys His Phe Glu
115 120 125
Lys Ile Arg Ile Ile Pro Lys Ser Asp Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
130 135 140
Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Lys Ser Tyr Lys Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
180 185 190
Gly Ile His His Ser Asn Asn Val Glu Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
195 200 205
Asn Pro Ile Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
210 215 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val His Gly Gln Ser Gly
225 230 235 240
Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Asn Pro Asn Asp Thr Ile Asn
245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
275 280 285
Asp Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
340 345 350
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
355 360 365
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
370 375 380
Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
385 390 395 400
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu
405 410 415
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
420 425 430
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
435 440 445
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
450 455 460
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe
465 470 475 480
Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn
485 490 495
Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg
500 505 510
Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile
515 520 525
Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met
530 535 540
Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
545 550 555 560
Arg Ile Cys Ile
<210> 22
<211> 1728
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> codon-optimized gene coding for HA from Influenza H9N2
A/chicken/Iran/AV1221/1998 strain
<400> 22
atcgcgatat ccgttaagtt tgtatcgtaa tggagaccat cagcctgatc accatcctgc 60
tggtcgtgac cgccagcaac gccgacaaga tctgcatcgg ctaccagagc accaacagca 120
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gcaacgtgga gaacctggag gagctgcgga ccctgttcag cagcgcctcc tcttaccagc 420
ggatccagat cttccccgac accatctgga acgtgaccta caccggcacc agcaaggcct 480
gcagcggcag cttctaccgg agcatgcggt ggctgaccca gaagagcggc agctaccccg 540
tgcaggacgc ccagtacacc aacaaccggg gcaagagcat cctgttcgtg tggggcatcc 600
accacccccc caccgacacc gcccagacca acctgtacat ccggaacgac accaccacct 660
ccgtgaccac cgaggacctg aaccggatct tcaagcccat gatcggcccc aggcccctcg 720
tgaacggcca gcagggccgg atcaactact actggagcgt gctgaagccc ggccagaccc 780
tgagagtgcg gagcaacggc aacctgatcg ccccttggta cggccacgtg ctgtccggcg 840
gcagccacgg ccggatcctg aaaaccgacc tgaacagcgg caactgcgtg gtgcagtgcc 900
agaccgagaa gggcggcctg aacagcaccc tgcccttcca caacatcagc aagtacgcct 960
tcggcaactg ccctaagtac gtgcgcgtga agagcctgaa gctggccgtg ggcctgagga 1020
acgtgcccgc cagaagcagc aggggcctgt tcggcgccat cgccggcttc atcgagggcg 1080
gctggcctgg actggtggcc gggtggtacg gcttccagca cagcaacgac cagggcgtgg 1140
gcatggccgc cgaccgggac agcacccaga aggccatcga caagatcacc agcaaagtga 1200
acaacatcgt ggacaagatg aacaagcagt acgagatcat cgaccacgag ttcagcgagg 1260
