CN112852760A - 重组鸭肠炎病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物医学领域，具体而言，涉及一种重组鸭肠炎病毒及其应用。该重组鸭肠炎病毒在ACCESSION NO.EU082088所示基因组的142921bp‑142975bp位置之间插入有具有鸭3型腺病毒Fiber2基因的表达盒。该病毒同时也是一种鸭肠炎病和鸭3型腺病毒病的二联重组疫苗，通过将由CMV启动子控制下的Fiber2基因插入到DEV基因组中，rDEV‑Fiber2不仅能抵抗DEV强毒株的攻击，而且对鸭3型腺病毒病也能起到良好的免疫保护作用。

Description

重组鸭肠炎病毒及其应用

技术领域

本发明涉及动物医学领域，具体而言，涉及一种重组鸭肠炎病毒及其应用。

背景技术

近年来，随着我国水禽饲养规模的不断扩大，养殖模式的发展，水禽中新发疫病也越来越多、越来越复杂。2014年在我国广东地区番鸭中出现一种新的鸭腺病毒(Zhang,X.,Zhong,Y.,Zhou,Z.,et al.Molecular characterization,phylogeny analysis andpathogenicity of a Muscovy duck adenovirus strain isolated in China in2014.2016,Virology 493,12–21)，剖检发现病鸭出现严重肝脏肿大、斑驳状出血、白色点状坏死等症状。鸭的死亡率超过20％。该病毒和鸭2型腺病毒存在以下明显区别：其全基因组序列和鸭2型腺病毒的核苷酸同源性仅为92.3％；CH-GD-2014株和鸭2型腺病毒的Hexon基因的核苷酸同源性仅为76.6％；CH-GD-2014株有2个纤突蛋白(Fiber 1、Fiber 2)，而鸭2型腺病毒只有1个纤突蛋白(Fiber)。基于上述特征表明，我国番鸭群中流行一种新的鸭腺病毒，并将其命名为鸭3型腺病毒(duck adenovirus 3，DAdV3)。

随着DNA重组技术的发展和利用，基因工程疫苗的研究取得了快速发展，其中重组病毒活载体疫苗成为当前新型疫苗的研究热点。重组病毒活载体疫苗是以病毒为载体，在真核细胞中表达外源基因，它在病毒病的防治等方面展现了广阔的前景，其中以疱疹病毒作为病毒载体的研究近年来十分活跃。与传统疫苗相比，重组病毒活载体疫苗具有使用安全、免疫力持久、接近动物自然感染的方式，多价苗还可以达到一针预防多病的目的。目前，国内外在鸭、鹅等水禽基因工程疫苗的研究领域尚属空白。

发明内容

鸭3型腺病毒的Fiber 2基因编码的蛋白具有很强的免疫原性，能够诱导产生中和抗体，是引起动物机体产生保护性免疫的主要抗原蛋白(Lijuan Yin,Li Chen,etal.Recombinant fiber-2protein protects Muscovy ducks against duck adenovirus3(DAdV3)Virology,2019,526(2019)99–104)。

在本发明中，发明人通过同源重组技术，将含鸭3型腺病毒的Fiber2基因的表达盒插入DEV基因组中，插入的区域为DEV基因组中病毒生长非必需的区域。本发明DAdV3-Fiber2基因的表达盒插入DEV基因组中的位置位于鸭肠炎疫苗株基因组(ACCESSIONNO.EU082088)的US7基因和US8基因之间，更具体的：本发明的第一方面提供一种重组鸭肠炎病毒，其在ACCESSION NO.EU082088所示基因组的142921bp-142975bp位置之间插入有具有鸭3型腺病毒Fiber2基因的表达盒。

