JP2006528647A - 新規ワクチン製剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、細菌懸濁液又はウイルス懸濁液、特に濃縮したもの及び未精製若しくは少し精製したものの存在下で安定性の高い新規な水中油(O/W)型エマルジョンを提供する。本発明のエマルジョンは、少なくも1種の免疫原、具体的には、不活性化した病原体、弱毒化した病原体、サブユニット、組換え発現ベクター、及びプラスミド、又はその組合せを含む群から選択される免疫原を含む薬剤組成物を送達するための媒体の役割を果たすことができる。一実施形態では、本発明は、(1)不活性化したマイコプラズマハイオニューモニエ細菌、不活性化したブタサーコウイルス2型(PCV−2)ウイルス、又はその組合せを含む群から選択される免疫原を含有する水溶液と、(2)鉱油と、(3)非イオン性親油性界面活性剤と、(4)エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステルを含むHLB値の低い非イオン性親水性界面活性剤(通常、11〜13のHLB値を有する)とを含む、注射可能な水中油(O/W)型エマルジョンを提供する。
【選択図】図4
【選択図】図4
Description
本出願は、その内容の全体を参照により組み込む、2003年7月24日出願の米国特許仮出願第60/490345号に対して優先権を主張する。
本発明は、水中油型エマルジョン、アジュバントとしてのその使用、及びそれを含む薬剤組成物、免疫組成物、又はワクチン組成物に関する。
ワクチンにおけるアジュバントの使用は公知である。アジュバントとは、ワクチン抗原と併用されると、ワクチン抗原のみによって誘導される応答と比べて、ワクチン抗原に対する免疫応答を高める化合物である。抗原免疫原性を促進する戦略の中には、ワクチン抗原を粒子状にするもの、ワクチン抗原を重合させ又は乳化するもの、ワクチン抗原を封入する方法、宿主の生得的サイトカイン応答を高める方法、及び抗原提示細胞をワクチン抗原の標的にする方法がある(Nossal, 1999, In: Fundamental Immunology. Paul (Ed.), Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa.; Vogel and Powell, 1995, In: Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. Powell and Newman (Eds.), Plenum Press, NY, N.Y. p. 141)。アジュバントがワクチン抗原の免疫原性を改善するうえで果たす役割は極めて重要であるため、ワクチンを調合する際のアジュバントの使用は、ほぼいたるところで行われている(上述のNossal, 1999;上述のVogel and Powell, 1995;国際公開第97/18837号も参照のこと。これらの教示は、参照により本明細書に組み込む)。当技術分野で公知の従来のアジュバントは、性質が多様である。例えば、これらは、水不溶性の無機塩、リポソーム、ミセル又はエマルジョンからなるもの、即ちフロイントのアジュバントでよい。上述のVogel and Powell, 1995で、他のアジュバントを見つけることができる。アジュバントの作用に単一の機序はないが、本質的な特質は、ワクチン抗原のみによって誘導される応答と比べて、ワクチン抗原に対する免疫応答を有意に高める能力である(上述のNossal, 1999;上述のVogel and Powell, 1995)。この点に関して、体液性免疫応答を高めるのにより有効なアジュバントもあれば、細胞性免疫応答を高めるのにより有効なアジュバントもあり(上述のVogel and Powell, 1995)、さらに別のグループのアジュバントは、ワクチン抗原に対する体液性免疫応答も細胞性免疫応答も高める(上述のVogel and Powell, 1995)。
一般に、ワクチン製剤で使用されるエマルジョンは、油、水溶液、及び界面活性剤の混合物を含む。一部のエマルジョンは、「Span 80(登録商標)」などの親油性界面活性剤、及び「Tween 80(登録商標)」などの親水性界面活性剤を組み込む。これらのエマルジョンは、イオン性界面活性剤の特性を有することが知られているレシチンやサポニンなどの化合物を含んでもよい。
しかし、ワクチンアジュバントとして使用されるエマルジョンに関して、特に保管又は輸送中の安定性の問題が認められている。この問題は、これらの組成物が、濃縮した免疫原、特に未精製の濃縮した免疫原を含有しているとき、特に当てはまる。一般に、これは、不活性化ワクチン(死菌ワクチン)で使用されるアジュバントで起こることである。この問題は、多価ワクチン組成物では、同体積の希釈液における免疫原の濃度がより高いため、さらに著しい。
アジュバント使用に関する別の問題は、毒性や注射部位の局所的炎症などの有害事象の危険性に関係している。例えば、局所的な炎症反応及び/又は肉芽腫が、注射後に生じることがある。このような有害反応を制限するために、エマルジョン中の界面活性剤及び他の成分を減らしてよいが、その場合、減量により、ワクチン組成物の安定性が低下することがある。したがって、新規なアジュバント、並びに安全性及び安定性の高いこのようなアジュバントを含有するワクチン組成物が必要とされている。
米国特許仮出願第60/490345号
国際公開第97/18837号
Nossal, 1999, In: Fundamental Immunology. Paul (Ed.), Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa.
Vogel and Powell, 1995, In: Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. Powell and Newman (Eds.), Plenum Press, NY, N.Y. p. 141
第1の実施形態では、本発明は、細菌懸濁液又はウイルス懸濁液、特に濃縮したもの及び未精製若しくは少し精製したものの存在下で安定性の高い新規な水中油(O/W)(oil in water)型エマルジョンを提供する。
本発明の別の実施形態では、より具体的には免疫原でよい少なくとも1種の有効成分を含む薬剤組成物を送達するための媒体の役割を果たす、安定で、安全で、且つ容易に投与可能な、具体的には注射可能な、O/W型エマルジョンを提供する。
本発明のさらに別の実施形態は、免疫原によって誘導される免疫応答を高めるためのアジュバントの役割を果たす、安定で、安全で、且つ注射可能なO/W型エマルジョンを提供する。具体的には、本発明は、免疫原を含有するワクチン組成物中で使用すると、免疫原に対するワクチン接種者の細胞性免疫応答、体液性免疫応答、又は好ましくはその双方を高める、新規なアジュバントを提供する。
本発明のさらに別の実施形態では、O/W型エマルジョンを含む、安定で、安全で、且つ免疫原性の組成物又はワクチンを提供する。
本発明の別の実施形態では、本発明のアジュバントを用いてワクチン組成物を作製する方法、そうして得られたワクチン組成物、及びそれを使用する方法を提供する。
本発明のさらに別の実施形態では、第1のバイアル中の免疫原又は他の医薬品と、第2のバイアル中の本発明に従って作製したアジュバントとを備える、使用前にこのアジュバントを免疫原又は他のワクチン製品と混合するように設計したキットを提供する。
好ましい一実施形態では、本発明は、
(1)免疫原を含有する水溶液と、
(2)鉱油と、
(3)非イオン性親油性界面活性剤と、
(4)エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステルを含むHLB値の低い非イオン性親水性界面活性剤(通常、11〜13のHLB値を有する)とを含む、
注射可能な水中油(O/W)型エマルジョンを提供する。
(1)免疫原を含有する水溶液と、
(2)鉱油と、
(3)非イオン性親油性界面活性剤と、
(4)エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステルを含むHLB値の低い非イオン性親水性界面活性剤(通常、11〜13のHLB値を有する)とを含む、
注射可能な水中油(O/W)型エマルジョンを提供する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、
(1)免疫原を含有する水溶液と、
(2)親水性−親油性バランス(HLB)(hydrophilic-lipophilic balance)値が高く、HLB値が13より大きく40より小さく、特にHLB≧13.5、好ましくはHLB≧14である、非イオン性親水性界面活性剤と、
(3)鉱油と、
(4)非イオン性親油性界面活性剤と、
(5)HLB値の低い非イオン性親水性界面活性剤(約9〜13のHLB値)とを含む、注射可能な水中油(O/W)型エマルジョンを提供する。
(1)免疫原を含有する水溶液と、
(2)親水性−親油性バランス(HLB)(hydrophilic-lipophilic balance)値が高く、HLB値が13より大きく40より小さく、特にHLB≧13.5、好ましくはHLB≧14である、非イオン性親水性界面活性剤と、
(3)鉱油と、
(4)非イオン性親油性界面活性剤と、
(5)HLB値の低い非イオン性親水性界面活性剤(約9〜13のHLB値)とを含む、注射可能な水中油(O/W)型エマルジョンを提供する。
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ワクチン接種者中で免疫応答を引き出すのに適した少なくとも1種の免疫原を含有する新規なエマルジョンを含むワクチン組成物を提供する。本発明は、そのエマルジョンが、免疫原によって誘導される免疫応答を高めるための、具体的には細胞性応答、体液性応答、又は好ましくはその双方を高めるためのアジュバントの役割を果たす、このような組成物をさらに提供する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、免疫原、特に、凍結乾燥した形態の又は水溶液に溶かした免疫原が本発明によるアジュバントと混合されたワクチン組成物を作製する方法を提供する。この免疫原は、プラスミドなどを含めて、不活性化した病原体、弱毒化した病原体、サブユニット抗原、組換え発現ベクターからなる群から選択してよい。この病原体は、起源が細菌でも、ウイルスでも、原生動物でも、真菌でもよく、又は、免疫原は、抗毒素であってもよい。
別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のワクチン組成物をワクチン接種者に投与するステップを含む、ワクチン接種者中で病原体に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも2つのバイアルと、第1のバイアル中の免疫原、特に凍結乾燥した形態の又は水性媒体の溶液に溶かした免疫原と、第2のバイアル中の本発明によるアジュバント又はエマルジョンとを含む、キットを提供する。
本開示内容及び特に特許請求の範囲では、「comprises(含む)」「comprised」「comprising」などの用語は、米国特許法においてこれらの用語に帰されている意味を有することができ、例えば、これらは、「includes(含む)」、「included」、「including」などを意味することができること、また、「consisting essentially of(から本質的になる)」や「consists essentially of」などの用語は、米国特許法によりこれらの用語に認められている意味を有し、例えば、これらは、明示的に列挙されていない要素を考慮しているが、従来技術中に存在する要素又は本発明の基本的若しくは新規な特徴に影響を及ぼす要素は除外することに留意されたい。
これら及び他の実施形態は、以下の詳細な説明により開示され、又はそれらから明らかになり、また、それらに包含される。
その最良の形態を含めて、当業者に対する本発明の完全な開示及び実施可能な程度の開示を、本明細書の残りの部分で、添付の図面の参照を含めてより具体的に説明する。
本発明の他の目的、特徴、及び態様は、以下の詳細な説明において開示され、又はそれから明らかになる。本考察は、例示的な実施形態の説明に過ぎず、本発明の広範な態様を限定するためのものではなく、その広範な態様は例示的な構成の中に包含されていることを、当業者は理解すべきである。実際に、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、様々な変更及び改変を本発明で行えることが、当業者には明らかであろう。例えば、一実施形態の一環として例示又は説明した特徴を別の実施形態で使用して、さらに別の実施形態を生じることができる。本発明は、添付の特許請求の範囲内で生じるこのような変更例及び改変例並びにその均等物を包含するものとして意図されている。本出願全体を通じて引用したすべての参考文献、公開特許、及び特許の内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
便宜上、明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲中で使用するいくつかの用語を以下にまとめる。
