KR102283303B1 - 재조합 아데노바이러스 벡터화 fmdv 백신 및 이의 용도 - Google Patents

재조합 아데노바이러스 벡터화 fmdv 백신 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 FMDV 백신 또는 조성물을 포함한다. 본 발명은 FMDV에 대항하여 동물, 특히 양, 소, 염소, 또는 돼지를 보호하는데 사용할 수 있는 FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하고 발현하는 재조합 벡터를 포함한다.

Description

재조합 아데노바이러스 벡터화 FMDV 백신 및 이의 용도
본 발명은 정부 지원에 의해 수행되었다. 정부는 본 발명의 일정 권리를 갖는다.
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2016년 1월 29일 출원된 미국 가출원 제62/288,540호에 대해 우선권을 청구한다.
발명의 분야
본 발명은 동물에서 구제역 바이러스 (Foot and Mouth Disease Virus) (FMDV) 감염을 방지하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 개시 내용은 FMDV 항원을 포함하는 약학 조성물, FMDV에 대항한 백신접종 방법, 및 이러한 방법 및 조성물에서 사용을 위한 키트를 제공한다.
구제역 (FMD)은 농장 동물에 영향을 미치는 가장 악성의 전염성 질환 중 하나이다. 이 질환은 전세계적으로, 특히 아프리카, 아시아 및 서부 아메리카의 수많은 국가에서의 풍토병이다. 또한, 집단 발생이 주기적으로 일어날 수 있다. 국가에서 이러한 질환의 존재는 생산성 손실, 감염된 무리에서 중량 및 우유 생산의 손실, 및 이들 국가에 부여되는 수출입 금지로 인한 매우 심각한 경제적 결과를 가져올 수 있다. 이 질환에 대해 취해지는 조치는 전국적 또는 지역적 수준에서, 또는 집단 발생이 발생할 때 주기적으로, 엄격한 수입 제한 적용, 위생 통제 및 격리, 전국적 또는 지역적 수준에서 예방적 조치로서 아픈 동물의 도살 및 백신을 사용한 백신접종 프로그램으로 이루어진다.
FMD는 이의 짧은 인큐베이션 기간, 이의 고도로 전염성인 성질, 입 및 발에 궤양의 형성 및 때때로 어린 동물의 폐사를 특징으로 한다. FMD는 수많은 동물 종, 특히 소, 돼지, 양 및 염소에서 발병된다. 이 질환의 원인이 되는 작용제는 피코르나바이러스과 (Picornaviridae)의 아프토바이러스 (Aphthovirus) 속에 속하는 리보핵산 (RNA) 바이러스이다 (Cooper et al., Intervirology, 1978, 10, 165-180). 현재, 다음의 적어도 7개 유형의 구제역 바이러스 (FMDV)가 공지되어 있다: 유럽형 (A, O 및 C), 아프리카형 (SAT1, SAT2 및 SAT3) 및 아시아형 (아시아 1). 수많은 아형이 또한 구분되어 있다 (Kleid et al. Science (1981), 214, 1125-1129).
FMDV는 양성 극성인, 약 8500 뉴클레오티드로 이루어진 단일 가닥 RNA 분자를 함유하는 약 25 nm 직경의 나형 20면체 바이러스이다. 이러한 RNA 분자는 그 중에서도 단백질 P1 또는 P88이라고도 알려진 캡시드 전구체를 함유하는 단일 폴리단백질을 코딩하는 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함한다. 단백질 P1은 이의 아미노 말단에서 미리스틸화된다. 성숙화 과정 동안, 단백질 P1은 VP0, VP1 및 VP3 (또는 개별적으로 1AB, 1D 및 1C; Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261)으로 알려진 3개 단백질로 프로테아제 3C에 의해 절단된다. 비리온에서, 단백질 VP0은 이후에 2개의 단백질, VP4 및 VP2 (또는 개별적으로 1A 및 1B)로 절단된다. 단백질 VP0의 VP4 및 VP2로의 전환에 관한 기전, 및 성숙한 비리온의 형성에 관한 기전은 알려져 있지 않다. 단백질 VP1, VP2 및 VP3은 약 26,000 Da의 분자량을 갖는 반면, 단백질 VP4는 약 8,000 Da보다 작다.
캡시드 단백질의 단순 조합은 FMDV 캡시드의 기초 성분인, 5S 분자 또는 프로토머를 형성한다. 이러한 프로토머는 이후에 펜타머로 복합체화되어 12S 분자를 형성한다. 비리온은 12개의 12S 펜타머의 조립에 의해 게놈 RNA 분자의 캡시드화에 의해 생성되며, 따라서 146S 입자로 구성된다. 바이러스 캡시드는 또한 그 내부에 RNA 분자의 존재없이 형성될 수도 있다 (이하 "빈 캡시드"). 빈 캡시드는 또한 입자 70S로 표시된다. 빈 캡시드의 형성은 바이러스 복제 동안 자연적으로 일어날 수 있거나 또는 화학적 처리에 의해 인공적으로 생성될 수 있다.
일부 실험들이 천연의 빈 캡시드에 대해 수행되었다. 특히 Rowlands 등 (Rowlands et al., J. Gen. Virol., 1975, 26, 227-238)은 A10 구제역의 비리온이 주로 4개 단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 포함한다는 것을 보여주었다. 비교를 통해서, 천연의 빈 캡시드 (재조합에 의한 수득이 아닌 A10 구제역 바이러스의 배양물로부터 정제)는 본질적으로 미절단된 단백질 VP0를 함유하고, A-판도 구제역 바이러스에 의한 동일한 결과가 Rweyemamu에 의해 기술되었다 (Rweyemamu et al., Archives of Virology, 1979, 59, 69-79). 인공적인 빈 캡시드는 Tris-EDTA의 존재 하에서 투석한 후 원심분리한 후에 수득되는데, 단백질 VP4를 함유하지 않는다. 이들 인공적인 캡시드는 Rowlands 등에 따르면 약간 면역원성이고, 천연 빈 캡시드는 그들을 안정화시키기 위해 포름알데히드를 처리한 후에만 면역원성인데 반해, 그럼에도 불구하고 저자가 언급한 바와 같이, 기니 피크에서 천연 빈 캡시드에 의해 유도된 항체 반응은 일정하지 않았다. 게다가, Rowlands 등 및 Rweyemamu 등은 천연 빈 캡시드를 안정화킬 필요성에 동의하지 않았다. Rweyemamu 등의 경우, 포름알데히드 처리의 부재가 천연 비 캡시드의 항원성 수준에 불리하지 않다. 면역원성은 기니 피그에서 중화 항체의 유도에 의해서만 시험되었다.
곤충 세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의한 캡시드 단백질의 전구체 P1을 코딩하는 유전자의 발현은 이. 콜라이에서 프로테아제 3C와 연관된 P1을 코딩하는 유전자의 발현과 비교된다 (Grubman et al., Vaccine, 1993, 11, 825-829; Lewis et al., J. Virol., 1991, 65, 6572-6580). 이. 콜라이에서 P1 및 3C의 공동 발현은 그 결과로 빈 캡시드 70S의 조립을 야기시킨다. 이들 2종의 구성물의 발현 생성물은 기니 피그 및 돼지에서 중화 항체를 생성시킨다. P1/배큘로바이러스 구성물로 수득된 역가는 낮다. 이들 동일한 발현 생성물은 돼지에서 부분 보호를 유도한다. 하지만, 질환에 대항하여 보호된 일부 돼지들은 챌린지 바이러스의 복제에 대해서는 보호되지 않는다. 그러나, 이. 콜라이 발현 시스템은 단백질을 미리스틸화하지 않고 프로테아제 3C는 이 세포에 유독하다. Lewis 등은 동물에서 최대 보호성을 수득하는데 필요한 캡시드의 구조 및 바이러스의 구성과 관련된 기본적인 질문에 답하지 못하였다고 결론내렸다. 뿐만 아니라, Grubman 등은 백신을 제제화하기 이전에 빈 캡시드를 안정화시키는 것이 필요할 것이라고 진술하였고, 이러한 점에서 그들은 바이러스 배양물로부터 추출에 의해 수득된 빈 캡시드에서 맞닥뜨리게 되는 문제에 대해 동의한다 (상기 참조).
단백질 P1의 일부 또는 전부를 함유하는 융합 단백질은 바이러스 벡터, 즉 헤르페스 바이러스 또는 백시니아 바이러스의 사용에 의해 수득되었다. CA-A-2,047,585는 특히 소 헤르페스 바이러스의 당단백질 gpIII과 융합된 구제역 바이러스의 펩티드 서열을 함유하는 융합 단백질 (P1의 아미노산 141 내지 158이 P1의 아미노산 200 내지 213에 결합)을 생성시키는데 사용된 이 소 헤르페스 바이러스를 기술한다. 아데노바이러스 벡터는 FMDV 빈 바이러스 캡시드를 발현시키는데 사용되었다 (US 8,323,663). 바이러스 벡터는 안정화된 FMDV 빈 캡시드를 발현시키는데 또한 사용되었다 (US 7,531,182, USSN14/863,181). 최근에, 식물 및 곤충 세포가 FMDV 항원의 생성을 위한 공급원으로서 조사되었다 (US 2011/0236416, USSN14/863,181).
모체 유래 항체 (maternally derived antibody) (MDA)가 FMD에 대항한 백신접종에 대한 송아지 (2세 미만의 소)의 반응을 억제할 수 있다고 보고되었다 (Graves, 1963, Journal of Immunology 91:251-256; Brun et al., 1977, Developments in Biological Standardisation, 25:117-122).
FMDV 폴리펩티드 이의 단편 및 변이체를 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물 또는 백신이 제공된다. FMDV 항원 및 이의 단편 및 변이체는 면역원성 및 보호성 특성을 보유한다. 재조합 바이러스 벡터는 FMDV 항원을 발현하는 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 백신 및/또는 약학 조성물로 제제화될 수 있다. 이러한 백신 또는 조성물은 동물을 백신접종하여 상동성 및 이종성 FMDV 바이러스주에 대항한 보호성을 제공하는데 사용될 수 있다. 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클로 제제화된 백신 또는 조성물은 열안정성 개선 및 온도 편위 (temperature excursions)에 대처하는 능력을 부여한다.
FMDV 감염에 대항하여 보통의 동물 및 모체 유래 항체-양성 (MDA-양성) 동물에서 향상된 보호성을 위한 방법이 제공된다. 사용을 위한 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체 및 지시서를 포함하는 키트가 또한 제공된다.
하기의 상세한 설명은 오로지 기술된 특정 구체예에만 개시 내용을 국한하려는 의도가 아니라, 예로서 제공되는 것이며, 첨부된 도면과 함께 최고로 이해될 것이다:
도 1은 DNA 및 단백질 서열을 요약하는 표를 도시한다.
도 2는 키메라 A24-A12 구성체에서 사용된 A24 (p1-2AB') 유전자 및 FMDV A24 바이러스주에 대한 유전자를 도시한다.
도 3은 키메라 A24-A12 구성체에서 사용되는 A12 (3B'/3C) 유전자 및 FMDV A12 바이러스주에 대한 유전자를 도시한다.
도 4는 PCR에 의한 재조합 아데노바이러스 벡터화 A24-A12 FMDV 백신의 유전자 구조적 동일성 어세이를 도시한다.
도 5는 재조합 아데노바이러스 벡터화 A24-A12 FMDV 백신의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 6은 재조합 아데노바이러스 벡터화 FMDV O1M 백신에서 사용되는 FMDV O1M 바이러스주에 대한 유전자를 도시한다.
도 7은 재조합 아데노바이러스 벡터화 FMDV Irn 백신에서 사용되는 FMDV Irn 바이러스주에 대한 유전자를 도시한다.
도 8은 재조합 아데노바이러스 벡터화 FMDV 아시아 백신에서 사용되는 FMDV 아시아 바이러스주에 대한 유전자를 도시한다.
도 9는 상이한 용량에서 O 혈청형 FMDV 백신에 의한 보호성 백분율을 도시한다.
도 10은 상이한 용량에서 O 혈청형 FMDV 백신의 혈청학을 도시한다.
도 11은 25℃에서 재조합 아데노바이러스 벡터화 FMDV + 보조제의 살바이러스 활성을 도시한다.
도 12는 4℃에서 재조합 아데노바이러스 벡터화 FMDV + 보조제의 살바이러스 활성을 도시한다.
도 13은 FMDV VN 역가의 기하 평균을 도시한다.
도 14는 SAV 역가의 기하 평균을 도시한다.
도 15는 FMDV VN 역가의 기하 평균을 도시한다.
동물에서 면역원성 반응을 유발하는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물 또는 백신이 제공된다. 재조합 바이러스 벡터는 FMDV 항원을 발현하는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터는 백신 또는 약학 조성물로 제제화될 수 있고 동물에서 보호 반응을 유발시키거나 또는 자극시키는데 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 폴리펩티드 항원은 FMDV 구조 단백질 P1 (VP4-VP2-Vp3-VP1), 비구조 단백질 P2 (2A, 2B, 및 2C) 또는 비구조 단백질 P3 (3A, 3B, 3C 및 3D) 또는 이의 활성 단편 또는 변이체이다.
본 개시 내용의 항원성 폴리펩티드는 전체 길이 폴리펩티드 또는 이의 활성 단편 또는 변이체일 수 있다는 것을 인지한다. "활성 단편" 또는 "활성 변이체"란 단편 또는 변이체가 폴리펩티드의 항원성 성질을 보유한다는 것을 의도한다. 따라서, 본 개시 내용은 동물에서 면역원성 반응을 유발시키는 임의의 FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 포함한다. FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은, 동물, 예컨대 양, 소, 염소 또는 돼지에서 반응을 유발시키거나, 유도하거나 또는 자극시키는, 임의의 FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원 예컨대 제한없이, 단백질, 펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
캡시드 단백질의 단순 조합은 FMDV 캡시드의 기본 성분인, 프로토머 또는 5S 분자를 형성한다. 이 프로토머가 이후에 펜타머로 복합체화되어 12S 분자를 형성한다. 비리온은 12개의 12S 펜타머의 조합에 의한 게놈 RNA 분자의 캡시드화에 의해 생성되며, 따라서 146S 입자를 구성한다. 바이러스 캡시드는 또한 그 안에 RNA 분자의 존재없이 형성될 수도 있다 (이하, "빈 캡시드"). 빈 캡시드는 또한 입자 70S로 표시된다. 빈 캡시드의 형성은 바이러스 복제 동안 자연적으로 발생될 수 있거나 또는 화학적 처리에 의해 인공적으로 생성될 수 있다.
본 개시 내용은 FMDV 항원을 발현하는 재조합 FMDV 항원 또는 재조합 바이러스 벡터의 유효량, 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클을 포함할 수 있는 소, 양, 염소 또는 돼지 백신 또는 조성물에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 백신은 보조제, 예컨대 미국 특허 제7,371,395호에 기술된 수중유 (O/W) 에멀션을 더 포함한다.
또 다른 구체예에서, 보조제는 TS6, TS7, TS8 및 TS9 에멀션, LR3, LR4 및 LR6 에멀션, LF2 에멀션, CARBIGEN™ 보조제, ENABL® 보조제, 폴리아크릴산, 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄, 사포닌, CpG, 유중수 에멀션, 및 수중유 에멀션, 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 구체예에서, 동물에서의 반응은 보호성 면역 반응이다.
"동물"이란, 포유동물, 조류 등을 의도하고자 한다. 동물 또는 숙주는 포유동물 및 인간을 포함한다. 동물은 말류 동물 (예를 들어, 말), 갯과 동물 (예를 들어, 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼), 고양잇과 동물 (예를 들어, 사자, 호랑이, 집고양이, 야생 고양이, 다른 거대 고양이, 및 치타 및 스라소니를 포함한 다른 고양잇과), 양류 동물 (예를 들어, 양), 소족 동물 (예를 들어, 축우, 젖소), 돼지류 동물 (예를 들어, 돼지), 염소류 동물 (예를 들어, 염소), 조류 (예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추리, 꿩, 앵무새, 되새류, 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조), 영장류 (예를 들어, 원원류, 안경원숭이, 원숭이, 긴팔원숭이, 유인원), 및 어류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 용어 "동물"은 또한 배아 및 태아 단계를 포함한 모든 발생 단계의 개별 동물을 포함한다.
달리 설명하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 단수 용어 "한", "하나" 및 "그"는 달리 문맥에서 명확하게 표시하지 않으면 복수 참조를 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 문맥에서 달리 명확하게 표시하지 않으면 "및"을 포함하고자 한다.