可选的，如上所述的重组鸭肠炎病毒，所述Fiber2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

可选的，如上所述的重组鸭肠炎病毒，所述表达盒所用启动子为CMV启动子。

可选的，如上所述的重组鸭肠炎病毒，所述表达盒所用终止子为SV40。

本发明的第二方面提供一种宿主细胞，其被如上所述的重组鸭肠炎病毒所感染。

本发明的第三方面提供一种如上所述的重组鸭肠炎病毒的制备方法，所述方法包括：

在能够将所述重组鸭肠炎病毒复制增殖的条件下将所述重组鸭肠炎病毒引入宿主细胞，并收集复制得到的病毒颗粒。

本发明的第四方面提供疫苗，其含有如上所述的重组鸭肠炎病毒。

可选的，如上所述的疫苗，其进一步包含药学上可接受的载体。

本发明的第五方面提供成套试剂盒，其包含如上所述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。

本发明的第六方面提供如上所述的重组鸭肠炎病毒在制备用于禽类宿主的鸭肠炎病毒和鸭3型腺病毒防治药物中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明将含鸭3型腺病毒Fiber2基因的表达盒与鸭肠炎病毒(DEV)结合在一起，获得了一种全新的重组鸭肠炎病毒rDEV-Fiber2，该病毒同时也是一种鸭肠炎病和鸭3型腺病毒病的二联重组疫苗，通过将由CMV启动子控制下的Fiber2基因插入到DEV基因组中，rDEV-Fiber2不仅能抵抗DEV强毒株的攻击，而且对鸭3型腺病毒病也能起到良好的免疫保护作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中的重组质粒pMD-Fiber2示意图。

图2为本发明一个实施例中的PMD-US78-Fiber2构建过程示意图。

图3为本发明一个实施例中的重组病毒rDEV-Fiber2的PCR鉴定电泳图。

图4为本发明一个实施例中的重组病毒荧光显微镜观察结果图。

图5为本发明一个实施例中的重组病毒rDEV-Fiber2遗传稳定性试验。

图6为本发明一个实施例中的动物实验存活率。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及重组鸭肠炎病毒，其在ACCESSION NO.EU082088所示基因组的142921bp-142975bp位置之间插入有具有鸭3型腺病毒Fiber2基因的表达盒。

本发明将含鸭3型腺病毒Fiber2基因的表达盒与鸭肠炎病毒(DEV)结合在一起，获得了一种全新的重组鸭肠炎病毒rDEV-Fiber2，该病毒同时也是一种鸭肠炎病和鸭3型腺病毒病的二联重组疫苗，通过将由CMV启动子控制下的Fiber2基因插入到DEV基因组中，rDEV-Fiber2不仅能抵抗DEV强毒株的攻击，而且对鸭3型腺病毒病也能起到良好的免疫保护作用。

上述，本领域技术人员应当理解，与所述重组鸭肠炎病毒在遗传上基本上相同的病毒，或与所述重组鸭肠炎病毒在碱基替换方式上基本相同的病毒，或含有与所述重组鸭肠炎病毒在遗传上基本上相同的病毒也在本申请的保护范围内。如本文所用的，术语“在遗传上基本上相同”是指病毒颗粒，其中它们的基因组的核酸序列，或由它们的基因组产生的氨基酸序列，显示至少98％或至少99％序列同源性。

在一些实施方式中，所述Fiber2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在一些实施方式中，本发明所述表达盒中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚T序列等)，或者报告元件(例如荧光蛋白、荧光素酶或LacZ)。在具体的实施方式中，其包含启动子和终止子。

“启动子”为指导RNA聚合酶结合并由此启动RNA合成的DNA序列。本发明所使用的启动子允许在各种各样的细胞和组织类型中表达；或者可以为无细胞特异性启动子，或者可为“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子，其允许分别在种类受限的细胞和组织类型中表达。