本明細書では、「動物」という用語は、ヒトを含めてすべての脊椎動物を含む。また、この用語は、胚段階及び胎児段階を含めて、発生の全段階における動物個体も含む。具体的には、「脊椎動物」という用語には、それだけには限らないが、ヒト、イヌ科の動物(例えばイヌ)、ネコ科の動物(例えばネコ)、ウマ科の動物(例えばウマ)、ウシ亜科の動物(例えばウシ)、ブタ系の動物(例えばブタ)、並びにトリが含まれる。本明細書では「トリ」という用語には、それだけには限らないが、中でも、ニワトリ(種畜、食肉用若鶏、及び産卵鶏)、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、並びにダチョウ、エミュー、及びヒクイドリを含めた平胸類など分類階級の任意の種又は亜種を意味する。
本明細書では、「ブタ」又は「子ブタ」という用語は、ブタに由来する動物を意味し、「雌ブタ」とは、生殖可能年齢であり生殖能力のある雌を意味する。
本明細書では、「毒性の」という用語は、動物宿主に感染する能力を保持した単離物を意味する。
本明細書では、「不活性化ワクチン」という用語は、もはや複製も増殖もできない感染性の生物又は病原体を含有するワクチン組成物を意味する。この病原体は、起源が細菌でも、ウイルスでも、原生動物でも、真菌でもよい。凍結融解、化学処理(例えば、チメロサール又はホルマリンによる処理)、音波処理、放射線、熱、又は、生物の免疫原性を維持しつつ、その複製若しくは増殖を防止することができる従来手段を含めて、様々な方法によって不活性化を行うことができる。
本明細書では、「免疫原性」という用語は、宿主動物中で1種又は複数の抗原に対する免疫応答を起こすことができる能力を意味する。この免疫応答は、ワクチンによって誘発される、特定の感染性生物に対する防御免疫の基礎を形成するものである。
本明細書では、「免疫応答」という用語は、動物で誘発される応答を意味する。免疫応答とは、細胞性免疫(CMI)(cellular immunity)を指しても、体液性免疫を指してもよく、或いは、その双方を含んでもよい。本発明は、免疫系の一部分に限定された応答も企図する。例えば、本発明のワクチン組成物は、特異的に、高いγインターフェロン応答を誘導することができる。
本明細書では、「抗原」又は「免疫原」という用語は、宿主動物中で特異的な免疫応答を誘導する物質を意味する。この抗原は、殺した、弱毒化した、又は生きた生物の全体、ある生物のサブユニット又は一部分、免疫原性の特質を有する挿入物を含む組換えベクター、宿主に与えると免疫応答を誘導できるDNAの一片又は断片、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン、或いは任意のそれらの組合せを含んでよい。或いは、この免疫原又は抗原は、毒素又は抗毒素を含んでもよい。
本明細書では、「多価」という用語は、同一種(即ち、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ(Mycoplasma hyopneumonia)の異なる分離株)又は異なる種(即ち、パスツレラヘモリティカ(Pasteurella hemolytica)及びパスツレラマルトシダ(Pasteurella multocida)の双方から得た分離株)から得た複数の抗原を含有しているワクチン、或いは、異なる属から得た抗原の組合せを含有しているワクチン(例えば、パスツレラマルトシダ、サルモネラ、大腸菌、ヘモフィルスソムナス(Haemophilus somnus)、及びクロストリジウムから得た抗原を含むワクチン)を意味する。
本明細書では、「アジュバント」という用語は、ワクチンの免疫原性を高めるためにワクチンに加えられる物質を意味する。アジュバントがどのように機能するかという機序は、完全には分かっていない。一部のアジュバントは、ゆっくりと抗原を放出することによって免疫応答を高めていると考えられているのに対し、他のアジュバントは、それ自体に強い免疫原性があり、相乗的に機能すると考えられている。既知のワクチンアジュバントには、それだけには限らないが、油及び水のエマルジョン(例えば、フロイントの完全アジュバント及びフロイントの不完全アジュバント)、コリネバクテリウムパルブム(Corynebacterium parvum)、カルメットゲラン菌(Bacillus Calmette Guerin)、水酸化アルミニウム、グルカン、硫酸デキストラン、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、バクトアジュバント(Bacto-Adjuvant)、ポリアミノ酸やアミノ酸のコポリマーなどいくつかの合成ポリマー、サポニン、「REGRESSIN」(Vetrepharm社製、アセンス(Athens)、ジョージア州)、「AVRIDINE」(N,N−ジオクタデシル−N’,N’−ビス(2−ヒドロキシエチル)−プロパンジアミン)、パラフィン油、ムラミルジペプチドなどが含まれる。
本明細書では、「製薬上許容される担体」及び「製薬上許容される媒体」という用語は交換可能であり、有害事象を起こさずに宿主中に注入することができる、ワクチン抗原を含有するための液体媒体を指す。当技術分野で既知の適切な製薬上許容される担体には、それだけには限らないが、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース、又は緩衝液が含まれる。担体は、それだけには限らないが、希釈剤、安定化剤(即ち、糖及びアミノ酸)、保存剤、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、増粘添加剤、着色剤などを含めて、補助剤を含んでよい。
本明細書では、「ワクチン組成物」という用語は、宿主中で免疫応答を誘導するのに有用な製薬上許容される媒体中の少なくとも1種の抗原又は免疫原を含む。ワクチン組成物は、医薬分野又は獣医学分野の当業者には公知の用量及び技法により、レシピエント動物の齢、性別、体重、種、及び状態などの因子並びに投与経路を考慮して、投与することができる。投与経路は、粘膜投与(例えば、口、鼻、肛門、膣)、又は非経口経路(皮内、筋肉内、皮下、静脈内、又は腹腔内)による経皮的なものでよい。ワクチン組成物は、単独で投与することができ、或いは、他の治療又は療法と合わせて同時投与又は順次投与することもできる。投与形態には、懸濁剤、シロップ又はエリキシル剤、及び滅菌した懸濁液やエマルジョンなど非経口投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、又は静脈内投与(例えば、注射投与)用の調製物が含まれてよい。ワクチン組成物は、スプレーとして又は食品及び/若しくは水に混合して投与しても、滅菌水、生理食塩水、グルコースなど適切な担体、希釈剤、又は賦形剤と混合して送達してもよい。この組成物は、投与経路及び所望の調製物に応じて、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤、アジュバント、ゲル化剤又は増粘添加剤、保存剤、矯味剤、着色剤などの補助物質を含有してよい。過度に実験をすることなく、適切な調製物を調製するために、"Remington's Pharmaceutical Sciences," 1990など標準的な製薬の教科書を参考にすることができる。
本発明は、
(1)宿主中で免疫応答を誘導することができるワクチン抗原又は免疫原を含有する水溶液、
(2)親水性−親油性バランス(HLB)値が13より大きく40より小さい(HLB>13、特にHLB≧13.5、好ましくはHLB≧14)非イオン性親水性界面活性剤、
(3)鉱油、
(4)非イオン性親油性界面活性剤、及び
(5)HLB値の低い非イオン性親水性界面活性剤(9〜13のHLB値)を含む、
新規な水中油(O/W)型アジュバント又はエマルジョンを提供する。
(1)宿主中で免疫応答を誘導することができるワクチン抗原又は免疫原を含有する水溶液、
(2)親水性−親油性バランス(HLB)値が13より大きく40より小さい(HLB>13、特にHLB≧13.5、好ましくはHLB≧14)非イオン性親水性界面活性剤、
(3)鉱油、
(4)非イオン性親油性界面活性剤、及び
(5)HLB値の低い非イオン性親水性界面活性剤(9〜13のHLB値)を含む、
新規な水中油(O/W)型アジュバント又はエマルジョンを提供する。
本発明に従って作製するエマルジョンは、界面活性剤の3種の異なるグループのメンバーから選択される少なくとも3種の界面活性剤の組合せをベースとしており、各グループに付属する1種又は複数の界面活性剤を使用することが可能である。
好ましい実施形態では、エマルジョン(本明細書では、これは、別段の定めがない限り、全成分を含む最終のエマルジョンを意味する)中の非イオン性親水性界面活性剤(5)の濃度は、エマルジョンの単位体積当たりの重量百分率((w/v))として表して、1%〜8%、特に1.5%〜6%、好ましくは2%〜5%、より好ましくは2.5%〜4%である。
このグループの界面活性剤は、HLB値の低い非イオン性親水性界面活性剤(9〜13のHLB値)を含む。このグループには、それだけには限らないが、エトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステル(特に5個のエトキシル基)(例えば「Tween 81(登録商標)」などのエトキシ化ソルビタンモノオレエート)、エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステル、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステル(特に20個のエトキシル基)(例えば、「Tween 85(登録商標)」などのエトキシ化ソルビタントリオレエート)、「Tween 65(登録商標)」などのエトキシ化ソルビタントリステアレート、エトキシ化脂肪アルコール(特に5〜10個のエトキシル基)(例えば、「Brij 76(登録商標)」、「Brij 56(登録商標)」、「Brij 96(登録商標)」)、エトキシ化脂肪酸(特に5〜10個のエトキシル基)(例えば、「Simulsol 2599(登録商標)」、「Myrj 45(登録商標)」)、エトキシ化ヒマシ油(特に25〜35個のエトキシル基)(例えば、「Arlatone 650(登録商標)」、「Arlatone G(登録商標)」)、及びそれらの組合せが含まれる。
エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステル及びエトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステルが好ましく、これら両方の種類の組合せも同様に好ましい。脂肪酸は、オレエート、パルミテート、ステアレート、イソステアレート、ラウレート、及びそれらの組合せからなる群から選択されることが好ましい。好ましいエトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステルは、「Tween85(登録商標)」などのエトキシ化ソルビタントリオレエート、又は「Tween65(登録商標)」などのエトキシ化ソルビタントリステアレートを含む。
好ましい実施形態では、非イオン性親水性界面活性剤(2)の濃度は、エマルジョンの単位体積当たりの重量百分率((w/v))として表して、一般に、0.1%〜1.5%、特に0.2%〜1.4%、好ましくは0.3%〜1.3%、より好ましくは0.4%〜1.2%である。
この第2の界面活性剤のグループは、親水性−親油性バランス(HLB)値の高い(HLB>13、特にHLB≧13.5、好ましくはHLB≧14)非イオン性親水性界面活性剤を含む。このグループは、エトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステル(特に20個のエトキシル基)(例えば、「Tween 20(登録商標)」などのエトキシ化ソルビタンモノラウレート、「Tween 40(登録商標)」などのエトキシ化ソルビタンモノパルミテート、「Tween 60(登録商標)」などのエトキシ化ソルビタンモノステアレート、「Tween 80(登録商標)」などのエトキシ化ソルビタンモノオレエート)、エトキシ化脂肪アルコール(特に15〜30個のエトキシル基)(例えば、「Brij 78(登録商標)」、「Brij 98(登録商標)」、「Brij 721(登録商標)」)、エトキシ化脂肪酸(特に15〜30個のエトキシル基)(例えば、「Myrj 49(登録商標)」、「Myrj 51(登録商標)」、「Myrj 52(登録商標)」、「Myrj 53(登録商標)」)、非イオン性ブロックコポリマー(例えば、「Lutrol F127(登録商標)」や「Lutrol F68(登録商標)」)などのポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレンコポリマー(POE−POP)(polyoxyehylene/polyoxypropylene copolymer)、及びそれらの組合せを含む。
非イオン性ブロックコポリマーの場合、比率はより低くてよく、具体的には0.1%〜0.5%、より具体的には0.2%〜0.4%(エマルジョンの単位体積当たりの重量((w/v)))でよい。
好ましい界面活性剤(2)は、前述したもののような、エトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステルを含む。
好ましい実施形態では、非イオン性親油性界面活性剤(4)の濃度は、エマルジョンの単位体積当たりの重量百分率((w/v))として表して、0.1%〜2.5%、特に0.2%〜2%、好ましくは0.2%〜1.5%、より好ましくは0.2%〜1.2%である。