본 개시 내용의 항원성 폴리펩티드는 FMDV에 대항하여 보호할 수 있다. 즉, 그들은 동물에서 면역 반응을 자극할 수 있다. "항원" 또는 "면역원"이란 숙주 동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 사멸, 약독화 또는 생존의 전체 유기체; 유기체의 서브유닛 또는 일부분; 면역원성 특성을 갖는 삽입부를 함유하는 재조합 벡터; 숙주 동물에 제시시 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA의 조각 또는 단편; 폴리펩티드, 에피토프, 햅텐, 또는 이의 임의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용시 용어 "면역원성 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드"는 숙주에 투여되면, 그 단백질에 대해서 체액 및/또는 세포 유형의 면역 반응을 일으킬 수 있다는 의미에서 면역학적으로 활성인 폴리펩티드를 포함한다. 구체예에서, 단백질 단편은 전체 단백질과 실질적으로 동일한 면역학적 활성을 갖는다. 따라서, 본 개시 내용에 따른 단백질 단편은 적어도 하나의 에피토프 또는 항원성 결정부를 포함할 수 있거나 또는 그로 본질적으로 이루어질 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 본 명세서에서 사용시 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드는 단백질의 전체 길이 서열, 이의 유사체, 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다. "면역원성 단편"이란 하나 이상의 에피토프를 포함하고 따라서 상기 기술된 면역학적 반응을 유발시키는 단백질의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 임의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용해 동정될 수 있다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어, 단백질 분자의 일부분에 상응하는 펩티드인 대량의 펩티드를 고형 지지체 상에서 동시에 합성시키고, 펩티드를 여전히 지지체에 부착시킨 채로 항체와 헵티드를 반응시켜 결정할 수 있다. 이러한 기술은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제4,708,871호; 문헌 [Geysen et al., 1984, PNAS USA, 81(13): 3998-400]; [Geysen et al., 1985, PNAS USA, 82(1): 178-82]에 기술되어 있다. 유사하게, 입체형태적 에피토프는 아미노산 예컨대, 예를 들어 x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명에 의해 아미노산의 공간적 입체형태를 결정하여 쉽게 동정된다. 티. 파르바 (T. parva)의 단백질에 특히 적용할 수 있는 방법이 PCT/US2004/022605에 기술되어 있다.
기술된 바와 같이, 본 개시 내용은 항원성 폴리펩티드의 활성 단편 및 변이체를 포함한다. 따라서, 용어 "면역원성 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드"는 그 폴리펩티드가 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역원성 반응을 생성하도록 기능하는 한, 서열에 대한 결실, 첨가 및 치환을 더욱 고려한다. 용어 "보존성 변이"는 그렇게 코딩되는 아미노산 잔기가 변화되지 않거나 또는 다른 생물학적으로 유사한 잔기인, 핵산 서열 내 뉴클레오티드의 치환, 또는 다른 생물학적으로 유사한 잔기로 아미노산 잔기의 치환을 의미한다. 이와 관련하여, 일부 치환은 일반적으로 성질이 보존될 것이고, 즉 아미노산 패밀리 내에서 발생되는 치환일 것이다. 예를 들어, 아미노산은 일반적으로 다음의 4개 패밀리로 분류된다: (1) 산성--아스파테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성--알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전된 극성--글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 보존성 변이의 예는 다른 소수성 잔기를 하나의 소수성 잔기 예컨대 이소루신, 발린, 루신 또는 메티오닌으로 치환, 또는 다른 극성 잔기를 하나의 극성 잔기로 치환, 예컨대 아르기닌을 리신으로 치환, 글루탐산을 아스파르트산으로 치환, 또는 글루타민을 아스파라긴으로 치환 등, 또는 생물학적 활성에 대해 주요한 효과를 갖지 않을 구조적 관련 아미노산으로 아미노산의 유사한 보존성 치환을 포함한다. 기준 분자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 소수의 아미노산 치환을 보유하는 단백질은, 따라서 기준 폴리펩티드의 정의에 속한다. 이들 변형에 의해 생성되는 모든 폴리펩티드는 본 명세서에 포함된다. 용어 "보존성 변이"는 또한 미치환된 부모 아미노산 대신에 치환된 아미노산의 사용을 포함하지만 단 치환된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 또한 미치환된 폴리펩티드와 면역반응한다.
용어 "에피토프"는 특이적 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 또는 햅텐 상의 부위를 의미한다. 이 용어는 또한 "항원성 결정부" 또는 "항원성 결정 부위"와 상호교환적으로 사용된다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 다른 항체의 결합을 차단하는 한 항체의 능력을 보여주는 단순한 면역어세이에서 동정될 수 있다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 반응"은 관심 조성물 또는 백신에 대한 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응의 숙주에서의 발생이다. 일반적으로, "면역학적 반응"은 제한없이 하기의 효과 중 하나 이상을 포함한다: 관심 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된, 항체, B 세포, 헬포 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생성. 바람직하게, 숙주는 치료적 또는 보호적 면역학적 반응을 나타내게 되어서 새로운 감염에 대한 내성이 증강되고/되거나 질환의 임상적 중증도가 감소될 것이다. 이러한 보호성은 감염된 숙주가 정상적으로 나타내는 증상의 감소 또는 결여, 보다 신속한 회복 시간 및/또는 감염된 숙주에서 저하된 바이러스 역가에 의해 입증될 것이다.
합성 항원, 예를 들어 폴리에피토프, 측접한 에피토프, 및 다른 재조합 또는 합성 유래된 항원이 정의에 포함된다. 개시 내용의 목적을 위한 면역원성 단편은 일반적으로 적어도 약 3개 아미노산, 적어도 약 5개 아미노산, 적어도 약 10 내지 15개 아미노산, 또는 약 15 내지 25개 아미노산 또는 그 이상의 아미노산의 분자를 포함한다. 단편의 길이에 임계 상한치는 존재하지 않아서, 거의 전체 길이의 단백질 서열, 또는 심지어 단백질의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있다.
따라서, 에피토프를 발현하는 폴리뉴클레오티드의 최소 구조는 FMDV 폴리펩티드의 항원성 결정부 또는 에피토프를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진 것이다. FMDV 폴리펩티드의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 코딩하는 최소 15개 뉴클레오티드, 약 30 내지 45개 뉴클레오티드, 약 45 내지 75개, 또는 적어도 57개, 87개 또는 150개의 연속하거나 또는 인접하는 뉴클레오티드의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있거나 또는 그로 본질적으로 이루어질 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 분지형의, 단일 또는 이중 가닥인 RNA 또는 DNA, 또는 이의 하이브리드를 의미한다. 이 용어는 또한 RNA/DNA 하이브리드를 포함한다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 우라실, 다른 당 및 연결기 예컨대 플루오로리보스 및 티올레이트, 및 뉴클레오티드 분지를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 예컨대 표지화 성분으로, 접합에 의해서, 중합반응 이후에 더욱 변형될 수 있다. 이러한 정의에 포함되는 다른 유형의 변형에는 유사체에 의한 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 치환, 및 단백질, 금속 이온, 표지화 성분, 다른 폴리뉴클레오티드 또는 고형 지지체에 폴리뉴클레오티드의 부착을 위한 수단의 도입이 있다. 폴리뉴클레오티드는 화학 합성에 의해 수득될 수 있거나 또는 미생물로부터 유래될 수 있다.
용어 "유전자"는 생물학적 기능과 연관된 폴리뉴클레오티드의 임의 절편을 의미하기 위해 광범위하게 사용된다. 따라서, 유전자는 게놈 서열 내에서와 같은 인트론 및 엑손, 또는 단지 그들 발현을 위해 요구되는 조절 서열 및/또는 cDNA에서와 같은 코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, 유전자는 또한 mRNA 또는 기능성 RNA를 발현하거나, 또는 특정 단백질을 코딩하고, 조절 서열을 포함하는 핵산 단편을 의미한다.
본 개시 내용은 FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 가닥을 더 포함한다. 상보적 가닥은 중합체일 수 있고 임의 길이일 수 있으며, 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및 임의 조합의 유사체를 함유할 수 있다.
용어 "단백질", "펩티드", "폴리펩티드" 및 "폴리펩티드 단편"은 임의 길이의 아미노산 잔기의 중합체를 의미하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형이거나 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있고, 아미노산 이외의 화학적 모이어티가 개재될 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 또는 개재, 예를 들어 디설피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 또는 생물활성 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다.
"단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 또는 단백질 또는 세포소기관)은 그 성분이 자연적으로 발생되는 유기체의 세포 내 다른 생물학적 성분, 예를 들어 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질, 및 세포소기관으로부터 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 성분을 의미한다. "단리된" 핵산 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 이 용어는 또한 재조합 기술을 비롯하여 화학적 합성에 의해 제조된 핵산 및 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용시 용어 "정제된"은 절대 순도를 요구하지 않지만, 대신, 상대적인 용어로서 의도하고자 한다. 따라서, 예를 들어 정제된 폴리펩티드 제조물은 폴리펩티드가 그 폴리펩티드가 이의 천연 환경에 존재하는 것보다 더 많이 농축된 것이다. 일부 예에서, 폴리펩티드는 세포 성분으로부터 분리된다. "실질적으로 정제된"이란, 폴리펩티드가 몇몇 구체예를 대표하여서, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98%, 또는 그 이상의 세포 성분 또는 물질이 제거된 것을 의도하고자 한다. 유사하게, 폴리펩티드는 부분적으로 정제될 수 있다. "부분적으로 정제된"이란 세포 성분 또는 물질의 60% 미만이 제거된 것을 의도한다. 동일하게 폴리뉴클레오티드에 적용된다. 본 명세서에 개시된 폴리펩티드는 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 정제될 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 항원성 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체는 생체내에서 바이러스 벡터에 의해 생성되는 FMDV 항원성 폴리펩티드이다. 개시된 폴리뉴클레오티드 및 그에 의해 코딩된 폴리펩티드의 단편 및 변이체도 또한 본 개시 내용에 포함된다. "단편"이란 폴리뉴클레오티드의 일부분 또는 그에 의해 코딩되는 항원성 아미노산 서열의 일부분을 의도하고자 한다. 폴리뉴클레오티드의 단편은 천연 단백질의 생물학적 활성을 보유하고 그러므로 본 명세서의 어딘가에서 언급한 바와 같이 면역원성 활성을 갖는 단백질 단편을 코딩할 수 있다. 폴리펩티드 서열의 단편은 동물에서 보호성 면역 반응을 유도하는 능력을 보유한다.
"변이체"는 실질적으로 유사한 서열을 의미하고자 한다. 폴리뉴클레오티드의 경우, 변이체는 천연 폴리뉴클레오티드 내 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실 및/또는 첨가 및/또는 천연 폴리뉴클레오티드 내 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환을 포함한다. 본 명세서에서 사용시, "천연" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 각각 자연적으로 발생된 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다. 본 개시 내용의 특정 폴리뉴클레오티드의 변이체 (예를 들어, 기준 폴리뉴클레오티드)는 또한 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 기준 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 간 서열 동일성 백분율의 비교에 의해 평가될 수 있다. "변이체" 단백질은 천연 단백질 내 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 첨가 및/또는 천연 단백질 내 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 천연 단백질로부터 유래되는 단백질을 의미하고자 한다. 본 개시 내용에 포함되는 변이체 단백질은 생물학적으로 활성이고, 즉 그들은 면역 반응을 유발시키는 능력이 있다.
일 양상에서, 본 개시 내용은 양, 소, 염소, 또는 돼지 FMDV 단리주 유래의 FMDV 폴리펩티드를 제공한다. 다른 양상에서, 본 개시 내용은 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 이의 변이체 및 단편을 제공한다.
게다가, 양, 소, 염소, 또는 돼지 유래의 FMDV 폴리펩티드의 상동체는 본 개시 내용의 범주 내에 두고자 한다. 본 명세서에서 사용시, 용어 "상동체"는 동족체 (ortholog), 유사체, 및 파라로그 (paralog)를 포함한다. 용어 "유사체"는 동일하거나 또는 유사한 기능을 갖지만 미관련된 유기체에서 별개로 진화된 2종의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "동족체"는 상이한 종으로부터 유래되지만, 종분화에 의해 공통 조상 유전자로부터 진화된 2종의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 보통, 동족체는 동일하거나 또는 유사한 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 용어 "파라로그"는 게놈 내 중복에 의해 관련된 2 종의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 말한다. 용어 파라로그는 일반적으로 상이한 기능을 갖지만, 이들 기능이 관련될 수 있다. 야생형 FMDV 폴리펩티드의 유사체, 동족체, 및 파라로그는 번역후 변형, 아미노산 서열 차이, 또는 둘 모두에 의해 야생형 FMDV 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 특히, 본 개시 내용의 상동체는 일반적으로 야생형 FMDV 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부분과 적어도 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 나타내게 될 것이며, 유사한 기능을 나타낼 것이다. 변이체는 대립유전자 변이체를 포함한다. 용어 "대립유전자 변이체"는 단백질의 아미노산 서열에 변화를 초래하고 천연 개체군 (예를 들어, 바이러스 종 또는 품종) 내에 존재하는 다형성을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 천연 대립유전자 변이는 전형적으로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 중에 1 내지 5% 변이를 초래할 수 있다. 대립유전자 변이체는 그들 종 내에서 동일한 유전자의 유전자좌를 동정하도록 혼성화 프로브를 사용하여 쉽게 수행할 수 있는, 수많은 상이한 종에서의 관심 핵산 서열의 서열분석에 의해 동정될 수 있다. 천연 대립유전자 변이의 결과이며 관심 유전자의 기능적 활성을 변경시키지 않는 임의의 모든 이러한 핵산 변이 및 최종 아미노산 다형성 또는 변이는 본 개시 내용의 범주 내에 두고자 한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "유도체" 또는 "변이체"는 하나 이상의 보존성 아미노산 변이 또는 다른 소수의 변형을 가져서, (1) 상응하는 폴리펩티드가 야생형 폴리펩티드와 비교시 실질적으로 균등한 기능을 갖거나, 또는 (2) 그 폴리펩티드에 대항하여 발생된 항체가 야생형 폴리펩티드와 면역반응성인, 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 의미한다. 이들 변이체 또는 유도체는 비변형된 대응 폴리펩티드와 비교하여 실질적으로 균등한 활성을 갖는 펩티드를 생성시킬 수 있는 FMDV 폴리펩티드 1차 아미노산 서열의 소수 변형을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 변형은 부위 지정 돌연변이유발법에 의한 것으로서 숙고될 수 있거나, 또는 자발적일 수 있다. 용어 "변이체"는 폴리펩티드가 본 명세서에서 정의하는 바와 같은 면역학적 반응을 생성하도록 기능하는 한, 서열에 대한 결실, 첨가 및 치환을 더 고려한다.
용어 "보존성 변이"는 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 아미노산 잔기의 치환, 또는 코딩되는 아미노산 잔기가 변화되지 않거나 또는 다른 생물학적으로 유사한 잔기인 핵산 서열 중 뉴클레오티드의 치환을 의미한다. 이러한 점에서, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 상기에 기술된 바와 같이, 자연에서 보존성일 것이다.
본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드는 유전자 코드, 예를 들어 특정 숙주에 대해 최적화된 코돈 용법의 결과로서 축퇴성인 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용시, "최적화된"은 소정 종에서 이의 발현을 증가시키도록 유전자 조작된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. FMDV 폴리펩티드를 코딩하는 최적화된 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위해서, FMDV 단백질의 DNA 서열은 1) 특정 종에서 고도로 발현되는 유전자가 선호하는 코돈을 포함하거나; 2) 상기 종에서 실질적으로 존재하는 뉴클레오티드 염기 조성으로 A+T 또는 G+C 함량을 포함하거나; 3) 상기 종의 개시 서열을 형성하거나; 또는 4) RNA의 불안정화, 부적절한 폴리아데닐화, 분해 및 종결을 야기하거나, 또는 2차 구조 헤어핀 또는 RNA 스플라이싱 부위를 형성하는 서열을 제거하도록 변형될 수 있다. 상기 종에서 FMDV 단백질의 증가된 발현은 진핵생물 및 원핵생물, 또는 특정 종에서 코돈 용법의 분포 빈도를 이용하여 달성될 수 있다. 용어 "바람직한 코돈 용법의 빈도"는 소정 아미노산을 특정하는 뉴클레오티드 코돈의 용법에서 특정 숙주 세포가 나타내는 선호도를 의미한다. 20개의 천연 아미노산이 존재하고, 그들 대부분은 하나를 초과하는 코돈에 의해 특정된다. 그러므로, 모든 축퇴성 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 FMDV 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기능적으로 변화되지 않는 한 본 개시 내용에 포함된다.
2종의 아미노산 서열 간 서열 동일성은 표준 매개변수를 사용하여, NCBI (National Center for Biotechnology Information) 쌍별 blast 및 blosum62 매트릭스에 의해 확립될 수 있다 (예를 들어, "미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)" (NCBI, Bethesda, Md., USA) 서버에서 이용할 수 있는 BLAST 또는 BLASTX 알고리즘 참조).
서열과 관련하여 "동일성"은 2개 서열 중 보다 짧은 것의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 개수로 나눈 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산을 갖는 위치의 개수로서, 여기서 2개 서열의 정렬은 Wilbur 및 Lipman 알고리즘에 따라 결정할 수 있다 (1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 80, pp726-730). 2종의 아미노산 서열의 서열 동일성 또는 서열 유사성, 또는 2종의 뉴클레오티드 서열 간 서열 동일성은 Vector NTI 소프트웨어 패키지 (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA)를 사용해 결정할 수 있다. RNA 서열을 DNA 서열과 유사하다거나, 또는 서열 동일성 또는 상동성 정도를 갖는다고 할 때, DNA 서열 중 티미딘 (T)은 RNA 서열 중 우라실 (U)과 동등하게 간주된다. 따라서, RNA 서열은 본 개시 내용의 범주에 속하며 DNA 서열의 티미딘 (T)을 RNA 서열의 우라실 (U)과 동등한 것으로 간주하여, DNA 서열로부터 유래될 수 있다.