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cctacaacgc cgagctgctc gtgctgctgg agaaccagaa aaccctggac gagcacgacg 1380
ccaacgtgaa caatctgtac aacaaagtga agcgggccct gggcagcaac gccatggagg 1440
acggcaaggg ctgcttcgag ctgtaccaca agtgcgacga ccagtgcatg gagacaatca 1500
gaaacggcac ctacaaccgg cggaagtaca aggaagagag ccggctggag cggcagaaaa 1560
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<210> 23
<211> 560
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> HA proein from Influenza H9N2 A/chicken/Iran/AV1221/1998 strain
<400> 23
Met Glu Thr Ile Ser Leu Ile Thr Ile Leu Leu Val Val Thr Ala Ser
1 5 10 15
Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu
20 25 30
Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Thr Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys
35 40 45
Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Asn Leu
50 55 60
Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Gly Gly Arg Glu Trp Ser Tyr
85 90 95
Ile Val Glu Arg Ser Ser Ala Val Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asn
100 105 110
Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Thr Leu Phe Ser Ser Ala Ser Ser
115 120 125
Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp Thr Ile Trp Asn Val Thr Tyr
130 135 140
Thr Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Gly Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg
145 150 155 160
Trp Leu Thr Gln Lys Ser Gly Ser Tyr Pro Val Gln Asp Ala Gln Tyr
165 170 175
Thr Asn Asn Arg Gly Lys Ser Ile Leu Phe Val Trp Gly Ile His His
180 185 190
Pro Pro Thr Asp Thr Ala Gln Thr Asn Leu Tyr Ile Arg Asn Asp Thr
195 200 205
Thr Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Leu Asn Arg Ile Phe Lys Pro Met
210 215 220
Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Gln Gln Gly Arg Ile Asn Tyr
225 230 235 240
Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Val Arg Ser Asn
245 250 255
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Val Leu Ser Gly Gly Ser
260 265 270
His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Asn Ser Gly Asn Cys Val Val
275 280 285
Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Ser Thr Leu Pro Phe His
290 295 300
Asn Ile Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Pro Lys Tyr Val Arg Val
305 310 315 320
Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ala Arg Ser
325 330 335
Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp
340 345 350
Pro Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln
355 360 365
Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp
370 375 380
Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln
385 390 395 400
Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn
405 410 415
Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Val Trp Ala Tyr
420 425 430
Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu
435 440 445
His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu
450 455 460
Gly Ser Asn Ala Met Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His
465 470 475 480
Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn
485 490 495