在一些实施方式中，所述第一启动子和第二启动子均为无细胞特异性的启动子。示例性的无细胞特异性的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)极早期启动子，病毒性猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、莫罗尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子，劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子，牛痘病毒的H5、P7.5和Pll启动子，延长因子l-α(EFla)启动子，早期生长应答I(EGRl)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、3_磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、真核生物翻译起始因子4A 1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDa-β成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人R0SA26基因座(Irions et al.,(2007)Nature Biotechnology25,1477-1482)、泛激素C启动子(UBC)，磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子，巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子，以及β-肌动蛋白启动子。在一些实施方式中，所述无细胞特异性的启动子优选自CMV启动子、EFS启动子、miniCMV启动子、EFl-a启动子或PGK启动子；更优选CMV启动子。无细胞特异性的启动子能使得所述基因表达盒具有更好的通用性及表达效率。

在一些实施方式中，所述表达盒所用终止子为SV40。

如技术人员清楚地知道的，可以出现CMV基因启动子以及其他元件的长度中的一些变化，所述其他元件构成根据本发明的重组DNA表达盒。这可以由用于克隆和构建的确切条件中的差异所产生；例如由使用不同限制性酶位点、PCR克隆引物、或用于适应使用的克隆分子端的不同条件所产生。因此，可发生组成元件的长度的一些变化(更小或更大)，而不影响整个表达盒的稳定性和效力。在该情况下，这些长度差异是不重要的，并且在本发明的范围内。

根据本发明的再一方面，还涉及宿主细胞，其被如上所述的重组鸭肠炎病毒所感染。

宿主细胞通常不具有全能性的动物细胞(优选禽类细胞)，例如不包括受精卵、胚胎、生殖干细胞、胚胎干细胞等。

根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的重组鸭肠炎病毒的制备方法，所述方法包括：

在能够将所述重组鸭肠炎病毒复制增殖的条件下将所述重组鸭肠炎病毒引入宿主细胞，并收集复制得到的病毒颗粒。

病毒培养通常也可以在蛋(可以是未受精的蛋，或者胚胎)中进行。

根据本发明的再一方面，还涉及疫苗，其含有如上所述的重组鸭肠炎病毒。

如本文所使用，“疫苗”是适合于应用于动物的组合物，在施用于动物后，所述组合物诱导免疫应答，其强度足以最低限度地帮助防御起因于由野生型微生物感染的临床疾病，即强度足以帮助预防临床疾病，和/或预防、改善或治愈临床疾病。除非另有明确说明，术语疫苗的使用包括多价疫苗。

如本文所使用，“多价疫苗”是包含两种或更多种不同抗原的疫苗。在该类型的具体实施方案中，所述多价疫苗刺激受体的免疫系统预防两种或更多种不同病原体。

在一些实施方式中，所述的疫苗进一步包含药学上可接受的载体。

“药学上可接受的载体”意在帮助疫苗的稳定和施用，同时无害且被目标良好耐受。此类载体可以例如是无菌水或无菌生理盐溶液。在更复杂的形式中，载体可以例如是缓冲液，其可以包含进一步的添加剂，例如稳定剂或防腐剂。水或水溶液盐水溶液和糖(例如，右旋糖和/或甘油)水溶液可以用作载体，特别是用于可注射溶液。此外，所述载体可以是和/或包含水胶体和/或聚合物溶液，例如，以使待喷在禽类上的禽类疫苗变稠。

在一些实施方式中，所述的疫苗进一步包含灭活的病毒和/或灭活的细菌(例如菌苗)和/或菌苗的抗原。这可以以任何合适的方式，例如作为“活”减毒、灭活或亚单位抗原衍生自对禽类致病的该微生物。

源自对禽类致病的微生物的额外抗原优选源自一种或多种选自以下组的微生物：

-病毒：传染性支气管炎病毒、NDV、减蛋综合征病毒、IBDV、鸡贫血病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽痘病毒、火鸡鼻气管炎病毒、鸽痘病毒、MDV、禽白血病病毒、ILTV、禽肺病毒和呼肠孤病毒；

-细菌；大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、鼻气管鸟杆菌(Ornitobacteriumrhinotracheale)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)、多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、丹毒种(Erysipelas)、支原体属(Mycoplasma)和梭菌属(Clostridium)；