혼성화 반응은 상이한 "엄격성"의 조건 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 4th edition (Sambrook et al., 2014)]을 참조한다.
개시 내용은 벡터 분자 또는 발현 벡터에 함유되고 프로모터 성분 및 임의로 인핸서에 작동적으로 연결된 FMDV 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다.
"벡터"는 시험관내에서 또는 생체내에서, 표적 세포로 전달하려는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA 또는 RNA 플라스미드 또는 바이러스를 의미한다. 이종성 폴리뉴클레오티드는 예방 또는 요법의 목적을 위한 관심 서열을 포함할 수 있고, 임의로 발현 카세트의 형태일 수 있다. 본 명세서에서 사용시, 벡터는 궁극적인 표적 세포 또는 대상체에서 복제를 할 필요가 없다. 이 용어는 클로닝 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다.
용어 "재조합"은 자연계에서 발생되지 않거나, 또는 자연계에 존재하지 않는 배열로 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 반합성 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"이종성"은 비교되는 독립체의 나머지와 유전적으로 별개인 독립체로부터 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 상이한 공급원으로부터 유래된 플라스미드 또는 벡터로 유전자 조작 기술에 의해 위치될 수 있고, 이종성 폴리뉴클레오티드이다. 이의 천연 코딩 서열로부터 제거되고 천연 서열이외의 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터는 이종성 프로모터이다.
본 개시 내용은 재조합 FMDV 항원의 유효량 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 포함할 수 있는 양, 소, 염소 및 돼지 백신 또는 약학적 또는 면역학적 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에 기술된 대상 주제는, 부분적으로, 상동성 및 이종성 FMDV 바이러스주로부터의 공격에 대항하여 동물을 보호하고 고도로 면역원성인 배큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템으로 제조된 FMDV 항원과 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다.
조성물
본 개시 내용은 재조합 FMDV 항원의 유효량 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클을 포함할 수 있는 FMDV 백신 또는 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에서, FMDV 백신 또는 조성물은 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함한다.
개시 내용의 일 구체예는 FMDV 항원을 발현하는 바이러스 벡터를 포함하는 백신 또는 조성물에 관한 것이다. FMDV 항원은 영역 P1 (VP4-VP2-VP3-VP1), 2A/2B'/3B' 및 3C, 또는 P1 (VP4-VP2-VP3-VP1), 2A/2B/2C 및 3A/3B/3C/3D의 cDNA의 발현에 의해 수득된다. 구조적 영역 P1 및 비구조적 영역 P2 또는 P3은 동일한 FMDV 혈청형 또는 상이한 혈청형 (키메라 항원)으로부터 유래될 수 있다.
본 개시 내용은 동물, 예컨대, 양, 소, 염소 또는 돼지에서 면역원성 반응을 유발시키는 임의의 FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 포함한다. FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은 동물, 예컨대 양, 소, 염소 또는 돼지에서 반응을 유발시키거나, 유도하거나 또는 자극시키는, 임의의 FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원, 예컨대 제한없이, 단백질, 펩티드 또는 이의 단편일 수 있다.
FMDV 면역학적 조성물 또는 백신이 재조합 면역학적 조성물 또는 백신인 일 구체예에서, 조성물 또는 백신은 재조합 벡터 및 약학적 또는 수의학적 허용가능한 부형제, 담체, 보조제 또는 비히클을 포함하고; 제조합 벡터는 FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는 배큘로바이러스 발현 벡터이다. FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은 VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 또는 3D, 또는 이의 임의 조합일 수 있다.
일 구체예에서, P1 (VP4-VP2-VP3-VP1)-2A/부분 2B/부분 3B 및 3C 폴리펩티드는 바이러스 벡터에서 발현될 수 있고 발현은 하나 이상의 프로모터 서열에 의해 조절될 수 있다. 다른 구체예에서, FMDV 항원은 FMDV 혈청형 A24 유래의 P1 (VP4-VP2-VP3-VP1)-2A-부분 2B 및 FMDV 혈청형 A12 유래의 부분 3B 및 FMDV 혈청형 A24 유래의 3C 항원을 포함하는 키메라 항원일 수 있다. 또 다른 구체예에서, FMDV 항원은 P1 (VP4-VP2-VP3-VP1)-2A-2B-부분 2C-부분 3A-3B-3C일 수 있다.
다른 구체예에서, FMDV 항원은 FMDV O1 마니사, O1 BFS 또는 캄푸스, A24 크루제이루, A12, 아시아 1 샤미르, A 이란'96, 아시아/IRN/05, A22 이라크, SAT2 사우디 아라비아로부터 유래될 수 있다.
본 개시 내용은 재조합 FMDV 항원 또는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터의 유효량, 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클을 포함할 수 있는 FMDV 백신에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클은 유중수 에멀션일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클은 수중유 에멀션일 수 있다.
본 개시 내용은 벡터 분자 또는 발현 벡터에 함유되고 프로모터 성분 및 임의로 인핸서에 작동적으로 연결된 FMDV 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다.
일 양상에서, 본 개시 내용은 FMDV 폴리펩티드, 특히 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 양, 소, 염소 또는 돼지 폴리펩티드, 및 이의 변이체 또는 단편을 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 항원성 폴리펩티드, 특히 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 개시 내용은 분자 생물학 기술을 사용하여 당업자에 쉽게 제조할 수 있는 상기 동정된 FMDV 폴리펩티드 (서열번호 2, 4, 6, 또는 8)의 단편 및 변이체를 제공한다.
변이체는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 기재된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 갖는 상동성 폴리펩티드이다.
FMDV 폴리펩티드의 면역원성 단편은 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 FMDV 폴리펩티드, 또는 이의 변이체의 적어도 8, 10, 15, 또는 20개의 연속적인 아미노산, 적어도 21개 아미노산, 적어도 23개 아미노산, 적어도 25개 아미노산, 또는 적어도 30개 아미노산을 포함한다. 다른 구체예에서, FMDV 폴리펩티드의 단편은 전체 길이 FMDV 폴리펩티드 상에 존재하는 특이적 항원성 에피토프를 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 FMDV 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 개시 내용은 서열번호 2, 4, 6 또는 8에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 또는 이들 폴리펩티드 중 하나의 적어도 8개 또는 적어도 10개의 연속하는 아미노산을 포함하는 보존성 변이체, 대립유전자 변이체, 상동체 또는 면역원성 단편, 또는 이들 폴리펩티드의 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 서열번호 1, 3, 5, 또는 7에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변이체를 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 개시 내용은 서열번호 1, 3, 5, 또는 7에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변이체를 제공한다.
본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드는 추가의 서열, 예컨대 동일한 전사 유닛 내 추가의 코딩 서열, 제어 성분 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서, 5'UTR, 3'UTR, 전사 종결부, 폴리아데닐화 부위, 동일하거나 또는 상이한 프로모터 제어 하의 추가의 전사 유닛, 클로닝, 발현, 상동성 재조합, 및 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 서열, 및 본 개시 내용의 구체예를 제공하는데 바람직할 수 있는 임의의 이러한 구성체를 포함할 수 있다.
FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원의 발현을 위한 성분은 본 발명의 벡터에 유리하게 존재한다. 최소의 방식으로, 이것은 개시 코돈 (ATG), 중지 코돈 및 프로모터, 임의로 또한 일정 벡터 예컨대 플라스미드 및 일정 바이러스 벡터, 예를 들어 폭스바이러스이외의 바이러스 벡터를 위한 폴리아데닐화 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다. 유리하게 벡터에서 폴리뉴클레오티드가 폴리단백질 단편, 예를 들어 FMDV 펩티드를 코딩하는 경우, ATG는 리딩 프레임의 5'에 위치되고, 중지 코돈은 3'에 위치된다. 발현을 제어하기 위한 다른 성분, 예컨대 인핸서 서열, 안정화 서열, 예컨대 단백질의 분비를 허용하는 신호 서열 및 인트론이 존재할 수 있다.
본 개시 내용은 또한 벡터, 예컨대 발현 벡터를 포함하는 조제물, 예를 들어 치료적 조성물에 관한 것이다. 조제물은 하나 이상의 FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 포함하고 발현하는, 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 발현 벡터, 예컨대 생체내 발현 벡터를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 벡터는 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 비히클에, FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩 (및 유리하게 발현)하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 함유하고 발현한다. 따라서, 본 개시 내용의 구체예에 따라서, 조제물 중 다른 벡터 또는 벡터들은 FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원의 하나 이상의 다른 단백질, 또는 이의 단편을 코딩하고, 적절한 상황 하에서 그 벡터가 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다.
다른 구체예에 따라서, 조제물 중 벡터 또는 벡터들은 FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원의 하나 이상의 단백질 또는 이의 단편(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하거나, 또는 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고, 벡터 또는 벡터들은 그 폴리뉴클레오티드(들)를 발현한다. 다른 구체예에서, 조제물은 FMDV 폴리펩티드, 항원, 이의 융합 단백질 또는 에피토프를 유리하게 생체내에서, 코딩하고 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 하나, 둘, 또는 그 이상의 벡터를 포함한다. 개시 내용은 또한 상이한 FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원, 예를 들어, 상이한 동물 종 예컨대, 제한없이, 양, 소, 염소 또는 돼지로부터 유래되는 FMDV 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하고 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 혼합물에 대한 것이다.
개시 내용의 또 추가의 구체예에 따라서, 발현 벡터는 플라스미드 벡터 또는 DNA 플라스미드 벡터, 특히 생체내 발현 벡터이다. 특정한, 비제한적인 예에서, pVR1020 또는 1012 플라스미드 (VICAL, Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, Hum Gene Ther, 7(10): 1205-17; 예를 들어, 미국 특허 제5,846,946호 및 제6,451,769호 참조)는 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 위한 벡터로서 이용될 수 있다. pVR1020 플라스미드는 pVR1012로부터 유래되고 인간 tPA 신호 서열을 함유한다. 일 구체예에서, 인간 tPA 신호는 수탁 번호 HUMTPA14 하의 유전자은행에서의 아미노산 M(1) 내지 아미노산 S(23)을 포함한다. 다른 특정한, 비제한적인 예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 위한 벡터로서 이용되는 플라스미드는 수탁 번호 U28070 하의 유전자은행에서의 아미노산 M(24) 내지 아미노산 A(48)의 말 IGF1의 신호 펩티드 서열을 함유할 수 있다. 실시에서 적용하거나 또는 고려할 수 있는 DNA 플라스미드에 대한 추가의 정보는 예를 들어, 미국 특허 제6,852,705호; 제6,818,628호; 제6,586,412호; 제6,576,243호; 제6,558,674호; 제6,464,984호; 제6,451,770호; 제6,376,473호; 및 제6,221,362호에서 확인한다.
용어 플라스미드는 개시 내용에 따른 폴리뉴클레오티드 및 바람직한 숙주 또는 표적의 세포 또는 세포들에서 이의 생체 내 발현을 위해 필수적인 성분을 포함하는 임의의 DNA 전사 유닛을 포괄하고, 이러한 점에서, 수퍼코일 또는 비수퍼코일, 원형 플라스미드를 비롯하여, 선형 형태를 개시 내용의 범주 내에 포함하고자 한다는 것을 주의한다.
플라스미드는 이종성 펩티드 서열과 임의로 융합된, FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 이외에도, 프로모터에 작동적으로 연결되거나 또는 프로모터의 제어 하이거나 또는 프로모터에 의존적인, 변이체, 유사체 또는 단편을 포함할 수 있거나 또는 그를 함유하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일반적으로, 진핵생물 세포에서 기능성인 강력한 프로모터를 적용하는 것이 유리하다. 강력한 프로모터는 제한없이, 인간 또는 쥣과동물 기원이거나, 또는 임의로 래트 또는 기니 피크와 같은 다른 기원을 갖는, 급초기 사이토메갈로바이러스 프로모터 (CMV-IE), 수퍼 프로모터일 수 있다 (Ni, M. et al., Plant J. 7, 661-676, 1995.). CMV-IE 프로모터는 인핸서 부분과 연합될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있는, 실제 프로모터 부분을 포함할 수 있다. EP-A-260 148, EP-A-323 597, 미국 특허 제5,168,062호, 제5,385,839호, 및 제4,968,615호를 비롯하여, PCT 공개 특허 출원 WO87/03905를 참조할 수 있다. 구체예에서, CMV-IE 프로모터는 인간 CMV-IE (Boshart et al., 1985, Cell, 41(2): 521-30)이거나 또는 쥣과동물 CMV-IE이다.
보다 일반 용어로, 프로모터는 바이러스, 식물, 또는 세포 기원이다. 개시 내용의 실시에 적용할 수 있는 CMV-IE 이외의 강력한 바이러스 프로모터는 SV40 바이러스의 초기/후기 프로모터 또는 루이스 육종 바이러스의 LTR 프로모터이다. 개시 내용의 실시에서 유용하게 적용할 수 있는 강력한 세포 프로모터는 세포 골격 유전자의 프로모터, 예컨대 예를 들어, 데스민 프로모터 (Kwissa et al., 2000, Vaccine, 18(22): 2337-44), 또는 액틴 프로모터 (Miyazaki et al., 1989, Gene, 79(2): 269-77)이다.
플라스미드는 다른 발현 제어 성분을 포함할 수 있다. 안정화 서열(들), 예를 들어, 인트론 서열(들), 예를 들어 옥수수 알콜 디히드로게나제 인트론 (Callis et al. Genes & Dev.1(10):1183-1200, Dec. 1987), hCMV-IE의 제1 인트론 (PCT 공개 특허 출원 WO1989/01036), 토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 II (van Ooyen et al., 1979, Science, 206(4416): 337-44)를 도입시키는 것이 특히 유리하다. 다른 구체예에서, 플라스미드는 3' UTR을 포함할 수 있다. 3' UTR은 제한없이, 아그로박테리움 (agrobacterium) 노팔린 신타제 (Nos) 3' UTR일 수 있다 (Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Depicker, A. et al. J. Mol. Appl. Genet., 1982; Bevan, NAR, 1984, 12(22): 8711-8721).
폭스바이러스이외의 바이러스 벡터 및 플라스미드를 위한 폴리아데닐화 신호 (폴리A)와 관련하여, 소 성장 호르몬 (bGH) 유전자의 폴리(A) 신호 (미국 특허 제5,122,458호 참조), 또는 토끼 β-글로빈 유전자의 폴리(A) 신호 또는 SV40 바이러스의 폴리(A) 신호를 더욱 이용할 수 있다.
"숙주 세포"는 유전적으로 변경되거나, 또는 외생성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 재조합 플라스미드 또는 벡터의 투여에 의해 유전적으로 변경될 수 있는 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 의미한다. 유전자 변경된 세포를 언급시, 이 용어는 본래의 변경된 세포와 이의 자손 둘 모두를 의미한다.
일 구체예에서, 재조합 FMDV 항원은 곤충 세포에서 발현된다.
사용 방법
일 구체예에서, 본 명세서에서 개시하는 대상 주제는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터, 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용할 수 있는 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클을 포함할 수 있는 백신의 유효량을 양, 소, 염소, 또는 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는, 양, 소, 염소, 또는 돼지를 백신접종하는 방법에 관한 것이다.
본 개시 내용의 일 구체예에서, 방법은 개시 내용에 따라 에멀션으로 제제화된 백신 조성물의 단일 투여 단계를 포함한다. 예를 들어, 일 구체예에서, 면역학적 또는 백신 조성물은 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함한다.
본 개시 내용의 다른 구체예에서, 방법은 2종의 이종성 백신 조성물의 단일 투여 단계를 포함한다. 이종성 백신 또는 조성물은 상이한 유형의 백신, 예컨대 FMDV VLP 백신 또는 FMDV 바이러스 벡터 백신일 수 있다. 이종성 백신은 또한 상이한 FMDV 혈청형, 예컨대 A24, A12, O1 마니사, 아시아 또는 이라크 바이러스주의 캡시드를 발현하는 동일 유형의 백신일 수도 있다.
일 구체예에서, 본 명세서에서 개시되는 대상 주제는 생체 내에서 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 백신을 양, 소, 염소, 또는 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는, 양, 소, 염소 또는 돼지를 백신접종하는 방법에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 명세서에서 개시하는 대상 주제는 생체내에서 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 백신을 양, 소, 염소, 또는 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응을 유발시키는 방법에 관한 것이다.
상동성 및 이종성 FMDV 바이러스주 둘 모두가 백신의 효능을 시험하기 위한 공격에 사용된다. 투여는 피하 또는 근육내일 수 있다. 투여는 바늘 무함유일 수 있다 (예를 들어, 피그젯 (Pigjet) 또는 바이오젝트(Bioject)).
개시 내용의 일 구체예에서, 적어도 하나의 1차 투여 및 적어도 하나의 공통 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 사용하는 적어도 하나의 부스터 투여로 구성되는, 프라임-부스트 계획 (prime-boost regimen)이 적용될 수 있다. 1차 투여에서 사용되는 면역학적 조성물 또는 백신은 부스터로서 사용되는 것과 성질이 상이하다. 그러나, 동일한 조성물이 1차 투여 및 부스터로서 사용될 수 있다는 것을 주의한다. 이러한 투여 프로토콜을 "프라임-부스트"라고 한다.