Arg Arg Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Arg Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu
500 505 510
Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr
515 520 525
Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Met Gly Phe Ala Ala Phe
530 535 540
Leu Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile
545 550 555 560
<210> 24
<211> 15407
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> NDV Avinew genome sequence containing cloning sites
<400> 24
ttcgccctta acagcggccg ctaatacgac tcactatagg accaaacaga gaatccgtga 60
ggtacgatag aaggcgaagg agcaatcgaa gtcgtacggg tagaaggtgt gaatctcgag 120
tgcgagcccg aagctcaaac tcgagagagc cttctgccaa aatgtcttct gtattcgatg 180
agtacgagca gctcctcgcg gctcagactc gccccaatgg agctcatggc ggaggagaga 240
aggggagcac cttaaaggta gaagtcccgg tattcactct caacagtgat gacccagaag 300
atagatggaa ctttgcagtg ttttgtcttc ggattgctgt tagcgaggat gccaacaaac 360
cacttaggca aggtgctctc atatctctct tatgttccca ctctcaagtg atgaggaacc 420
atgttgccct tgcggggaaa cagaatgagg ccacactggc tgttcttgag atcgatggtt 480
ttaccaacgg cgtgccccag ttcaacaaca ggagtggagt gtctgaagag agagcacaga 540
gatttatgat gatagcaggg tctctccctc gggcatgcag caacggtacc ccgttcgtca 600
cagctggggt tgaagatgat gcaccagaag acattactga taccctggag aggatcctct 660
ctatccaggc tcaagtatgg gtcacggtgg caaaggccat gactgcatat gagacagcag 720
atgagtcaga aacaagaaga atcaataagt acatgcagca aggcagggtc cagaagaagt 780
acatcctcca ccccgtatgc aggagcgcaa tccaactcac aatcagacag tctctggcgg 840
tccgcatctt tttggttagc gagcttaaga gaggccgcaa cacggcaggt gggacctcca 900
cctattacaa cttggtgggg gatgtagact catacatcag gaacactggg ctaactgcat 960
tcttcctgac acttaaatat ggaattaaca ccaagacatc agcccttgca cttagcagcc 1020
tctcaggcga tatccagaaa atgaagcagc tcatgcgctt gtatcggatg aaaggagata 1080
atgcgccgta catgacattg ctcggtgaca gtgaccagat gagctttgca cctgccgagt 1140
atgcacaact ttactccttt gccatgggta tggcatcagt cctagataaa ggaactagca 1200
aataccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg gagacttgga gtagagtacg 1260
ctcaggctca aggaagtagc atcaatgagg atatggccgc cgagctaaag ctaaccccag 1320
cagcaaggag aggcctggca gctgctgccc aaagagtgtc tgaggagacc agcagcatgg 1380
acatgcccac ccaacaagcc ggggtcctca ctggactcag cgacggaggc tcccaagccc 1440
cccaaggtgc actgaacaga tcacaagggc aaccggacac cggggatggg gagacccaat 1500
ttctggatct gatgagagcg gtggcaaata gcatgagaga agcgccaaac tctgcgcagg 1560
gcacccctca accggggcct cccccaaccc ctgggccctc tcaagacaat gacaccgact 1620
gggggtactg accgacagca cccagtttgc ttctatgagg tcatcccaat tcctctgccc 1680
acaccccacc cctcaatccg caatcccgca tggccaaacc cacaaacgaa cccccctgtc 1740
tccctcctct cccccagccc cacaacccca cctgcccagg gcaacatagg tacaatgcga 1800
cccactaata atcaatacag ggccaaagaa attagaaaaa agtacgggta gaagggagac 1860
attcagagat cagggcgagt cacccgggtc tctgctctcc cttctaccta gtggattagg 1920
atggagatgg ccacctttac agatgcggag atcgacgagc tatttgagac cagtggaact 1980
gtcattgaca gcataattac ggcccaggga aaaccagtag agactgttgg aaggagtgca 2040
atcccacaag gcaaaactaa ggctttgagc gcagcatggg agaagcatgg gagcatccag 2100
tcaccagcca gccaagacac ccctgatcga caggacagat cagataaaca actgtccaca 2160
cccgagcaag cgagtccaaa cgacagcccc ccagccacat ccactgacca gcctcccact 2220