このグループの界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステル(例えば、「Span 20(登録商標)」のようなソルビタンモノラウレート、「Span 40(登録商標)」などのソルビタンモノパルミテート、「Span 60(登録商標)」などのソルビタンモノステアレート、「Span 65(登録商標)」などのソルビタントリステアレート、「Span 80(登録商標)」のようなソルビタンモノオレエート、「Span 85(登録商標)」のようなソルビタントリオレエート、「Arlacel 987(登録商標)」などのソルビタンモノイソステアレート、「Crill 6(登録商標)」などのソルビタンイソステアレート)、マンニドの脂肪酸エステル(例えば、「Montanide 80(登録商標)」、モノオレイン酸マンニド(「Arlacel A(登録商標)」など)、ジオレイン酸マンニド、トリオレイン酸マンニド、テトラオレイン酸マンニド)、マンニドのエトキシ化脂肪酸エステル(2、3又は4個のエトキシル基)(例えば、「Montanide 888(登録商標)」、「Montanide 103(登録商標)」、エトキシ化モノオレイン酸マンニド、エトキシ化ジオレイン酸マンニド、エトキシ化トリオレイン酸マンニド、エトキシ化テトラオレイン酸マンニド)、及びそれらの組合せを含む。
脂肪酸は、オレエート、パルミテート、ステアレート、イソステアレート、ラウレート及びそれらの組合せからなる群から選択されることが好ましい。
好ましい界面活性剤(4)は、ソルビタン脂肪酸エステル、特に前述したもの、及びそれらの組合せを含む。
本発明の界面活性剤は、動物由来又は植物由来の脂肪酸を含んでよい。エマルジョンを調合する際にごくわずかに調整するだけで、ある由来元を別のものへ変更(例えば動物由来「Tween 80(登録商標)」を植物由来「Tween 80(登録商標)」に変更)できるはずである。
本発明によるエマルジョンは、エマルジョンの単位体積当たりの重量で、総濃度が1.2%〜10%、特に2%〜8%、好ましくは3%〜7%、より好ましくは4%〜6%の界面活性剤を含んでよい。
一般に、本発明によるエマルジョンは、33℃以上、具体的には33℃〜65℃の範囲、より具体的には36℃〜60℃、好ましくは37℃〜55℃、より好ましくは38℃〜50℃の転相温度(PIT)(phase inversion temperature)を有していてよい。
PITは、油中水型エマルジョンが水中油型エマルジョンに変化し、又は、相が変化する(エマルジョンの破壊及び2相の分離)温度である。PIT値は、例えば、視覚的外観によって(例えば、実施例2を参照のこと)又は導電率によってなど、様々な手段で測定することができる。エマルジョンのPITより低い温度、例えば約25℃で水浴中にエマルジョンを入れる。温度を徐々に上げる。エマルジョンの視覚的外観の変化、特に、流動性、粘性、2相の分離、表面に油相が移動することにより起こる表面の外観の変化を対照のエマルジョンと比べて観察する。視覚的外観の変化が観察された温度が、エマルジョンのPIT値である。或いは、エマルジョンの表面近くに装着したプローブによる測定した導電率の値が、約5〜8ミリジーメンス/センチメートル(mS/cm)(水中油型エマルジョン)から約0mS/cmの値(油中水型エマルジョン)に急速に推移することから、PITを決定する。転移が観察された温度が、エマルジョンのPIT値である。当業者なら、本発明によるエマルジョン、具体的には上記に定義した範囲内のPIT値を有するエマルジョンを過度の実験をせずに調製するために、個々の濃度を含めて、界面活性剤及び油の組合せを決定することができるであろう。
本発明の特定の実施形態では、本明細書で説明するエマルジョンは、イオン性界面活性剤、又はレシチンやサポニンなどイオン性界面活性剤の性質を有することが分かっている化合物をまったく含まない。一般に、本発明によるエマルジョンは、エマルジョンの単位体積当たりの体積で、3%〜55%の油、特に5%〜50%の油、好ましくは10%〜40%の油、より好ましくは20%〜40%の油を含んでよい。別段の定めがない限り、本明細書の値の範囲は、常に範囲の境界を含むものと定義する。
使用する油は、それだけには限らないが、イソパラフィン油などのパラフィン油、及び/又はナフテン油、スクアラン、プリスタン、ポリイソブテン油、水素添加ポリイソブテン油、ポリデセン油、ポリイソプレン油、ポリイソプロペン油などを含めて、鉱油でよい。本発明で有用な1種の有利な鉱油には、15より多い、好ましくは15〜32個のいくつかの炭素原子を有する直鎖状又は分枝状の炭素鎖を含み、芳香族化合物を含まない油が含まれ得る。このような油は、例えば、「MARCOL 52(登録商標)」若しくは「MARCOL 82(登録商標)」(Esso社製、フランス)又は「DRAKEOL 6VR(登録商標)」(Penreco社製、米国)の名称で市販されているものでよい。
油は、本明細書で記述する油の中から選択される少なくとも2種の油を任意の比率で含む、油の混合物でもよい。この油の混合物は、前述の油の中から選択される少なくとも1種の油及び少なくとも1種の植物油を含んでよく、また、この植物油は、油相の約0.1%〜約33%、好ましくは約10%〜約25%(v/v)を占める。これらの植物油は、生分解性であり、好ましくは保管温度(約+4℃)で液体であり、又は、少なくともこの温度で液状のエマルジョンを生じることを可能にする、オレイン酸に富む不飽和油である。例えば、この植物油は、ラッカセイ油、ナッツ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ダイズ油、オナガー(onager)油などでよい。
好ましい実施形態では、親水性界面活性剤(2)及び(5)は、分子中に同じ親水性部分を有する界面活性剤を含むことが好ましい。例えば、親水性界面活性剤(2)及び(5)のそれぞれに対してエトキシ化ソルビタン脂肪酸エステルを使用する。例えば、「Tween 85(登録商標)」をHLB値の低い非イオン性親水性界面活性剤として選択する場合、HLB値の高い非イオン性親水性界面活性剤は、「Tween 80(登録商標)」などのエトキシ化ソルビタンで構成された親水性部分を有すると、有利である。
一般に、本発明は、それだけには限らないが、滅菌水、生理食塩水、グルコース、緩衝液などを含めて、獣医学的に又は製薬上許容される適切な媒体、賦形剤、又は希釈剤を含む水溶液の使用を企図する。媒体、賦形剤又は希釈剤は、ポリオール、糖質、又はpH緩衝剤を含んでもよい。媒体、賦形剤、又は希釈剤は、例えば、アミノ酸、ペプチド、抗酸化薬、殺菌薬、静菌性化合物を含んでもよい。この水溶液を油及び界面活性剤に十分量加えて、本発明によるエマルジョンの100%の体積を得る。
エマルジョンの親水性−親油性バランス(HLB)から、界面活性剤の親水力又は親油力を概算することが可能である。両親媒性分子のHLBは、一般に以下のように算出される。
HLB=(20×親水性部分の重量)/(両親媒性分子の重量)
HLB=(20×親水性部分の重量)/(両親媒性分子の重量)
HLBは、0(大半の親油性分子の場合)〜20(大半の親水性分子の場合)の範囲の値をとり得る。界面活性剤の化学組成(特に、例えばエトキシル基又はアルケンオキシドの添加)によって、この概算が変わることがあり、また、HLB値の範囲が大きくなることがある(例えば、「Lutrol F68(登録商標)」のHLBは29である)。界面活性剤の混合物に関しては、混合物のHLBは、重量比によって重み付けした、各界面活性剤のHLBの加算値である。
HLB={(界面活性剤XのHLB×界面活性剤Xの重量)+(界面活性剤YのHLB×界面活性剤Yの重量)}/(界面活性剤Xの重量+界面活性剤Yの重量)
HLB={(界面活性剤XのHLB×界面活性剤Xの重量)+(界面活性剤YのHLB×界面活性剤Yの重量)}/(界面活性剤Xの重量+界面活性剤Yの重量)
本発明に従って作製するエマルジョンの一実施形態では、エマルジョンの最終HLBは、約9〜約12、好ましくは約9.5〜約11.5、より好ましくは約10〜約11.5である。
本発明は、パラフィン油(具体的には、エマルジョンの単位体積当たりの体積(v/v)で表して、約10%〜約40%、好ましくは約20%〜約40%の濃度)、ソルビタン脂肪酸モノエステル(非イオン性親油性界面活性剤として)、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステル(HLB値の低い非イオン性親水性界面活性剤として)、及びエトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステル(HLB値の高い非イオン性親水性界面活性剤として)を含むエマルジョンを企図する。具体的には、このソルビタン脂肪酸モノエステルは、ソルビタンモノオレエート(具体的には、エマルジョンの単位体積当たりの重量((w/v))で表して、0.2〜1.5%、好ましくは0.2%〜1.2%の濃度)であり、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステルは、エトキシ化ソルビタントリオレエート(具体的には、2%〜5%、好ましくは2.5%〜4%の濃度(w/v))であり、エトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステルは、エトキシ化ソルビタンモノオレエート(具体的には、0.3%〜1.3%、好ましくは0.4%〜1.2%(w/v)の濃度)である。例えば、このエマルジョンは、エマルジョンの単位体積当たりの体積で約29.3%のパラフィン油と、エマルジョンの単位体積当たりの重量で0.6%のソルビタンモノオレエートと、エマルジョンの単位体積当たりの重量で3.4%のエトキシ化ソルビタントリオレエートと、エマルジョンの単位体積当たりの重量で0.75%のエトキシ化ソルビタンモノオレエートとを含む。
本発明による第2の実施形態では、エマルジョンは、パラフィン油(具体的には、10%〜40%、好ましくは20%〜40%(v/v)の濃度)、ソルビタン脂肪酸モノエステル(非イオン性親油性界面活性剤として)、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステル(HLB値の低い非イオン性親水性界面活性剤として)、及び非イオン性ブロックコポリマー(HLB値の高い非イオン性親水性界面活性剤として)を含む。具体的には、このソルビタン脂肪酸モノエステルは、ソルビタンモノオレエート(具体的には、0.2%〜1.5%、好ましくは0.2%〜1.2%(w/v)の濃度)であり、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステルは、エトキシ化ソルビタントリオレエート(具体的には、2%〜5%、好ましくは2.5%〜4%(w/v)の濃度)であり、非イオン性ブロックコポリマーは、ポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレンポリマー(POE−POP)(具体的には、0.1%〜0.5%、好ましくは0.2%〜0.4%(w/v)の濃度)である。例えば、このエマルジョンは、約29.3%(v/v)のパラフィン油と、0.6%(w/v)のソルビタンモノオレエートと、3.4%(w/v)のエトキシ化ソルビタントリオレエートと、0.25%(w/v)のエトキシ化ソルビタンモノオレエートとを含む。
特定の実施形態では、本発明は、
(1)薬物や免疫原などの活性成分、好ましくは免疫原を含有する水溶液と、
(2)鉱油と、
(3)非イオン性親油性界面活性剤と、
(4)エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステルからなるHLB値の低い非イオン性親水性界面活性剤(11〜13のHLB値を有することができる)とを含む、
注射可能な水中油(O/W)型エマルジョンを企図する。
(1)薬物や免疫原などの活性成分、好ましくは免疫原を含有する水溶液と、
(2)鉱油と、
(3)非イオン性親油性界面活性剤と、
(4)エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステルからなるHLB値の低い非イオン性親水性界面活性剤(11〜13のHLB値を有することができる)とを含む、
注射可能な水中油(O/W)型エマルジョンを企図する。
この実施形態によるエマルジョンは、最大20個のエトキシ基を含み得るエトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステルを含む。脂肪酸は、動物由来でも植物由来でもよく、オレエート、パルミテート、ステアレート、イソステアレート、ラウレート、及びそれらの組合せからなる群から選択され得る。一実施形態では、エトキシ化脂肪酸はオレエートであることが好ましい。他の成分、並びにPITなどエマルジョンの一般的特性は、前述のものと同じ特徴を有していてよい。
界面活性剤(4)は、エトキシ化ソルビタンジオレエート、エトキシ化ソルビタンジステアレート、又はエトキシ化ソルビタンジイソステアレート、エトキシ化ソルビタンジパルミテート、エトキシ化ソルビタンジラウレート、及びそれらの組合せなどのエトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステルを含むことが好ましい。