본 개시 내용에 따른 프라임-부스트는 항원성 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 FMDV 코딩 서열 또는 이의 단편을 발현시키는데 사용되는 재조합 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 특히, 바이러스 벡터는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 FMDV 유전자 또는 이의 단편을 발현할 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 바이러스 벡터는 제한없이, 폭스바이러스 [예를 들어, 백시니아 바이러스 또는 약독화된 백시니아 바이러스, 아비폭스 바이러스 또는 약독화된 아비폭스 바이러스 (예를 들어, 카나리폭스, 계두, 비둘기폭스, 구두, 메추라기폭스, ALVAC, TROVAC; 예를 들어, 미국 특허 제5,505,941호 및 제5,494,807호 참조), 라쿤폭스바이러스, 돼지폭스 바이러스 등], 아데노바이러스 (예를 들어, 인간 아데노바이러스, 개 아데노바이러스), 헤르페스바이러스 (예를 들어, 개 헤르페스, 칠면조의 헤르페스바이러스, 마렉병 바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 고양이 헤르페스바이러스, 후두기관염 바이러스 (ILTV), 소 헤르페스바이러스, 돼지 헤르페스바이러스), 배큘로바이러스, 레트로바이러스 등을 포함한다. 다른 구체예에서, 아비폭스 발현 벡터는 카나리폭스 벡터, 예컨대 ALVAC일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 아비폭스 발현 벡터는 계두 벡터, 예컨대 TROVAC일 수 있다. 발현시키려는 개시 내용의 FMDV 항원은 특정한 폭스바이러스 프로모터, 그 중에서도, 예를 들어 곤충폭스바이러스 암삭타 무레이 (Amsacta moorei) 42K 프로모터 (Barcena, Lorenzo et al., 2000, J Gen Virol., 81(4): 1073-85), 백시니아 프로모터 7.5 kDa (Cochran et al., 1985, J Virol, 54(1): 30-7), 백시니아 프로모터 I3L (Riviere et al., 1992, J Virol, 66(6): 3424-34), 백시니아 프로모터 HA (Shida, 1986, Virology, 150(2): 451-62), 우두 프로모터 ATI (Funahashi et al., 1988, J Gen Virol, 69 (1): 35-47), 백시니아 프로모터 H6 (Taylor et al., 1988, Vaccine, 6(6): 504-8; Guo et al., 1989, J Virol, 63(10): 4189-98; Perkus et al., 1989, J Virol, 63(9): 3829-36.)의 제어 하에 삽입된다.
다른 구체예에서, 아비폭스 발현 벡터는 카나리폭스 벡터, 예컨대 ALVAC일 수 있다. FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원은 FMDV P1-3C일 수 있다. FMDV 바이러스 벡터는 카나리폭스 바이러스 예컨대 vCP2186, vCP2181, 또는 vCP2176, 또는 계두 바이러스 예컨대 vFP2215일 수 있다 (미국 특허 제7,527,960호 참조). 또 다른 구체예에서, FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원은 좀개구리밥 (duckweed)에서 생성될 수 있다 (미국 공개 특허 출원 제2011/0236416호 참조).
개시 내용의 프라임-부스트 프로토콜의 다른 양상에서, 본 개시 내용의 FMDV 항원을 포함하는 조성물이 투여되고 이후에 곤충 세포에서 배큘로바이러스에 의해 발현된 FMDV VLP를 포함하는 서브유닛 백신을 포함하는 백신 또는 조성물 (USSN14/863,181 참조), 또는 FMDV 항원을 포함하는 불활성화된 바이러스 백신 또는 조성물, 또는 FMDV 항원을 함유하거나 또는 발현하는 DNA 플라스미드 백신 또는 조성물의 투여가 후속된다. 유사하게, 프라임-부스트 프로토콜은 곤충 세포에서 배큘로바이러스에 의해 발현된 FMDV VLP를 포함하는 서브유닛 백신을 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 FMDV 항원을 포함하는 불활성화된 바이러스 백신 또는 조성물, 또는 FMDV 항원을 함유하거나 또는 발현하는 DNA 플라스미드 백신 또는 조성물의 투여 이후에, 본 개시 내용의 FMDV 항원을 포함하는 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 1차 및 2차 투여 둘 모두는 본 개시 내용의 FMDV 항원을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다는 것을 더욱 주의한다.
프라임-부스트 프로토콜은 적어도 하나의 프라임-투여, 및 적어도 하나의 공통 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체 또는 단편을 사용하는 적어도 하나의 부스트 투여를 포함한다. 프라임-투여에서 사용되는 백신은 이후의 부스터 백신으로서 사용되는 것과 성질이 상이할 수 있다. 프라임-투여는 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다. 유사하게, 부스트 투여는 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다.
포유동물인 표적 종에 대한 조성물의 용량 부피, 예를 들어 양, 소, 염소 또는 돼지 조성물의 용량 부피는 바이러스 벡터, 예를 들어, 비폭스바이러스 바이러스 벡터 기반 벡터 기반 조성물을 기초로, 일반적으로 약 0.1 내지 약 5.0 ml, 약 0.1 내지 약 3.0 ml, 및 약 0.5 ml 내지 약 2.5 ml이다.
백신의 효능은 동물, 예컨대 양, 소, 염소 또는 돼지를 FMDV의 독성 바이러스주, 예컨대 FMDV O1 마니사, O1 BFS 또는 캄푸스, A24 크루제이루, A12, 아시아 1 샤미르, A 이란'96, 아시아/IRN/05, A22 이라크, SAT2 사우디 아라비아 바이러스주로 공격하여 마지막 면역화 이후 약 2 내지 4주에 시험될 수 있다.
여전히 다른 바이러스주는 FMDV 바이러스주 A10-61, A5, A12, A24/크루제이루, C3/인다이알, O1, C1-산타 파우, C1-C5, A22/550/아제르바이잔/65, SAT1-SAT3, A, A/TNC/71/94, A/IND/2/68, A/IND/3/77, A/IND/5/68, A/IND/7/82, A/IND/16/82, A/IND/17/77, A/IND/17/82, A/IND/19/76, A/IND/20/82, A/IND/22/82, A/IND/25/81, A/IND/26/82, A/IND/54/79, A/IND/57/79, A/IND/73/79, A/IND/85/79, A/IND/86/79, A/APA/25/84, A/APN/41/84, A/APS/44/05, A/APS/50/05, A/APS/55/05, A/APS/66/05, A/APS/68/05, A/BIM/46/95, A/GUM/33/84, A/ORS/66/84, A/ORS/75/88, A/TNAn/60/947/아시아/1, A/IRN/05, 아시아/IRN/05, O/HK/2001, O/UKG/3952/2001, O/UKG/4141/2001, 아시아 1/HNK/CHA/05 (유전자은행 수탁 번호 EF149010, 참조로 본 명세서에 편입됨), 아시아 I/XJ (Li, ZhiYong et al. Chin Sci Bull, 2007), HK/70 (Chin Sci Bull, 2006, 51(17): 2072-2078), O/UKG/7039/2001, O/UKG/9161/2001, O/UKG/7299/2001, O/UKG/4014/2001, O/UKG/4998/2001, O/UKG/9443/2001, O/UKG/5470/2001, O/UKG/5681/2001, O/ES/2001, HKN/2002, O5인도, O/BKF/2/92, K/37/84/A, KEN/1/76/A, GAM/51/98/A, A10/네덜란드, O/KEN/1/91, O/IND49/97, O/IND65/98, O/IND64/98, O/IND48/98, O/IND47/98, O/IND82/97, O/IND81/99, O/IND81/98, O/IND79/97, O/IND78/97, O/IND75/97, O/IND74/97, O/IND70/97, O/IND66/98, O/IND63/97, O/IND61/97, O/IND57/98, O/IND56/98, O/IND55/98, O/IND54/98, O/IND469/98, O/IND465/97, O/IND464/97, O/IND424/97, O/IND423/97, O/IND420/97, O/IND414/97, O/IND411/97, O/IND410/97, O/IND409/97, O/IND407/97, O/IND399/97, O/IND39/97, O/IND391/97, O/IND38/97, O/IND384/97, O/IND380/97, O/IND37/97, O/IND352/97, O/IND33/97, O/IND31/97, O/IND296/97, O/IND23/99, O/IND463/97, O/IND461/97, O/IND427/98, O/IND28/97, O/IND287/99, O/IND285/99, O/IND282/99, O/IND281/97, O/IND27/97, O/IND278/97, O/IND256/99, O/IND249/99, O/IND210/99, O/IND208/99, O/IND207/99, O/IND205/99, O/IND185/99, O/IND175/99, O/IND170/97, O/IND164/99, O/IND160/99, O/IND153/99, O/IND148/99, O/IND146/99, O/SKR/2000, A22/인도/17/77을 포함할 수 있다.
이들 FMDV 바이러스주의 추가 상세사항은 유럽 생물정보학 정보 (European Bioinformatics Information) (EMBL-EBI) 웹페이지에서 확인할 수 있고, 모든 연관된 뉴클레오티드 서열을 참조로 본 명세서에 편입시킨다. 발명자들은 본 명세서에 열거된 모든 FMDV와 아직 동정되어야 하는 것들이 예를 들어, 유효한 백신 조성물을 생성시키기 위해 본 개시 내용의 교시에 따라 발현될 수 있다고 간주한다. 상동성 및 이종성 바이러스주 둘 모두는 백신의 효능을 시험하기 위한 공격에 사용된다. 동물은 피내, 피하, 분무, 비내, 안내, 기관내, 및/또는 경구로 공격될 수 있다.
프라임-부스트 투여는 유리하게, 1 내지 6주 간격, 예를 들어 약 3주 간격으로 수행될 수 있다. 일 구체예에 따라서, 바이러스 벡터-기반 벡터를 유리하게 사용하여, 연 2회 (semi-annual) 부스터 또는 연 1회 부스터가 또한 구상된다. 동물은 유리하게 제1 투여의 시점에 적어도 6 내지 8주령 또는 약 6월령이다.
프라임-부스트 프로토콜에서 사용되는 본 개시 내용의 재조합 항원성 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 비히클, 희석제, 보조제, 또는 부형제에 함유된다. 개시 내용의 프로토콜은 양, 소, 염소 또는 돼지 FMDV로부터 동물을 보호하고/하거나 감염된 동물에서 질환 진행을 예방한다.
본 명세서의 개시 내용은 예를 통해서 제공되지만 본 개시 내용에 그에 국한되지 않는다는 것을 당업자는 이해해야 한다. 본 명세서의 개시 내용 및 당분야의 지식으로부터, 당업자는 투여 횟수, 투여 경로, 및 각 주사 프로토콜에 사용하려는 용량을 임의의 과도한 실험없이 결정할 수 있다.
본 개시 내용은 개시 내용에 따라 제조된 치료적 조성물의 유효량의 동물에 대한 적어도 1회의 투여를 고려한다. 동물은 숫컷, 암컷, 임신한 암컷 및 신생 동물일 수 있다. 이러한 투여는 제한없이, 근육내 (IM), 피내 (ID) 또는 피하 (SC) 주사 또는 비내를 통하거나 또는 경구 투여를 포함한 다양한 경로를 통할 수 있다. 개시 내용에 따른 치료적 조성물은 무바늘 장치 (예를 들어, 피그젯 (Pigjet), 더모젯 (Dermojet), 바이오젝터 (Biojector), 아비젯 (Avijet) (Merial, GA, USA), 베트젯 (Vetjet) 또는 비타젯 (Vitajet) 장치 (Bioject, Oregon, USA))에 의해 투여될 수 있다. 플라스미드 조성물을 투여하기 위한 다른 접근법은 전기영동을 사용하는 것이다 (예를 들어, Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; PCT 공개 특허 출원 제WO99/01158호 참조). 다른 구체예에서, 치료적 조성물은 유전자 총 또는 금 입자 충격법에 의해 동물에게 전달된다.
일 구체예에서, 개시 내용은 표적 세포에서 FMDV 항원 또는 에피토프의 전달 및 발현을 위한 제제의 치료 유효량의 투여를 제공한다. 치료 유효량의 결정은 당업자에게는 일상적인 실험작업이다. 일 구체예에서, 제제는 FMDV 항원 또는 에피토프를 발현하는 폴리뉴클레오티드 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 비히클 또는 부형제를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 구체예에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 비히클 또는 부형제는 숙주 동물로 폴리뉴클레오티드의 형질감염 또는 다른 수송 수단을 용이하게 하고/하거나 숙주에서 벡터 또는 단백질의 보존을 개선시킨다.
일 구체예에서, 본 명세서에 개시된 대상 주제는 감염된 동물 및 백신접종된 동물 간 구별 (differentiation between infected and vaccinated animal) (DIVA)을 위한 검출 방법을 제공한다.
본 개시 내용의 백신 또는 조성물의 사용은 동물에서 FMDV 감염의 검출을 가능하게 한다는 것을 본 명세서에서 개시한다. 본 개시 내용의 백신 또는 조성물의 사용은 감염된 동물 및 백신접종된 동물 간 구별 (DIVS)에 의해 동물에서 감염의 검출을 가능하게 한다는 것을 본 명세서에서 개시한다. FMDV 비구조 단백질 (예를 들어, FMDV 3ABC 또는 3D-특이적 ELISA)을 사용하여 동물에서 FMDV의 감염을 진단하기 위한 방법이 본 명세서에서 개시된다.
제조 물품
일 구체예에서, 본 명세서에 개시된 대상 주제는 재조합 FMDV 면역학적 조성물 또는 백신, 불활성화된 FMDV 면역학적 조성물 또는 백신, 재조합 FMDV 바이러스 조성물 또는 백신 중 어느 하나, 및 방법을 수행하기 위한 지시서를 포함할 수 있는 면역 반응을 유발시키거나 또는 유도시키는 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
개시 내용의 다른 구체예는 개시 내용의 FMDV 항원을 포함하는 조성물 또는 백신 및 재조합 FMDV 바이러스 면역학적 조성물 또는 백신, 및 동물에서 면역 반응을 유발시키기 위한 유효량으로 전달 방법을 수행하기 위한 지시서를 포함하는, 동물에서 FMDV에 대항하여 면역학적 또는 보호성 반응을 유도시키는 방법을 수행하기 위한 키트이다.
개시 내용의 다른 구체예는 개시 내용의 FMDV 항원을 포함하는 조성물 또는 백신 및 불활성화된 FMDV 면역학적 조성물 또는 백신, 및 동물에서 면역 반응을 유발시키기 위한 유효량으로 전달 방법을 수행하기 위한 지시서를 포함하는 동물에서 FMDV에 대항하여 면역학적 또는 보호성 반응을 유도시키는 방법을 수행하기 위한 키트이다.
본 개시 내용의 또 다른 양상은 상기에 기술된 바와 같이 본 개시 내용에 따른 프라임-부스트 백신접종을 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 적어도 2개의 바이알을 포함할 수 있는데, 제1 바이알은 본 개시 내용에 따른 프라임-백신접종을 위한 백신 또는 조성물을 함유하고, 제2 바이알은 본 개시 내용에 따라 부스트-백신접종을 위한 백신 또는 조성물을 함유한다. 키트는 추가의 프라임-백신접종 또는 추가의 부스트-백신접종을 위한 추가의 제1 또는 제2 바이알을 함유할 수 있다.
일 구체예에서, FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클을 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구체예에서, FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클을 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 구체예에서, FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체가 양, 소, 염소, 또는 돼지 FMDV 항원의 적어도 15개 아미노산을 포함하는 면역원성 단편을 포함하는 상기 기술된 조성물이 개시된다. 일 구체예에서, FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체가 부분적으로 정제된 상기 조성물이 개시된다. 일 구체예에서, FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체가 실질적으로 정제된 상기 조성물이 개시된다.
일 구체예에서, FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체가 양, 소, 염소 또는 돼지 FMDV 폴리펩티드인 상기 조성물이 개시된다. 일 구체예에서, FMDV 폴리펩티드가 P1 폴리펩티드, VP0 폴리펩티드, VP1 폴리펩티드, VP3 폴리펩티드, VP2 폴리펩티드, VP4 폴리펩티드, 2A 폴리펩티드, 2B 폴리펩티드, 2C 폴리펩티드, 3A 폴리펩티드, 3B 폴리펩티드, 3C 폴리펩티드, 또는 3D 폴리펩티드인 상기 조성물이 개시된다. 일 구체예에서, FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체가 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 상기 조성물이 개시된다. 일 구체예에서, FMDV 항원이 서열번호 1, 3, 5, 또는 7에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 상기 조성물이 개시된다. 일 구체예에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클이 유중수 에멀션 또는 수중유 에멀션인 상기 조성물이 개시된다. 다른 구체예에서, 동물에게 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 양, 소, 염소 또는 돼지 FMDV에 대해 감수성인 동물을 백신접종하는 방법을 개시한다. 일 구체예에서, 프라임-부스트 계획을 포함하는, 양, 소, 염소, 또는 돼지 FMDV에 감수성인 동물을 백신접종하는 방법이 개시된다. 일 구체예에서, 곤충 세포에서 발현되는 실질적으로 정제된 항원성 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6 또는 8에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이 개시된다. 임의의 구체예에서, 동물은 바람직하게, 양, 소, 돼지, 또는 염소이다. 일 구체예에서, 동물에서 FMDV 감염을 진단하는 방법이 개시된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 2개의 바이알을 포함하는 프라임-부스트 백신접종을 위한 키트로서, 여기서 제1 바이알은 FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 조성물을 함유하고, 제2 바이알은 FMDV 항원을 함유하거나 또는 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 것이 개시된다.