caggctgcag atgaggccgg cgatacacag ctcaagaccg gagcaagcaa ctctctgctg 2280
tcgatgcttg ataaactcag caataagtca tctaatgcta aaaagggccc agggtcgagc 2340
cctcaagaaa ggcatcatca acgtctgact caacaacagg ggagtcaaca aagccgcgga 2400
aacagccaag agagaccgca gaaccaggcc aaggccatcc ctggaaacca ggtcacagac 2460
gcgaacacag catatcatgg acaatgggag gagtcacaac tatcagctgg tgcaacccat 2520
catgctctcc gatcagagca gagccaagac aatactcctg cacctgtgga tcatgtccag 2580
ctacctgtcg actttgtgca ggcgatgatg tctatgatgg aggcgatatc acagagggta 2640
agtaaagttg actatcagct ggaccttgtc ttgaaacaga catcttctat ccccatgatg 2700
cggtctgaaa tccagcagct gaaaacgtct gttgcggtca tggaagccaa tttgggcatg 2760
atgaagatcc tggaccctgg ttgtgccaac gtttcatctc taagtgatct acgggcagtt 2820
gcccgatccc acccggtttt aatttctggc cccggagacc catctcctta tgtgacccaa 2880
gggggcgaaa tggcactcaa taaactttcg caaccggtgc aacacccctc tgaattgatt 2940
aaacccgcca cggcaagcgg gcctgatata ggagtggaga aagacactgt ccgtgcattg 3000
atcatgtcac gccctatgca tccgagctct tcagctaggc tcttgagcaa actggacgca 3060
gccggatcga ttgaggaaat cagaaaaatc aagcgccttg cactgaatgg ctaatcacca 3120
ccgcaacccg cagcagatcc ctgtccaccc agcaccacac ggtatctgca ccaagctcct 3180
ctctgcaaat ccaaggtcca acacccttaa ttaagtctgt ctggccggcc cgagcgacaa 3240
ccctgtcctg cttcctctgc cccactaaat gatcgcgcag ctgcaatcaa ttcagctata 3300
ttaaggatta agaaaaaata cgggtagaat cggagtgccc cgattgtgcc aagatggact 3360
catctaggac aatcgggctg tactttgatt ctacccttcc ttctagcaac ctgctagcat 3420
tcccgatagt cctacaagac acaggggacg ggaagaagca aatcgccccg caatacagga 3480
tccagcgtct tgactcgtgg acagacagca aagaagactc ggtattcatc accacctatg 3540
gattcatctt tcaggttggg aatgaagaag ccactgtcgg catgatcaat gataatccca 3600
agcgcgagtt actttccact gccatgctat gcctagggag tgtaccaaat gtcggagatc 3660
ttgttgagct ggcaagggcc tgcctcacta tggtggtaac atgcaagaag agtgcaacta 3720
acaccgagag aatggtcttc tcagtagtgc aggcacccca ggtgctgcaa agctgtaggg 3780
ttgtggcaaa caaatactcg tcggtgaatg cagtcaagca cgtgaaagca ccagagaaga 3840
ttcctgggag cggaacccta gagtacaaag tgaactttgt ctctctgacc gtggtgccaa 3900
gaaaggacgt ctacaagata ccaactgcag cacttaaggt ctctggctca agtctgtaca 3960
atcttgcgct caatgtcact attgatgtgg aggtagaccc gaagagcccg ttggtcaaat 4020
ccctttccaa gtccgacagt gggtactatg ctaatctctt cttacatatt gggcttatgt 4080
ccactgtaga taagaagggg aagaaagtga catttgacaa gctggaaagg aagataagga 4140
gacttgatct atctgtaggg cttagtgacg tgctcggacc ttccgtgctt gtaaaggcga 4200
gaggtgcacg gactaagctg ctggcacctt tcttctctag cagtgggaca gcctgctatc 4260
ccatagcaaa tgcctctcct caggtggcca agatactctg gagccaaacc gcgtacctgc 4320
ggagtgtaaa agtcattatc caagcgggca cccagcgtgc tgtcgcagtg accgccgacc 4380
acgaggttac ctctactaag ctggagaagg ggcataccat tgccaaatac aatcccttca 4440
agaaataggc tgcatctctg agattgcact ccgcccatct tcccggatca ccatgacact 4500
aaataatgat ctgtcttgat tacttatagt tagttcgcct gtctatcaaa ttagaaaaaa 4560
cacgggtaga agattctgga tcccggttgg cgccttcaag gtgcaagatg ggctccagat 4620
cttctaccag gatcccagta cctcttatgc tgaccgtccg agtcatgttg gcactgagtt 4680
gcgtctgtcc gaccagcgcc cttgatggca ggcctcttgc agctgcaggg attgtggtaa 4740
caggagacaa agcagtcaac atatacacct catctcagac agggtcaatc ataatcaagt 4800
