CN101448521A - 猪肺炎支原体疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过给断奶小猪或母猪施用单剂量的有效量的猪肺炎支原体疫苗而对猪接种疫苗以对抗猪肺炎支原体的新方法。猪肺炎支原体疫苗可以是完整或部分细胞灭活或经修饰的活制剂、亚单位疫苗、或核酸或DNA疫苗。

Description

猪肺炎支原体疫苗
通过引用合并
本申请要求于2006年3月3日提交的美国临时专利申请序列号60/778,987的权益。
参考于2004年7月26日提交的美国专利申请序列号10/899,181，于1999年1月15日提交的USSN 09/232,279(于2002年4月23日授予的现在的美国专利号6,376,473)，于1999年1月15日提交的USSN 09/232,469(于2002年9月17日授予的现在的美国专利号6,451,770)，于1999年1月15日提交的USSN 09/232,477(于2001年5月8日授予的现在的美国专利号6,228,846)，于1999年1月15日提交的USSN 09/232,478(于2001年3月27日授予的现在的美国专利号6,207,166)，于1999年1月15日提交的USSN 09/232,479(于2001年4月24日授予的现在的美国专利号6,221,362)，于1999年7月1日提交的USSN09/347,594(于2001年4月17日授予的现在的美国专利号6,217,883)，于2000年5月31日提交的USSN09/583,350(于2003年2月11日授予的现在的美国专利号6,517,843)，于2000年7月14日提交的USSN 09/616,781(于2003年3月18日授予的现在的美国专利号6,534,066)，于2000年10月6日提交的USSN 09/680,228，于2001年2月16日提交的USSN09/784,962，于2001年2月16日提交的USSN 09/784,982(于2003年7月1日授予的现在的美国专利号6,586,412)，于2001年2月16日提交的USSN 09/784,990(于2002年10月15日授予的现在的美国专利号6,464,984)，于2001年2月16日提交的USSN 09/785,055(于2003年5月6日授予的现在的美国专利号6,558,674)，于2002年2月15日提交的USSN 10/077,489(于2004年10月12日授予的现在的美国专利号6,803,361)，于2002年2月28日提交的USSN10/085,519(于2004年11月16日授予的现在的美国专利号6,818,628)，于2002年8月2日提交的USSN 10/211,502，于2002年8月28日提交的USSN 10/229,412，于2002年9月10日提交的USSN10/238,114，于2002年2月18日提交的USSN 10/368,861，于2003年3月18日提交的USSN 10/391,498，于2003年4月4日提交的USSN10/406,686，于2003年12月8日提交的USSN 10/730,206(于2005年6月21日授予的现在的美国专利号6,908,620)，于2004年5月3日提交的USSN 10/838,122，于2004年11月8日提交的USSN10/983,928，于2005年1月19日提交的USSN 11,038,682，于2005年3月14日提交的USSN 11/079,559，于2005年4月15日提交的USSN11/106,780(于2006年2月14日授予的现在的美国专利号6,998,127)，于2005年6月20日提交的USSN 11/156,829，于2005年7月19日提交的USSN 11/184,236，于2005年8月3日提交的USSN11/196,722，于2005年9月25日提交的USSN 11/211,983，于2006年2月6日提交的USSN 11/348,084，于1999年8月31日提交的USSN60/151,564，于2001年9月12日提交的USSN 60/318,686，于2002年3月20日提交的USSN 60/366,014，于2002年4月5日提交的USSN60/370,282，于2002年12月9日提交的USSN 60/432,298，于2003年7月24日提交的USSN 60/490,345，于2003年11月13日提交的USSN 60/519,571，于2004年3月12日提交的USSN 60/522,636，于2004年6月4日提交的USSN 60/576,771，于2004年6月15日提交的USSN 60/581,689，于2004年6月21日提交的USSN 60/581,698、于2004年11月15日提交的USSN 60/627,878，于2005年3月17日提交的USSN 60/662,646和于2005年11月14日提交的USSN60/736,452。
前述申请和在其中或在其处理期间引用的所有文件(“申请引用文件”)，以及申请引用文件中引用或参考的所有文件，以及本文引用或参考的所有文件(“本文引用文件”)，以及本文引用文件中引用或参考的所有文件，连同关于本文或通过引用合并入本文的任何文件中提及的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品规格说明、和产品单，在此通过参考引用并入本文并可以在本发明的实践中使用。
发明领域
本发明提供了猪肺炎支原体疫苗及其施用方法。
发明背景
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)，地方性动物肺炎的起因，仍是养猪业中重要的病原体。这种小的、复杂的生物定殖在呼吸道的纤毛细胞中，导致很少暴露于免疫系统。通常在幼猪中观察到的肺损伤的特征在于上皮细胞的增生以及单核细胞在血管周围和细支气管周围积聚增加。猪肺炎支原体感染后，在猪中观察到免疫反应并且诱导抗性。(在例如Thacker，Anim Health Res Rev.2004 Dec；5(2)：317-20和Kobisch & Friis，Rev Sci Tech.1996 Dec；15(4)：1569-605中综述)。临床症状和损伤发展是猪肺炎支原体的致病能力和肺中的防御反应的结果。肺炎的经济关联性很大程度受在初始猪肺炎支原体感染后常见的继发感染影响。用于诊断单个猪和群体中的肺炎的不同测试是可获得的。治疗和控制并不简单，因为地方性动物肺炎是多因素疾病(在例如Maes等人，VetQ.1996 Sep；18(3)：104-9中综述)。
猪肺炎支原体还与包括几种呼吸系统病原体的多因素呼吸系统综合征-猪呼吸疾病复征(PRDC)相关。最常从具有PRDC临床体征的猪中分离出来的病原体感染免疫系统的细胞或诱导显著的免疫病理表现。因此，PRRSV和猪肺炎支原体，与PRDC相关的2种最常见的病原体，改变呼吸免疫系统对其存在和其他病原体存在应答的能力。通过改变呼吸免疫系统，这2种常见病原体增加对与PRDC相关的许多其他病原体的敏感性(在例如Thacker，Vet Clin North Am Food Anim Pract.2001Nov；17(3)：551-65中综述)。
针对猪肺炎支原体的已知疫苗中的大多数已基于佐剂化的猪肺炎支原体灭活完整细胞制剂。商业来源包括RESPIFEND(Fort Dodge，American Home Products)、HYORESP(MerialLtd)、M+PAC(ScheringPlough)、PROSYSTEMM(Intervet)、INGLEVAC M(Boehringer)、RESPISURE(Pfizer Inc.)、和STELLAMUNE MYCOPLASMA(Pfizer Inc.)。WO 03/003941涉及以针施用的组合物。
仍存在对在单剂量治疗中起作用的有效的猪肺炎支原体疫苗的需要，其易于施用给大量动物且是经济的。猪的几种感染性疾病例如支原体病在过去数年中的流行，已使得必需开发疫苗和伴随的疫苗接种方案。这些方案包括在成熟前给猪接种疫苗，这存在后勤困难，即要接种疫苗的猪的数目多，并且经由针注射的疫苗接种在抓住动物的同时进行-这是费力的，或者不抓住它们-这阻止确实实现施用接种的有效性。此类疫苗将消除多次给药的需要，并从而显著减少与猪群的全世界大量接种疫苗相关的成本和劳力。
本申请中任何文件的引用或确认并非承认此类文件可作为本发明的现有技术得到。
发明概述
本发明提供了治疗或预防动物(有利的是猪)中由猪肺炎支原体感染引起的疾病或病症的方法，所述方法可以包括给动物(有利的是猪)施用有效量的单剂量的猪肺炎支原体疫苗。
猪肺炎支原体疫苗可以包含完整或部分细胞制剂，例如菌苗或经修饰的活制剂，亚单位疫苗，例如可以包含一种或多种猪肺炎支原体衍生的多肽或蛋白质，此类多肽或蛋白质的免疫原性片段，或编码此类蛋白质、多肽或免疫原性片段的一种或多种猪肺炎支原体基因的亚单位疫苗。有利的是，猪肺炎支原体疫苗是灭活的疫苗。在另一个有利的实施方案中，猪肺炎支原体疫苗可以进一步包含佐剂。