약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 보조제 또는 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 에를 들어, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 0.9% NaCl (예를 들어, 염수) 용액 또는 포스페이트 완충액일 수 있다. 이 개시 내용의 방법에서 사용할 수 있는 다른 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 제한없이, 폴리-(L-글루타메이트) 또는 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 보조제 또는 부형제는 벡터 (또는 시험관 내에서 본 발명의 벡터로부터 발현되는 단백질)의 투여를 용이하게 하는 임의의 화합물 또는 화합물의 조합일 수 있고, 유리하게 담체, 비히클 또는 부형제는 벡터 (또는 단백질)의 보존성을 개선시키고/시키거나 형질감염성을 촉진할 수 있다. 용량 및 용량 부피는 본 명세서에서 일반 설명에서 기술하며 또한 임의의 과도한 실험활동없이, 당분야의 지식과 함께 본 개시 내용을 읽고 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
플라스미드에 유리하지만 배타적이지 않게 적합한 4차 암모늄 염을 함유하는 양이온성 지질은 유리하게 다음의 화학식을 갖는 것들이다:
Figure 112018085897730-pct00001
상기 식에서 R1은 12 내지 18개 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화된 직쇄 지방족 라디칼이고, R2는 2 또는 3개 탄소 원자를 함유하는 다른 지방족 라디칼이며 X는 아민 또는 히드록실 기, 예를 들어 DMRIE이다. 다른 구체예에서, 양이온성 지질은 중성 지질, 예를 들어 DOPE와 회합될 수 있다.
이들 양이온성 지질 중에서, 바람직한 것은 DMRIE (N-(2-히드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판 암모늄; WO96/34109)으로서, 유리하게 중성 지질, 유리하게 DOPE (디올레오일-포스파티딜-에탄올 아민; Behr, 1994)과 회합되어, DMRIE-DOPE를 형성하는 것이다.
유리하게, 보조제와 플라스미드 혼합물은 즉석으로, 조제물의 투여와 유리하게 동시에 또는 조제물의 투여 직전에 형성되고, 예를 들어 투여 직전 또는 이전에, 유리하게 혼합물이 복합체를 형성하도록 투여 이전에 충분한 시간이 주어지도록, 예를 들어 투여 이전 약 10분 내지 약 60분, 예컨대 투여 이전 약 30분에, 플라스미드-보조제 혼합물이 형성된다.
DOPE가 존재하는 경우, DMRIE:DOPE 몰비율은 약 95: 약 5 내지 약 5: 약 95, 보다 유리하게 약 1: 약 1, 예를 들어, 1:1이다.
DMRIE 또는 DMRIE-DOPE 보조제:플라스미드 중량비는 약 50: 약 1 내지 약 1: 약 10, 예컨대 약 10: 약 1 내지 약 1:약 5, 및 약 1: 약 1 내지 약 1: 약 2, 예를 들어, 1:1 내지 1:2일 수 있다.
다른 구체예에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클은 유중수 에멀션일 수 있다. 적합한 유중수 에멀션의 예는 6 내지 50 v/v%의 항원-함유 수성층, 바람직하게 전체적으로 또는 부분적으로 비대사성 오일 (예를 들어, 미네랄 오일 예컨대 파라핀 오일) 및/또는 대사성 오일 (예를 들어, 식물성 오일, 또는 지방산, 폴리올 또는 알콜 에스테르)을 함유하는 12 내지 25 v/v%, 50 내지 94 v/v%의 오일층, 0.2 내지 20 p/v%, 바람직하게 3 내지 8 p/v%의 계면활성제를 함유하는 4℃에서 유체이고 안정한 오일 기반 유중수 백신 에멀션을 포함하고, 후자는 전체적으로 또는 부분적으로, 또는 혼합물로 폴리글리세롤 에스테르이고, 상기 폴리글리세롤 에스테르는 바람직하게 폴리글리세롤 (폴리)리시놀레에이트, 또는 폴리옥시에틸렌 리신 오일 또는 그외 수소화된 폴리옥시에틸렌 리신 오일이다. 유중수 에멀션에 사용될 수 있는 계면활성제의 예는 에톡실화된 솔비탄 에스테르 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노올레에이트 (TWEEN 80®), AppliChem, Inc.(Cheshire, CT)에서 입수가능) 및 솔비탄 에스테르 (예를 들어, 솔비탄 모노올레에이트 (SPAN 80®), Sigma Aldrich (St. Louis, MO)에서 입수가능)를 포함한다. 또한, 유중수 에멀션과 관련하여, 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 특허 제6,919,084호, 예를 들어, 이의 실시예 8을 참조한다. 일부 구체예에서, 항원-함유 수성층은 하나 이상의 완충제를 포함하는 염수 용액을 포함한다. 적합한 완충 용액의 예는 포스페이트 완충된 염수이다. 유리한 구체예에서, 유중수 에멀션은 물/오일/물 (W/O/W) 삼중 에멀션 (미국 특허 제6,358,500호)일 수 있다. 다른 적합한 에멀션의 예는 미국 특허 제7,371,395호에 기술되어 있다.
본 개시 내용에 따른 면역학적 조성물 및 백신은 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있거나 또는 그로 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 개시 내용의 실시에서 사용하기 위해 적합한 보조제는 (1) 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물 및 알케닐 유도성 중합체, (2) 면역자극성 서열 (immunostimulating sequence) (ISS), 예컨대 하나 이상의 비메틸화된 CpG 유닛을 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열 (Klinman et al., 1996, PNAS USA, 93(7): 2879-83; WO98/16247), (3) 수중유 에멀션, 예컨대 M. Powell, M. Newman, Plenum Press가 출판한 ["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" 1995, 6: 147, 183]의 147 페이지에 기술된 SPT 에멀션, 및 동일 문헌의 183 페이지에 기술된 에멀션 MF59, (4) 4차 암모늄 염을 함유하는 양이온 지질, 예를 들어, DDA (5) 사이토카인, (6) 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄, (7) 사포닌 또는 (8) 본 출원에서 인용되어 참조로 편입된 임의 문서에 기술된 다른 보조제, 또는 (9) 이의 임의 조합 또는 혼합물이다.
바이러스 벡터에 특히 적절한 수중유 에멀션 (3)은 연질 액상 파라핀 오일 (유럽 약전 유형), 이소프레노이드 오일 예컨대 스쿠알란, 스쿠알렌, 알켄의 올리고화에 의한 오일, 예를 들어 이소부텐 또는 데센, 직쇄 알킬 기를 갖는 알콜 또는 산의 에스테르, 예컨대 식물성 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜, 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세롤 트리(카프릴레이트/카프레이트) 및 프로필렌 글리콜 디올레에이트, 또는 분지된, 지방 알콜 또는 산의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르를 기반으로 할 수 있다.
오일은 에멀션을 형성하도록 유화제와 조합되어 사용된다. 유화제는 비이온성 계면활성제, 예컨대 한편으로는 솔비탄, 만니드 (예를 들어, 언히드로만니톨 올레에이트), 글리세롤, 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 및 다른 한편으로 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르일 수 있고, 상기 에스테르는 임의로 에톡실화되거나, 또는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 예컨대 Pluronic, 예를 들어, L121이다.
유형 (1) 보조제 중합체 중에서, 바람직한 것은, 특히 폴리알콜 또는 당의 폴리알케닐 에테르에 의해 가교된, 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 이들 화합물은 카보머라는 명칭으로 알려져 있다 (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996). 당업자는 또한 미국 특허 제2,909,462호를 언급할 수 있는데, 이것은 적어도 3개의 히드록실 기, 바람직하게 8개를 넘지 않는 이러한 기를 갖는 폴리히드록실 화합물에 의해 가교된 이러한 아크릴산 중합체를 제공하며, 적어도 3개의 히드록실 기의 수소 원자는 적어도 2개의 탄소 원자를 갖는 불포화된, 지방족 라디칼에 의해 치환된다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개 탄소 원자를 함유하는 것들, 예를 들어 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이다. 불포화된 라디칼은 또한 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있다. CARBOPOL® (BF Goodrich, Ohio, USA) 명칭 하에서 판매되는 제품이 특히 적합하다. 그들은 알릴 사카로스 또는 알릴 펜타에리쓰리톨에 의해 가교된다. 그들 중에서, CARBOPOL® l 974P, 934P 및 971P를 참조한다.
말레산 무수물-알케닐 유도체 공중합체와 관련하여, 바람직한 것은 직쇄 또는 가교된 에틸렌-말레산 무수물 공중합체인 EMA® (Monsanto)이고, 그들은 예를 들어 디비닐 에테르에 의해 가교된다.
구조와 관련하여, 아크릴산 또는 메타크릴산 중합체 및 EMA®는 바람직하게 다음의 화학식을 갖는 기본 유닛에 의해 형성된다:
Figure 112018085897730-pct00002
상기 식에서
- R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이할 수 있고, H 또는 CH3을 나타내고,
- x = 0 또는 1이고, 바람직하게 x = 1이고,
- y = 1 또는 2로서, x + y = 2이다.
EMA®의 경우, x = 0이고 y = 2이며 카보머의 경우 x = y = 1이다.
이들 중합체는 물 또는 생리적 염 용액 (20 g/l NaCl) 중에 가용성이며 pH는 발현 벡터(들)가 도입될 수 있는 보조제 용액을 제공하도록, 예를 들어 소다 (NaOH)에 의해 7.3 내지 7.4로 조정될 수 있다. 최종 면역학적 또는 백신 조성물 중 중합체 농도는 약 0.01 내지 약 1.5% w/v, 약 0.05 내지 약 1% w/v, 및 약 0.1 내지 약 0.4% w/v 범위일 수 있다.
사이토카인 또는 사이토카인들 (5)은 면역학적 또는 백신 조성물에 단백질 형태로 존재할 수 있거나, 또는 숙주에서 면역원 또는 면역원들 또는 이의 에피토프(들)과 공동 발현될 수 있다. 바람직한 것은 면역원 또는 면역원들 또는 이의 에피토프(들)을 발현하는 것과 동일한 벡터에 의하거나, 또는 이의 개별 벡터에 의한 사이토카인 또는 사이토카인들의 공발현이다.
본 개시 내용은 예를 들어 활성 성분을 유리하게 보조제, 담체, 사이토카인, 및/또는 희석제와 함께 혼합하여, 이러한 조합 조성물을 제조하는 것을 이해한다.
본 개시 내용에서 사용할 수 있는 사이토카인은 제한없이, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구/마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론 α (IFNα), 인터페론 β (IFNβ), 인터페론 γ, (IFNγ), 인터루킨-1α (IL-1α), 인터루킨-1β (IL-1β), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-5 (IL-5), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-7 (IL-7), 인터루킨-8 (IL-8), 인터루킨-9 (IL-9), 인터루킨-10 (IL-10), 인터루킨-11 (IL-11), 인터루킨-12 (IL-12), 종양 괴사 인자 α (TNFα), 종양 괴사 인자 β (TNFβ), 폴리이노신산 및 폴리시티딜산, 시티딘-포스페이트-구아노신 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN), 및 형질전환 성장 인자 β (TGFβ)를 포함한다. 사이토카인은 본 개시 내용의 면역학적 또는 백신 조성물과 공동투여될 수 있고/있거나 순차적으로 투여될 수 있다는 것을 이해한다. 따라서, 예를 들어 본 개시 내용의 백신은 또한 적합한 사이토카인, 예를 들어, 백신접종하고자 하거나 또는 면역학적 반응을 유발시키려는 이러한 숙주에 일치되는 사이토카인 (예를 들어 소에게 투여하려는 조제물의 경우 소 사이토카인)을 생체내에서 발현하는 외생성 핵산 분자를 함유할 수 있다.
특정 구체예에서, 보조제는 TS6, TS7, TS8 및 TS9 에멀션 (미국 특허 제7,371,395호); LR3 및 LR4 (US7,691,368); TSAP (미국 공개 특허 출원 제20110129494호); TRIGEN™ (Newport Labs); 합성 dsRNA (예를 들어, 폴리-IC, 폴리-ICLC [HILTONOL®]); CARBIGEN™ 보조제 (MVP Laboratories, Inc.); ENABL® 보조제 (VaxLiant); 및 MONTANIDE™ 보조제 (W/O, W/O/W, O/W, IMS 및 겔) (SEPPIC)를 포함할 수 있다. 최종 면역학적 조성물 또는 백신 조성물 중 보조제 농도는 5% 내지 80% v/v의 범위일 수 있다.
배큘로바이러스/곤충 세포-발현된 폴리펩티드를 기반으로 하는 면역학적 조성물 및/또는 백신의 경우에서, 용량은 약 1 ㎍ 내지 약 2000 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 및 약 100 ㎍ 내지 약 500 ㎍의 FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원을 포함할 수 있다. 용량은 약 102 내지 약 1020, 약 103 내지 약 1018, 약 104 내지 약 1016, 약 105 내지 약 1012 VLP (viral like particle: 바이러스 유사 입자)를 포함할 수 있다. FMDV 항원을 발현하는 바이러스 벡터를 기반으로 하는 면역학적 조성물 및/또는 백신의 경우에서, 용량은 약 103 바이러스 입자 내지 약 1015 바이러스 입자, 약 103 바이러스 입자 내지 약 1014 바이러스 입자, 약 103 바이러스 입자 내지 약 1013 바이러스 입자, 약 103 바이러스 입자 내지 약 1012 바이러스 입자를 포함할 수 있다. 바이러스 입자는 제한없이, FFA (Focus Forming Assay) 또는 FFU (Focus Forming Unit), TCID50 (50% Tissue Culture　Infective Dose), PFU (Plaque Forming Units), 및 FAID50 (50% Fluorescent Antibody Infectious Dose)를 포함하는 임의의 바이러스 적정 방법을 기반으로 계산될 수 있다. 용량 부피는 약 0.1 내지 약 10 ml, 약 0.2 내지 약 5 ml일 수 있다.
개시 내용을 이제 하기의 비제한적인 실시예에 의해 더욱 설명할 것이다.
실시예
DNA 삽입부, 플라스미드 및 재조합 바이러스 벡터의 구축은 문헌 [J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2014)]에 기술된 표준 분자 생물학 기술을 사용해 수행하였다.
실시예 1 재조합 인간 아데노바이러스 5 벡터화 FMDV 항원의 구축
실시예 1.2 재조합 인간 아데노바이러스 5 벡터화 FMDV 키메라 A24-A12 항원의 구축
게놈의 E1, E3, 및 E4 영역 내 결실이 있는 인간 아데노바이러스 C, 혈청형 5 (Ad5) 벡터 (아데노바이러스 벡터) (GV11 골격, 미국 특허 제8,323,663호 참조) 를 키메라 FMDV 단백질을 발현하는 재조합 FMDV 백신을 구축하는데 사용하였다. 키메라 FMDV 단백질은 FMDV 혈청형 A24의 구조적 캡시드 유전자 (A24 P1) 및 비구조적 유전자 A24 (2A-부분 2B), 비구조적 부분 3B 유전자 및 FMDV 혈청형 A12의 프로테아제 유전자 (부분 3B-C3) (서열번호 2)를 함유한다.
FMDV A24 (P1-2A-부분 2B)-A12 (부분 3B-3C)를 코딩하는 키메라 폴리뉴클레오티드는 셔틀 플라스미드에 도입시켰다 (도 2 및 3 참조). 선형화된 GV11 골격 플라스미드 (카나마이신 내성 유전자 보유) 및 키메라 FMDV 폴리뉴클레오티드를 함유하는 선형화된 셔틀 플라스미드를 BJDE3 이. 콜라이 세포로 공동형질전환시킨 후, 이. 콜라이의 카나마이신-내성 클론을 선별하였다. 재조합 플라스미드를 보유하는 클론은 RFLP에 의해 확증하였다. 단일 클론을 선택하였고, 플라스미드를 선형화시키고 M2A 세포로 형질감염시켰다. M2A 세포 형질감염물 유래의 용해물을 연속적으로 계대하여 재조합 아데노바이러스 벡터화 키메라 FMDV 백신의 고역가 스톡을 생성시켰다.
도너 유전자 삽입 부위는 Ad5 E1 발현 카세트의 SV40 폴리A와 CMV 프로모터 사이에 존재하고, 발현 카세트는 E1 영역에서 BBA에 삽입되었다. E1 영역 결실 접합부에 위치된, A24-A12 발현 카세트는 바이러스 게놈 RNA 전사와 관련하여 우측에서 좌측으로 읽혀진다. 삽입 카세트의 측접한 뉴클레오티드 서열에 기지의 조절 신호가 존재하지 않는다. CMV 인핸서/프로모터는 전사의 개시를 제어한다. 이 서열 내에는 바이러스 인핸서 CAAT 박스, TATA 박스, 전사 출발 부위, 및 5' 슬라이싱 부위 서열이 존재한다.