tactcccaaa tatgcccaag gataaagagg cgtgtgcaaa agccccgttg gaggcataca 4860
acaggacatt gactactttg ctcacccccc ttggtgattc tatccgtagg atacaagagt 4920
ctgtgaccac gtccggagga gggaaacagg gacgtcttat aggcgccatt atcggtggtg 4980
tagctctcgg ggttgcaacc gctgcacaga taacagcagc ctcggctctg atacaagcca 5040
atcaaaatgc tgccaacata ctccggctaa aagagagcat tgctgcaacc aatgaggctg 5100
tgcacgaggt cactaatgga ttatcacaac tagcagtggc agttgggaag atgcagcaat 5160
ttgttaatga ccagtttaat aaaacagctc aggaattgga ctgtataaaa attacacagc 5220
aggttggtgt agaactcaac ctgtacctaa ctgaattgac tacagtattc gggccacaaa 5280
tcacttcccc tgccttaact cagctgacta tccaggcgct ttacaatcta gctggtggga 5340
atatggatta cttgttgact aagttaggtg tggggaacaa ccaactcagc tcattaatta 5400
gtagtggcct gatcaccggc aaccctattc tgtacgactc acagactcaa ctcttgggta 5460
tacaggtaac cctaccctca gtcgggaacc taaataatat gcgtgccacc tacctggaaa 5520
ccttgtctgt aagtacaacc aaaggatttg cctcagcact tgtcccaaaa gtagtgacac 5580
aggtcggttc cgtgatagaa gagcttgaca cctcgtactg tatagagacc gatttggatc 5640
tatattgtac aagaatagtg acattcccta tgtctcctgg tatttattcc tgtttgagtg 5700
gcaatacatc tgcttgcatg tactcaaaga ctgaaggcgc actcactacg ccgtatatga 5760
ccctcaaagg ctcagttatt gctaactgta agatgacaac atgtagatgt gcagaccccc 5820
cgggtatcat atcgcaaaat tatggagaag ctgtgtctct aatagatagg caatcatgca 5880
atatcttatc cttagacggg ataactttga ggctcagtgg ggaatttgat gcaacttatc 5940
aaaagaatat ctcaatacaa gattctcaag taatagtgac aggcaatctt gatatctcga 6000
ctgagcttgg gaatgtcaac aactcgataa gtaatgcttt ggataagtta gaggaaagca 6060
acagcaaact agataaggtc aatgtcaaac tgaccagcac atccgctctt attacctata 6120
tcgttttaac tgtcatatct cttgtatgtg gtatacttag cctggttcta gcatgctacc 6180
tgatgtacaa gcaaaaggcg caacagaaga ccttgttgtg gcttgggaat aataccctag 6240
accagatgag ggccactaca aaaatgtgaa tgcggatgag aggcagaaac atccccaata 6300
gcagtttgtg tgtaaagtct gacagcctgt taattagaag aattaagaaa aaactaccgg 6360
atgtagatga ccaaagggcg atatacgggt agaacggtcg gggaggccgt ccctcaatcg 6420
ggagccgggc ctcacaacat ccgttctacc gcatcaccaa tagcagtttt cagtcatgga 6480
ccgcgcagtt agccaagttg cgctagagaa tgatgaaaga gaggcaaaga atacatggcg 6540
cttggtattc cggatcgcaa tcctactctc aacggtggtg accttagcca tctctgcagc 6600
cgcccttgca tatagcatgg aggccagcac acctagcgat cttgtaggca taccgactgc 6660
gatctctaga gcagaggaaa agattacatc tgcactcggt tccaatcaag atgtagtaga 6720
taggatatat aagcaggtgg ccctcgaatc tccactggca ttgctaaaca ccgaatctac 6780
aattatgaac gcaataacgt ctctctctta tcgaatcaat ggggccgcaa atagcagcgg 6840
atgtggagca cccattcatg atccagatta tattggagga ataggtaaag aacttattgt 6900
agatgatgct agcgacgtca catcatacta tccctctgcg ttccaagaac acctgaactt 6960
tatcccggcg cctactacag gatcaggttg cactcggata ccctcatttg acatgagcgc 7020
tacccactac tgttatactc acaatgtgat attatctggc tgcagagatc actcgcactc 7080
acatcaatat ttagcacttg gtgtgcttcg gacatctgca acagggaggg tattcttttc 7140
cactctgcgt tccatcaatc tggatgacac ccaaaatcgg aagtcttgca gtgtgagtgc 7200
aacccccttg ggttgtgata tgctgtgctc taaagtcaca gagactgaag aagaggatta 7260
taactcagct atccccacgt cgatggtaca tggaaggtta gggttcgacg gccaatacca 7320
cgagaaggac ctagatgtca caacactatt cgaggactgg gtggcaaact acccaggagt 7380