本发明的另一点是针对猪肺炎支原体的疫苗接种方法，所述方法可以包括使用液体喷射无针注射器给动物(有利的是猪)施用有效量的猪肺炎支原体疫苗的步骤，所述施用引发针对猪肺炎支原体的安全的和保护性的免疫应答。另一个目的是疫苗接种试剂盒或套组，其可以包含此类液体喷射无针注射器和至少一个包含猪肺炎支原体疫苗的疫苗小瓶，可操作地装配以执行给动物(有利的是猪)施用疫苗，并引发针对猪肺炎支原体的安全的和保护性的免疫应答。
应当指出在本公开内容并且特别在权利要求和/或段落中，术语例如“包含/包括”等可以具有美国专利法中归于其的含义，例如，它们可以意指“包括”等；并且术语例如“基本上由......组成”具有美国专利法中归于其的含义，例如，它们允许未明确描述的要素，但排除在现有技术中发现或影响本发明的基本或新特征的要素。
这些及其他实施方案由以下详述公开、或由以下详述显而易见，并且包括在以下详述中。
详述
本发明提供了治疗或预防动物(有利的是猪)中由猪肺炎支原体感染引起的疾病或病症的方法，所述方法可以包括给动物(有利的是猪)施用有效量的单剂量的猪肺炎支原体疫苗。
如本文所使用的，术语“动物”包括所有脊椎动物，包括人。它还包括处于所有发育阶段包括胚胎和胎儿期的个体动物。特别地，术语“脊椎动物”包括但不限于人、犬科动物(例如，犬)、猫科动物(例如，猫)；马科动物(例如，马)、牛科动物(例如，牛)、猪科动物(例如，猪)、以及禽类。如本文所使用的，术语“禽类”指分类学鸟纲的任何物种或亚种，例如，但不限于鸡(种鸡、适肉鸡和蛋鸡)、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀类、鹰类、鸦类和平胸鸟包括鸵鸟、鸸鹋和鹤鸵。
如本文所使用的，术语“猪”指猪起源的动物。术语“公猪”指预定为雄亲种畜的超过6月龄的整体雄猪。术语“小母猪”指未生产第一窝小崽直至第一次产小猪的幼雌猪。术语“肉猪”指阉割的雄猪。术语“小猪”指幼猪。术语“食用猪”指养殖用于良好的猪肉切割的猪品种。术语“储备用猪(stores)”指可以是约10-12周龄的猪。术语“母猪”指为生育年龄并具有生育能力的雌性或已有第一窝小崽的雌猪。术语“断奶小猪”或“断奶的幼畜”指可以是约11-约24日龄、约2-3周龄、约3-5周龄或约5-8周龄的幼猪。
如本文所使用的，术语“有毒力的”意指保留其在动物宿主中感染性的能力的分离物。
如本文所使用的，术语“灭活的疫苗”意指包含不能再复制或生长的感染性生物或病原体的疫苗组合物。病原体可以是细菌、病毒、原生动物或真菌来源的。灭活可以通过多种方法来完成，包括冻融、化学处理(例如，用硫柳汞或福尔马林处理)、超声处理、辐射、热或足以阻止生物复制或生长同时保留其免疫原性的任何其他常规方法。
如本文所使用的，术语“免疫应答”指在动物中引发的应答。免疫应答可以指细胞免疫(CMI)；体液免疫或可以包含两者。本发明还预期了限于免疫系统一部分的应答。例如，本发明的疫苗组合物可以特异性诱导增加的γ干扰素应答。
如本文所使用的，术语“抗原”或“免疫原”意指在宿主动物中诱导特异性免疫应答的物质。抗原可以包含整个生物，被杀死的、减毒的或活的；生物的亚单位或部分；包含编码免疫原的多核苷酸的重组载体，其在呈递给宿主动物后能够诱导免疫应答；蛋白质、多肽、肽、表位、半抗原或其任何组合。
如本文所使用的，术语“多价”意指包含超过一种来自不同属或种的微生物的抗原的疫苗(例如包含来自多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)、沙门氏菌属(Salmonella)、大肠埃希杆菌(Escherichiacoli)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)和梭菌属(Clostridium)的抗原的疫苗)。
如本文所使用的，术语“佐剂”意指加入疫苗中以增加疫苗的免疫原性的物质。佐剂如何起作用的机制仍未完全了解。某些佐剂被认为通过缓慢释放抗原而增强免疫应答，而其他佐剂更高效率地或有效地将免疫原呈递给宿主免疫系统或刺激特定细胞因子的产生。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的媒介物”可互换使用，并且指用于包含疫苗抗原的可以注射入宿主而无不良效应的流体媒介物。本领域已知的合适的药学上可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖、或缓冲溶液。载体可以包含辅助试剂，包括但不限于稀释剂、稳定剂(即，糖和氨基酸)、防腐剂、湿润剂、乳化剂、pH缓冲剂、粘度增强添加剂、着色剂等。
如本文所使用的，术语“疫苗组合物”包括在药学上可接受的媒介物中用于在宿主中诱导免疫应答的至少一种抗原或免疫原。疫苗组合物可以以剂量并通过医学或兽医学领域技术人员众所周知的技术进行施用，考虑此类因素如接受动物的年龄、性别、体重、物种和状况、以及施用途径。施用途径可以是经皮例如皮内、肌内、皮下。疫苗组合物可以单独施用，或可以与其他处理或治疗共同施用或顺次施用。组合物可以包含辅助物质例如湿润或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、或粘度增强添加剂、防腐剂、着色剂等，取决于期望的施用途径和制剂。可以参考标准药学教科书例如＂Remington′s PharmaceuticalSciences，＂1990以制备合适的制剂，而无需过度实验。
猪肺炎支原体疫苗可以包含完整或部分细胞制剂和/或上清液，例如菌苗或经修饰的活制剂，亚单位疫苗，例如可以包含一种或多种猪肺炎支原体衍生的多肽或蛋白质，此类多肽或蛋白质的免疫原性片段，或编码此类蛋白质、多肽或免疫原性片段的一种或多种猪肺炎支原体基因的亚单位疫苗。有利的是，猪肺炎支原体疫苗是灭活的疫苗。在另一个有利的实施方案中，猪肺炎支原体疫苗可以进一步包含佐剂。
为了获得灭活的免疫或疫苗组合物，病原体在能够支持支原体生长的培养基中产生。所选择的培养基可以包括本领域技术人员已知繁殖支原体的培养基，例如在R.Ross等人Am.J.Vet.Res.1984，45，1899-1905，B.Kristensen等人Am.J.Vet.Res.1981，42，784-788，WO 91/18627，美国专利号5,338,543或其他类似参考文献中描述的。支原体优选在收获后进行灭活，并且任选通过化学处理实施澄清，使用例如福尔马林或甲醛、β-丙内酯、乙烯亚胺、二乙烯亚胺(BEI)、硫柳汞等，和/或通过物理处理(例如，热处理或超声处理)实施澄清。用于灭活的方法是本领域技术人员众所周知的。猪肺炎支原体细菌可以通过甲醛处理(Ross R.F.等人，Am.J.Vet.Res.，1984，45：1899-1905)，通过乙烯亚胺或BEI处理(参见例如WO91/18627)，或通过硫柳汞处理(美国专利号5,968,525和5,338,543)进行灭活。灭活试剂可以被中和或通过纯化步骤去除。
灭活的病原体可以通过常规浓缩技术特别是通过超滤进行浓缩，和/或通过常规纯化方法特别是使用层析技术或通过超滤进行纯化，所述层析技术包括但不限于凝胶过滤。如本文所使用的，术语“免疫原性”意指能够在宿主动物中产生针对一种或多种抗原的免疫应答。这种免疫应答构成了由针对特定感染性生物的疫苗引发的保护性免疫的基础。
本发明的方法可以使用亚单位疫苗进行实践，所述亚单位疫苗含有纯化的猪肺炎支原体免疫原性蛋白质、多肽以及此类蛋白质和多肽的免疫原性片段。此类蛋白质和多肽可以使用本领域已知的技术进行制备。此外，本领域技术人员众所周知的方法可以用于测定蛋白质纯度或同质性，例如样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后在染色凝胶上显现单个多肽条带。较高的分辨率可以使用HPLC或本领域众所周知的其他类似方法确定。在一个具体实施方案中，本发明中使用的疫苗包含猪肺炎支原体的至少一种蛋白质，例如但不限于P46、P65、P97、P102、P70、P50和P44。关于猪肺炎支原体基因组的序列，参考Minion等人，J Bacteriol.2004 Nov；186(21)：7123-33。
在其他实施方案中，本发明的方法中使用的疫苗包含猪肺炎支原体菌苗(灭活的完整或部分细胞或经修饰的活的)或猪肺炎支原体蛋白质或多肽或其免疫原性片段，和至少一种其他的免疫原(灭活的完整或部分细胞或经修饰的活的)或免疫原性或抗原蛋白质、多肽或其免疫原性片段，并且优选是病毒、细菌或寄生虫多肽。在一个进一步的具体实施方案中，此类蛋白质或多肽的免疫原性片段具有这样的序列，其包含本发明的方法中使用的免疫原性蛋白质和多肽的至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95或至少100个连续氨基酸，所述免疫原性蛋白质和多肽包括但不限于P46、P65、P97、P102、P70、P50和P44。