-寄生虫：艾美虫属(Eimeria)；和

-真菌：曲霉属(Aspergillus)。

在一些实施方式中，所述的疫苗进一步包含抗生素。

根据本发明的再一方面，还涉及成套试剂盒，其包含如上所述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。

接种容器优选为医用注射器或者滴鼻器。

根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的重组鸭肠炎病毒在制备用于禽类的鸭肠炎病毒和/或鸭3型腺病毒防治药物中的应用。

术语“禽类”是指野生或经过驯化的鸡、鸭、鹅、天鹅、大雁、鸽子、鹌鹑等禽类，其中特别是各种水禽。

本发明进一步提供了保护动物免于的鸭肠炎病毒和/或鸭3型腺病毒的方法，其包括给所述动物施用预防有效量/治疗有效量的根据本发明的疫苗。

疫苗典型地被配制用于肠胃外施用。典型的免疫接种是通过鼻腔途径的疫苗接种，但本发明还考虑了口腔和皮下(SC)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或真皮内(ID)注射实现。或者，所述疫苗还可以经由皮肤贴剂、在延迟释放植入物中、划痕或局部施用进行施用。还可以经由受体禽类的饮用水和/或食物进行施用。

上述疫苗是以与剂量配方相容的方式，以及诸如治疗有效量和免疫原性有效量的用量被施用的。施用量取决于接受治疗的对象、该对象的免疫系统合成抗体的能力，以及预期的保护程度。需施用的活性成分的准确数量取决于医师的判断，个体不同，用量也不同。最初施用和加强接种的合适方案也可变化，但典型地在首次施用后的一定间隔时间(数周或数月)后再进行1次注射或以其它方式施用。

影响优选剂量方案的因素可以包括例如主体的物种或品种(例如禽类的物种或品种)、年龄、重量、饮食、活动、肺大小，和状况；施用途径；使用的特定疫苗的功效、安全性和免疫持续时间概况；是否使用递送系统；以及疫苗是否作为药物和/或疫苗组合的一部分施用。因此，实际上采用的剂量可以对于特定动物不同，并且因此可以偏离上文所述的典型剂量。这样的剂量调整的确定通常在使用常规方法的疫苗开发领域技术人员的技术内。

类似地，可以与这样的剂量一起施用的体积通常在0.01mL(滴眼应用)至2.0mL之间。对于肌内施用，施用体积的典型范围在0.03至1.0mL之间，并且为约0.1至0.5mL。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1含鸭3型腺病毒的Fiber2(DAdV3-Fiber2)基因的表达盒的制备

DAdV3-Fiber2基因表达盒序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。DAdV3-Fiber2表达盒包括CMV启动子序列、鸭3型腺病毒的Fiber2基因及SV40终止序列，DAdV3-Fiber2序列参考CH-GD-2014株设计(ACCESSION NO.KR135164)。该表达盒的基因序列如SEQID NO:2所示。将上述制备的表达盒克隆入pMD-18T载体中，该质粒命名为pMD-Fiber2，其示意图如图1所示。

实施例2重组病毒rDEV-Fiber2的构建

(1)转移载体PMD-US78-Fiber2的构建

根据Genebank中发表的鸭肠炎疫苗株的全基因序列(ACCESSION NO.EU082088)，设计扩增US7和US8区域的左右同源臂，用来扩增同源臂的引物如下表1。以鸭肠炎疫苗株基因组DNA(AV1222)为PCR扩增模板，以引物US7u-F、US7u-R扩增左同源臂，预期扩增大小为1496bp，其基因序列如SEQ ID NO:3所示。以引物US8d-F、US8d-R扩增右同源臂，预期扩增大小为1507bp，其基因序列如SEQ ID NO:4所示。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒PMD-US7u和PMD-US8d。用Sal I和EcoR I分别酶切上述重组质粒，将它们先后插入pMD-Fiber2质粒中，获得转移载体PMD-US78-Fiber2。具体的构建过程如附图2所示。