agggggcggg tcttttattg acaaccgcgt atggttccca gtttacggag ggctaaaacc 7440
caattcgccc agtgacaccg cacaagaagg gaaatatgta atatacaagc gatacaatga 7500
cacatgtcca gatgagcaag attatcagat tcaaatggct aagtcttcat ataagcctgg 7560
gcggtttgga gggaaacgcg tacagcaggc catcttatct atcaaagtgt caacatcctt 7620
gggcgaggac ccggtactga ctgtaccgcc caacacagta acactcatgg gggccgaagg 7680
cagagttctc acagtaggga catctcattt cctttatcag cgagggtcat catacttctc 7740
ccctgcccta ctatatccta tgatagtcag caacaaaaca gccactcttc atagtcctta 7800
tacattcaat gccttcactc gaccaggtag tgtcccttgc caggcttcag caagatgccc 7860
taactcatgt gttaccggag tctatactga tccatatccc ttggtcttct ataggaacca 7920
caccttgcga ggggtattcg ggacgatgct tgatgataaa caagcaagac tcaaccctgt 7980
atctgcagta tttgacagca tatcccgcag tcgcataacc cgggtgagtt caagcagcac 8040
caaggcagca tacacaacat caacatgttt taaagttgta aagaccaata aaacctattg 8100
tctcagcatt gccgaaatat ccaataccct cttcggggaa ttcagaatcg tccctttact 8160
agttgagatt ctcaaggatg atggggttag agaagccagg tctagccggt tgagtcaact 8220
gcgagagggt tggaaagatg acattgtatc acctatcttt tgcgacgcca agaatcaaac 8280
tgaataccgg cgcgagctcg agtcctacgc tgccagttgg ccataatcag ctagtgctaa 8340
tgtgattaga ttaagtcttg tcggtagtca cttgattaag aaaaaatgtg ggtggtagcg 8400
ggatataagg caaaacaact caaggaggat agcacgggta ggacatggcg agctccggtc 8460
ccgagagggc ggagcatcag attatcctac cagagtcaca cctgtcttca ccattagtca 8520
agcacaaact actctattac tggaaattaa ctgggctacc actccctgac gagtgtgact 8580
tcgaccacct cattctcagc cgacaatgga agaaaatact tgaatcggcc tcccctgaca 8640
ctgagagaat gataaaactt ggaagggcag tgcaccagac tctcaaccac aattccaaga 8700
taaccggagt actccatccc aggtgtttag aagaattggc tagtattgag gttcctgact 8760
caaccaacaa gtttcggaag atcgagaaga aaatccaaat tcacaacaca aggtatggag 8820
aactgttcac aagactgtgc acgcatgtag agaagaaatt gttgggatca tcttggtcta 8880
ataatgtccc ccggtcagaa gagttcaaca gcatccgtac agatccggca ttctggtttc 8940
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tgattgtggc agcaagaaca aggtccgcag ccaacaaatt ggtgacgctg acccataagg 9060
taggccaagt ctttgttact cctgagcttg tcattgtgac acatacagat gagaacaagt 9120
tcacgtgtct tacccaggaa cttgtgttga tgtatgcaga tatgatggag ggcagagata 9180
tggtcaacat aatatcatcc acggcggcac atctcaggag cctatcagag aaaattgatg 9240
acattctgcg gttagtagat gccctggcaa aagatctggg taatcaagtc tacgatgttg 9300
tagcactcat ggagggattt gcatacggcg ccgtccagct gcttgagccg tcaggtacat 9360
tcgcagggga tttcttcgca ttcaacctgc aggagctcaa agacactttg atcggcctcc 9420
ttcctaagga tatagcagaa tctgtgactc acgcaatagc cactgtattc tctggcttag 9480
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ttgatatgat cctccaggta ttgtctttct ttaaaggaac aatcatcaac ggatacagaa 9660
agaagaatgc aggtgtttgg ccacgtgtca aagtagatac gatatacggg aaggtcattg 9720
ggcagctaca cgctgattca gcggagattt cacacgatat catgttgaga gagtacaaga 9780
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tcttgataga gttcttagag tcaaatgatt ttgatccata taaggagatg gaatatctga 10020
cgacccttga gtacctaaga gatgacaatg tggcagtatc atactcgctc aaggagaagg 10080
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tgatggcgga agggatctta gctgaccaga ttgcaccttt ctttcaaggg aatggggtca 10200
ttcaggatag catatcttta accaagagta tgctagcgat gagtcaattg tctttcaaca 10260