此外，用于疫苗中的猪肺炎支原体蛋白质是基本上纯的或同质的。本发明的方法使用一般由宿主细胞纯化的蛋白质或多肽，所述宿主细胞表达编码这些蛋白质的重组核苷酸序列。此类蛋白质纯化可以通过本领域众所周知的多种方法来完成。参见，例如，＂Methods InEnzymology＂，1990，Academic Press，Inc.，San Diego，＂ProteinPurification：Principles和practice＂，1982，Springer-Verlag，New York中描述的技术。
本发明进一步包括至少一种猪肺炎支原体免疫原，其包含在载体分子或表达载体中，且与启动子元件和任选与增强子可操作地连接。
在一个有利的实施方案中，启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期基因的启动子。
在另一个实施方案中，增强子和/或启动子包括多种细胞或组织特异性启动子(例如，肌肉、内皮细胞、肝脏、体细胞或干细胞)，多种病毒启动子和增强子。肌肉特异性启动子和增强子的例子已得到描述且是本领域技术人员已知的(参见，例如，Li等人，Gene Ther.December 1999；6(12)：2005-11；Li等人，Nat Biotechnol.March1999；17(3)：241-5和Loirat等人，Virology.Jul.20，1999；260(1)：74-83；其公开内容通过引用整体合并)。
可以在本发明中使用的启动子和增强子包括但不限于劳斯肉瘤病毒的LTR、HSV-1的TK、SV40的早期或晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子(MLP)、磷酸甘油酸激酶、金属硫蛋白、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、胶原酶、弹性蛋白酶I、β-肌动蛋白、β-珠蛋白、γ-珠蛋白、甲胎蛋白、肌肉肌酸激酶。
“载体”指重组DNA或RNA质粒或病毒，其包含在体外或体内待递送给靶细胞的异源多核苷酸。异源多核苷酸可以包含用于治疗目的的感兴趣序列，并且可以任选为表达盒的形式。如本文所使用的，载体无需能够在最终靶细胞或受试者中复制。该术语包括克隆载体，也包括病毒载体。
术语“重组”意指半合成、或合成来源的多核苷酸，其在自然界中不存在或以自然界中未发现的排列与另一种多核苷酸连接。
“异源”意指衍生自与相比较的实体的其余部分在遗传上不同的实体。例如，多核苷酸可以通过基因工程技术置于衍生自不同来源的质粒或载体内，并且是异源多核苷酸。从其天然编码序列取出且与除天然序列外的编码序列可操作地连接的启动子是异源启动子。
本发明的多核苷酸可以包含另外的序列，例如在相同转录单位内的另外的编码序列，控制元件例如启动子、核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、在相同或不同启动子控制下的另外的转录单位，允许克隆、表达、同源重组和转化宿主细胞的序列，和可能是提供本发明的实施方案所需要的任何此类构建体。
本发明包括表达猪肺炎支原体免疫原或变体或类似物或片段的载体。用于表达猪肺炎支原体免疫原的元件有利地存在于本发明的载体中。最低限度地，这包含下述元件、或基本上由下述元件组成、或由下述元件组成：起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子、以及任选地还有对于某些载体例如质粒和某些病毒载体例如除痘病毒外的病毒载体的多腺苷酸化序列。当多核苷酸编码多聚蛋白质片段，例如猪肺炎支原体免疫原时，有利的是，在载体中，ATG置于读码框的5′处和终止密码子置于3′处。可以存在用于控制表达的其他元件，例如增强子序列、稳定序列、例如内含子和允许蛋白质分泌的信号序列。
用于制备和/或施用载体或重组体或质粒以在体内或在体外表达本发明的基因的基因产物的方法可以是任何所需方法，例如，通过下述参考文献中公开的或下述参考文献引用的文件中公开的方法，或与之类似的方法：美国专利号4,603,112；4,769,330；4,394,448；4,722,848；4,745,051；4,769,331；4,945,050；5,494,807；5,514,375；5,744,140；5,744,141；5,756,103；5,762,938；5,766,599；5,990,091；5,174,993；5,505,941；5,338,683；5,494,807；5,591,639；5,589,466；5,677,178；5,591,439；5,552,143；5,580,859；6,130,066；6,004,777；6,130,066；6,497,883；6,464,984；6,451,770；6,391,314；6,387,376；6,376,473；6,368,603；6,348,196；6,306,400；6,228,846；6,221,362；6,217,883；6,207,166；6,207,165；6,159,477；6,153,199；6,090,393；6,074,649；6,045,803；6,033,670；6,485,729；6,103,526；6,224,882；6,312,682；6,348,450和6；312,683；于1986年10月16日提交的美国专利申请序列号920,197；WO 90/01543；WO 91/11525；WO 94/16716；WO 96/39491；WO 98/33510；EP 265785；EP 0 370 573；Andreansky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：11313-11318；Ballay等人，EMBO J.1993；4：3861-65；Felgner等人，J.Biol.Chem.1994；269：2550-2561；Frolov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：11371-11377；Graham，Tibtech 1990；8：85-87；Grunhaus等人，Sem.Virol.1992；3：237-52；Ju等人，Diabetologia 1998；41：736-739；Kitson等人，J.Virol.1991；65：3068-3075；McClements等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：11414-11420；Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：11341-11348；Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；93：11349-11353；Pennock等人，Mol.Cell.Biol.1984；4：399406；Richardson(Ed)，Methods in Molecular Biology 1995；39，＂Baculovirus Expression Protocols，＂Humana Press Inc.；Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.1983；3：2156-2165；Robertson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：11334-11340；Robinson等人，Sem.Immunol.1997；9：271；和Roizman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：11307-11312。因此，本发明中的载体可以是任何合适的重组病毒或病毒载体，例如痘病毒(例如，痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、鸡痘病毒、浣熊痘病毒、猪痘病毒等)，腺病毒(例如，人腺病毒、犬腺病毒)，疱疹病毒(例如犬疱疹病毒)，杆状病毒，逆转录病毒等(如在通过引用合并入本文的文件中)；或该载体可以是质粒。本文引用或通过引用合并入本文的文件除了提供在本发明的实践中有用的载体的例子外，还可以提供关于待由一种或多种载体表达的非猪肺炎支原体免疫原的来源，例如非猪肺炎支原体免疫原，非猪肺炎支原体免疫原肽或其片段、细胞因子等，所述载体在本发明的组合物中或包括在本发明的组合物中。
