ES2617232T3

ES2617232T3 - Una vacuna que comprende células inactivadas de bacterias Haemophilus parasuis de serotipo 5

Info

Publication number: ES2617232T3
Application number: ES11715569.7T
Authority: ES
Inventors: Maarten Hendrik Witvliet; Selma Marianne Hensen; Ruud Philip Antoon Maria Segers
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2011-04-22
Publication date: 2017-06-15
Anticipated expiration: 2031-04-22
Also published as: EP2561063A1; EP2561063B1; US20130039941A1; WO2011131789A1; US20140178435A1

Abstract

Una vacuna que comprende células inactivadas de bacterias Haemophilus parasuis de serotipo 5 obtenidas mediante cultivo en condiciones de restricción de hierro, o derivados de las mismas, expresando dichas bacterias una proteína cuya expresión se regula positivamente cuando la bacteria que expresa se cultiva en condiciones de restricción de hierro, visible en una transferencia Western cuando se hace reaccionar con suero de un animal convaleciente que se ha recuperado de una infección por bacterias Haemophilus parasuis de serotipo 4, no siendo dicha proteína visible en una transferencia Western cuando las bacterias Haemophilus parasuis de tipo salvaje de serotipo 5 cultivadas en condiciones de repleción de hierro se hacen reaccionar en las mismas condiciones, de modo que la vacuna proporciona protección contra un trastorno que se origina de las bacterias Haemophilus parasuis de serotipo 4.

Description

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DESCRIPCION

Una vacuna que comprende celulas inactivadas de bacterias Haemophilus parasuis de serotipo 5

La presente invencion se refiere a una vacuna que comprende celulas inactivadas de bacterias Haemophilus paraseis.

Haemophilus parasuis es una bacteria patogena oportunista del tracto respiratorio superior de los cerdos. Es la causante de la enfermedad de Glasser, una afeccion que da como resultado una amplia diversidad de sintomas clinicos tales como artritis, pericarditis, pleuritis, poliserositis, meningitis y muerte aguda. La enfermedad de Glasser es principalmente un problema asociado con la lactancia de lechones. Sin embargo, con la prestacion de nuevas tecnologias sanitarias, tales como el destete precoz segregado (DPS) y la aparicion de nuevos patogenos, tales como el virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino (SrRp), la frecuencia de la enfermedad de Glasser ha aumentado. En primer lugar, los problemas con Haemophilus parasuis empeoran por infeccion del SRRP. Junto a esto, aunque las tecnologias del DPS han eliminado a Haemophilus parasuis de determinadas piaras, esto se ha convertido en un problema muy grave para companias de cria de ganado: su objetivo es elevar el estado de salud de sus animales y en el proceso aumentar la susceptibilidad de ganado de reemplazo contra Haemophilus parasuis. La enfermedad aguda de Glasser se produce con frecuencia cuando en una granja infectada se introducen lechonas o verracos de reemplazo en un estado completamente sano. Por lo tanto, entre otras cosas, resulta de gran importancia inmunizar a animales no expuestos anteriormente antes de introducirlos en granjas infectadas. En terminos generales, la obtencion de proteccion contra Haemophilus parasuis mediante inmunizacion se ha vuelto cada vez mas importante. Existen diferentes serotipos conocidos de Haemophilus parasuis, pudiendo cada uno de estos identificarse usando la tecnica de inmunodifusion (Kielstein et al. in J. Clin. Microbiol. 30:862-865; 1992 and Rapp-Gabrielson et al. in AJVR 53:659-664; 1992).

Combinord® es una vacuna inactivada certificada (Intervet Dinamarca) para proteger (es decir, mitigar al menos un efecto negativo de un trastorno) a cerdas y a lechonas contra Haemophilus parasuis serotipo 5. Tambien protege, de manera pasiva, a la descendencia contra el serotipo 5 mediante la ingesta de calostro. Sin embargo, no se ha certificado para la proteccion contra Haemophilus parasuis serotipo 4. De hecho, como generalmente se sabe para vacunas que protegen de manera activa contra Haemophilus parasuis, no hay proteccion cruzada del serotipo 5 frente al serotipo 4. Esto se sabe, por ejemplo, a partir de una publicacion de Rapp-Gabrielson et al (Veterinary Medicine/January 1997/pag. 83-90). Rapp Gabrielson ha examinado diferencias en cuanto a virulencia e inmunogenicidad de cepas de Haemophilus parasuis, enfocadas a la proteccion y a la proteccion cruzada contra cepas que representan serotipos prevalentes, a saber, serotipos 5, 4, 13, 14, 2 y 12 respectivamente. De esta investigacion pudieron extraerse diversas conclusiones. Lo mas importante, se observo que Haemophilus parasuis de serotipo 5 no proporcionaba proteccion contra la exposicion al serotipo 4. Junto a esto, se observo que dentro del serotipo 4, se proporcionaba proteccion cruzada contra cepas heterologas. Por tanto, la proteccion contra una cepa del serotipo 4 implicaba proteccion contra otras cepas del mismo serotipo 4.