CMV 서열은 스플라이스 도너 서열을 함유하는 인공 비번역 영역 (UTR)이 후속된다. 발현시키려는 유전자의 오픈 리딩 프레임은 3' 플라이싱 부위 서열에 뒤따르고 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 폴리아데닐화 신호가 전사를 종결시키기 위해 오픈 리딩 프레임의 3'에 위치된다.
프라이머 쌍은 RBA 유전자 구조적 동일성 (Genetic Structural Identity) (GSI) 어세이를 위해 디자인되었다. GSI 어세이는 골격 생물학제 및 발현 카세트를 동정하기 위해 PCR을 사용한다. GSI 블롯 (도 4 참조)은 올바른 골격 및 A24-A12 FMDV 발현 카세트를 보여주었다. A24-A12 발현 카세트의 서열 분석은 또한 재조합 아데노바이러스 벡터화 키메라 A24-A12 FMDV 백신으로부터 추출된 DNA와 셔틀 플라스미드 사이의 뉴클레오티드 서열 동일성을 확증시켜 주었다
재조합 아데노바이러스 벡터화 키메라 A24-A12 FMDV 백신은 대략 28 KDa의 위치로 이동된 반응성 단백질을 산출시킨, 웨스턴 블롯 어세이를 통해서 293 세포에서 시험관내 A24 단백질이 발현되는 것이 확증되었다 (도 5 참조). 웨스턴 블롯 어세이에서 검출을 위해 사용된 항체는 단일클론 항체이다. 재조합 아데노바이러스 벡터화 키메라 A24-A12 FMDV 백신으로부터 발현되는 A24 단백질의 분자량은 293 세포로 양성 대조군 셔틀 플라스미드의 형질감염 이후에 관찰된 것과 구별되지 않았다 (도 5 참조).
실시예 1.2 재조합 인간 아데노바이러스 5 벡터화 FMDV O1M 항원의 구축
게놈의 E1, E3 및 E4 영역에 결실이 있는 인간 아데노바이러스 C, 혈청형 5 (Ad5) 벡터 (아데노바이러스 벡터) (GV11 골격, 미국 특허 제8,323,663호 참조)를 FMDV 단백질을 발현하는 재조합 FMDV 백신을 구축하는데 사용하였다. FMDV 단백질은 FMDV O1/Man/87 바이러스주로부터 유래되는 전체 길이 프로테아제 3C (서열번호 4)를 포함하는 비구조적 단백질 2ABC 및 3ABC 및 구조적 캡시드 P1 (VP4-VP2-VP3-VP1)을 함유한다.
FMDV O1M P1 (VP4-VP2-VP3-VP1-2ABC'3A'BC)을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드 (서열번호 3)를 셔틀 플라스미드로 도입시켰다 (도 6 참조). 재조합 아데노바이러스 벡터화 O1M FMDV 백신은 실시예 1.2에 기술된 바와 같은 과정에 따라서 구축하였다.
E1 영역 결실 접합부에 위치된, O1M87 FMDV 발현 카세트는 바이러스 게놈 RNA 전사와 관련하여 우측에서 좌측으로 읽혀진다. 삽입 카세트의 측접한 뉴클레오티드 서열 내에 기지의 조절 신호는 존재하지 않는다. CMV 인핸서/프로모터는 전사의 개시를 제어한다. 이 서열 내에 바이러스 인핸서 CAAT 박스, TATA 박스, 전사 출발 부위, 및 5' 스플라이스 부위 서열이 존재한다.
CMV 서열은 스플라이스 도너 서열을 함유하는 인공 비번역 영역 (UTR)이 후속된다. 발현시키려는 유전자의 오픈 리딩 프레임은 3' 스플라이스 부위 서열에 뒤따르고 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 폴리아데닐화 신호는 전사를 종결하도록 오픈 리딩 프레임의 3'에 위치된다.
GSI 블롯은 올바른 골격 및 O1M87 FMDV 발현 카세트를 보여주었다. O1M87 FMDV 발현 카세트의 서열 분석은 또한 재조합 아데노바이러스 벡터화 O1M87 FMDV 백신으로부터 추출된 DNA와 셔틀 플라스미드 간 뉴클레오티드 서열 동일성을 확증시켜 주었다. 재조합 아데노바이러스 벡터화 O1M87 FMDV 백신은 웨스턴 블롯 어세이를 통해서 293 세포에서 시험관내 O1M87 단백질이 발현되는 것이 확증되었다.
실시예 1.3 재조합 인간 아데노바이러스 5 벡터화 FMDV Irn 항원의 구축
게놈의 E1, E3 및 E4 영역 내에 결실이 있는 인간 아데노바이러스 C, 혈청형 5 (Ad5) 벡터 (아데노바이러스 벡터) (GV11 골격, 미국 특허 제8,323,663호 참조)는 FMDV 단백질을 발현하는 재조합 FMDV 백신을 구축하는데 사용되었다. FMDV 혈청형 A/Irn/05의 3C의 프로테아제 코딩 서열 및 비구조적 유전자 2A, 2B, 부분 2C (2C'), 부분 3A (3A'), 3B 및 P1의 합성 FMDV 캡시드 코딩 서열을 셔틀 플라스미드에 도입시켰다 (도 7 참조). 재조합 아데노바이러스 벡터화 Irn FMDV 백신은 실시예 1.2에 기술된 바와 같은 과정을 따라서 구축하였다.
E1 영역 결실 접합부에 위치된, Irn FMDV 발현 카세트는 바이러스 게놈 RNA 전사와 관련하여 우측에서 좌측으로 읽혀진다. 삽입 카세트의 측접한 뉴클레오티드 서열에 기지의 조절 신호는 존재하지 않는다. CMV 인핸서/프로모터는 전사의 개시를 제어한다. 이 서열 내에 바이러스 인핸서 CAAT 박스, TATA 박스, 전사 출발 부위, 및 5' 스플라이스 부위 서열이 존재한다.
CMV 서열은 스플라이스 도너 서열을 함유하는 인공 비번역 영역 (UTR)이 후속된다. 발현시키려는 유전자의 오픈 리딩 프레임은 3' 스플라이스 부위 서열에 뒤이어 오고 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 폴리아데닐화 신호는 전사를 종결하도록 오픈 리딩 프레임의 3'에 위치된다.
재조합 아데노바이러스 벡터화 Irn FMDV 백신은 PCR-기반 유전자 구조적 동일성 (GSI) 어세이를 사용해 동정하였고 웨스턴 블롯 기술을 통한 단백질 발현을 사용해 확증하였다.
실시예 1.4 재조합 인간 아데노바이러스 5 벡터화 FMDV 아시아 항원의 구축
게놈의 E1, E3 및 E4 영역에 결실이 있는 인간 아데노바이러스 C, 혈청형 5 (Ad5) 벡터 (아데노바이러스 벡터) (GV11 골격, 미국 특허 제8,323,663호 참조)는 FMDV 단백질을 발현하는 재조합 FMDV 백신을 구축하는데 사용되었다. FMDV 바이러스주 아시아/Leb/89 유래의 3C의 프로테아제 코딩 서열 및 비구조적 유전자 2A, 2B, 부분 2C (2C'), 부분 3A (3A'), 3B 및 P1의 합성 FMDV 캡시드 코딩 서열을 셔틀 플라스미드에 도입시켰다 (도 8 참조). 재조합 아데노바이러스 벡터화 아시아 FMDV 백신은 실시예 1.2에 기술된 바와 같은 과정에 따라서 구축하였다.
E1 영역 결실 접합부에 위치된, 아시아 FMDV 발현 카세트는 바이러스 게놈 RNA 전사와 관련하여 우측에서 좌측으로 읽혀진다. 삽입 카세트의 측접한 뉴클레오티드 서열에 기지의 조절 신호는 존재하지 않는다. CMV 인핸서/프로모터는 전사의 개시를 제어한다. 이 서열 내에 바이러스 인핸서 CAAT 박스, TATA 박스, 전사 출발 부위, 및 5' 스플라이스 부위 서열이 존재한다.
CMV 서열은 스플라이스 도너 서열을 함유하는 인공 비번역 영역 (UTR)이 후속된다. 발현시키려는 유전자의 오픈 리딩 프레임은 3' 스플라이스 부위 서열에 뒤이어 오고 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 폴리아데닐화 신호는 전사를 종결하도록 오픈 리딩 프레임의 3'에 위치된다.
재조합 아데노바이러스 벡터화 아시아 FMDV 백신은 대략 38 kDa의 위치로 이동된 반응성 단백질을 산출한, 웨스턴 블롯 어세이에 의해 293 세포에서 시험관내 아시아 단백질을 발현하는 것이 확증되었다. 웨스턴 블롯 어세이에서 검출을 위해 사용된 항체는 FMD VP2 다클론이었다. 발현된 아시아SS.2B 단백질의 분자량은 293 세포로 양성 대조군 플라스미드의 형질감염 이후에 관찰된 것과 구별되지 않았다.
실시예 2 축우 및 돼지에서 공격 실험
축우 및 돼지를 IM을 통해서 0일에 1회 A24-A12 FMDV 백신 또는 O1M87 FMDV 백신을 백신접종시켰고 14일에 많은 FMDV 혈청형, 예컨대 A24, A12, O1, 아시아, Irn, 및 이라크 바이러스주로 공격하였다.
도 9는 3가지 상이한 용량 및 대조군에서 FMDV 공격에 대항하여 동물에서 O1 FMDV 백신의 보호성을 보여준다. 이러한 용량 적정 실험에서, 재조합 아데노-벡터화 O1M FMDV 백신은 백신 접종 후 14일 (dpv)에 직접, IDL 상동성 공격 후 FMD 전신 질환 (족부 병변)에 대항하여 보호성을 부여하는 능력에 대해 평가되었다. 건강한 6개월령 암컷 홀슈타인종 축우를 4개 처치 그룹 중 하나로 임의추출하였다. 대조군인, 나이브 축우 (T01; n=4)는 1회, 2 mL 용량의 최종 제제 완충액 (FFB)으로 근육내 면역화시켰다. T02 내지 T04 (n=7/그룹)의 축우는 ENABL™ C1 보조제에 제제화된 마스터 씨드 바이러스 계대 2 (MSV+2)로부터 제조된 활성 성분의 감소된 용량 [항-아데노바이러스 헥손 병소 형성 유닛 (focus forming unit) (FFU) 또는 병소 형성 어세이(focus forming assay) (FFA); log10]으로 백신접종시켰다. T02 내지 T04는 개별적으로 2.38x105, 5.94x104 FFU 또는 1.49　x104 FFU의 전체 용량을 투여받았다. 백신 접종 후 2주 (공격일)에, 최저 백신 용량 처치 그룹 (T04)에서 43% 대비, T02 및 T03 백신접종군의 100%가 FMDV O1 마니사 혈청 바이러스 중화 (serum virus neutralizing) (SVN) 역가를 가졌다. 1 x 104의 소 감염성 용량 단위 50% (BID50)의 FMDV O1 마니사로 피내 설측 공격 후, 100%의 T01 대조군, 나이브 축우는 전신 질환 (족부 병변)을 나타냈다. 대조적으로, 백신접종군에서 전신 질환에 대항한 보호 수준은 86% (T04) 내지 100% (T02 및 T03) 범위였다. 모든 4마리 대조군 축우 (T01)가 공격 후 1 내지 3일 (dpc)에 채혈된 혈장에서 FMDV 양성이었던데 반해, 21마리의 백신접종군 중 어떠한 동물도 1 내지 5 dpc에서 검출가능한 혈장 바이러스혈증을 갖지 않았다. T01에서, 2 내지 5 dpc에 채취된 비측 샘플 중 88%가 2 내지 5 dpc에 검사된 샘플 중 25% (T03), 27% (T02) 및 36% (T04)와 비교하여, 바이러스 양성이었다. 도 10은 3가지 용량 및 대조군에서 O1 FMDV 백신의 혈청학을 보여준다.
이들 결과는 ENABL C1 보조제에 제제화된 재조합 아데노벡터 O1M FMDV 백신 활성 성분이 축우에서 IDL, 상동성 FMDV 공격에 대항하여 고도로 면역원성이고 효과적이며, 추정되는 최소 보호 용량에 대한 데이타를 제공한다는 것을 입증한다.
A24-A12 및 O1M87 백신 둘 모두는 마우스 및 송아지에서 안전한 것으로 검사되었다.
실시예 3 보조제 혈청학 면역원성 및 상응하는 살바이러스/안정성 실험
백신을 보조하는 것은 최소 보호 용량 (minimum protective dose) (MPD)을 감소시킬 수 있고 그 결과로 보다 유효한 백신을 생성시킬 수 있다. 감소된 MPD는 보조제 비용 및 공급 보안성에 의해 균형을 이룰 수 있다. 그러나, 일부 보조제는 백신 유효성을 감소시킬 수 있다. 보조제는 면역계를 원치않는 반응쪽으로 밀어낼 수 있거나 또는 보조제가 면역화제에 유해할 수 있다 (예를 들어 안정성 결여).
실험의 목적은 보조제의 혈청학 효능을 평가하는 것이었다. 효능 혈청학 실험을 축우에서 수행하였고, 동시에 살바이러스/안정성 실험을 수행하여 5종 보조제 중 어느 것이 아데노바이러스 FMDV 백신에 유해한 효과를 갖는지 여부를 결정하였다. 각 용량은 각각의 보조제 2 mL 용량에서 용량 당 200 ㎕의 최종 AI (Active Ingredient: 활성 성분)로 이루어진다. 보조제는 폴리아크릴산, LF2 에멀션, LR6 에멀션, CARBIGEN™ M 및 ENABL® C1이다 (하기 표 1.1 참조).
Figure 112018085897730-pct00003
Figure 112018085897730-pct00004
Figure 112018085897730-pct00005
백신은 4℃ 및 25℃에서 저장하였고 시간 경과에 따라 시험하였다. 각 백신 중 바이러스는 표준 병소 형성 어세이 적정 어세이에 따라 적정하였는데, 여기서 검출되는 바이러스의 양은 세포 단층 상의 특이적 항-아데노바이러스 항체에 의해 판독된다. 개별 역가를 비교하였다. 처음 3개월부터의 데이타를 하기 표 2 및 도 11 (25℃) 및 12 (4℃)에 나타내었다. 4℃에서, 제제화된 백신에 존재하는 대부분의 항원 또는 바이러스는 3개월 까지 안정하였다. 25℃에서, 보조제 폴리아크릴산, LF2 및 Carbigen M으로 제제화된 항원 또는 바이러스는 비교적 7주까지 안정하였다. 이들 3종 제제의 안정성은 3개월 지점에 25℃에서 약간의 감소를 보였다. 그러나, 이러한 하락은 재조합 바이러스를 보조제와 조합했을 때 덜하여 보조제의 보호 효과가 입증되었다. 보조제 LR6으로 제제화된 항원 또는 바이러스는 4℃ 및 25℃ 둘 모두에서 검출 수준 이하로 증명되듯이 일부 보조제 어세이 간섭을 경험하였다. 그러나, LR6으로 보조된 제제는 3개월에 특정 바이러스 역가를 생성시켰고 25℃에서 안정하였다.
Figure 112018085897730-pct00006
상응하는 혈청학 실험을 축우에서 수행하였다. 각각의 그룹은 실험 그룹 당 10마리 동물 (대조군은 5마리)을 함유하였고 0일에 2 mL 용량으로 1회 투여된 후 21일에 부스트되었다. 혈액 샘플은 실험 전반에서 몇몇 시점에 채취되었고 혈청 샘플을 분석하였다. 바이러스 중화 역가에 의한 혈청학을 수행하였다. 초기 데이타는 몇몇 그룹에서 처음 백신접종 이후 14일에 혈청학적 반응을 의미하였다. 취합하여, 데이타는 일정 보조제에 제제화된 아데노바이러스-벡터화 FMD 백신이 온도 편위에 대처하는 능력 및 열안정성 개선에 대한 기회를 제공할 수 있다는 것을 의미한다. 이들 초기 데이타와 조합시, 면역학적 반응은 유지되거나 또는 잠재적으로 개선된다.
실시예 4 축우에서 다수의 재조합 인간 아데노바이러스 벡터화 FMDV O1M 항원에 의한 2-용량 백신접종의 혈청학 면역원성
실험의 목표는 상이한 보조제 존재 및 부재에서 제제화된 아데노 벡터화 FMDV O1마니사의 투여 후 축우에서 혈청학적 항체 반응을 평가하는 것이다.
55마리의 통상적으로 사육된 송아지 (대략 5개월령)를 각각 하기 표 4에 표시된 바와 같이 6개의 처치 그룹 중 하나로 임의추출하였다.