表1本发明构建所涉及的相关引物信息

(2)同源重组

按照LipofectamineTM2000转染试剂盒(Invitrogen公司)说明书，将转移载体PMD-US78-Fiber2与鸭肠炎疫苗株(AV1222)进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体步骤如下：六孔板中的CEF培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的鸭肠炎疫苗株(AV1222)，吸附4小时；将2μg转移载体稀释于opti-DMEM中，使混合液的终体积均为100μL；取5μL Lipofectamine 2000与100μL的opti-DMEM轻轻混匀；将100μL Lipofectamine 2000稀释液分别滴加到100μL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清opti-DMEM轻轻洗两遍后，每孔加入0.5mL无血清opti-DMEM，将200μLLipofectamine 2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养4h，弃去上清，加入10％胎牛血清的DMEM培养基，置37℃培养24h后，用1％胎牛血清的DMEM培养基换液，置37℃培养3～5d，每天观察，直到病毒噬斑变得可见。

(3)重组病毒的蚀斑纯化

可见的噬斑包括重组病毒以及亲本野生型病毒，因此重组病毒要从野生型病毒中通过一系列的有限稀释法得以纯化。每次纯化时，采用抗DAdV3-Fiber2的单克隆抗体(由本发明人所在实验室制备、保存)证实Fiber2基因的表达，重复纯化操作直到每个获得的噬斑均由抗DAdV3-Fiber2抗体染色呈现阳性，纯化的重组病毒为rDEV-Fiber2；

(4)重组病毒rDEV-Fiber2的鉴定

在DAdV3-Fiber2表达盒的两侧设计引物，引物序列见表1：rDEV-Fiber2-JD-F、rDEV-Fiber2-JD-R。以上述获得的rDEV-Fiber2为模板利用此引物进行扩增，可以扩增出2555bp的特异性片段(图3)，经测序验证，此2555bp的片段除含有两队引物序列外，还含有2288bp的DAdV3-Fiber2表达盒序列，可知获得的重组病毒rDEV-Fiber2中成功插入了含鸭3型腺病毒的Fiber2基因的表达盒。

(5)重组病毒rDEV-Fiber2间接免疫荧光鉴定

将重组病毒rDEV-Fiber2及其亲本鸭肠炎疫苗株分别接种CEF，当细胞病变达80％时，用间接免疫荧光法检测Fiber2基因的表达情况。步骤如下：弃去细胞培养液，用PBS轻洗细胞表面1次，然后每孔加入冷甲醇，置室温固定10～15分钟；用PBS洗1次，然后分别加入适当稀释的DAdV3-Fiber2单抗(由本发明人所在实验室制备、保存)，置37℃作用1小时；用含PBS洗3次；每孔加入适当稀释的FITC标记的抗鼠IgG荧光抗体(购自SIGMA公司)，置37℃作用1小时；用PBS洗3次；在倒置荧光显微镜下观察，细胞噬斑出现了特异性绿色荧光，而对照组亲本鸭肠炎疫苗株感染细胞后无荧光(图4)，表明DAdV3-Fiber2基因能够良好的正确表达。

实施例3重组病毒rDEV-Fiber2的体外体内的稳定性实验

将rDEV-Fiber2在CEF细胞中传代20次，每隔5代利用表1中引物(rDEV-Fiber2-JD-F和rDEV-Fiber2-JD-R)进行扩增，结果仍能扩增出2555bp的条带，如附图5所示，表明所发明的rDEV-Fiber2在细胞中传20代后仍保持稳定。