本发明还涉及包含载体例如表达载体的制剂，例如治疗组合物。制剂可以包含一种或多种载体，基本上由一种或多种载体组成，或由一种或多种载体组成，所述载体例如表达载体，例如体内表达载体，包含一种或多种猪肺炎支原体免疫原，基本上由一种或多种猪肺炎支原体免疫原组成，或由一种或多种猪肺炎支原体免疫原组成(并有利地表达一种或多种猪肺炎支原体免疫原)。有利的是，载体包含并表达这样的多核苷酸，其包含编码一种或多种猪肺炎支原体免疫原的编码区，或基本上由编码一种或多种猪肺炎支原体免疫原的编码区组成，或由编码一种或多种猪肺炎支原体免疫原的编码区组成；药学上或兽医学可接受的载体、赋形剂或媒介物。因此，根据本发明的一个实施方案，制剂中的其他一种或多种载体包含这样的多核苷酸，基本上由这样的多核苷酸组成，或由这样的多核苷酸组成，所述多核苷酸编码猪肺炎支原体免疫原的一种或多种其他蛋白质或其片段，并且在合适环境下该载体表达猪肺炎支原体免疫原的一种或多种其他蛋白质或其片段。
根据另一个实施方案，制剂中的一种或多种载体包含这样的多核苷酸，基本上由这样的多核苷酸组成，或由这样的多核苷酸组成，所述多核苷酸编码编码猪肺炎支原体免疫原的一种或多种蛋白质或其片段，所述一种或多种载体具有所述多核苷酸的表达。本发明的制剂有利地包含至少2种载体，基本上由至少2种载体组成，或由至少2种载体组成，所述载体包含来自不同猪肺炎支原体分离株的编码相同蛋白质和/或不同蛋白质(但有利的是相同蛋白质)的多核苷酸，基本上由来自不同猪肺炎支原体分离株的编码相同蛋白质和/或不同蛋白质(但有利的是相同蛋白质)的多核苷酸组成，或由来自不同猪肺炎支原体分离株的编码相同蛋白质和/或不同蛋白质(但有利的是相同蛋白质)的多核苷酸组成，并且有利地在体内在适当的条件下或合适的条件下或在合适的宿主细胞中，有利地还表达来自不同猪肺炎支原体分离物的编码相同蛋白质和/或不同蛋白质(但有利的是相同蛋白质)的多核苷酸。包含一种或多种载体的制剂包含这样的多核苷酸，基本上由这样的多核苷酸组成，或由这样的多核苷酸组成，所述多核苷酸编码并有利地表达(有利地在体内)猪肺炎支原体肽、融合蛋白或其表位。
根据本发明的一个实施方案，表达载体是病毒载体，特别是体内表达载体。在一个有利的实施方案中，表达载体是腺病毒载体。有利的是，腺病毒是人Ad5载体，E1缺失和/或E3缺失型腺病毒。
在一个具体实施方案中，病毒载体是痘病毒，例如痘苗病毒或减毒的痘苗病毒(例如，MVA，安卡拉疫苗株在鸡胚成纤维细胞上超过570次传代后获得的经修饰的安卡拉株；参见Stickl &Hochstein-Mintzel，Munch.Med.Wschr.，1971，113，1149-1153；Sutter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1992，89，10847-10851；可作为ATCC VR-1508获得；或NYVAC，参见美国专利号5,494,807，例如美国专利号5,494,807中讨论NYVAC的构建的实施例1-6等，以及从哥本哈根株痘苗病毒基因组中删除另外的ORF，并且异源编码核酸分子插入这种重组体的位点内的NYVAC变体，以及匹配启动子的使用；还参见WO96/40241)，禽痘病毒或减毒的禽痘病毒(例如，金丝雀痘、鸡痘、鸠痘、鸽痘、鹌鹑痘、ALVAC或TROVAC；参见，例如，美国专利号5,505,941、5,494,807)猪痘，浣熊痘，骆驼痘或粘液瘤病病毒。
根据本发明的另一个实施方案，痘病毒载体是金丝雀痘病毒或鸡痘病毒载体，有利的是减毒的金丝雀痘病毒或鸡痘病毒。在这点上，提及在登录号VR-111下可从ATCC获得的金丝雀痘。减毒的金丝雀痘病毒在美国专利号5,756,103(ALVAC)和WO01/05934中得到描述。众多鸡痘病毒疫苗接种株也是可获得的，例如由MERIAL上市的DIFTOSEC CT株，和由INTERVET上市的NOBILIS VARIOLE疫苗；并且还参考涉及减毒的鸡痘病毒株TROVAC的美国专利号5,766,599。
关于产生其重组体和如何施用其重组体的方法的信息，技术人员可以参考本文引用的文件和WO90/12882，例如，关于痘苗病毒，特别提及美国专利号4,769,330，4,722,848，4,603,112，5,110,587，5,494,807和5,762,938；关于鸡痘，特别提及美国专利号5,174,993，5,505,941和美国专利号5,766,599；关于金丝雀痘特别提及美国专利号5,756,103；关于猪痘特别提及美国专利号5,382,425；和关于浣熊痘，特别提及WO00/03030。
当表达载体是痘苗病毒时，待表达的一种或多种多核苷酸的一个或多个插入位点有利地在胸苷激酶(TK)基因或插入位点、血凝素(HA)基因或插入位点、编码A型包含体(ATI)的区域处；还参见本文引用的文件，特别是涉及痘苗病毒的那些。在金丝雀痘的情况下，有利的是一个或多个插入位点是ORF(s)C3，C5和/或C6；还参见本文引用的文件，特别是涉及金丝雀痘病毒的那些。在鸡痘的情况下，有利的是一个或多个插入位点是ORFsF7和/或F8；还参见本文引用的文件，特别是涉及鸡痘病毒的那些。MVA病毒区域的一个或多个插入位点有利地如多种出版物中所述，包括CarrollM.W.等人，Vaccine，1997，15(4)，387-394；StittelaarK.J.等人，J.Virol.，2000，74(9)，4236-4243；SutterG.等人，1994，Vaccine，12(11)，1032-1040；并且，在这方面，还应当指出完整的MVA基因组在AntoineG.，Virology，1998，244，365-396中得到描述，所述参考文献使得技术人员能够使用其他插入位点或其他启动子。
有利的是，待表达的多核苷酸插入在特定痘病毒启动子的控制下，例如，特别是痘苗启动子7.5kDa(Cochran等人，J.Virology，1985，54，30-35)，痘苗启动子I3L(Riviere等人，J.Virology，1992，66，3424-3434)，痘苗启动子HA(Shida，Virology，1986，150，451-457)，牛痘启动子ATI(Funahashi等人，J.Gen.Virol.，1988，69，35-47)，痘苗启动子H6(TaylorJ.等人，Vaccine，1988，6，504-508；GuoP.等人J.Virol.，1989，63，4189-4198；Perkus M.等人，J.Virol.，1989，63，3829-3836)。
在一个具体实施方案中，病毒载体是腺病毒，例如人腺病毒(HAV)或犬腺病毒(CAV)。
在一个实施方案中，病毒载体是人腺病毒，特别是血清型5腺病毒，通过病毒基因组E1区中的缺失致使无法复制，特别是约核苷酸459-约核苷酸3510，参考Genbank中在登录号M73260下和参考的出版物J.Chroboczek等人Virol.1992，186，280-285中公开的hAd5序列。缺失型腺病毒在表达E1的293(F.Graham等人J.Gen.Virol.1977，36，59-72)或PER细胞特别是PER.C6细胞(F.Falloux等人Human Gene Therapy 1998，9，1909-1917)中进行繁殖。人腺病毒可以在E3区中缺失，特别是约核苷酸28592-约核苷酸30470。E1区中的缺失可以与E3区中的缺失组合完成(参见，例如J.Shriver等人Nature，2002，415，331-335，F.Graham等人Methods inMolecular Biology第7卷：Gene Transfer and Expression Prot ocolsEdited by E.Murray，The Human Press Inc，1991，第109-128页；Y.Ilan等人Proc.Natl.Acad.Sci.1997，94，2587-2592；美国专利号6,133,028；美国专利号6,692,956；S.Tripathy等人Proc.Natl.Acad.Sci.1994，91，11557-11561；B.Tapnell Adv.DrugDeliv.Rev.1993，12，185-199；X.Danthinne等人Gene Thrapy 2000，7，1707-1714；K.Berkner Bio Techniques 1988，6，616-629；K.Berkner等人Nucl.Acid Res.1983，11，6003-6020；C.Chavier等人J.Virol.1996，70，4805-4810)。插入位点可以是最终在E1和/或E3区域部分或完全缺失后的E1和/或E3基因座(区域)。有利的是，当表达载体是腺病毒时，待表达的多核苷酸插入在真核细胞中有功能的启动子的控制下，例如强启动子，优选巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV-IE启动子)，特别是M.Boshart等人Cell 1985，41，521-530中的约核苷酸-734至约核苷酸+7的增强子/启动子区，或来自Promega Corp的pCI载体的增强子/启动子区。