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atgacatata tattgtcagt gctagagggg gtattgaggg attatgtcag aagctatgga 10620
caatgatctc aattgctgca atccaacttg ctgcagcaag atcacattgt cgcgtcgcct 10680
gtatggtaca gggtgacaat caagtaatag ctgtaacgag agaggtaagg tcagatgact 10740
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ttcatgttaa tcatttgatt ggccataatt tgaaggatcg tgaaacaatc agatcagaca 10860
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cactcttccc gatgacgaca accaggacat acgatgagat cacattgcac ctccacagta 12480
aatttagctg ctgtatcagg gaagcaccgg ttgcagttcc tttcgagtta ctcgggatgg 12540
caccagaact aaggacagtg acctcaaata agtttatgta tgatcctagt cctgtatcgg 12600
agggtgactt tgcgagactt gacttagcta tctttaagag ttatgagctt aatctagaat 12660
catatcccac aatagagcta atgaacattc tttcaatatc cagcgggaag ttaatcggcc 12720
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acaacacccg gaattggatc agcgaagctc agaattcaga tgtggtccgc ctattcgagt 12840
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tgtcttagaa aaaagttgcg cgtaattgtt cttgaatgta gtcttgtcat tcaccaaatc 15240
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<210> 25
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<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> highly pathogenic avian influenza sequence - multiple basic amino
acids
<400> 25
Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg
1 5
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<211> 4
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> low pathogenic avian influenza sequence
<400> 26
Arg Glu Thr Arg
1
Claims (25)
- (i) 유전자조작된 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV) 벡터 및
(ii) 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체
를 포함하는, 조류 독감을 예방 또는 치료하기 위한 조성물로서,
상기 유전자조작된 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV) 벡터가 SEQ ID NO:1 에 언급된 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO:1 에 언급된 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
상기 유전자조작된 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV) 벡터가 조류 독감 적혈구 응집소 (HA) 항원을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 상기 적혈구 응집소 (HA) 항원이 SEQ ID NO:15, 17, 19, 21 또는 23 에 언급된 서열로 이루어진 것인 조성물. - 제 1 항에 있어서, 조류 독감 적혈구 응집소 (HA) 항원이 H5 적혈구 응집소 (HA) 폴리펩티드인 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:14, 16, 18, 20, 또는 22 에 언급된 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 조성물.
- 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV) 게놈의 비-필수 영역 내의 단리된 폴리뉴클레오티드를 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV) 게놈 내에 도입하는 것을 포함하는, 유전자조작된 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV) 벡터를 제조하기 위한 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV) 의 게놈의 개질 방법으로서,
상기 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV) 가 SEQ ID NO:1 에 언급된 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO:1 에 언급된 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
상기 비-필수 영역이 뉴클레오캡시드 단백질 (NP) 유전자 업스트림, 조류 파라믹소바이러스 (APMV) 게놈의 2 개의 유전자 사이, 및 L 유전자의 다운스트림에 위치한 미번역 영역으로 이루어지는 영역으로부터 선택되는 방법. - 제 4 항에 있어서, 비-필수 영역이 P 와 M 유전자 사이 또는 M 과 F 유전자 사이에 위치하는 방법.