实施例4动物试验

将30只10天龄番鸭，随机分成3组，每组10只。第1组颈部皮下注射rDEV-Fiber2，每只10³TCID₅₀，第2组颈部皮下注射亲本鸭肠炎疫苗株(AV1222)，每只10³TCID₅₀，第3组不免疫，作对照。每组单独隔离饲养。在免疫后14天，腿部肌肉注射接种DAdV3病毒，每只2×10⁶TCID₅₀。攻毒后3、5天采集泄殖腔拭子，观察14d，每天记录发病死亡情况。结果显示攻毒后仅不免疫对照组在第4天死一只鸭，其余2组没有死鸭(图6)，但是临床观察发现鸭肠炎疫苗株(AV1222)组和不免疫对照组的鸭子都有精神沉郁症状，而rDEV-Fiber2没有；而且泄殖腔拭子病毒分离情况发现仅rDEV-Fiber2免疫组没有排毒(表2)，说明rDEV-Fiber2具有良好的保护效果。

表2泄殖腔拭子病毒分离情况

实施例5将重组病毒rDEV-Fiber2制备成疫苗方法

rDEV-Fiber2接种鸡胚成纤维细胞，按体积比0.01％～0.5％的接毒量将生产种毒rDEV-Fiber2株接种CEF细胞单层，接种后，每日观察1～2次，一般在接种后48-72小时，有70％以上单层细胞出现典型的细胞病变(CPE)时收获病毒液，加入适量的5％蔗糖脱脂奶稳定剂和抗生素，充分混匀，定量分装，迅速进行冻干即可。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 温氏食品集团股份有限公司

<120> 重组鸭肠炎病毒及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1443

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

atgaaacgga ccaacagatc agacaatggt gaaggattca caaagcgtgc gaagattcag 60

gcatctgctt ctgcgacaat cgacctaaca tatccgttct gggagcaagc ttcgagtgcc 120

aacccgataa atcctccgtt tgtcaccgga ccactgtatg atgacaacgg gtatcttaac 180

gtaagaacat ccgacccgat aagaaccgtt ggtaacagcc tcagcctact gtacgatgat 240

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gagtcgcccg ctggactcag tttagctcta ggagacggtc ttgaagaaga cgagttcaca 360

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gggccactta caatcgaccc tggcaaagga ctggatattg atatcgatca atcactctcc 660

gttagaacta atcctcaagg agagaaagag ttaggcatca acatcatccc cacatcgtgc 720

ataacactag acaacggagg cctcgacctc aaggtggacc caggaagcct ggccgtcact 780

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acacttcaga agacacaagc ccaagtgtgc tgcggagcag ggtctgttac gtttccgtgc 900

gcatactatg ccaagatcgt atgctcaaac aatgtgtctt caggatatat aacactgaag 960

gtgagcgctg aggatgcatc acatgctgta gatcaacgct tcgcgactat tcaaccagta 1020

ttcacattct ggttatgtcg agacataggt aatgaaaaca ccgtcaattt ttcccactgt 1080

accaacaaca gttataagcc agaggaaacc gcagtcgtta aggcatgcat cacaccagca 1140

tacaaaaatt ttgatgtcag caatgtttca gaacatgact ttattctgta taactatagt 1200

ggggtaaaca catcaggagt tccaataggc acagggaacc taaagaatgt gtatgattac 1260

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tag 1443

<210> 2

<211> 2288

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

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cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180

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catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360

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acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600

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gcttcgagtg ccaacccgat aaatcctccg tttgtcaccg gaccactgta tgatgacaac 780

gggtatctta acgtaagaac atccgacccg ataagaaccg ttggtaacag cctcagccta 840

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gggcctctag atgagtcgcc cgctggactc agtttagctc taggagacgg tcttgaagaa 960

gacgagttca caggtttatc tgtaaaacca gatccacgtg gccctatcga agtgtcagat 1020

gaaggagtgg gtatagccta tgatacagaa accatgtcaa taacatcaat gcaaccaaat 1080

tcacagatga ctctcggtgt acgactaaac cccgatggtg cactacacag taacaacgga 1140

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cccacatcgt gcataacact agacaacgga ggcctcgacc tcaaggtgga cccaggaagc 1380