CMV-IE启动子有利地是鼠源或人源的。还可以使用延伸因子1α的启动子。在一个具体实施方案中，可以使用由缺氧调节的启动子，例如K.Boast等人Human Gene Therapy 1999，13，2197-2208中描述的启动子HRE。还可以使用肌特异性启动子(X.Li等人Nat.Biotechnol.1999，17，241-245)。强启动子还在本文中关于质粒载体进行讨论。在一个实施方案中，剪接序列可以位于增强子/启动子区的下游。例如，从CMV-IE基因中分离的内含子1(R.Stenberg等人J.Virol.1984，49，190)，从兔或人β-珠蛋白基因中分离的内含子，特别是来自b-珠蛋白基因的内含子2，从免疫球蛋白基因中分离的内含子，来自SV40早期基因的剪接序列或从来自Promege Corp的pCI载体中分离的嵌合体内含子序列，其包含与小鼠免疫球蛋白受体序列(在Genbank中在登录号CVU47120下的约核苷酸890-约核苷酸1022)融合的人β-珠蛋白供体序列。多聚(A)序列和终止子序列可以插入待表达的多核苷酸下游，例如牛生长激素基因特别是在Genbank中在登录号BOVGHRH下的约核苷酸2339-约核苷酸2550，兔β-珠蛋白基因或SV40晚期基因多腺苷酸化信号。
在另一个实施方案中，病毒载体是犬腺病毒，特别是CAV-2(参见，例如，L.Fischer等人Vaccine，2002，20，3485-3497；美国专利号5,529,780；美国专利号5,688,920；PCT申请号WO95/14102)。对于CAV，插入位点可以在E3区和/或位于E4区和右ITR区之间的区域中(参见美国专利号6,090,393；美国专利号6,156,567)。在一个实施方案中，插入片段在启动子的控制下，例如巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV-IE启动子)或已对人腺病毒载体描述的启动子。多聚(A)序列和终止子序列可以插入待表达的多核苷酸下游，例如牛生长激素基因或兔β-珠蛋白基因多腺苷酸化信号。
在另一个具体实施方案中，病毒载体是疱疹病毒例如伪狂犬病病毒(PRV)。对于PRV，插入位点可以特别在胸苷激酶基因中，在gE基因中，或在UL43 ORF中(参见WO 96/13575，WO 87/04463)。在一个实施方案中，待表达的多核苷酸插入在真核细胞中有功能的启动子的控制下，优选CMV-IE启动子(鼠或人)。在一个具体实施方案中，可以使用由缺氧调节的启动子，例如K.Boast等人Human GeneTherapy 1999，13，2197-2208中描述的启动子HRE。多聚(A)序列和终止子序列可以插入待表达的多核苷酸下游，例如牛生长激素或兔β-珠蛋白基因多腺苷酸化信号。
根据本发明的一个再进一步的实施方案，表达载体是质粒载体或DNA质粒载体，特别是体内表达载体。在一个具体的、非限制性例子中，pVR1020或1012质粒(VICAL Inc.；LukeC.等人，Journal ofInfectious Diseases，1997，175，91-97；Hartikka J.等人，HumanGene Therapy，1996，7，1205-1217，参见，例如，美国专利号5,846,946和6,451,769)可以用作载体用于插入多核苷酸序列。pVR1020质粒衍生自pVR1012并且包含人tPA信号序列。在一个实施方案中，人tPA信号包含在Genbank中在登录号HUMTPA14下的氨基酸M(1)-氨基酸S(23)。在另一个具体的、非限制性例子中，用作载体用于插入多核苷酸序列的质粒可以包含在Genbank中在U28070登录号下的氨基酸M(24)-氨基酸A(48)的马IGF1的信号肽序列。关于可以在实践中参考或使用的DNA质粒的另外信息在例如美国专利号6,852,705；6,818,628；6,586,412；6,576,243；6,558,674；6,464,984；6,451,770；6,376,473和6,221,362中找到。
术语质粒涵盖任何DNA转录单位，其包含根据本发明的多核苷酸和其在所需宿主或靶的细胞中体内表达所必需的元件；并且在这方面，应当指出超螺旋结构或非超螺旋结构、环状质粒以及线性形式旨在包括在本发明的范围内。
每个质粒包含或含有或基本上组成为：除了包含编码猪肺炎支原体免疫原或其变体、类似物或片段的多核苷酸外，其还与启动子可操作地连接或在启动子的控制下或依赖启动子。一般而言，利用在真核细胞中有功能的强启动子是有利的。优选的强启动子是人源或鼠源的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，或任选其它来源例如大鼠或豚鼠。CMV-IE启动子可以包含实际启动子部分，其可以与增强子部分结合或不结合。可以参考EP-A-260 148，EP-A-323 597，美国专利号5,168,062，5,385,839和4,968,615，以及PCT申请号WO87/03905。CMV-IE启动子有利地是人CMV-IE(BoshartM.等人，Cell.，1985，41，521-530)或鼠类CMV-IE。
更一般而言，启动子具有病毒或细胞来源。可以在本发明的实践中成功使用的除CMV-IE外的强病毒启动子是SV40病毒的早期/晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可以在本发明的实践中成功使用的强细胞启动子是细胞骨架的基因的启动子，例如结蛋白启动子(Kwissa M.等人，Vaccine，2000，18，2337-2344)，或肌动蛋白启动子(Miyazaki J.等人，Gene，1989，79，269-277)。
这些启动子的功能亚片段即这些启动子中保留足够的启动活性的部分包括在本发明内，例如，根据PCT申请号WO98/00166或美国专利号6,156,567的截短的CMV-IE启动子可以用于本发明的实践中。在本发明的实践中的启动子因此包括全长启动子的衍生物和亚片段，其保留足够的启动活性且因此充当启动子，优选地基本上类似于衍生物或亚片段所来源的实际或全长启动子的启动活性，例如象美国专利号6,156,567的截短的CMV-IE启动子的活性类似于全长CMV-IE启动子的活性。因此，在本发明的实践中的CMV-IE启动子可以包含全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分、以及衍生物和亚片段，或基本上由其组成，或由其组成。
优选地，质粒包含其他表达控制元件，或基本上由其他表达控制元件组成。掺入稳定序列例如内含子序列是特别有利的，优选hCMV-IE的第一个内含子(PCT申请号WO89/01036)，兔b-珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等人，Science，1979，206，337-344)。
关于用于质粒和除痘病毒外的病毒载体的多腺苷酸化信号(多聚A)，可以使用牛生长激素(bGH)基因的多聚(A)信号(参见美国专利号5,122,458)，或兔β-珠蛋白基因的多聚(A)信号或SV40病毒的多聚(A)信号。
根据本发明的另一个实施方案中，表达载体是用于在合适的细胞系统中体外表达蛋白质的表达载体。所表达的蛋白质可以在培养上清液中收获或由培养上清液收获，在分泌后或不在分泌后进行收获(如果不存在分泌，那么一般发生或执行细胞裂解)，任选通过浓缩方法例如超滤进行浓缩，和/或通过纯化方法例如亲和、离子交换或凝胶过滤类型的层析法进行纯化。
可以在本发明中使用的宿主细胞包括但不限于肌细胞、角质形成细胞、成肌细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、vero细胞、BHK21、sf9细胞等。本领域技术人员应当理解用于培养宿主细胞的条件根据特定基因而改变，并且常规实验有时是必要的，以测定取决于宿主细胞用于培养猪肺炎支原体的最适条件。
“宿主细胞”指已在遗传上改变，或能够通过施用外源多核苷酸例如重组质粒或载体而在遗传上改变的原核或真核细胞。当指的是遗传上改变的细胞时，该术语指原始改变的细胞及其后代。
包含所需序列的多核苷酸可以插入合适的克隆或表达载体内，并且载体进而可以引入合适的宿主细胞内用于复制和扩增。多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法引入宿主细胞内。包含目的多核苷酸的载体可以通过众多合适的方法中的任何一种引入宿主细胞内，包括直接摄取，胞吞作用，转染，f-接合，电穿孔，使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击；脂转染；和感染(当载体是感染性的，例如逆转录病毒载体)。引入载体或多核苷酸的选择通常将依赖宿主细胞的特征。