Figure 112018085897730-pct00007
그룹 6 (센티넬(sentinel))의 송아지를 제외한 모든 송아지는 보조제 존재 (1 내지 4 그룹) 또는 보조제 부재 (그룹 5)하는 아데노바이러스 벡터화 O1/마니사 구성체를 사용해, 2회, 21일 간격으로, 2 mL의 시험 백신을 백신접종하였다. 모든 주사는 우측 및 좌측을 교대로 어깨 위에 근육내 경로 (IV)를 통해 제공되었다. 상기 표 4는 각 그룹에 대한 처치의 요약을 함유한다.
송아지는 급성 전신 부작용의 임상적 징후에 대해서 각각의 백신접종 이후 적어도 1시간 동안 간헐적으로 관찰하였다. 혈액 샘플은 -1일 (백신접종 이전), 7일, 15일, 21일 (백신접종 이전), 28일, 및 35일에 모든 축우로부터 채취하였다. 모든 축우로부터의 혈청 샘플은 혈청 바이러스 중화 (SVN)에 의해 FMDV 항체에 대해 시험하였다. 또한, 아데노바이러스에 대한 항체 반응 (SAV)은 -1일 및 35일에 채취된 샘플에서 모든 그룹의 모든 동물에서 결정하였다. SVN 및 SAV에 대한 결과는 Log10 으로 기록하였고 0.6 Log10 이하의 값은 혈청 항체에 대해 음성으로 간주하였다.
백신접종 후 안전성 평가는 각각의 백신접종 이후 적어도 3일 동안 직장 온도, 육안 검사 및 주사 부위의 촉진 (palpation)을 포함하였다. 국소 주사 부위 부작용이 있는 소는 이상증의 해결까지 간헐적으로 관찰하였다. 실험은 최종 혈액 채혈 이후 D35에 종료하였다.
혈청 바이러스 중화 (SVN) Log10 에 의한 FMDV 항체를 사용한 FMDV 혈청학적 반응의 결과를 하기에 설명한다.
모든 그룹의 모든 송아지는 실험 시작 이전에 FMDV 항체에 음성으로 시험되었다. 모든 센티넬은 실험 전반에서 FMDV 항체에 음성이었다.
백신접종 후 혈청전환은 Log10 역가 > 0.9의 증가로서 정의하였다.
14일까지 (처음 백신접종 후 2주), ENABL® C1 (그룹 1)의 5/10 송아지 (50%)가 혈청전환되었다. 나머지 백신접종 그룹의 동물들 (2-5)은 20 내지 40%의 송아지가 혈청전환되었다. 또한, 그룹 당 평균 항체 역가는 그룹 1 (ENABL® C1)에서 약간 더 높았고 그 이후에 그룹 2 (LF) 및 3 (폴리아크릴산)이었다 (도 13).
35일까지 (2차 백신접종 후 2주), 모든 백신접종된 동물 (그룹 1 [ENABL®], 그룹 2 [LF] 및 그룹 5 [보조제 무함유])가 혈청전환되었고 이후에 개별적으로 90% 및 80%의 그룹 3 (폴리아크릴산) 및 그룹 4 (Carbigen M)의 동물들이 혈청전환되었다.
LF, 보조제로 백신접종된 이후에, 보조제 없이 백신접종된 동물 (그룹 5) 및 ENABL® C1 (그룹 1) 보조제로 백신접종된 동물은 2-용량 백신접종 계획 이후 더 높은 항체 반응을 가졌다 (도 13 참조).
혈청 바이러스 중화 (SVN) Log10 의한 아데노바이러스 항체를 사용한 FMDV 혈청학 반응의 결과를 하기에 기술한다.
모든 센티넬 및 백신접종 송아지는 -1일에 SN 항체 역가에 의해 아데노바이러스에 음성이었다 (≤ 0.6 Log10). 35일까지, 백신접종된 송아지 중 한마리 (ID:134; 그룹 5)를 제외한 전부는 보조제를 함유하는 백신으로 백신접종된 동물 (그룹 1-4)의 그룹보다 전반적으로 더 높은 기하 평균 역가로 혈청 전환되었다 (도 14 참조).
결과는 몇몇 그룹에서 제1 백신접종 후 14일에 혈청학적 반응을 의미하였다. 2차 백신접종 후 2주에 더 높은 항체 반응이 LF 보조제로 백신접종된 송아지에서 확인되었고 이후 보조제없이 백신접종된 동물 및 Enable C1 보조제로 백신접종된 동물에서 확인되었다.
결과는 보조제의 존재 또는 부재와 무관하게 단일 백신접종 후 항체 반응이 작다는 것을 시사한다. 하지만, 2회 백신접종 (프라임-부스트) 계획을 사용하면 항체 반응이 전반적으로 더 높았다. 백신 구성체를 근육내로 2회 (3주 간격) 투여시 전신 부작용이 관찰되지 않았다.
실시예 5 돼지에서 백신접종 후 FMDV 백신의 혈청학 평가
실험의 목표는 아데노 5 벡터화 FMDV O1 마니사) 및/또는 FMDV 배큘로바이러스-발현된 O1 마니사 재조합 바이러스 유사 입자 (VLP)를 함유하는 1가 백신 제제의 투여 후 새끼돼지에서 항체 반응을 평가하는 것이다.
20마리의 통상적으로 사육되는 새끼돼지 (대략 5주령)를 각각 10마리 새끼돼지를 함유하게, 2개의 처치 그룹으로 임의추출하였다. 그룹 조성은 하기 표 5에 표시한다.
Figure 112018085897730-pct00008
그룹 1의 새끼돼지는 2 mL의 백신으로 백신접종하였다. 모든 주사는 우측 및 좌측을 교대로 어깨 상에 근육내 경로 (IM)를 통해 제공하였다. 새끼돼지는 그들의 전반적인 건강 상태에 대해 각 백신접종 이전에 관찰되었다. 혈액 샘플은 모든 새끼돼지로부터 0일 (백신접종 이전), 7일, 14일, 21일 (백신접종 이전), 28일 및 35일에 채혈하였다. 모든 새끼돼지로부터의 35일 혈청 샘플은 혈청 바이러스 중화 (SVN)에 의해 FMDV 항체에 대해 검사하였다. 그룹 1의 새끼돼지 유래의 샘플에 대해서 그들이 35일 이후에 전반적으로 더 높은 항체 반응을 가졌기때문에 모든 채혈일에 SNV 어세이를 수행하였다. 결과는 Log10 으로 기록하였고 0.75 Log10 이하의 값은 혈청 항체에 대해 음성으로 간주하였다. 백신접종 후 안전성 평가는 각 백신접종 후 3일 동안 직장 온도, 육안 검사 및 주사 부위의 촉진을 포함하였다.
혈청 바이러스 중화 (SVN) Log10 에 의한 FMDV 항체를 사용한 FMDV 혈청학적 반응의 결과를 하기에서 설명한다.
모든 센티넬은 실험 이전 및 종료시에 FMDV 항체에 대해 음성이었다.
28일까지 (2차 백신접종 후 1주), 그룹 1의 모든 새깨돼지가 혈청전환되었다 (역가 ≥ 1.20 log10) (도 15 참조). 백신접종이 원인이 되는 어떠한 전신 및/또는 국소 부작용도 관찰되지 않았다. 결과는 백신접종된 그룹이 1차 백신접종 후 작은 항체 반응을 가졌더라도, 2차 (프라임-부스트) 백신접종 후 항체 반응이 실험 종료까지 높았다는 것을 분명하게 보여주었다.
실시예 6 투여 경로
이 실험의 목표는 2종의 재조합 아데노바이러스 벡터화 FMDV 백신, 하나의 재조합 아데노바이러스 벡터화 FMDV 백신 및 하나의 배큘로바이러스-발현된 재조합 FMDV 바이러스 유사 입자 (VLP) 백신, 또는 2종의 FMDV VLP 백신이 사용될 때, 및 상이한 투여 경로 (경피, 피하, 또는 피내 투여 경로)가 사용될 때 축우 또는 돼지에서 2-용량 백신접종의 혈청학적 반응을 평가하는 것이다. 이 실험은 또한 다수의 백신이 투여될 때 간섭 문제를 해결하고자 디자인된다.
보조제는 폴리아크릴산, LF2 에멀션, LR6 에멀션, CARBIGEN™ M 및 ENABL® C1이었다. 처치 그룹은 하기 표 6에 표시하였다.
Figure 112018085897730-pct00009
급성 전신 부작용의 임상적 징후에 대하여 각 백신접종 후 적어도 1시간 동안 간헐적으로 송아지를 관찰하였다. 혈액 샘플은 모든 축우로부터 -1일 (백신접종 이전), 7일, 15일, 21일 (백신접종 이전), 28일, 및 35일에 채혈하였다. 모든 축우로부터의 혈청 샘플은 혈청 바이러스 중화 (SVN)에 의해 FMDV 항체에 대해 검사하였다. 또한, 아데노바이러스에 디한 항체 반응 (SAV)을 -1일 및 35일에 채취된 샘플에서 모든 그룹의 모든 동물에서 결정하였다.
백신접종 후 안전성 평가는 각 백신접종 후 적어도 3일 동안 직장 온도, 육안 검사 및 주사 부위의 촉진을 포함하였다. 국소 주사 부위 부작용이 있는 소는 이상증 해결까지 간헐적으로 관찰하였다.
결과는 프라임-부스트가 모든 그룹에 영향을 미치지만 프라임-부스트 효과는 아데노바이러스 백신으로 프라임을 받은 후 배큘로바이러스-FMD 구성체로 부스트된 동물에서 더 크다는 것을 보여준다. 더욱이, 투여 경로는 혈청학적 반응과 보호성을 비롯하여, 면역 지속기간에 영향을 미친다. 투여의 특정 경로 및/또는 투여 경로 TD, IM 및 SQ의 특정 조합은 면역 반응을 악화시키고, 보호성을 더욱 증폭시켜, 간섭을 극복하고 모체 유래된 항체-양성 (MDA-양성) 동물을 보호하는 것으로 나타났다.
실시예 7 돼지에서의 효능
돼지는 FMDV에 대항 (몇몇 혈청형에 대항)하여 2회 21일 간격으로, 이종성 프라임-부스트 프로토콜 (아데노 프라임 후 배큘로 부스트)을 비롯하여 상동성 프라임 부스트 (아데노-아데노; 배큘로-배큘로)를 고려하는 프라임-부스트 계획으로 백신접종하고, 14 dpv에 많은 FMDV 혈청형, 예컨대 A24, A12, O1, 아시아, Irn, 및 이라크 바이러스주로 공격하였다.
용량 적정 실험에서, 재조합 아데노-벡터화 FMDV 백신은 백신접종 후 14일 (dpv)에 상동성 및 이종성 공격 후 FMD 전신 질환 (족부 병변)에 대항한 보호성을 부여하는 능력에 대해 평가하였다. 실시예 2에 기술된 절차가 이 실험에서 사용되어 프라임-부스트 투여 계획에서 최소 보호성 용량을 결정하였다.
결과는 프라임-부스트 프로토콜에서 사용된 재조합 아데노벡터 FMDV 백신이 돼지에서 상동성 및 이종성 FMDV 공격에 대항하여 고도로 면역원성이고 효율적이며, 간섭을 극복하고 모체 유래 항체-양성 (MDA-양성) 동물을 보호한다는 것을 입증하였다.
실시예 8 소에서의 효능
축우를 먼저 재조합 아데노바이러스 벡터화 FMDV 백신으로 백신접종하였고 통상의 사멸된 FMD 백신 또는 배큘로바이러스-발현된 FMDV VLP 백신으로 21일 간격으로 부스트시키고 많은 FMDV 혈청형, 예컨대 A24, A12, O1, 아시아, Irn, 및 이라크 바이러스주에 의해 2차 백신접종 후 14일에 공격하였다.
용량 적정 실험에서, 재조합 아데노-벡터화 FMDV 백신은 백신 접종 후 14일 (dpv)에 직접 상동성 및 이종성 공격 후 FMD 전신 질환 (족부 병변)에 대항한 보호성을 부여하는 능력에 대해 평가되었다. 실시예 2에 기술된 절차를 이 실험에서 사용하여 프라임-부스트 투여 계획에서 최소 보호성 용량을 결정하였다.
결과는 프라임-부스트 투여 계획이 축우에서 상동성 및 이종성 FMDV 공격에 대항하여 고도로 면역원성이고 효율적이며, FMDV 감염에 대항하여 동물에서 보호성을 제공하고, 간섭을 극복하고, 모체 유래 항체-양성 (MDA-양성) 동물을 보호한다는 것을 입증하였다.