場合によっては、それだけには限らないが、ミョウバン;CpGオリゴヌクレオチド(ODN)(oligonucleotide)、具体的にはODN2006、2007、2059、又は2135 (Pontarollo R.A. et al, Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43-59; Wernette C.M. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89-103);ポリA−ポリU ("Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: 03);ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド(DDA)(dimethyldioctadecylammonium bromide)("Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, volume 6: 157)、N,N−ジオクタデシル−N’,N’−ビス(2−ヒドロキシエチル)プロパンジアミン(「Avridine(登録商標)」など)(同書、p.148)、カーボマー、キトサン(例えば、米国特許出願第5980912号を参照のこと)を含めて、コアジュバントとして他の化合物をエマルジョンに加えてよい。
本発明は、少なくとも1種の抗原又は免疫原と、本発明に従って作製したアジュバント又はエマルジョンとを含むワクチン組成物又は免疫組成物を作製する方法も提供する。免疫原は、エマルジョンを形成する間に組み込んでもよく、又は、代替の実施形態では、後で、例えば使用の直前に免疫原をエマルジョンに加えてもよい。
最初に生成されるエマルジョン中に、使用する水溶液の全量が存在してもよい。或いは、この水溶液の一部分だけをエマルジョン形成のために使用し、免疫原の組込み後に残りの量の水溶液を加えてもよい。免疫原又は抗原は、凍結乾燥した形態で、又は他の何らかの適切な固形で存在していて、次にエマルジョンと混合してもよく、或いは、抗原を溶液、特に水溶液に溶かし、この溶液をエマルジョンと混合してもよい。
界面活性剤は、その溶解性に応じて、油又は水溶液に加えることが好ましい。例えば、本発明によれば非イオン性親油性界面活性剤は、油に加えられるが、一方、HLB値の高い非イオン性親水性界面活性剤は水溶液に加えられる。
乳化は、当業者には既知の従来の方法によって行うことができる。例えば、本発明の一実施形態では、エマルジョンのPITより低い温度、具体的には室温、例えば約25℃でエマルジョンを調製することができる。機械攪拌によって、例えば、高せん断力を生じることができるローター/ステーターを装備したタービンを用いて、水性相及び油相を一緒に混ぜる。攪拌は、低い回転速度で開始して、通常は油中に水溶液を徐々に添加するのとともにゆっくりと速めることが好ましい。水溶液を、油に徐々に加えることが好ましい。油/水溶液の比は、油中水(W/O)型エマルジョンを得るために適合させることができ、例えば、油の約40%〜約55%(v/v)の濃度である。攪拌を止めると、エマルジョンは、徐々にO/W型エマルジョンに変化する(転相)。転相後、必要なら、水溶液を加えることによりエマルジョンを希釈して、最終のエマルジョン中に入る油を所望の濃度にする。このエマルジョンは、約5℃で保管することができる。
別の実施形態では、エマルジョンのPITより高い温度で、エマルジョンを調製することができる。第1の工程では、エマルジョンのPITより高い温度で、水性相及び油相を一緒に混ぜる。水溶液を、油に徐々に加えることが好ましい。油/水溶液の比は、油中水(W/O)型エマルジョンを得るために適合させることができ、例えば、油の約40%〜約55%(v/v)の濃度である。低いせん断力で、又はせん断力を加えずに攪拌することによって、例えば、静止型混合機若しくはマリンヘリックス(marine helix)を用いて、又はタービンを極めて低い回転速度で用いて、乳化を行うことができる。得られるエマルジョンは、油中水(W/O)型エマルジョンである。第2の工程では、エマルジョンを徐々にPITより低い温度に冷やす。この工程の間に、エマルジョンは、O/W型エマルジョンに変化する(転相)。転相後、必要なら、水溶液を加えることによりエマルジョンを希釈して、最終のエマルジョン中に入る油を所望の濃度にする。このエマルジョンは、約5℃で保管することができる。
エマルジョン中の液体粒子のサイズは、約100nm〜約500nmになり得る。このエマルジョンは、例えば、ワクチン組成物又は薬剤組成物を調合するためのアジュバントとして使用してよい。このエマルジョンは、例えば、弱毒化した微生物又は生きた組換ベクターを含有している乾燥製品、特に凍結乾燥した製品を溶解させるための溶媒として使用してもよい。
特定の実施形態では、水溶液の一部分だけを用いてプレエマルジョンを作製する。薬物又は免疫原などの活性成分、好ましくは免疫原の懸濁液を加えることによりこのプレエマルジョンを希釈して、最終組成物を得ることができる。或いは、水溶液でプレエマルジョンを希釈し、凍結乾燥製品などの乾燥製品を溶解させるのに使用してもよい。
本発明で使用するのに適した免疫原又は抗原は、免疫原性挿入物を有するプラスミドを含めて、不活性化した病原体、弱毒化した病原体、免疫原性のサブユニット(例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン)、又は組換え発現ベクターからなる群から選択してよい。本発明の一実施形態では、この免疫原は、不活性化した、又は殺した微生物である。本発明の別の実施形態では、ワクチン組成物は、それだけには限らないが、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ゲルトネル菌(Salmonella enteritidis)、感染性気管支炎ウイルス(IBV)(Infectious Bronchitis virus)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)(Newcastle Disease virus)、産卵低下症候群ウイルス(EDS)(egg drop syndrome virus)、又は伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)(Infectious Bursal Disease virus)、トリインフルエンザウイルスなど、及びそれらの組合せを含めて、トリ病原体の群から選択される免疫原を含む。
或いは、このワクチン組成物は、それだけには限らないが、ネコヘルペスウイルス(FHV)(feline herpesvirus)、ネコカリシウイルス(FCV)(feline calicivirus)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)(feline leukemia virus)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)(feline immunodeficiency virus)、狂犬病ウイルスなど、及びそれらの組合せなどネコの病原体から選択される免疫原を含む。
さらに別の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、それだけには限らないが、狂犬病ウイルス、イヌヘルペスウイルス(CHV)(canine herpesvirus)、イヌパルボウイルス(CPV)(canine parvovirus)、イヌコロナウイルス、犬型レプトスピラ(Leptospira canicola)、黄疸出血性レプトスピラ(Leptospira icterohaemorragiae)、レプトスピラグリッポチフォーサ(Leptospira grippotyphosa)、ボレリアブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)など、及びそれらの組合せを含めて、イヌの病原体から選択される免疫原を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物は、ウマヘルペスウイルス(1型又は4型)、ウマインフルエンザウイルス、テタヌス、西ナイルウイルスなど、又はそれらの組合せなどウマの病原体から選択される免疫原を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物は、狂犬病ウイルス、ウシロタウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス3型(bPIV−3)(bovine parainfluenza virus type 3)、ウシコロナウイルス、ウシウイルス性下痢性ウイルス(BVDV)(bovine viral diarrhea virus)、口蹄疫ウイルス(FMDV)(foot and mouth disease virus)、ウシ呼吸器合胞体ウイルス(BRSV)(bovine respiratory syncytial virus)、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス(IBR)(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus)、大腸菌、パスツレラマルトシダ、パスツレラヘモリティカなど、及びそれらの組合せなどウシの病原体から選択される免疫原を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物は、それだけには限らないが、ブタインフルエンザウイルス(SIV)(swine influenza virus)、ブタサーコウイルス2型(PCV−2)(porcine circovirus type 2)、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス(PRRS)(porcine reproductive respiratory syndrome virus)、仮性狂犬病ウイルス(PRV)(pseudorabies virus)、ブタパルボウイルス(PPV)(porcine parvovirus)、FMDV、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、豚丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、パスツレラマルトシダ、気管支敗血症菌、大腸菌など、及びそれらの組合せなどブタの病原体から選択される免疫原を含む。
本発明の好ましい実施形態は、製薬上許容される媒体中に少なくとも1種の免疫原及びエマルジョンを含むワクチン組成物を提供する。ウイルス、細菌、真菌などを含む免疫原は、適切な培養培地又は宿主細胞系統を用いるin vitroの培養方法、及び当業者には公知の従来の方法によって作製することができる。例えば、PRRSは、MA−104細胞系統など適切な細胞系統で培養することができる(特に、米国特許出願第5587164号、第5866401号、第5840563号、第6251404号を参照のこと)。同様の方法で、PK−15細胞系統を用いて、PCV−2を培養することができ(米国特許出願第6391314号を参照のこと)、卵上でSIV を培養することができ(米国特許出願第6048537号)、適切な培養培地中で、マイコプラズマ・ハイオニューモニエを培養することができる(米国特許出願第5968525号、米国特許第5338543号、Ross R. F. et al., Am. J. Vet. Res., 1984, 45: 1899-1905)。
不活性化した免疫組成物又はワクチン組成物を得るために、回収後に病原体を不活性化することが好ましく、場合によっては、例えば、ホルマリン若しくはホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレンイミン、バイナリーエチレンイミン(BEI)(binary ethyleneimine)、チメロサールなどを用いる化学的処理、及び/又は物理的処理(例えば熱処理又は音波処理)により清浄化する。不活性化の方法は、当業者には公知である。例えば、PRRSウイルスは、β−プロピオラクトン処理により(Plana-Duran et al., Vet. Microbiol., 1997, 55: 361-370)、又はBEI処理により(米国特許出願第5587164号)、不活性化することができ、PCV−2ウイルスの不活性化は、エチレンイミン処理により、又はβ−プロピオラクトン処理により(米国特許出願第6391314号)行うことができ、ブタインフルエンザウイルスは、Tritonのような洗浄剤を用いて、又はホルムアルデヒド処理によって(米国特許出願第6048537号)不活性化することができ、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌は、ホルムアルデヒド処理により(Ross R. F.、前掲書)、エチレンイミン処理若しくはBEI処理により(国際公開第91/18627号を参照のこと)、又はチメロサール処理(米国特許出願第5968525号及び第5338543号)により、不活性化することができる。
不活性化した病原体は、従来の濃縮技術、具体的には限外ろ過によって濃縮することができ、且つ/又は従来の精製手段、具体的には、それだけには限らないが、ゲルろ過を含めたクロマトグラフィー技術、ショ糖密度勾配超遠心法、又は、特にポリエチレングリコール(PEG)(polyethylene glycol)の存在下での選択的沈殿を用いて、従来の精製技術によって精製することができる。