ctggccgtca ctgacaatac cctacacctc acaagctcat actcaaccta tgtctttacg 1440

agtggatctg acacacttca gaagacacaa gcccaagtgt gctgcggagc agggtctgtt 1500

acgtttccgt gcgcatacta tgccaagatc gtatgctcaa acaatgtgtc ttcaggatat 1560

ataacactga aggtgagcgc tgaggatgca tcacatgctg tagatcaacg cttcgcgact 1620

attcaaccag tattcacatt ctggttatgt cgagacatag gtaatgaaaa caccgtcaat 1680

ttttcccact gtaccaacaa cagttataag ccagaggaaa ccgcagtcgt taaggcatgc 1740

atcacaccag catacaaaaa ttttgatgtc agcaatgttt cagaacatga ctttattctg 1800

tataactata gtggggtaaa cacatcagga gttccaatag gcacagggaa cctaaagaat 1860

gtgtatgatt acgtatcaag attctccata gcccaagtat caggaagccc cacatcacca 1920

caattaactt ttacaataga acttaataag atagatcaat cttcgtacta tctgtacaaa 1980

caaggcacaa ctggtgatat tacaattggt ccaattccat tttcgtacgt tagcaaccca 2040

tcaaatgtta attagctgat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct 2100

ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt 2160

gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 2220

acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 2280

tcttaact 2288

<210> 3

<211> 1484

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

cgctgtagtg tctatctgta tagtattagg tatttgtggg tgggtcatct acatatgttt 60

aacaaccaaa gatgataagc gccgccacaa aactaaaaat acaagaccag taagaagcgc 120

ttacaaaatc ctcgacgaag aggataggct tgactgggcg gcgcctatgt ggacataaaa 180

tacacgtctc ttgcggccgt ctgtagttct tttagtgtat tactgggagc gcgtacttcc 240

agtattgtcc agtgcgccat atagacgata tattgagttt caaaaataga aatgggaacg 300

acacgacata tactgatact tgtttcggcg attaactgta taacaacgat caatgcaatc 360

gtgtatgctg ggacgtccgt aagcttatat ctacaggaac ctgcttctgc gtcaataccg 420

gccgtggaag acagacacgc agtttatgga aaactacttt ttcttggatc acaggccgaa 480

ctaccgccag tatacaatgg aactgtcgag ctactagtat ataatatttc tcgtcactgc 540

tattctgtcg cgtatgcagc tatatatgat gattgccctc gtcttggagc aactgccttc 600

aaggcctgca gacatgctac acgctatttc gacccggcgc gaccacacct gaaagatgtt 660

ctaagtagta ctgcgttgtt tgtattggac tctccatcta tacacgattc ggggatatat 720

tatatcagag taagtgtgaa cgatgctgta gtaccggatg tgtttaaaac gacagttata 780

attaccgaca aaaataatgc agtagtcccc ccggatgata acgcttatga aaaggtaaca 840

gaacggccac ccgtcggcga agatttcgga gttgtagcgg atgtaggttc catatgccat 900

cactatgact tctattctgg agttcctctc gactatcatc tcatgggcat ttctggacca 960

ttggaggatg acaagcattt gaaagaagag gtatctacag aaggcttctc gaccatgaag 1020

cctgtgaccg ttcctacgac taacaattac acaacattat ctgatgatat gcagcctacg 1080

cataatgata ccaatagtgg acttaatatc tttgacaaaa ttccaaatat ctatcttatc 1140

ccagctgtaa tgtttgtggt actaccgctg accatattca tcgtgttgat gtgctctcct 1200

cttaaacgca aattatgtcg ttgttgtacg aaacgacgtg tttatacagg ttctaccaca 1260

agcgtgatca accaatcggc actggataat cctccttctc aagacgctct ggaatcaaaa 1320