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이렇게 본 개시내용의 상세한 구체예를 설명하였지만, 본 개시내용의 범주 또는 사조를 벗어나지 않고 많은 명확한 이의 변이가 가능하므로 상기 실시예에 의해 정의된 개시내용은 상기 설명에 기재된 특정 상세 사항에 국한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
본 명세서에서 인용하거나 또는 참조한 모든 문헌 ("본 명세서에서 인용된 문헌"), 및 본 명세서에서 인용된 문헌에서 인용되거나 또는 참조된 모든 문헌은, 본 명세서에서 참조로 편입시킨 임의의 문헌 또는 본 명세서에서 언금된 임의 제품에 관한 임의의 제조사 지시서, 설명서, 제품 사양서, 및 제품 시트와 함께 참조로 본 명세서에 편임되며, 본 발명의 실시에서 적용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Merial, Inc. Genvec Inc. The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of Homeland Security Widener, Justin Woodyward , Leszlie Siger , Leonardo Brough , Douglas Ettyreddy , Damodar Gall , Jason McVey , Duncan Burrage , Tom <120> RECOMBINANT ADENOVIRUS VECTORED FMDV VACCINES AND USES THEREOF <130> MER 15-277.PCT <150> 62/288,540 <151> 2016-01-29 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3381 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> polynucleotide encoding chimeric A24-A12 FMDV antigen <400> 1 atgaacacaa ctgactgttt tatcgctttg gtgcacgcaa tcagagagat cagagcactt 60 ttcctaccac gaaccacagg aaagatggaa ctcaccctgt acaacggcga gaaaaagact 120 ttctactcca gacctaacaa ccacgacaac tgttggttga acactgtcct tcagttgttc 180 aggtatgtcg atgagccctt cttcgactgg gtctacaact cacctgagaa cctcacgctc 240 gaagccatcg agcaattgga ggaactcaca ggacttgagc tgcacgaagg tgggccgccc 300 gccctcgtga tctggaacat caaacacttg ctccacaccg gcatcggcac agcctcacga 360 cccagtgagg tgtgcatggt ggacggtacg gacatgtgtc ttgccgactt ccacgcaggc 420 attttcctga agggacagga acacgcagtc tttgcatgtg tcacctccaa cgggtggtac 480 gcgattgatg atgaggaatt ttacccctgg acgcctgacc cgtcagacgt cctggtgttt 540 gtcccatacg accaagagcc actcaacggg gactggaaag cgatggtcca gaggaagctt 600 aagggcgccg ggcaatccag cccggcgacc ggctctcaga accagtctgg caacactggc 660 agcataatca ataactacta catgcagcag taccagaact ccatggacac gcagcttggt 720 gacaatgcca tcagtggagg ctccaacgaa ggctccacgg acacaacgtc aacacacaca 780 accaacaccc aaaacaacga ctggttttcg aaacttgcca gctcagcctt taccggtctg 840 ttcggcgcct tgcttgccga caagaagacg gaagagacta cgcttctgga ggaccgcatt 900 ctcaccaccc gcaacgggca caccatctcg accacccagt cgagtgtggg agtcacctac 960 gggtactcca ctggagaaga ccacgttgct gggcccaaca catcgggcct ggagacgcgg 1020 gtggtgcagg ctgagagatt ttacaaaaag tttttgtttg attggacaac ggataagcct 1080 tttggacatt tggaaaagtt ggaacttccc accgaccacc acggtgtttt cgggcacttg 1140 gtggaatcgt atgcctacat gagaaacggt tgggacgttg aggtgtctgc tgttggcaac 1200 cagttcaacg gcgggtgtct cctggtggct atggtaccgg agtggaagga gtttgaacaa 1260 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Thr Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ile Glu Gln Leu Glu Glu Leu Thr Gly Leu Glu Leu His Glu 85 90 95 Gly Gly Pro Pro Ala Leu Val Ile Trp Asn Ile Lys His Leu Leu His 100 105 110 Thr Gly Ile Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Glu Val Cys Met Val Asp 115 120 125 Gly Thr Asp Met Cys Leu Ala Asp Phe His Ala Gly Ile Phe Leu Lys 130 135 140 Gly Gln Glu His Ala Val Phe Ala Cys Val Thr Ser Asn Gly Trp Tyr 145 150 155 160 Ala Ile Asp Asp Glu Glu Phe Tyr Pro Trp Thr Pro Asp Pro Ser Asp 165 170 175 Val Leu Val Phe Val Pro Tyr Asp Gln Glu Pro Leu Asn Gly Asp Trp 180 185 190 Lys Ala Met Val Gln Arg Lys Leu Lys Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro 195 200 205 Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn 210 215 220 Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly 225 230 235 240 Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr 245 250 255 Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu 260 265 270 Ala Ser Ser Ala Phe Thr Gly Leu Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys 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cctgaacttc 2220 gacctgctca agttggcggg agacgtcgag tccaaccctg ggcccttctt cttctctgac 2280 gtcaggacga acttttctaa gctggttgac accatcaacc agatgcagga ggacatgtca 2340 acaaaacacg ggcccgactt taaccggttg gtgtctgcgt ttgaggaatt ggccgctgga 2400 gtgaaagcta tcaggaccgg tctcgacgag gccaagccct ggtacaagct cattaagctc 2460 ctgagccgcc tgtcatgcat ggccgctgta gcagcacggt caaaggaccc agtccttgtg 2520 gccatcatgc tagctgacac cggtctcgag attctggaca gcacctttgt cgtgaagaag 2580 atctccgact cgctctccag tctctttcac gtgccggccc ccgtcttcag cttcggagcc 2640 ccgattctgc tggccgggtt ggtcaaagtc gcctcgagtt tcttccggtc cacacccgaa 2700 gaccttgaga gagcagagaa acagctcaaa gcacgtgaca tcatcgagcg tcagaaacct 2760 ctgaaagtga gagccaagct cccacagcag gaggggccct acgctggtcc gatggagaga 2820 caaaagcccc tgaaagtgaa agcaaaagcc ccggtcgtaa aggaaggacc ttacgagggg 2880 cttgtgaaga aacctgtcgc tttgaaagtg aaagccaaaa atttgattgt cactgagagt 2940 ggtgcccccc cgaccgactt gcaaaagatg gtcatgggca acaccaagcc tgttgagctc 3000 atcctcgacg ggaagacggt agccatctgt tgcgctaccg gagtgtttgg cactgcttac 3060 cttgtaccac gtcatctttt cgcggagaag tatgacaaga tcatgctgga cggcagagcc 3120 atgacagaca gtgactacag agtgtttgag tttgagatta aagtaaaagg acaggacatg 3180 ctttcagatg ccgcgctcat ggtgctccac cgtgggaatc gcgtgagaga tatcacgaaa 3240 cactttcgtg acacagcaag aatgaagaag ggcacccccg ttgtcggtgt tatcaacaac 3300 gccgatgtcg ggagactgat tttctctggt gaggccctta cctacaagga cattgtagtg 3360 tgtatggatg gagacaccat gcctggcctc tttgcctaca gagccgccac caaggctggc 3420 tattgtggag gagctgttct tgcaaaggac ggagccgaga ctttcatcgt cggcactcac 3480 tccgcaggcg gtaatggagt tggatactgt tcatgcgttt ccaggtccat gctgctaaag 3540 atgaaggcac acattgaccc tgagccacac cacgagtaa 3579 <210> 6 <211> 1192 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Irn FMDV antigen <400> 6 Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser 1 5 10 15 Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln 20 25 30 Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn 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Asn Ala Asp Val Gly Arg Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu 1100 1105 1110 Thr Tyr Lys Asp Ile Val Val Cys Met Asp Gly Asp Thr Met Pro 1115 1120 1125 Gly Leu Phe Ala Tyr Arg Ala Ala Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly 1130 1135 1140 Gly Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Glu Thr Phe Ile Val Gly 1145 1150 1155 Thr His Ser Ala Gly Gly Asn Gly Val Gly Tyr Cys Ser Cys Val 1160 1165 1170 Ser Arg Ser Met Leu Leu Lys Met Lys Ala His Ile Asp Pro Glu 1175 1180 1185 Pro His His Glu 1190 <210> 7 <211> 3576 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Polynucleotide encoding Asia FMDV antigen <400> 7 atgggagccg gtcaatccag tccggcaacc gggtcacaga accaatctgg caacactgga 60 agcatcatta acaactacta catgcaacag taccagaatt ccatggacac acagcttggt 120 gacaacgcta ttagcggagg ttccaacgaa ggttccacgg ataccacttc cacacacaca 180 aacaacaccc aaaacaacga ctggttctcg cgcctggcta gctctgcatt cagtggtctc 240 tttggtgcac ttttggctga caagaagaca gaagagacaa ctctgcttga agaccgcatt 300 ctcaccacca ggaacggcca cacaacatcg acgacacagt cgagcgttgg cgtaacatac 360 ggttacgctg tggccgagga cgcggtgtct ggacccaata cctcgggtct agagactcgt 420 gttcaacagg cagaacggtt tttcaagaaa cacctgtttg actggacacc gaacttggca 480 tttggacact gttactacct ggaacttccc actgaacaca aaggcgtgta cggcagtctc 540 atgggctcgt acgcctacat gagaaatgga tgggacatag aggtgactgc tgttggaaac 600 caattcaacg gtggttgtct ccttgtcgcg ctcgtgccag agctgaagga actcgacacg 660 cgacagaagt accagctgac cctctttccc caccagttca tcaacccacg caccaacatg 720 acggcccaca tcaacgtgcc gtacgtgggt atcaacaggt acgaccagta cgccctccac 780 aagccgtgga cgcttgttgt gatggtggta gccccactca ccgtcaaaac tggtggttct 840 gaacagatca aggtttacat gaatgcagcg ccaacctacg tgcatgtggc gggagagctg 900 ccctcgaaag agggaatagt tcccgtcgcg tgtgcggacg gttacggcaa catggtgacc 960 acggacccga agacggccga tccagtttac gggaaagtgt tcaacccccc caggacaaac 1020 ctccctgggc gcttcacgaa cttccttgat gttgcggagg catgtccaac tttcctccgc 1080 tttggagaag taccatttgt gaagacggtg aactctggtg accgcttgct ggccaagttc 1140 gacgtgtccc tcgctgcagg gcacatgtcc aacacctact tggctggcct ggcgcagtac 1200 tacacacagt acagcggcac catgaacgtc cacttcatgt tcaccgggcc cacggatgct 1260 aaagcccgat acatggtggc ttatgtcccc cctggcatga caccgcccac ggaccctgag 1320 cacgccgcac actgcattca ctctgagtgg gatactggtc ttaactctaa gtttaccttt 1380 tccatacctt acctctctgc tgctgactat gcctacactg cttctgacgt ggcggagacc 1440 acgagtgtgc agggatgggt gtgtatctat cagatcaccc acggcaaggc tgagggagac 1500 gcactggtcg tttctgtcag cgccggcaaa gactttgagt ttcgcttgcc tgttgacgca 1560 cgccagcaaa ccaccaccac tggcgaatca gcagatccag tcacaaccac ggttgagaac 1620 tatggaggag agactcagac agccagacgg cttcacactg acgtcgcctt cattcttgac 1680 aggtttgtga aactcactgc tcccaagaac atccaaaccc tcgatctcat gcagatcccc 1740 tcacacacgc tggttggagc actacttcgt tctgcgacgt actacttctc agacctggag 1800 gtcgcgcttg tccacacagg cccggtcacc tgggtgccca acggcgcgcc caaggatgct 1860 ctaaacaacc agaccaaccc aactgcctat cagaagcaac ccatcacccg cctggcactc 1920 ccctacaccg ccccccatcg tgtgctggca acagtgtaca acgggaagac ggcgtacggg 1980 gaaacgacct caaggcgcgg cgacatggcg gccctcgcac aaaggttgag cgctcggctg 2040 cccacctcct tcaactacgg cgccgtgaag gccgacacca tcactgagct tttgatccgc 2100 atgaagcgcg cggagacata ttgccctagg cctttactag cccttgacac cactcaggac 2160 cgccgcaaac aggagatcat tgcacctgag aagcaggttt tgaactttga cctactcaag 2220 ttggcaggag acgttgagtc caaccctggg cccttcttct tctccgacgt taggtcgaac 2280 ttctccaaac tggtcgagac catcaaccag atgcaggagg acatgtcaac aaagcacgga 2340 cccgacttca accggttggt ttccgcgttt gaggaattgg ccacaggagt aaaggccatc 2400 aggaacggtc tcgatgaggc caagccctgg tacaagctca tcaaactcct aagccgcctg 2460 tcgtgcatgg ccgctgtagc agcacggtcc aaggacccag tccttgtggc catcatgctg 2520 gctgacaccg gtcttgagat tctggacagc acgttcgtcg tgaagaagat ctccgactcg 2580 ctctccagtc tctttcacgt gccggccccc gtcttcagtt tcggagctcc gattctgttg 2640 gctgggttgg tcaaagtcgc ctcgagtttc ttccggtcca cacccgaaga ccttgagaga 2700 gcagagaaac agctcaaagc acgtgacatc aacgacatac tcgagcgtca gaaacccctg 2760 aaagtgagag ctaagctgcc acaacatgag ggaccttacg ctggcccgat ggagagacag 2820 aaaccactga aagtgaaagc aaaagccccg gtcgttaagg aaggacctta cgagggaccg 2880 gtgaagaagc ctgtcgcttt gaaagtgaaa gctaagaact tgattgtcac tgagagtggt 2940 gccccaccga ccgacttgca aaagatggtc atgagcaaca ctaagcctgt tgagctcatc 3000 cttgacggta agacggtggc catctgctgc gccaccggag tgtttggtac tgcctacctc 3060 gtgcctcgtc accttttcgc agaaaagtac gacaggatca tgttggacgg cagggccatg 3120 acagacagtg actacagagt gtttgagttt gagattaaag taaaaggaca ggacatgctc 3180 tcagacgctg cgctcatggt gctccaccgt ggcaaccgtg tgagagacat cacgaaacac 3240 tttcgtgata cagcaagaat gaagaaaggt acccccgttg tcggcgtgat caacaacgcc 3300 gacgttggga gactgatttt ctccggtgag gccctcacct acaaggacat tgtagtgtgc 3360 atggatggag acaccatgcc gggcctattt gcctacagag ccgctaccaa ggctggctac 3420 tgtggaggag ccgttcttgc caaggacgga gctgacacat ttatcgtcgg cactcactcc 3480 gcaggaggca atggagtcgg gtactgctca tgcgtatcta ggtccatgct cttgaagatg 3540 aaggcacaca ttgaccccga accacaccac gagtag 3576 <210> 8 <211> 1191 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Asia FMDV antigen <400> 8 Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser 1 5 10 15 Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln 20 25 30 Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Asn Asn Thr Gln 50 55 60 Asn Asn Asp Trp Phe Ser Arg Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu 65 70 75 80 Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu 85 90 95 Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr 100 105 110 Gln Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Glu Asp Ala 115 120 125 Val Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Gln Gln Ala 130 135 140 Glu Arg Phe Phe Lys Lys His Leu Phe Asp Trp Thr Pro Asn Leu Ala 145 150 155 160 Phe Gly His Cys Tyr Tyr Leu Glu Leu Pro Thr Glu His Lys Gly Val 165 170 175 Tyr Gly Ser Leu Met Gly Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp 180 185 190 Ile Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu 195 200 205 Val Ala Leu Val Pro Glu Leu Lys Glu Leu Asp Thr Arg Gln Lys Tyr 210 215 220 Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met 225 230 235 240 Thr Ala His Ile Asn Val Pro Tyr Val Gly Ile Asn Arg Tyr Asp Gln 245 250 255 Tyr Ala Leu His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro 260 265 270 Leu Thr Val Lys Thr Gly Gly Ser Glu Gln Ile Lys Val Tyr Met Asn 275 280 285 Ala Ala Pro Thr Tyr Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu 290 295 300 Gly Ile Val Pro Val Ala Cys Ala Asp Gly Tyr Gly Asn Met Val Thr 305 310 315 320 Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Val Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro 325 330 335 Pro Arg Thr Asn Leu Pro Gly Arg Phe Thr Asn Phe Leu Asp Val Ala 340 345 350 Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Arg Phe Gly Glu Val Pro Phe Val Lys 355 360 365 Thr Val Asn Ser Gly Asp Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Val Ser Leu 370 375 380 Ala Ala Gly His Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Gly Leu Ala Gln Tyr 385 390 395 400 Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Met Asn Val His Phe Met Phe Thr Gly 405 410 415 Pro Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr Val Pro Pro Gly 420 425 430 Met Thr Pro Pro Thr Asp Pro Glu His Ala Ala His Cys Ile His Ser 435 440 445 Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro Tyr 450 455 460 Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Val Ala Glu Thr 465 470 475 480 Thr Ser Val Gln Gly Trp Val Cys Ile Tyr Gln Ile Thr His Gly Lys 485 490 495 Ala Glu Gly Asp Ala Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys Asp Phe 500 505 510 Glu Phe Arg Leu Pro Val Asp Ala Arg Gln Gln Thr Thr Thr Thr Gly 515 520 525 Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu 530 535 540 Thr Gln Thr Ala Arg Arg Leu His Thr Asp Val Ala Phe Ile Leu Asp 545 550 555 560 Arg Phe Val Lys Leu Thr Ala Pro Lys Asn Ile Gln Thr Leu Asp Leu 565 570 575 Met Gln Ile Pro Ser His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ser Ala 580 585 590 Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Val Ala Leu Val His Thr Gly Pro 595 600 605 Val Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Lys Asp Ala Leu Asn Asn Gln 610 615 620 Thr Asn Pro Thr Ala Tyr Gln Lys Gln Pro Ile Thr Arg Leu Ala Leu 625 630 635 640 Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Lys 645 650 655 Thr Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Ser Arg Arg Gly Asp Met Ala Ala Leu 660 665 670 Ala Gln Arg Leu Ser Ala Arg Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala 675 680 685 Val Lys Ala Asp Thr Ile Thr Glu Leu Leu Ile Arg Met Lys Arg Ala 690 695 700 Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Leu Asp Thr Thr Gln Asp 705 710 715 720 Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu Lys Gln Val Leu Asn Phe 725 730 735 Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Phe 740 745 750 Phe Phe Ser Asp Val Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu Val Glu Thr Ile 755 760 765 Asn Gln Met Gln Glu Asp Met Ser Thr Lys His Gly Pro Asp Phe Asn 770 775 780 Arg Leu Val Ser Ala Phe Glu Glu Leu Ala Thr Gly Val Lys Ala Ile 785 790 795 800 Arg Asn Gly Leu Asp Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Lys Leu Ile Lys Leu 805 810 815 Leu Ser Arg Leu Ser Cys Met Ala Ala Val Ala Ala Arg Ser Lys Asp 820 825 830 Pro Val Leu Val Ala Ile Met Leu Ala Asp Thr Gly Leu Glu Ile Leu 835 840 845 Asp Ser Thr Phe Val Val Lys Lys Ile Ser 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Leu Met Val Leu 1055 1060 1065 His Arg Gly Asn Arg Val Arg Asp Ile Thr Lys His Phe Arg Asp 1070 1075 1080 Thr Ala Arg Met Lys Lys Gly Thr Pro Val Val Gly Val Ile Asn 1085 1090 1095 Asn Ala Asp Val Gly Arg Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu Thr 1100 1105 1110 Tyr Lys Asp Ile Val Val Cys Met Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly 1115 1120 1125 Leu Phe Ala Tyr Arg Ala Ala Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly Gly 1130 1135 1140 Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Asp Thr Phe Ile Val Gly Thr 1145 1150 1155 His Ser Ala Gly Gly Asn Gly Val Gly Tyr Cys Ser Cys Val Ser 1160 1165 1170 Arg Ser Met Leu Leu Lys Met Lys Ala His Ile Asp Pro Glu Pro 1175 1180 1185 His His Glu 1190

Claims (13)

  1. 구제역 바이러스 (foot and mouth Disease Virus) (FMDV) 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 면역원성 조성물로서, FMDV 항원은 서열번호 2, 4, 6 또는 8에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스인 면역원성 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, FMDV 항원은 서열번호 1, 3, 5, 또는 7에 기재된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 면역원성 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역원성 조성물은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 보조제 또는 비히클을 더 포함하는 면역원성 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클은 폴리아크릴산, LF2 에멀션, LR6 에멀션, TS6 에멀션, LR4 에멀션, 카보머, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 사포닌, CpG, 유중수 에멀션, 수중유 에멀션 및 카보머-기반 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 면역원성 조성물의 적어도 1회의 투여 단계를 포함하는, FMDV에 대항하여 인간을 제외한 동물에서 면역 반응을 유도하거나 또는 FMDV 감염에 감수성인 인간을 제외한 동물을 백신접종하는 방법에 사용되기 위한 면역원성 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 방법은 프라임-부스트 (prime-boost) 투여 계획을 포함하는 면역원성 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 프라임-부스트 계획은 FMDV로부터 동물을 보호하거나, 감염된 동물에서 질환 진행을 예방하거나, 또는 FMDV로부터 동물을 보호하고 감염된 동물에서 질환 진행을 예방하도록, 제1항에 따른 면역원성 조성물의 프라임-투여 단계, 및 FMDV 항원을 생체 내에서 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물, 또는 FMDV 항원을 포함하는 조성물, 또는 FMDV 항원을 포함하는 불활성화된 바이러스 조성물의 부스트 투여 단계를 포함하는 면역원성 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 프라임-부스트 계획은 FMDV로부터 동물을 보호하거나, 감염된 동물에서 질환 진행을 예방하거나, 또는 FMDV로부터 동물을 보호하고 감염된 동물에서 질환 진행을 예방하도록, FMDV 항원을 생체내에서 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물, 또는 FMDV 항원을 포함하는 조성물, 또는 FMDV 항원을 포함하는 불활성화된 바이러스 조성물의 프라임-투여 단계, 및 제1항에 따른 면역원성 조성물의 부스트 투여 단계를 포함하는 면역원성 조성물.
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