本発明によるワクチン組成物で有用な免疫原には、発現ベクターも含まれる。このようなベクターには、それだけには限らないが、ポリヌクレオチドベクターやプラスミドなどのin vivo組換え発現ベクター(欧州特許出願公開第1001025号;Chaudhuri P, Res. Vet. Sci. 2001, 70: 255-6)、それだけには限らないが、アデノウイルスベクター、鶏痘ベクター(米国特許出願第5174993号、第5505941号、及び第5766599号)やカナリア痘ベクター(米国特許出願第5756103号)などのポックスウイルスベクターなどのウイルスベクター、又は細菌ベクター(大腸菌又はサルモネラ菌種)が含まれる。
本発明は、多価の免疫組成物又は混合ワクチン組成物の製剤も包含する。例えば、本発明に従って作製した本発明の混合ウシ細菌ワクチンで有用な抗原には、それだけには限らないが、ウシ・マイコプラズマ(Mycoplasma bovis)、パスツレラ菌種、特にP.マルトシダ及びP.ヘモリティカ(haemolytica)、ヘモフィルス菌種、特にH.ソムナス、クロストリジウム菌種、サルモネラ、コリネバクテリウム、ストレプトコッカス(Streptococcus)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、モラクセラ(Moraxella)、大腸菌などが含まれる。
本発明は、本発明による免疫組成物又はワクチン組成物を宿主に投与するステップを含む、宿主、例えば動物中で免疫応答を誘導するための方法もさらに提供する。この方法で誘発される免疫応答は、具体的には抗体反応及び/又は細胞性免疫応答、特にγ−インターフェロン応答である。
具体的には、本発明は、動物の病原生物への感染(例えば、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生性原虫による感染)に対して免疫性を与え、又はその感染によって引き起こされる症状を予防若しくは軽減するための方法を提供する。本発明の方法は、それだけには限らないが、ヒト、イヌ科の動物(例えば、イヌ)、ネコ科の動物(例えば、ネコ)、ウマ科の動物(例えば、ウマ)、ウシ亜科の動物(例えばウシ)、及びブタ系の動物(例えば、ブタ)を含めた脊椎動物、並びに、それだけには限らないが、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、及び平胸類(ダチョウ、エミュー、ヒクイドリなど)を含めたトリにおいて有用である。
本発明の特定の態様では、これらの方法は、本発明に従って作製したワクチン組成物を投与することにより、分娩前に妊娠中のメスにワクチン接種することからなる。これらの方法は、ワクチン接種プロトコールにより誘発される防御抗体の誘導、及びワクチン接種された妊娠中のメスからその子孫へのこれら防御抗体の移行もさらに含む。このような母性抗体が移行されると、続いてその子孫が疾患から保護される。
本発明に従って作製したワクチン組成物の用量は、ワクチンを接種される動物の種、品種、齢、大きさ、ワクチン接種歴、及び健康状態に応じて変わる。抗原濃度、追加のワクチン成分、及び投与経路(即ち、皮下、皮内、経口、筋肉内、又は静脈内投与)のような他の因子も、有効用量に影響を及ぼす。投与するワクチン用量は、ワクチンの抗原濃度、投与経路、並びにワクチンを接種される動物の齢及び状態に基づき、容易に決定できる。抗原の各回分量は、個別に調整することができる。或いは、様々な用量の系統的な免疫原性試験、並びにLD50試験及び他のスクリーニング手順を使用して、過度の実験をすることなく、本発明によるワクチン組成物の有効用量を決定することができる。以下に示す実施例から、およそどれくらいの用量及びおよそどれくらいの体積が、本明細書で記述するワクチン組成物を使用するのに適切であるかが用意に明らかになるであろう。その用量が、自然感染に関連する死亡率及び罹患率の低下により証明されるような、自然感染に対する少なくとも部分的な防御効果を与えているということが、重要な要素である。同様に、適切な体積は、当業者によって容易に確認される。例えば、トリの種では、用量の体積は、約0.1ml〜約0.5ml、有利には、約0.3ml〜約0.5mlである。ネコ、イヌ及びウマの種では、用量の体積は、約0.2ml〜約3.0ml、有利には約0.3ml〜約2.0ml、より有利には、約0.5ml〜約1.0mlでよい。ウシ及びブタの種では、用量の体積は、約0.2ml〜約5.0ml、有利には約0.3ml〜約3.0ml、より有利には0.5ml〜約2.0mlでよい。
最初に、又は最後の投与から長時間が経過しているときに免疫応答を高めるためには、定期的な時間間隔でワクチンを反復接種することが好ましいことがある。 本発明の一実施形態では、非経口的な注射剤として(即ち、皮下、皮内、又は筋肉内に)、ワクチン組成物を投与する。組成物は、1回量で投与してもよく、或いは、代替の実施形態では、約2〜約6週間、好ましくは約2〜約5週間の間隔で約2〜約5回投与する反復投与で投与してもよい。しかし、投与回数及びワクチン接種の間の時間間隔は、それだけには限らないが、ワクチン接種される動物の齢、動物の状態、免疫感作の経路、用量当たりの利用可能な抗原量などを含めて、いくつかの因子に応じて変わることが、当業者には認識されよう。初回のワクチン接種である場合は、期間は、通常、1週間より長く、好ましくは、約2〜約5週間となる。ワクチン接種歴のある動物の場合は、妊娠前又は妊娠中に、追加免疫用のワクチン接種を約1年間隔で実施してよい。
本発明は、「Pigjet(登録商標)」、「Avijet(登録商標)」、「Dermojet(登録商標)」又は「Biojector(登録商標)」(Bioject社製、オレゴン州、米国)などの針なし注射器を用いて、ワクチン組成物を投与することも企図する。当業者なら、過度に実験をすることなく、ワクチンを接種される動物の種、その動物の齢及び体重などの因子に対して必要に応じて、注射器の仕様を調整することができる。
本発明の一実施形態では、この方法は、本発明によるエマルジョンと調合したワクチン組成物の単回投与を含む。例えば、一実施形態では、このワクチン組成物は不活性化したマイコプラズマ・ハイオニューモニエのワクチンであり、一方、代替実施形態では、不活性化したPCV2ウイルス組成物を含むワクチンが提供される。それだけには限らないが、不活性化したPRRS及びSIVを含めて、他の免疫組成物又はワクチンが、単回投与療法で使用するのに適している。具体的には、マイコプラズマ・ハイオニューモニエのワクチン組成物の場合、ブタが生まれてから屠殺されるまでの間、特に約3〜約56日齢、好ましくは約10〜約35日齢、より好ましくは約15〜約30日齢の間に、単回投与を行うことができる。ワクチンは、既存の抗体の存在下でも、投与してよい。
本発明はさらに、本発明に従って作製し、また、タンパク質若しくはペプチド、抗体、アレルゲン、CpG ODN、成長因子、サイトカイン、又は抗生物質、特にCpG ODN又はサイトカインからなる群から選択される少なくとも1種の免疫原を含む薬剤組成物を宿主に投与するステップを含む、宿主、例えば、動物を治療するための方法にも関する。これらの薬剤組成物を使用して、ニワトリ、ブタ、又は乳牛などの動物の発育能力を改善することができる。
本発明はさらに、免疫原や薬剤組成物などの成分を含む第1のバイアルと、第2のバイアル中に入れた、本発明に従って作製したエマルジョンとを備える、キットに関する。免疫原は、本明細書で記述するように、凍結乾燥した形態でも、乾燥形態でも、水溶液に溶かしたものでもよい。
次に、以下の非限定的な実施例によって、本発明をさらに説明する。
エマルジョン製造法
以下に記述する2つの工程でエマルジョンを作製した。
以下に記述する2つの工程でエマルジョンを作製した。
第1工程:Silverson社製のハイシアーローター/ステーター式乳化機(直径10mmの粉砕用ヘッドが付いたL4RTタイプ)を用いて、調合物を作製した。エマルジョンを得るために、25℃で、1体積の油相を1体積の水性相#1で乳化した。1分間、5000rpm(1分当たり回転数)で攪拌しながら、水性相を油相に加えた。体積の増加に伴ない、1分間の間に、回転速度を徐々に8300rpmまで高めた。この工程の間、エマルジョンは油中水型エマルジョンであった。TS6エマルジョンの場合、相の組成は以下のとおりであった。
油相(120ml):
− ソルビタンモノオレエート(「Span 80(登録商標)」) :1.8%(w/v)
− ソルビタントリオレエート(20 OE)(「Tween 85(登録商標)」):10.2%(w/v)
− パラフィン油(「Marcol 82(登録商標)」) :88%(v/v)、
水性相#1(120ml):
− 20%(w/v)ソルビタンモノオレエート溶液(20 OE)(「(Tween 80(登録商標)」) :11.25%(w/v)
− リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8):85.75%(v/v)
− ナトリウムメルクロチオレート(「Thiomersal(登録商標)」)の1%水溶液:1.5%(v/v)
油相(120ml):
− ソルビタンモノオレエート(「Span 80(登録商標)」) :1.8%(w/v)
− ソルビタントリオレエート(20 OE)(「Tween 85(登録商標)」):10.2%(w/v)
− パラフィン油(「Marcol 82(登録商標)」) :88%(v/v)、
水性相#1(120ml):
− 20%(w/v)ソルビタンモノオレエート溶液(20 OE)(「(Tween 80(登録商標)」) :11.25%(w/v)
− リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8):85.75%(v/v)
− ナトリウムメルクロチオレート(「Thiomersal(登録商標)」)の1%水溶液:1.5%(v/v)
ソルビタンモノオレエート(「Span 80(登録商標)」)及びソルビタントリオレエート(20 OE)(「Tween 85(登録商標)」)を油相に添加した。ソルビタンモノオレエート(20 OE)(「Tween 80(登録商標)」)は、パラフィン油に混和性がなかった。ワクチンと同じ緩衝液、例えば、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)中に溶かして、「Tween 80(登録商標)」の20%((w/v))溶液を調製した。ナトリウムメルクロチオレートは、保存剤の役割を果たし、エマルジョンに不可欠なものではない。
攪拌を止めると、エマルジョンは、水中油型エマルジョンに変化した。このエマルジョンを少なくとも4時間、5℃の冷室に置いた。この段階では、エマルジョンは、油相を50%含有するプレエマルジョンであった。
第2工程:免疫原(後述するような、不活性化したマイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原、又はPCV−2免疫原)を含むpH7.8のリン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液120mlを用いて、水性相#2を調製した。第1の工程で調製したプレエマルジョンを約5℃まで冷却し、同じ温度で2分の1体積の水性相#2を加えて希釈し、1分間マグネチックバーを回転させて混合した。TS6エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、4.75%((w/v))であった。
本明細書で調製したTS6ワクチンは、5℃で少なくとも1年間安定である。
同じ調整法を用いて、後述するように、他のエマルジョンを得ることができる。
TS7エマルジョン:
TS7エマルジョンは、油相を33%含有するO/W型エマルジョンである。油相(120ml)は、「Marcol 82(登録商標)」を88%(v/v)、「Span 80(登録商標)」を1.8%(w/v)、及び「Tween 85(登録商標)」を10.2%(w/v)含む。水性相#1(120ml)は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)を97.75%(v/v)、「Thiomersal(登録商標)」1%水溶液を1.5%(v/v)、及び「Lutrol F127(登録商標)」を0.75%(w/v)含む。水性相#2(120ml)は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)で構成され、場合によっては免疫原を含有する。TS7エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、4.25%(w/v)である。
TS7エマルジョンは、油相を33%含有するO/W型エマルジョンである。油相(120ml)は、「Marcol 82(登録商標)」を88%(v/v)、「Span 80(登録商標)」を1.8%(w/v)、及び「Tween 85(登録商標)」を10.2%(w/v)含む。水性相#1(120ml)は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)を97.75%(v/v)、「Thiomersal(登録商標)」1%水溶液を1.5%(v/v)、及び「Lutrol F127(登録商標)」を0.75%(w/v)含む。水性相#2(120ml)は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)で構成され、場合によっては免疫原を含有する。TS7エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、4.25%(w/v)である。