catccggagc tagatggtac cctaatgaga aagctggagg aaaaactggc agcgtatgac 1380

agctctgggg atcataaaac agaataattc acatcagtat gactaaaagt aaatgttttt 1440

gttatgattg actgtttgcc tttcattaac atccaaatat attt 1484

<210> 4

<211> 1495

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

tgcagcctgg ttaactgtat tatgcgcgga gtttggagta ctaaacacca acatactgcc 60

ggccagacta cggaacctca acaattggta cgatgatggt tacttttata tctacagctg 120

tgtgcataat aacatgtatg ttgaactgtt gtatagcaga ctatcatcaa gtgattggaa 180

ctaccggtca ggatgtaacg ctggagccga aaatacgtga taagttgcct acgatcgtcg 240

gatcccgctt caaagaagcg tggtcattta ccaaaactac ggaatgcaaa gccgtagcac 300

cggcctatat ctgtctcgac acaatctact gcttttcgga tttggtaatg gacaaggatt 360

gcgactacca tggacatatg accgttccgc taggaatcgc ttactacacc gtacatgaaa 420

actcagccct gacggaactt gatcatgctt attttacccg cgattctaat gtctatccaa 480

tacttggagc caacatacgc ggtgtaaaga tcactaattc aacagaagca aacgaaggac 540

tctatctact acacgcacgt ataaatgatt cgtcgtattt taggacagaa gtatttcttc 600

ttacacttaa agacggtgcg ctaaaaccga ctgcgatgcc aatgccaaca tatgctccta 660

ttacacctaa acatatggac gcagaagcta tcatttcttt gtataaaaca gtcctattcc 720

atgccggcga agatatgaac gtgacagcag acttatccat ctaccacata caaggacctt 780

ataatatgac tatccagtgg tttatgaagc ctatagttga caacacatgc cctatactat 840

cgctttatga accgtgttta tttcatccgt ctgaacgtga atgtcttttc ccagaaaacg 900

caaattgcgc attcgcatct acgttgaacg ccagtatagt cggggaaaga aagatcagca 960

attgcaatga gacgggtgct ggttgggcat catgtcaatc ggaacagcta gacggtgata 1020

ataatgcggc aatacaagta atgcaaaagg gtatagggtt aagactgacg aatcctcaga 1080

acacagactc aggactatat gtcgtaatta tcacgataga tgataaaata acatcgtggg 1140

catatacgtt actatcaact attgatctat ttgtcggcgt gaccatcgaa actcataaac 1200

ccgcaattgc tgaagatacg atgctaaagt ctaccgaatc tacacctggc cgcggtaccc 1260

atgacggcag atctggactg tttgtagtcg gtctcggagt actaggggtc gtgactatta 1320

taatcctggc tgtttcatcc atctttttaa ctactaaatt ccttagggca agagcgcgtt 1380

cgaaaagcaa tggcatcaag aatgcatacg gctcgtatta caattcatta cccggcgtcg 1440

agccatacag tgatagtgac tgtgaaaatg gtggagactt ttccgacgat tcttt 1495

Claims (10)

1.重组鸭肠炎病毒，其在ACCESSION NO.EU082088所示基因组的142921bp-142975bp位置之间插入有具有鸭3型腺病毒Fiber2基因的表达盒。

2.根据权利要求1所述的重组鸭肠炎病毒，所述Fiber2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

3.根据权利要求1或2所示的重组鸭肠炎病毒，所述表达盒所用启动子为CMV启动子。

4.根据权利要求1或2所示的重组鸭肠炎病毒，所述表达盒所用终止子为SV40。

5.宿主细胞，其被权利要求1～4任一项所述的重组鸭肠炎病毒所感染。

6.权利要求1～4任一项所述的重组鸭肠炎病毒的制备方法，所述方法包括：

在能够将所述重组鸭肠炎病毒复制增殖的条件下将所述重组鸭肠炎病毒引入宿主细胞，并收集复制得到的病毒颗粒。

7.疫苗，其含有权利要求1～4任一项所述的重组鸭肠炎病毒。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其进一步包含药学上可接受的载体。

9.成套试剂盒，其包含权利要求7或8所述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。

10.权利要求1～4任一项所述的重组鸭肠炎病毒在制备用于禽类宿主的鸭肠炎病毒和鸭3型腺病毒防治药物中的应用。

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