- 하나 이상의 항원을 발현하는 유전자조작된 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV) 벡터 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 비히클을 조류에게 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 조류 병원균에 대항하여 조류에서 보호 반응을 도출하거나 조류를 백신접종시키는 방법으로서,
상기 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV) 벡터가 SEQ ID NO:1 에 언급된 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO:1 에 언급된 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법. - 제 6 항에 있어서, 항원이 조류 독감 항원인 방법.
- 제 7 항에 있어서, 조류 독감 항원이 적혈구응집소 (HA) 인 방법.
- 제 8 항에 있어서, 조류 적혈구응집소 (HA) 항원이 SEQ ID NO:15, 17, 19, 21 또는 23 에 언급된 서열로 이루어진 것인 방법.
- 제 6 항에 있어서, 투여가 점안액, 스프레이, 식수, 알 내, 근육내 또는 피하 투여에 의해 이루어지는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 투여가 프라임-부스트인 방법.
- 제 11 항에 있어서, 프라임-부스트가 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물의 프라임-투여, 및 생체 내에서 조류 병원균 항원을 함유하고 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 조류 병원균 항원을 포함하는 비활성화된 바이러스 백신, 또는 조류 병원균 항원을 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 조류 병원균 항원을 함유하거나 발현하는 DNA 플라스미드 백신 또는 조성물의 부스트-투여를 포함하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 프라임-부스트가 생체 내에서 조류 병원균 항원을 함유하고 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 조류 병원균 항원을 포함하는 비활성화된 바이러스 백신, 또는 조류 병원균 항원을 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 조류 병원균 항원을 함유하거나 발현하는 DNA 플라스미드 백신 또는 조성물의 프라임-투여, 및 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물의 부스트-투여를 포함하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 프라임-부스트가 생체 내에서 조류 병원균 항원을 함유하고 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 조류 병원균 항원을 포함하는 비활성화된 바이러스 백신, 또는 조류 병원균 항원을 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 조류 병원균 항원을 함유하거나 발현하는 DNA 플라스미드 백신 또는 조성물의 프라임-투여, 및 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물의 부스트-투여를 포함하는 방법으로서,
상기 프라임-투여가 조류 독감 항원을 함유하고 발현하는 폭스바이러스를 포함하는 조성물을 포함하고, 부스트-투여가 조류 독감 항원을 포함하는 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 방법. - 제 11 항에 있어서, 프라임-부스트가 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물의 프라임-투여 및 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물의 부스트-투여를 포함하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 조류가 닭 또는 오리인 방법.
- SEQ ID NO:1 에 언급된 서열과 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO:1 에 언급된 서열과 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자조작된 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV) 벡터.
- SEQ ID NO:1 로 나타내는 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO:1 로 나타내는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드와 서열 일치성을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- a) SEQ ID NO:2 로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) SEQ ID NO:3 으로 나타내는 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
c) 상기 a) 또는 b) 의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드
로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 폴리뉴클레오티드. - a) SEQ ID NO:4 로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) SEQ ID NO:5 로 나타내는 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
c) 상기 a) 또는 b) 의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드
로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 폴리뉴클레오티드. - a) SEQ ID NO:6 으로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) SEQ ID NO:7 로 나타내는 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
c) 상기 a) 또는 b) 의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드
로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 폴리뉴클레오티드. - a) SEQ ID NO:8 로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) SEQ ID NO:9 로 나타내는 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
c) 상기 a) 또는 b) 의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드
로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 폴리뉴클레오티드. - a) SEQ ID NO:10 으로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) SEQ ID NO:11 로 나타내는 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
c) 상기 a) 또는 b) 의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드
로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 폴리뉴클레오티드. - a) SEQ ID NO:12 로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) SEQ ID NO:13 으로 나타내는 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
c) 상기 a) 또는 b) 의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드
로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 폴리뉴클레오티드. - SEQ ID NO:24 로 나타내는 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO:24 로 나타내는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드와 서열 일치성을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드.
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