在一个有利的实施方案中，本发明提供了施用治疗有效量的制剂用于在靶细胞中递送和表达猪肺炎支原体免疫原。治疗有效量的确定是本领域普通技术人员的常规实验。在一个实施方案中，制剂包含表达载体，所述表达载体包含表达猪肺炎支原体免疫原的多核苷酸和药学或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂。在一个有利的实施方案中，药学或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂促进转染和/或改善载体或蛋白质的保存。
药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂是本领域技术人员众所周知的。例如，药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是0.9％ NaCl(例如，盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可以用于本发明的方法的其他药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂包括但不限于，聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是促进载体(或在体外由本发明的载体表达的蛋白质)的施用的任何化合物或化合物的组合；有利的是，载体、媒介物或赋形剂可以促进转染和/或改善载体(或蛋白质)的保存。剂量和剂量体积在本文的一般描述中讨论，并且也可以由技术人员根据本公开内容结合本领域中的知识进行确定，而无需过度实验。
有利但并非唯一适合于质粒的包含季铵盐的阳离子脂质有利地是具有下式的那些：
Figure A200780013976D00221
其中R1是具有12-18个碳原子的饱和或不饱和的直链脂肪族基团，R2是包含2或3个碳原子的另一种脂肪族基团，而X是胺或羟基基团，例如DMRIE。在另一个实施方案中，阳离子脂质可以与中性脂质例如DOPE结合。
在这些阳离子脂质中，优先考虑DMRIE(N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-双(十四烷氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，有利地结合中性脂质，有利的是DOPE(二油酰-磷脂酰-乙醇胺；BehrJ.P.，1994，Bioconjugate Chemistry，5，382-389)，以形成DMRIE-DOPE。
有利的是，质粒与佐剂的混合物临时并有利地与制剂的施用同时或在制剂施用前不久形成；例如，在施用前不久形成质粒-佐剂混合物，有利地致使在施用前给予足够的时间使混合物形成复合物，例如在施用前约10-约60分钟，例如在施用前约30分钟。
当DOPE存在时，DMRIE：DOPE摩尔比有利地为约95:约5-约5:约95，更有利的是约1:约1，例如，1:1。
根据本发明的免疫原性组合物和疫苗有利地包含一种或多种佐剂，或基本上由一种或多种佐剂组成。在本发明实践中使用的合适佐剂是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、马来酸酐和烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如具有一个或多个非甲基化的CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman D.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1996，93，2879-2883；WO98/16247)，(3)水包油乳剂，例如由M.Powell，M.Newman，Plenum Press1995出版的＂VaccineDesign，The Subunit and Adjuvant Approach＂的第147页上描述的SPT乳剂，和同一著作第183页上描述的乳剂MF59，(4)包含季铵盐的阳离子脂质，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝或(7)皂苷，(8)溴化二甲基双十八烷基铵(Vaccine Design第157页)，(9)Aridine(Vaccine Design第148页)在引用和通过引用合并入本申请的任何文件中讨论的其他佐剂，或(8)其任何组合或混合物。
特别适合于病毒载体的水包油乳剂(3)可以基于：轻液态石蜡(欧洲药典类型)，类异戊二烯油例如角鲨烷，角鲨烯，烯烃寡聚化产生的油，例如异丁烯或癸烯，具有直链烷基的酸或醇的酯，例如蔬菜油，油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或支链脂肪醇或酸的酯，特别是异硬脂酸酯。
油与乳化剂组合使用以形成乳剂。乳化剂可以是非离子型表面活性剂，例如：一方面山梨聚糖、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油或丙二醇，和另一方面油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟硬脂酸的酯，所述酯任选是乙氧基化的，或聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如Pluronic，例如L121。
丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物(1)优选特别与糖或多元醇的聚烯基醚交联。这些化合物以术语卡波姆为人所知(Pharmeuropa第8卷，No.2，1996年6月)。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462，其描述了与具有至少3个羟基、优选不超过8个的多羟基化合物交联的此类丙烯酸聚合物，其中至少3个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团替换。优选的基团是包含2-4个碳原子的那些，例如乙烯基、烯丙基和其他乙烯不饱和基团。不饱和基团其自身可以包含其他取代基，例如甲基。在名称CarbopolTM(BFGoodrich，Ohio，USA)下出售的产品是特别合适的。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。在它们中，可以提及CarbopolTM 974P、934P和971 P。
在马来酸酐和烯基衍生物的共聚物中，EMATM共聚物(Monsanto)是优选的，其为马来酸酐和乙烯的共聚物，其为线性或交联的，例如与二乙烯醚交联。可以参考J.Fields等人，Nature，186：778-780，Jun.4，1960。
有用的佐剂比例是本领域技术人员众所周知的并且容易获得的。例如，最终疫苗组合物中的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或马来酸酐和烯基共聚物的浓度将为0.01％-1.5％W/V，更特别地0.05-1％W/V，优选0.1-0.4％W/V。
在一个有利的实施方案中，佐剂是于2004年7月26日提交且于2005年4月14日作为美国专利公开号2005/0079185公开的美国专利申请序列号10/899,181中公开的佐剂。在一个有利的实施方案中，佐剂是TS6佐剂。
任选地根据本发明的方法使用的疫苗可以包含细胞因子。细胞因子可以作为蛋白质或作为插入重组病毒载体内的编码这种细胞因子的基因存在。细胞因子可以在猫科细胞因子中进行选择，例如猫白介素18(fIL-18)(TaylorS.等人，DNA Seq.，2000，10(6)，387-394)，fIL-16(Leutenegger C.M.等人，DNA Seq.，1998，9(1)，59-63)，fIL-12(FehrD.等人，DNA Seq.，1997，8(1-2)，77-82；ImamuraT.等人，J.Vet.Med.Sci.，2000，62(10)，1079-1087)和猫科GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)(GenBank AF053007)。
在一个具体实施方案中，药物组合物直接在体内施用，并且编码的产物由载体在宿主中进行表达。有利的是，根据本发明的药物和/或治疗组合物和/或制剂包含引发治疗反应有效量的如本文所讨论的一种或多种表达载体和/或多肽，或基本上由其组成，或由其组成；有效量可以根据本公开内容，包括合并入本文的文件，和本领域的知识进行确定，而无需过度实验。