TS8エマルジョン:
TS8エマルジョンは、油相を50%含有するO/W型エマルジョンである。油相(160ml)は、「Marcol 82(登録商標)」を92%(v/v)、「Span 85(登録商標)」を1.8%(w/v)、及び「Brij 96(登録商標)」を6.2%(w/v)含む。水性相#1(160ml)は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)を98.5%(v/v)、「Thiomersal(登録商標)」1%水溶液を1.0%(v/v)、及び「Lutrol F127(登録商標)」を0.5%(w/v)含み、場合によっては免疫原を含有する。TS8エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、4.25%(w/v)である。
TS8エマルジョンは、油相を50%含有するO/W型エマルジョンである。油相(160ml)は、「Marcol 82(登録商標)」を92%(v/v)、「Span 85(登録商標)」を1.8%(w/v)、及び「Brij 96(登録商標)」を6.2%(w/v)含む。水性相#1(160ml)は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)を98.5%(v/v)、「Thiomersal(登録商標)」1%水溶液を1.0%(v/v)、及び「Lutrol F127(登録商標)」を0.5%(w/v)含み、場合によっては免疫原を含有する。TS8エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、4.25%(w/v)である。
TS9エマルジョン:
TS9エマルジョンは、油相を10%含有するO/W型エマルジョンである。油相(120ml)は、「Marcol 82(登録商標)」を60%(v/v)、「Span 40(登録商標)」を17.2%(w/v)、及び「Arlatone 650(登録商標)」を22.8%(w/v)含む。水性相#1(120ml)は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)を97.5%(v/v)、及び「Tween 20(登録商標)」を2.5%(w/v)含む。水性相#2は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)400mlで調製され、場合によっては免疫原を含有する。100mlのプレエマルジョンを、400mlの水性相#2で希釈して、TS9エマルジョンを得た。TS9エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、4.25%(w/v)である。
TS9エマルジョンは、油相を10%含有するO/W型エマルジョンである。油相(120ml)は、「Marcol 82(登録商標)」を60%(v/v)、「Span 40(登録商標)」を17.2%(w/v)、及び「Arlatone 650(登録商標)」を22.8%(w/v)含む。水性相#1(120ml)は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)を97.5%(v/v)、及び「Tween 20(登録商標)」を2.5%(w/v)含む。水性相#2は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)400mlで調製され、場合によっては免疫原を含有する。100mlのプレエマルジョンを、400mlの水性相#2で希釈して、TS9エマルジョンを得た。TS9エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、4.25%(w/v)である。
エマルジョンの転相温度(PIT)の測定
温度約25℃の水浴中のガラス管中に、10mlのTS6エマルジョンを入れた。TS6エマルジョンは、白色の均一なエマルジョンであった。水浴の温度を徐々に高くした。エマルジョンの変化が視覚的に観察された(エマルジョンは、黄褐色の油相が表面へ移動したことにより、2つの分離した相になった)。この変化は、エマルジョン破壊の特徴である。この変化が観察される温度が、エマルジョンのPIT値である。TS6エマルジョンのPITは40〜45℃であり、TS7エマルジョンのPITは44〜49℃であった。
温度約25℃の水浴中のガラス管中に、10mlのTS6エマルジョンを入れた。TS6エマルジョンは、白色の均一なエマルジョンであった。水浴の温度を徐々に高くした。エマルジョンの変化が視覚的に観察された(エマルジョンは、黄褐色の油相が表面へ移動したことにより、2つの分離した相になった)。この変化は、エマルジョン破壊の特徴である。この変化が観察される温度が、エマルジョンのPIT値である。TS6エマルジョンのPITは40〜45℃であり、TS7エマルジョンのPITは44〜49℃であった。
マイコプラズマ・ハイオニューモニエのワクチン組成物及びヘテロロガス攻撃
材料及び方法:実施例1で記述したようにして調製したTS6エマルジョン、及びワクチン1ml当たり8.7log10 CCU(色調変化単位(color changing unit))の濃度の不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、BQ14系統(Kobisch M. et al., Ann. Inst. Pasteur Immunol., 1987, 138:693-705)を含有するワクチン組成物を調合した。母性抗体を有する(マイコプラズマ・ハイオニューモニエ血清陽性の雌ブタから生まれた)3週齢の22匹の子ブタを、無作為に2つの群に割り当てた。10匹の子ブタからなる1つの群には、第0日に、2mlのワクチン組成物を筋肉内注射によってワクチン接種し、一方、12匹の子ブタからなる対照群にはワクチンを接種しなかった。
材料及び方法:実施例1で記述したようにして調製したTS6エマルジョン、及びワクチン1ml当たり8.7log10 CCU(色調変化単位(color changing unit))の濃度の不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、BQ14系統(Kobisch M. et al., Ann. Inst. Pasteur Immunol., 1987, 138:693-705)を含有するワクチン組成物を調合した。母性抗体を有する(マイコプラズマ・ハイオニューモニエ血清陽性の雌ブタから生まれた)3週齢の22匹の子ブタを、無作為に2つの群に割り当てた。10匹の子ブタからなる1つの群には、第0日に、2mlのワクチン組成物を筋肉内注射によってワクチン接種し、一方、12匹の子ブタからなる対照群にはワクチンを接種しなかった。
実験期間中に選択した間隔(第0、27、42、及び56日)で、双方の群の子ブタから鼻スワブを採取し、ELISAによって抗BQ14分泌型抗体を測定した。27日目に、子ブタから血を採り、末梢血中のIFNγレベルを測定するために末梢血単核球(PBMN)を得た。28日目に、約6.6log10 CCU/mlのマイコプラズマ・ハイオニューモニエMp88c系統(デンマークの病気のブタから単離し、Kobisch and Friis in Rev. Sci. Tech. Off.Int. Epiz. 1996, 15: 1569-1605に記載されているように培養した系統)を含有する溶液で、各外鼻孔に約5mLを塗布してすべての子ブタを経鼻的に攻撃した。この攻撃を24時間後に繰り返し行った。ブタを屠殺し、死体解剖をして肺を集めた。7つの肺葉のそれぞれについて病変の表面積を概算することにより(葉全体の表面に対する百分率として表して)、肺のスコアを決定した。スコアは、以下のように割り当てられた。
結果:TS6ワクチン製剤をワクチン接種したブタは、強い細胞性応答を示し、この応答は、5×105個の末梢血単核球(PBMN)からIFNγを分泌しているスポットの数によって実証されているように、対照群より有意に高いものであった。ワクチン接種群のブタのスポット数の平均は、ワクチン接種されていない対照群で11(標準偏差5)であったのに対し、139(標準偏差25)であった。
ワクチン接種群及び対照群における抗BQ14分泌型抗体のレベルを以下の表にまとめて示す。この結果は、ワクチン接種されたブタの方が、未処置の対照群と比べて、攻撃の2〜3週間後に有意に高いレベルの分泌型抗体を有することを示している。
ここで図1を参照すると、TS6ワクチン組成物をワクチン接種した動物は、未処置の対照群の平均肺スコアが7.8±4.1であるのに対し、2.1±1.9(平均値±標準偏差)の平均肺スコアを示している。これらの結果は、ワクチン接種されていない対照群と比べて、ワクチン組成物をワクチン接種したブタにおいて肺病変が有意に低下したことを示している。
マイコプラズマ・ハイオニューモニエのヘテロロガス攻撃に対する防御の持続
材料及び方法:母性抗体を有する(マイコプラズマ・ハイオニューモニエ血清陽性の雌ブタから生まれた)3週齢の38匹の子ブタを、以下のように、無作為に3つの群に割り当てた。
第1群(12匹のコブタ)には、第0日に、実施例3で記述したワクチン組成物2mlを筋肉内経路によりワクチン接種した。
第2群(12匹のコブタ)には、第0日に、市販のマイコプラズマ・ハイオニューモニエの不活性化ワクチン2mlを筋肉内注射によりワクチンを接種した。
第3群(14匹の子ブタ)は、ワクチンを接種されていない対照群の役割を果たした。
材料及び方法:母性抗体を有する(マイコプラズマ・ハイオニューモニエ血清陽性の雌ブタから生まれた)3週齢の38匹の子ブタを、以下のように、無作為に3つの群に割り当てた。
第1群(12匹のコブタ)には、第0日に、実施例3で記述したワクチン組成物2mlを筋肉内経路によりワクチン接種した。
第2群(12匹のコブタ)には、第0日に、市販のマイコプラズマ・ハイオニューモニエの不活性化ワクチン2mlを筋肉内注射によりワクチンを接種した。
第3群(14匹の子ブタ)は、ワクチンを接種されていない対照群の役割を果たした。
ワクチン接種の20週後に、前述したマイコプラズマ・ハイオニューモニエMp88cの攻撃用系統(6.6log10 CCU/ml)を外鼻孔当たり約5ml用いて、すべての子ブタを経鼻的に攻撃した。この攻撃を24時間後に繰り返し行った。前述したように、すべての群から血液を採取し、IFNγレベルを測定するために末梢血単核球(PBMN)(peripheral blood mononuclear cells)を得た。各群について、第138日に抗BQ14 IgA及びIgG1血清抗体を測定した。死体解剖後、上記の実施例3で記述したようにして、肺スコア(平均値+標準偏差)を計算した。
結果:ここで図2を参照すると、TS6ワクチン組成物をワクチン接種した第1群は、0.4±0.9の平均肺スコアを示し、市販のワクチンを接種した子ブタ群の肺スコア(4.0±5.1)又はワクチンを接種されていない対照群の肺スコア(6.1±5.8)からの統計学的に有意な低下を実証した。
第138日に各群から採取した血清中の抗BQ14 IgA及びIgG1循環抗体の平均結果(±標準偏差)を以下にまとめて示す。
以下の表は、5×105個の末梢血単核球(PBMN)について、末梢血中でγ−インターフェロン(IFNγ)を分泌しているスポットの数の平均結果(±標準偏差)をまとめたものである。
不活性化ワクチンを用いたときに予想されたように、ワクチン接種後138日の時点で検出可能な抗BQ14 IFNγ分泌T細胞の出現率は、28日時点よりはるかに低かった。興味深いことに、TS6をワクチン接種したブタの大半は138日時点でもなお陽性であり、この群では細胞性応答が維持されていることが示唆された。152日時点(攻撃の13日後)で循環している抗BQ14 IFNγ分泌T細胞の出現率は、これら3つの群の間で大きく異なっていた。TS6をワクチン接種した群は、他の群とは対照的に、極めて高い細胞性応答を示した。この結果は、攻撃が、TS6ワクチンにより誘導された免疫記憶を効率的に呼び戻すことを示唆している。
TS6エマルジョンによるPCV−2アジュバントワクチンの1回量を投与した後の血清分析の結果
材料及び方法:2〜3ヶ月齢の特定病原体除去(SPF)(specific pathogen-free)子ブタ10匹を無作為に2群に割り当てた。5匹の子ブタからなる1つの群には、1回量当たり6.8log10 CCID50の不活性化PCV−2(imp1010系統)を含有するワクチン2mlを(第0日に)筋肉内経路によりワクチン接種した(ワクチン接種群)。5匹の子ブタからなる対照群にはワクチンを接種しなかった。ELISAによってPCV−2 ORF2抗体の力価測定をするために、ワクチン接種後0日、7日、14日、21日、及び28日に血液サンプルを採取した。
材料及び方法:2〜3ヶ月齢の特定病原体除去(SPF)(specific pathogen-free)子ブタ10匹を無作為に2群に割り当てた。5匹の子ブタからなる1つの群には、1回量当たり6.8log10 CCID50の不活性化PCV−2(imp1010系統)を含有するワクチン2mlを(第0日に)筋肉内経路によりワクチン接種した(ワクチン接種群)。5匹の子ブタからなる対照群にはワクチンを接種しなかった。ELISAによってPCV−2 ORF2抗体の力価測定をするために、ワクチン接種後0日、7日、14日、21日、及び28日に血液サンプルを採取した。