在基于质粒载体的治疗和/或药物组合物的情况下，一般而言，剂量可以包含下述量的表达猪肺炎支原体免疫原的质粒，基本上由其组成，或由其组成：约1μg-约2000μg，优选约50μg-约1000μg，和更优选约100μg-约800μg。当基于质粒载体的治疗和/或药物组合物用电穿孔施用时，质粒的剂量一般为约0.1μg-1mg，有利的是约1μg-100μg，有利的是约2μg-50μg。治疗和/或药物组合物每剂包含约104-约1011，有利的是105-约1010，和更更有利的是约106-约109表达猪肺炎支原体免疫原的重组腺病毒的病毒颗粒。在基于痘病毒的治疗和/或药物组合物的情况下，剂量可以为约102pfu-约109pfu。药物组合物每剂包含约105-109，有利的是约106-108pfu表达猪肺炎支原体免疫原的痘病毒或疱疹病毒重组体。
本领域技术人员应当理解本文的公开内容通过举例方式提供，并且本发明并不限于此。根据本文的公开内容和本领域的知识，技术人员可以确定施用次数、施用途径、和对于每种注射方案待使用的剂量，而无需过度实验。
本发明预期了给动物施用至少一次有效量的根据本发明制备的治疗组合物。动物可以是雄性的、雌性的、妊娠雌性和新生儿。这种施用可以经由各种途径，包括但不限于肌内(IM)、皮内(ID)或皮下(SC)注射或经由鼻内或经口施用。根据本发明的治疗组合物还可以通过无针装置(例如用Pigjet、Biojector或Vitajet装置(Bioject，Oreg.，USA))进行施用。施用质粒组合物的另一种方法是使用电穿孔(参见，例如，S.Tollefsen等人Vaccine，2002，20，3370-3378；S.Tollefsen等人Scand.J.Immunol.，2003，57，229-238；S.Babiuk等人，Vaccine，2002，20，3399-3408；PCT申请号WO99/01158)。在另一个实施方案中，质粒通过基因枪或金颗粒轰击递送给动物。在一个有利的实施方案中，动物是猪。
有利的是，猪肺炎支原体疫苗施用于断奶的猪(约2-3周龄)。猪可以是约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19日龄、约20、约21、约22、约23、约24日龄。必要时可以在第一次施用后约3-5周进行加强施用。在另一个有利的实施方案中，本发明的猪肺炎支原体疫苗施用于母猪，从而使得小猪获得针对猪肺炎支原体的免疫性。施用是皮肤的(表皮和真皮)或皮下的(皮下组织和/或皮下和/或肌内)，有利地在颈部，更有利地在耳尾侧的颈部区域中。这种施用途径可以允许将免疫原靶向至树突状朗格汉斯细胞。
液体喷射无针注射器是通过微小孔口在高压下执行特定量液体注射的设备。注射器的机械规格可以调节或选择，以便控制穿透组织的深度。使用注射器或无针注射器施用液体导致液体在组织中的不同分布。使用注射器(syringe)导致局限性团块或池。使用注射器(injector)导致在靶向组织的层中弥散分布，如WO-A-01/13975中举例说明的。在一个有利的实施方案中，无针注射是DERMA-VAC NF透皮接种器系统。
穿透深度主要由液体压力控制。这种液体压力取决于注射器的机械规格，例如弹簧或任何其他推进工具的强度以及活塞和喷嘴孔口的直径。这对于本领域技术人员是容易获得的。
注射深度可以在优选具有与预期疫苗相同粘度的有色液体施用后，通过对注射部位的组织(优选对应疫苗待施用的位置，和测试有利的是对与待接种疫苗的群体相同的物种和年龄的动物进行)进行解剖而容易地确定。这种测试可以直接用进一步包含染料的预期疫苗来进行。这种测试允许本领域技术人员调整注射器的机械规格。
无针注射器可以配备包含一个或数个喷嘴的头部。数个喷嘴的使用允许增加疫苗在更大面积上的分散模式。可以存在1-10个喷嘴，优选1-6个。
几种注射器是商购可得的。VitajetTM3(Bioject Inc.)特别适合于根据本发明的方法。
使用配备允许标准小瓶或安瓿直接配合注射器的工具的注射器是有利的。另外，疫苗小瓶可以包含几个疫苗剂量，允许使用注射器和同一小瓶几次注射疫苗和/或给几个动物接种疫苗。因此，注射器优选能够执行从同一小瓶的连续注射。
在本发明的一个方面，针对猪肺炎支原体的疫苗接种可以与针对另一种猪疾病的疫苗接种结合。疫苗包含根据本发明的猪肺炎支原体疫苗和能够保护对抗其他猪疾病的疫苗组分。
注射的剂量体积可以是约0.1ml-约1.0ml，优选地约0.1ml-约0.8ml，更优选地约0.2ml-约0.5ml。根据定义，一剂的体积意指一次施用于一个动物的疫苗总体积。
疫苗可以包含约104.5-约108.0 TCID50/剂(50％组织培养感染剂量/剂疫苗)和优选地约105.5-约106.5 TCID50/剂。
任选地，必要或需要时，可以以合适的间隔作为加强施用进行重复施用，例如在第一次施用后约2-约8周，和优选在第一次施用后约3-约5周。加强施用还可以每年重复进行，特别是对于母猪。
本发明的另一个目的是使用有效量的如上所述的猪肺炎支原体疫苗和可接受的媒介物或稀释剂，用于制备设计为如上所述使用液体喷射无针注射器施用于动物的疫苗，并且导致引发针对猪肺炎支原体的安全的和保护性的免疫应答。
另一个目的是疫苗接种试剂盒或套组，其包含此类液体喷射无针注射器和至少一个包含猪肺炎支原体疫苗的疫苗小瓶，可操作地装配以执行给猪科的动物施用疫苗。疫苗的分布基本上在真皮和皮下组织中完成。
此类疫苗接种试剂盒或套组能够引发针对猪肺炎支原体的安全的和保护性的免疫应答。
本发明现在将通过下述非限制性实施例进行进一步描述。
实施例1：新猪肺炎支原体菌苗的无针透皮递送的功效和安全性
猪肺炎支原体仍是猪中的呼吸系统疾病的主导病因之一。疫苗接种现在是全球标准管理实践的组成部分。将增加疫苗接种程序的总效率的任何改善将是非常需要的。这些将包括通过新制剂和抗原呈递改善的疫苗功效，改善的依从性、对于动物和疫苗接种者改善的安全性、和消除针在最终产物中的危险(参见，例如，Almond G.W.和J.D.Roberts，2004，Assessment of a Needleless Injection Device forIron Dextran administration to piglets，Proceedings of the IPVS，618；Houser T.A.，J.G.Sebranek，T.J.Baas，B.J.Thacker，D.Nilubol和E.L.Thacker，2002，Feasibility of Transdermal，Needleless Injections for Prevention of Pork Carcass Defectshttp://www.ipic.iastate.edu/reports/02swinereports/asl-1814.pdf；Meredith M.J.，2004，AASV New archive，Needle-FreeVaccination http://www.aasp.org/news/stroy.php？id＝1279；SweatJ.M.，M.Abdy，B.G.Weniger，R.Harrington，B.Coyle，R.A.Abuknesha和E.P.J.Gibbs，2000，Safety Testing of Needle Free，Jet Injection Devices to Detect Contamination with Blood andOther Tissue Fluids，Annals of the New York Academy of Sciences916：681-682和Willson P.，2004，Council Research News，Needle-Free Immunization as Effective as Needle and SyringeMethod http://www.manitobapork.com/admin/docs/research_news_ly.pdf)。
特别设计为使用DERMA-VACTMNF Transdermal Vaccinator System透皮施用的新制剂的长期功效和安全性在这个实施例中呈现。无针施用具有解决这些目的的安全性和质量方面以及提供疫苗向免疫系统的优化呈递的潜力(参见，例如，Charreyre C.，F.Milward，R.Nordgren和G.Royer，2005，Demonstration of efficacy in pigs of Mycoplasmahyopneumoniae experimental vaccines by an innovativeneedle-free route，Proceedings of the American Association ofSwine Veterinarians)。
16-19日龄的48头常规猪从源自低猪肺炎支原体发病率猪群的常规圈(dam)获得。
疫苗接种用DERMA-VAC NF Transdermal Vaccinator System来进行。这种设备使用压缩空气以递送0.5ml特别配制的菌苗。在耳尾侧的颈部区域中用配制用于无针施用的猪肺炎支原体菌苗对猪进行注射。疫苗在动物到达试验场所当天(第0天)进行施用。
猪按照平行实验组(replicate)分圈饲养，平行实验组中的所有成员由同窝出生的仔畜组成。在平行实验组内将猪随机分配到处理组，从而使得平行实验组中的每个处理组有相同表现：
·组1(24头猪)由未疫苗接种的对照组成。
·组2(24头猪)通过透皮途径进行疫苗接种。
猪饲养在适合于其年龄和大小的环境控制的建筑物中。从第0天到第21天，猪饲养在前保育室(pre-nursery)内固边围栏中架高的、商业化的猪用塑料槽式地板上。从第21天直到第51天，猪饲养在常规保育室中。保育室设施利用在凹坑上具有电镀金属木栅门围栏的商业化的猪用塑料槽式地板。从第51天到尸检(第189、190或191天)，猪饲养在利用在凹坑上具有电镀金属木栅门围栏的混凝土板条的最后建筑物中。在研究至始至终维持平行圈养。饲料和水可随意获得。
在第2天(实验场外)，第21、42、125、155天(攻击前)，以及在第189、190或191天(尸检当天)采集血液样品。检测来自血液样品的血清以测定猪肺炎支原体ELISA抗体滴度。
在第160和161天时，所有猪用25ml猪肺炎支原体肺匀浆以1/100稀释度用Friis(猪肺炎支原体232株)进行鼻内攻击。在第162天时，猪经由鼻内途径接受20ml猪肺炎支原体SC2株的预先冷冻的培养物。攻击材料用注射器施用到用手限制的、警醒的猪的双侧鼻孔开口中。
在尸检时，取出肺、进行拍照并就猪肺炎支原体特征性的肺炎组织的百分比进行评分。肺由对处理指定不知情的2个不同个体进行独立评分。特别地，对于每个动物测定损伤累及的肺的总百分比。肺炎组织的百分比通过前(cranial)叶、中叶和下(caudal)叶的背侧和腹侧表面以及副叶的所有可视表面的目视观察进行评估。肺炎组织中的损伤百分比的计算基于如表1中所示的每个叶表示的总肺质量的百分比。
表1：用于计算肺炎组织中的损伤百分比的每个叶表示的总肺质量的百分比。
 
左前叶 7％ 左中叶 7％
左尾叶 30％ 右前叶 12％
右中叶 7％ 右尾叶 32％
副叶 5％
在一个分开的现场安全性研究中，位于美国的3个不同地理区域(MO、PA、NC)中的商业场所的663头猪用配制用于无针施用的Merial猪肺炎支原体菌苗的2个不同许可前系列之一进行疫苗接种。菌苗使用DERMA-VAC NF Transdermal Vaccinator System进行施用。就注射后的全身不良事件对猪进行观察。在所有猪中在第1、3、7、14和21天时以及在具有持续注射部位肿胀的猪中在第34或35天时目测和通过触诊观察注射部位。
在功效研究中，来自组1的1头猪在第162天时在损伤后被去除。由于存在过度粘着，来自组1中的另外1头猪的肺评分未包括在分析中。最终组大小是：
·组1，未疫苗接种的对照，23头猪(血清学)，22头猪(肺评分)
·组2，测试疫苗透皮，24头猪
在对照组中猪肺炎支原体抗体的平均ELISA抗体滴度保持在被认为阴性的值直至攻击后。测试疫苗接种的猪到疫苗接种后第21天时已血清转化至抗体阳性状态，保持阳性直到第125天，在第155天抽血时进入怀疑状态并显示实质性的攻击后既往应答(表2)。
表2：随时间的平均猪肺炎支原体ELISA抗体滴度。
 
第2天 第21天 第42天 第125天 第155天 第189-191天
组1对照 <0.001 0.03 0.05 0.11 0.18 0.64
组2测试疫苗 0.000 0.45 0.57 0.51 0.33 1.30
对照组中的肺炎组织的平均百分比为4.35％，相对于疫苗接种组的1.72％(表3)。用经由透皮途径施用的猪肺炎支原体菌苗接种的猪显示出显著低于(p<0.05)未接种疫苗的对照中观察到的肺炎肺损伤百分比。
在现场安全性研究期间，未观察到与疫苗接种相关的全身不良事件。可触及的注射部分肿胀是佐剂化菌苗典型的现象，并且到疫苗接种后第35天降至可忽略的水平。
表3：肺中肺炎组织的平均百分比和标准偏差。
 
组 疫苗 N 平均％* SD
1 未接种疫苗的对照 22 4.35 3.93
2 测试疫苗 24 1.72 1.82
*(p<0.05)
在3周龄前施用单次疫苗注射后160天，使用DERMA-VAC NFTransdermal Vaccinator System施用的猪肺炎支原体菌苗安全和显著地保护猪对抗猪肺炎支原体攻击。用DERMA-VAC NF TransdermalVaccinator System施用的猪肺炎支原体菌苗的总体安全性也在现场条件下在大量动物中得到证实。新DERMA-VAC NF TransdermalVaccinator System提供了特别配制用于无针使用的猪肺炎支原体疫苗的独特呈递，实现安全、便利和有效的疫苗接种方案。
实施例2：
将以通过ELISA测定的不同免疫原剂量，用根据美国专利申请号2005/0079185的TS6水包油乳剂配制的猪肺炎支原体菌苗通过肌内途径(IM)用注射器和针(2ml)或通过透皮途径(ID)用无针设备(0.5ml)在颈部区域中施用于16-19日龄的小猪。无针注射器是具有#3喷嘴的DERMA-VAC NF透皮疫苗接种器系统。猪在免疫接种后35天时通过气管内施用以Friis培养基1/100稀释的10ml猪肺炎支原体(232株)肺匀浆，和在免疫接种后36天时通过鼻内途径施用10ml相同悬浮液进行攻击。免疫接种后61-62天，对猪进行尸检，并且如实施例1中所述对肺损伤进行评分。
 
疫苗 途径 N 平均百分比
未接种疫苗的对照 19 11.23
疫苗1:6抗原单位/2ml剂量 IM 19 1.04
疫苗2:1.5抗原单位/0.5ml ID(NF) 20 3.24
疫苗3:3抗原单位/0.5ml ID(NF) 19 2.49
在对应疫苗1-3中每一种的组中，与对照组比较，肺炎肺组织的百分比显著减少(p<0.0001)。在疫苗接种组1、2和3中的损伤评分没有不同。无针注射器的使用允许疫苗中免疫原剂量减少1/4。
本发明通过下述编号段落进行进一步描述：
1.引发针对猪肺炎支原体的安全的和保护性的免疫应答的方法，其包括用液体喷射无针注射器给猪科动物施用单剂量的疫苗，所述疫苗包含灭活的猪肺炎支原体和佐剂。
2.根据段落1的方法，其中所述佐剂是TS6佐剂。
3.根据段落1或2的方法，其中所述猪科动物是断奶小猪。
4.根据段落3的方法，其中所述断奶小猪是约11-约24日龄。
5.根据段落3的方法，其中所述断奶小猪是约2-3周龄。
6.根据段落1-5中任一的方法，其中所述猪科动物是母猪。
7.根据段落1-5中任一的方法，其中所述无针注射器是DERMA-VAC NF注射器。
8.疫苗接种试剂盒或套组，其包含液体喷射无针注射器和至少一个包含猪肺炎支原体疫苗的疫苗小瓶，可操作地装配以执行给猪科动物施用疫苗并引发针对猪肺炎支原体的安全的和保护性的免疫应答。
9.段落8的疫苗接种试剂盒或套组，其包含段落1-7中任一的组合物和用于执行段落1-7中任一的方法的说明书。
* * *
尽管已详细描述了本发明的优选实施方案，但应当理解由上述段落限定的本发明不限于上文说明书中阐述的具体细节，因为无需背离本发明的精神或范围其许多显而易见的变化是可能的。

Claims (15)

1.引发针对猪肺炎支原体的安全的和保护性的免疫应答的方法，其包括用液体喷射无针注射器给猪科动物施用单剂量的疫苗，所述疫苗包含灭活的猪肺炎支原体和佐剂。
2.根据权利要求1的方法，其中所述佐剂是TS6佐剂。
3.根据权利要求1的方法，其中所述猪科动物是断奶小猪。
4.根据权利要求2的方法，其中所述猪科动物是断奶小猪。
5.根据权利要求3的方法，其中所述猪科动物是断奶小猪。
6.根据权利要求4的方法，其中所述断奶小猪是约11-约24日龄。
7.根据权利要求5的方法，其中所述断奶小猪是约11-约24日龄。
8.根据权利要求4的方法，其中所述断奶小猪是约2-3周龄。
9.根据权利要求5的方法，其中所述断奶小猪是约2-3周龄。
10.根据权利要求1的方法，其中所述猪科动物是母猪。
11.根据权利要求1的方法，其中所述无针注射器是DERMA-VAC NF注射器。
12.疫苗接种试剂盒或套组，其包含液体喷射无针注射器和至少一个含有猪肺炎支原体疫苗的疫苗小瓶，可操作地装配以执行给猪科动物施用疫苗并引发针对猪肺炎支原体的安全的和保护性的免疫应答。
13.权利要求12的疫苗接种试剂盒或套组，其中所述佐剂是TS6佐剂。
14.权利要求12的疫苗接种试剂盒或套组，其中所述无针注射器是DERMA-VAC NF注射器。
15.权利要求13的疫苗接种试剂盒或套组，其中所述无针注射器是DERMA-VAC NF注射器。
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