結果:以下の表で示すように、すべてのワクチン接種ブタが、ワクチン接種の7〜40日後に有意な抗PCV−2 ORF2抗体応答を示した。
TS6エマルジョンによるPCV−2アジュバントワクチンにより誘発される、攻撃に対する防御
材料及び方法:4〜5日齢のSPF子ブタ16匹を以下のように無作為に2群に割り当てた。8匹の子ブタからなる1つの群には、1回量当たり7.55log10 CCID50の不活性化PCV−2(imp1010系統)を含有するワクチン2mlを、第0日及び21日に、筋肉内注射によって2回ワクチン接種した(ワクチン接種群)のに対し、8匹の子ブタからなる対照群にはワクチンを接種しなかった。35日目に、1ml当たり約5.5log10 CCID50を含有するPCV−2 Imp1011-48285系統(アクセッション番号V98011608でECACCに寄託されているもの)を用いて、各外鼻孔に約5mLを塗布してすべての子ブタを経鼻的に攻撃した。ELISA試験と血清中和(SN)試験の双方を実施し、以下のように各子ブタの臨床スコアを決定した。
材料及び方法:4〜5日齢のSPF子ブタ16匹を以下のように無作為に2群に割り当てた。8匹の子ブタからなる1つの群には、1回量当たり7.55log10 CCID50の不活性化PCV−2(imp1010系統)を含有するワクチン2mlを、第0日及び21日に、筋肉内注射によって2回ワクチン接種した(ワクチン接種群)のに対し、8匹の子ブタからなる対照群にはワクチンを接種しなかった。35日目に、1ml当たり約5.5log10 CCID50を含有するPCV−2 Imp1011-48285系統(アクセッション番号V98011608でECACCに寄託されているもの)を用いて、各外鼻孔に約5mLを塗布してすべての子ブタを経鼻的に攻撃した。ELISA試験と血清中和(SN)試験の双方を実施し、以下のように各子ブタの臨床スコアを決定した。
死体解剖後に、以下のとおり、病変スコアを計算した。
結果:30日及び63日後の時点でELISA及び血清中和抗体価試験によって行った血清分析の結果は、ワクチン接種された子ブタの方が、未処置の対照群で得られたレベルより高いレベルを有することを示している。以下の表は、糞便スワブ及び神経節組織からPCV−2ウイルスを単離した結果を要約し、且つ、ワクチン接種群及び対照群の平均の臨床スコア及び病変スコアを示したものである。結果は、対照群と比べて、ワクチン接種群の方が、循環抗体とSN力価の双方がより高レベルであることを示している。同様に、臨床スコア及び肺病変も、ワクチン接種された子ブタで有意に低減されている。攻撃後の臨床スコアの変化を図3に示す。
TS6によるPCV−2不活性化アジュバントワクチンの1回量をワクチン接種した後の現場での有効性の結果
ワクチン組成物:実施例1で記述したようにして、TS6アジュバントを調製した。米国特許出願第6517843号(Ellis et al;その内容は、これによりその全体を本明細書に組み込む)で記載されているようにして、PCV−2ウイルスをPK/15細胞上で培養し、ウイルスを増殖させた。簡単に言うと、ウイルス培養の最後に、感染した細胞を収集し、溶解させ、ウイルス収集物を従来の方法で不活性化した。例えば、+37℃で18時間、0.1%エチレンイミンを用いて、又は+28℃で24時間、0.5%β−プロピオラクトンを用いて、又は、+4℃で24時間、0.2%及び0.1%β−プロピオラクトンを用いて、不活性化を行うことができる。不活性化前のウイルス力価が不十分である場合は、ウイルス懸濁液を、限外ろ過により、カットオフ値が150〜300kDaの膜を用いて濃縮した。ワクチンを調製する前に、不活性化したウイルス懸濁液を+5℃で保管した。ワクチンの抗原含有量は、1回量当たり2.1log10抗原単位に設定した。この含有量に基づき、ELISA法により最終製品中の活性成分を定量することによって決定されるワクチン活性を、自由裁量で、最小値が1回量当たり100ELISA単位となるように設定した。
ワクチン組成物:実施例1で記述したようにして、TS6アジュバントを調製した。米国特許出願第6517843号(Ellis et al;その内容は、これによりその全体を本明細書に組み込む)で記載されているようにして、PCV−2ウイルスをPK/15細胞上で培養し、ウイルスを増殖させた。簡単に言うと、ウイルス培養の最後に、感染した細胞を収集し、溶解させ、ウイルス収集物を従来の方法で不活性化した。例えば、+37℃で18時間、0.1%エチレンイミンを用いて、又は+28℃で24時間、0.5%β−プロピオラクトンを用いて、又は、+4℃で24時間、0.2%及び0.1%β−プロピオラクトンを用いて、不活性化を行うことができる。不活性化前のウイルス力価が不十分である場合は、ウイルス懸濁液を、限外ろ過により、カットオフ値が150〜300kDaの膜を用いて濃縮した。ワクチンを調製する前に、不活性化したウイルス懸濁液を+5℃で保管した。ワクチンの抗原含有量は、1回量当たり2.1log10抗原単位に設定した。この含有量に基づき、ELISA法により最終製品中の活性成分を定量することによって決定されるワクチン活性を、自由裁量で、最小値が1回量当たり100ELISA単位となるように設定した。
ワクチン接種プロトコール:現場条件下でのワクチン組成物の有効性を試験するために、子ブタのPCV−2感染によって引き起こされる離乳後多臓器性発育不良症候群(PMWS)(postweaning multisytemic wasting syndrome)の地方病的発生を典型的に示している農場を選択した。雌ブタを2群に分け、ワクチン接種群には、分娩の2〜3週間前にTS6によるPCV−2不活性化アジュバントワクチンを1回(用量2ml)筋肉内注射した。第2の群にはワクチンを接種せず、対照群とした。雌ブタに出産させて、ワクチン接種された雌ブタ(n=889)及び対照群の雌ブタ(n=713)から生まれた子ブタの死亡率を、屠殺する時点まで観察した。
結果:図4は、虐殺する時点までの子ブタのPMWS症例の百分率を示すグラフである。グラフから分かるように、ワクチンを接種されていない対照群から生まれた子ブタの症例数と比べて、ワクチン接種された雌ブタに生まれた子ブタのPMWSの症例数は75%低減していた。これらの結果は、PCV−2感染に関連した臨床疾患の有意な減少を示しており、子ブタのPCV2感染に伴なう死亡及び罹患を防ぐために、TS6によるPCV2不活性化アジュバントワクチンを分娩の直前に雌ブタにワクチン接種することの可能性を実証するものである。これらの結果はさらに、本発明によるワクチン組成物を1回量用いるだけで、実際の現場条件にある子ブタのPMWSの有意な減少が実現できることも実証している。
LF2エマルジョン
実施例1の前述の方法を用いて、10%の油相エマルジョンを含有し、LF2と名づけた水中油(O/W)型エマルジョンを作製した。油相(100ml)は、「Marcol 82(登録商標)」を88%(v/v)、「Span 80(登録商標)」を1.8%(w/v)、「Tween 85(登録商標)」を10.2%(w/v)を含んだ。水性相#1(100ml)は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)を88.5%(v/v)、及び「Tween 80(登録商標)」の20%(w/v)溶液を11.5%(w/v)含んだ。水性相#2(400ml)は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)で構成し、場合によっては免疫原を含有した。100mlのプレエマルジョンを、400mlの水性相#2で希釈して、LF2エマルジョンを得た。LF2エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、1.43%(w/v)であった。導電率によって決定したLF2エマルジョンのPITは45℃より高かった。
実施例1の前述の方法を用いて、10%の油相エマルジョンを含有し、LF2と名づけた水中油(O/W)型エマルジョンを作製した。油相(100ml)は、「Marcol 82(登録商標)」を88%(v/v)、「Span 80(登録商標)」を1.8%(w/v)、「Tween 85(登録商標)」を10.2%(w/v)を含んだ。水性相#1(100ml)は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)を88.5%(v/v)、及び「Tween 80(登録商標)」の20%(w/v)溶液を11.5%(w/v)含んだ。水性相#2(400ml)は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの0.02M等張緩衝液(pH7.8)で構成し、場合によっては免疫原を含有した。100mlのプレエマルジョンを、400mlの水性相#2で希釈して、LF2エマルジョンを得た。LF2エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、1.43%(w/v)であった。導電率によって決定したLF2エマルジョンのPITは45℃より高かった。
LF2エマルジョンによるブタインフルエンザアジュバントワクチンの投与後の血清分析
材料及び方法:約10週齢の子ブタ15匹を無作為に3群に割り当てた。1つの群(ワクチン接種群)では、5匹の子ブタに、1回量当たり7.7log10 CCID50の組換型ブタインフルエンザワクチン2mlを2回(第0日及び28日)、筋肉内注射によりワクチン接種した。この組換え発現ベクターワクチンは、H1N1ブタインフルエンザウイルスの核プロテイン(NP)(nucleoprotein)及び赤血球凝集素(HA)(haemagglutinin)をコード及び発現しているカナリア痘ベクターを含んだ。5匹の子ブタからなる第2の群には、(1回量当たり7.7log10 CCID50で)LF2エマルジョンによる組換型ブタインフルエンザのアジュバントワクチン2mlを(第0日及び28日に筋肉内注射によって)2回ワクチンを接種した(LF2ワクチン接種群)。5匹の子ブタはワクチン接種をせずに残した(対照群)。赤血球凝集抑制(HI)(haemagglutination inhibition)力価を測定するために、ワクチン接種後0日、14日、28日、42日、56日に血液サンプルを採取した。
材料及び方法:約10週齢の子ブタ15匹を無作為に3群に割り当てた。1つの群(ワクチン接種群)では、5匹の子ブタに、1回量当たり7.7log10 CCID50の組換型ブタインフルエンザワクチン2mlを2回(第0日及び28日)、筋肉内注射によりワクチン接種した。この組換え発現ベクターワクチンは、H1N1ブタインフルエンザウイルスの核プロテイン(NP)(nucleoprotein)及び赤血球凝集素(HA)(haemagglutinin)をコード及び発現しているカナリア痘ベクターを含んだ。5匹の子ブタからなる第2の群には、(1回量当たり7.7log10 CCID50で)LF2エマルジョンによる組換型ブタインフルエンザのアジュバントワクチン2mlを(第0日及び28日に筋肉内注射によって)2回ワクチンを接種した(LF2ワクチン接種群)。5匹の子ブタはワクチン接種をせずに残した(対照群)。赤血球凝集抑制(HI)(haemagglutination inhibition)力価を測定するために、ワクチン接種後0日、14日、28日、42日、56日に血液サンプルを採取した。
結果:以下の表で要約するように、すべてのワクチン接種ブタが、未処置の対照のブタと比べて、ワクチン接種の42〜56日後に有意な抗ブタインフルエンザ抗体応答を示した(分散分析、p<0.0001)。しかし、LF2によるアジュバントワクチンをワクチン接種したブタは、アジュバントを使用していない組換型ワクチンを与えられたブタと比べて、ワクチン接種の42〜56日後に、抗体応答の有意な上昇を示した(分散分析、p<0.0001)。
これらの結果から実証されるように、LF2エマルジョンのアジュバント効果により、ワクチンが、非アジュバントワクチンと比べて、ブタインフルエンザウイルスに対するより高い抗体応答を誘導することが可能となる。
LF2エマルジョンによるマンヘミアヘモリティカ(Mannheimia haemolytica)アジュバントワクチンによって誘導される防御
材料及び方法:陰性又はマンヘミアヘモリティカロイコトキシン抗体力価の低い5ヶ月齢の20匹の子ウシを、それぞれ子ウシ10匹からなる2つの群に無作為に割り当てた。上記の実施例8で記述したようにして、LF2エマルジョンを作製し、ワクチン1回量当たり約60〜70ELISA単位(未加工の非濃縮細菌培養物の約0.34mL〜1.1mLに相当)の不活性化マンヘミアヘモリティカ(A1系統)を含み、LF2エマルジョンをアジュバントとして用いたワクチンを調製した。10匹の子ウシからなる1つの群には、第0日に、LF2ワクチン組成物2mlを皮下注射によってワクチン接種し、一方、10匹の子ウシからなる対照群には、ワクチン接種しなかった。ワクチン接種の日(D0)から攻撃の日(D20)まで、すべてのワクチン接種した子ウシのワクチン接種に対する全身反応及び局所反応を定期的に検査した。臨床検査には、(感情鈍麻、食欲不振、多呼吸、唾液過多、震えなどの)全身性反応の評価、直腸温度の記録、及び注射部位での局所反応の測定を含んだ。ワクチン接種に対して全身性反応を示した子ウシは1匹もいなかった。以下の表に要約した直腸温度(単位;℃、平均±標準偏差)は、ワクチン接種後24時間以内をピークとする、一時的且つ軽度の体温上昇がワクチン接種群で観察されることを示した。
材料及び方法:陰性又はマンヘミアヘモリティカロイコトキシン抗体力価の低い5ヶ月齢の20匹の子ウシを、それぞれ子ウシ10匹からなる2つの群に無作為に割り当てた。上記の実施例8で記述したようにして、LF2エマルジョンを作製し、ワクチン1回量当たり約60〜70ELISA単位(未加工の非濃縮細菌培養物の約0.34mL〜1.1mLに相当)の不活性化マンヘミアヘモリティカ(A1系統)を含み、LF2エマルジョンをアジュバントとして用いたワクチンを調製した。10匹の子ウシからなる1つの群には、第0日に、LF2ワクチン組成物2mlを皮下注射によってワクチン接種し、一方、10匹の子ウシからなる対照群には、ワクチン接種しなかった。ワクチン接種の日(D0)から攻撃の日(D20)まで、すべてのワクチン接種した子ウシのワクチン接種に対する全身反応及び局所反応を定期的に検査した。臨床検査には、(感情鈍麻、食欲不振、多呼吸、唾液過多、震えなどの)全身性反応の評価、直腸温度の記録、及び注射部位での局所反応の測定を含んだ。ワクチン接種に対して全身性反応を示した子ウシは1匹もいなかった。以下の表に要約した直腸温度(単位;℃、平均±標準偏差)は、ワクチン接種後24時間以内をピークとする、一時的且つ軽度の体温上昇がワクチン接種群で観察されることを示した。
ワクチン接種された子ウシにおける局所反応(表面積として測定(単位;cm2)、平均±標準偏差)では、すべてのワクチン接種された動物においてワクチン接種の約24〜48時間後に現れ、その後、14日目までに約3cm2の大きさに急速に減少する強力な局所反応を示した。これらの反応は、20日目までにほとんどなくなった。この反応を以下にまとめて示す。
様々な間隔(第0日、7日、14日、20日、及び28日)ですべての動物から血液サンプルを採取し、マンヘミアヘモリティカA1のロイコトキシンに対する抗体レベルをELISAによって測定した(log10 OD50で示した力価)。結果は、ワクチン接種の前はすべての子ウシが陰性であることを示した。1回のワクチン接種後、20日目までに、ワクチン接種ウシ10匹中8匹で抗体陽転が起こったが、対照のすべての子ウシは、0日目から20日目まで陰性のままであった。ELISAの結果を以下にまとめて示す。
攻撃試験プロトコール:約9.2log10 CFU(colony forming unit)/ml(1ミリリットル当たりのコロニー形成単位)のマンヘミアヘモリティカA1系統を含有している30mlの攻撃用溶液を気管内投与することによって、すべての子ウシを20日目に攻撃した。この攻撃を24時間後に繰り返し行った。攻撃した日から試験の最終日まで、呼吸困難を含めて、すべての子ウシの全般的臨床徴候を毎日検査した。観察した徴候には、全身状態、食欲不振、直腸温度、鼻汁、咳、呼吸数、及び呼吸困難が含まれた。
以下の式及び表に示した部分スコアに従って、総合臨床スコアを計算した。
総合臨床スコア=Σ(部分スコア×係数)/14
総合臨床スコア=Σ(部分スコア×係数)/14
死亡した動物の場合は、個々の1日の臨床スコアの最大値2を適用した。
以下の式を用いて、各子ウシの肺病変スコア(百分率で表示)も決定した。
肺病変スコア=Σ(葉の病変の表面積/葉全体の表面積×100×LRM)
上式で、LRMは肺の相対論的質量であり、各値は、
右上葉及び右中上葉の場合は0.11、
右中下葉の場合は0.07、
右下葉の場合は0.35、
左上葉の場合は0.05、
左中葉の場合は0.06、
左下葉の場合は0.32、
奇静脈葉の場合は0.04
である。
肺病変スコア=Σ(葉の病変の表面積/葉全体の表面積×100×LRM)
上式で、LRMは肺の相対論的質量であり、各値は、
右上葉及び右中上葉の場合は0.11、
右中下葉の場合は0.07、
右下葉の場合は0.35、
左上葉の場合は0.05、
左中葉の場合は0.06、
左下葉の場合は0.32、
奇静脈葉の場合は0.04
である。
攻撃試験の結果:以下の表に示した各群の総合臨床スコアは、未処置の対照群と比べて、ワクチン接種された群の総合臨床スコアが有意な低下を示していることを示した(p=0.046、分散分析)。
攻撃に屈した動物はすべて、肺の60%以上が感染していた。対照群の病変よりも、ワクチン接種された動物の肺病変が少ないという統計的傾向(p=0.08)があった。肺の3分の1超が感染していた、群当たりの動物数はワクチン接種群では2/10(20%)であり、対照動物群では7/10(70%)であった。肺の3分の1超が感染していた動物の数は、ワクチン接種群で有意に低かった(p=0.03、フィッシャーの正確確率検定、片側検定)。肺病変スコアの結果を以下の表にまとめて示す。
総合臨床スコアと肺病変率との間には極めて有意で(p<0.001)強い相関関係(R2=0.86)があった。ワクチン接種された動物はすべて、ワクチン接種後にわずかな高体温を示したが、ワクチン接種に対する他の全身反応は観察されなかった。ワクチン接種後に強い局所反応が観察されたが、急速に減少して十分に許容される大きさになり、有意な病変は死体解剖で観察された。これらの結果は、LF2エマルジョンによるアジュバントワクチンの安全性を実証している。
対照群と比べて、平均臨床スコアと肺病変スコアの双方がワクチン接種群で有意に低下したことを示すこの実験結果は、LF2エマルジョンによるマンヘミアヘモリティカのアジュバントワクチンを1回注射するだけで、生まれたばかりの子ウシをマンヘミアヘモリティカの攻撃から保護することを実証している。
本発明の好ましい実施形態をこのように詳細に述べたが、上記の節で定義した本発明は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、多数のその外見上の改変例が実施可能であるため、上記の記載で説明した特定の詳細な内容に限定されるべきではないことを、理解すべきである。
Claims (30)
- (i)少なくとも1種の免疫原を含有する水溶液と、
(ii)鉱油と、
(iii)非イオン性親油性界面活性剤と、
(iv)13〜40の高い親水性−親油性バランス(HLB)値を有する非イオン性親水性界面活性剤と、
(v)9〜13の低い親水性−親油性バランス(HLB)値を有する非イオン性親水性界面活性剤とを含む、
注射可能な水中油(O/W)型エマルジョンを含む、ワクチン組成物。 - 高HLB非イオン性親水性界面活性剤が、エマルジョンの単位体積当たりの重量として表して、0.1%〜1.5%(w/v)の濃度で存在する、請求項1に記載の組成物。
- 界面活性剤の割合が、重量体積比(w/v)約4%〜約6%である、請求項2に記載の組成物。
- 低HLB非イオン性親水性界面活性剤が、エマルジョンの単位体積当たりの重量として表して、1%〜8%(w/v)の濃度で存在する、請求項1に記載の組成物。
- 非イオン性親油性界面活性剤が、エマルジョンの単位体積当たりの重量として表して、0.1%〜2.5%(w/v)の濃度で存在する、請求項1に記載の組成物。
- 鉱油が、20%〜40%(v/v)の濃度で存在する、請求項1に記載の組成物。
- エマルジョンが、33〜66℃の転相温度(PIT)を有する、請求項1に記載の組成物。
- 低HLB非イオン性親水性界面活性剤が、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステル、エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステル、エトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステル、エトキシ化脂肪アルコール、エトキシ化脂肪酸エトキシ化ヒマシ油、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- エトキシ化脂肪酸エステルのエステルが、オレエート、パルミテート、ステアレート、イソステアレート、ラウレート、及びそれら組合からなる群から選択される、請求項8に記載の組成物。
- 非イオン性親油性界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、マンニド脂肪酸エステル、ジエトキシ化マンニド脂肪酸エステル、トリエトキシ化マンニド脂肪酸エステル、テトラエトキシ化マンニド脂肪酸エステル、及びそれら組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 脂肪酸エステルのエステルが、オレエート、パルミテート、ステアレート、イソステアレート、ラウレート、及びそれら組合せからなる群から選択される、請求項10に記載の組成物。
- 高HLB非イオン性親水性界面活性剤が、エトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステル、エトキシ化脂肪アルコール、エトキシ化脂肪酸、非イオン性ブロックコポリマー、及びそれら組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- エトキシ化ソルビタンモノエステルが、エトキシ化ソルビタンモノラウレート、エトキシ化ソルビタンモノパルミテート、エトキシ化ソルビタンモノステアレート、エトキシ化ソルビタンモノオレエート、及びそれら組合せからなる群から選択される、請求項12に記載の組成物。
- 鉱油が、パラフィン油、スクアラン、プリスタン、ポリイソブテン油、水素添加ポリイソブテン油、ポリデセン油、ポリイソプレン油、ポリイソプロペン油、及びそれら組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- パラフィン油、非イオン性親油性界面活性剤としてのソルビタン脂肪酸モノエステル、低HLB非イオン性親水性界面活性剤としてのエトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステル、及び高HLB非イオン性親水性界面活性剤としての非イオン性ブロックコポリマーを含む、請求項1に記載の組成物。
- ソルビタン脂肪酸モノエステルがソルビタンモノオレエートであり、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステルがエトキシ化ソルビタントリオレエートであり、非イオン性ブロックコポリマーがポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレンポリマー(POE−POP)である、請求項15に記載の組成物。
- パラフィン油が、濃度10%〜40%(v/v)で存在し、ソルビタンモノオレエートが濃度0.2%〜1.5%(w/v)で存在し、エトキシ化ソルビタントリオレエートが濃度2%〜5%(w/v)で存在し、POE−POPが濃度0.1%〜0.5%(w/v)で存在する、請求項16に記載の組成物。
- パラフィン油が、濃度29.3%(v/v)で存在し、ソルビタンモノオレエートが濃度0.6%(w/v)で存在し、エトキシ化ソルビタントリオレエートが濃度3.4%(w/v)で存在し、POE−POPが濃度0.25%(w/v)で存在する、請求項16に記載の組成物。
- 免疫原が、不活性化した病原体、弱毒化した病原体、サブユニット、組換え発現ベクター、及びプラスミド、又はそれら組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 病原体が、ウイルス、細菌、真菌、寄生性原虫、又はそれら組合せからなる群から選択される、請求項19に記載の組成物。
- 免疫原が、不活性化ウイルスである、請求項19に記載の組成物。
- 免疫原が、不活性化ブタサーコウイルス2型(PCV−2)ウイルスである、請求項21に記載の組成物。
- 免疫原が、不活性化した不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌である、請求項19に記載の組成物。
- 請求項19に記載のワクチン組成物を動物に投与するステップを含む、動物中で病原体に対する免疫応答を誘導するための方法。
- 免疫原が、不活性化した病原体、弱毒化した病原体、サブユニット、組換え発現ベクター、及びプラスミド、又はそれら組合せからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 免疫原が、不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌、不活性化ブタサーコウイルス2型(PCV−2)ウイルス、又はそれら組合せからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 1回療法としてワクチン組成物が投与される、請求項25に記載の方法。
- 動物が、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ニワトリ、カモ、及びシチメンチョウからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 投与が筋肉内注射(IM)、皮内注射(ID)、又は皮下注射(SC)である、請求項27に記載の方法。
- 投与が、針なし注射器によって行われる、請求項29に記載の方法。
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