Los hallazgos anteriores son coherentes con los hallazgos de Oliveira (Journal of Swine Health and Production, volumen 12, numero 3, mayo y junio de 2004, pag.123-128. En este documento, se establecio que con una vacuna con Haemophilus paraseis inactivado hay una falta de proteccion cruzada entre serotipos diferentes, Bastante recientemente (21 de marzo del 2006), se concedio a Fort Dodge la autorizacion de comercializacion en el Reino Unido de una vacuna con microorganismos inactivados contra Haemophilus parasuis de los serotipos 4 y 5 (Suvaxyn M.hyo - Parasuis). De hecho, la vacuna comprende tanto Haemophilus parasuis inactivados de serotipo 4 asi como Haemophilus parasuis de serotipo 5. El RUMA (uso responsable de medicinas en la alianza agricola) del Reino Unido ha publicado las directrices sobre el uso de vacunas y vacunacion en la produccion de cerdos en noviembre de 2006. Con respecto a la enfermedad de Glasser, estas directrices afirman que las vacunas comerciales se basan en cepas de las que hay poca o ninguna inmunidad cruzada contra otras.

Se observa que, a partir del documento WO 2008/085406, se sabe que una composicion que comprende bacterias vivas modificadas de Haemophilus parasuis del serotipo 5, puede proporcionar proteccion contra el serotipo 4. Una desventaja de una composicion viva cuando se compara con una composicion inactivada es el riesgo de efectos secundarios debidos a la replication de las bacterias en el animal sujeto.

La desventaja de las bacterias Haemophilus parasuis de serotipo 5 conocidas hasta ahora es que las vacunas inactivadas basadas solamente en las mismas solo pueden proporcionar proteccion activa (mediante inmunizacion activa contra bacterias del mismo genotipo. Por tanto, para la proteccion activa contra los serotipos que son mas prevalentes, es decir, los serotipos 4 y 5, ambos serotipos tienen que estar en la vacuna inactivada. Desde un punto de vista de seguridad esto es una desventaja (mas bacterias presentes significa un mayor contenido de la vacuna de la endotoxina), pero tambien desde un punto de vista economico: la presencia de dos tipos de bacterias en la vacuna implica una mayor posibilidad de fracaso de lote y un mayor riesgo de contamination. Por lo tanto, aumenta la posibilidad de que se encuentre un lote inadecuado para la venta. Es por lo tanto un objeto de la presente invencion superar, o al menos mitigar, esta desventaja de las presentes bacterias de Haemophilus parasuis de serotipo 5.

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Para este fin, se ha descubierto que las bacterias Haemophilus parasuis de serotipo 5 que expresan una o mas protemas de restriccion (es dedr, protemas cuya expresion esta regulada positivamente en las bacterias silvestres cuando crecen en condiciones de restriccion de hierro), pueden proporcionar proteccion cruzada activa contra bacterias Haemophilus parasuis de serotipo 5. Como se sabe habitualmente, una proteina cuya expresion esta regulada positivamente cuando una bacteria crece en condiciones de restriccion de hierro se puede regular positivamente proporcionando las condiciones de restriccion de hierro reales (es decir, niveles bajos o nulos de hierro en el medio), pero tambien modificando geneticamente la bacteria, de forma que el gen que esta regulado positivamente en las condiciones de restriccion de hierro esta regulado positivamente con independencia de la cantidad de hierro presente en el medio de cultivo. En cualquier caso, la presente invencion se refiere a una nueva bacteria de Haemophilus parasuis de serotipo 5 que expresa al menos una proteina de restriccion de hierro, que es la misma proteina cuya expresion se regula positivamente cuando se cultiva una bacteria de tipo salvaje Haemophilus parasuis de serotipo 5 en condiciones de restriccion de hierro. Las condiciones de restriccion de hierro son condiciones en las que la cantidad de hierro disponible en el medio de cultivo influye negativamente sobre la tasa de crecimiento maxima obtenible de la bacteria en ese medio (es decir, sin otros cambios de los constituyentes del medio). Es decir, el aumento de la cantidad de hierro presente conducira a un aumento de la tasa de crecimiento de la bacteria en ese medio. Por el contrario, en condiciones de replecion de hierro, la tasa de crecimiento de la bacteria es maxima. Por lo tanto, un aumento en la cantidad de hierro en el medio de cultivo no conducira a un aumento en la tasa de crecimiento de la bacteria. Se observa que las condiciones de restriccion de hierro pueden proporcionarse de varias maneras conocidas en la materia. Una opcion es la adicion de un agente a un medio de cultivo que contiene hierro en el que el agente quela al menos parte del hierro presente. Los quelantes de hierro conocidos son, por ejemplo, a, a-bipiridilo (tambien llamado "dipiridilo"), acido nitrilotriacetico, acido dietilentriaminopentaacetico, desferrioxamina, etc. De esta manera, dependiendo de la cantidad de quelante utilizada, se puede obtener cualquier concentracion de hierro por debajo de un nivel repleto. Otros medios son, por ejemplo, pretratar un medio que contiene hierro para eliminar hierro mediante un intercambiador de iones, por ejemplo Chelex 100 (disponible en Biorad), o para obtener una concentracion baja definida de hierro anadido a un medio (auto)ensamblado.

Para las bacterias de Haemophilus parasuis del serotipo 5, se encontro que, en condiciones de restriccion de hierro, la bacteria expresa varias protemas (que pueden ser protemas libres o unidas, tales como glicoprotemas) a diferentes velocidades en comparacion con el cultivo en condiciones de replecion de hierro. Al menos una proteina, que es muy claramente visible alrededor de 60 kDa en una transferencia Western cuando se cultiva una bacteria de tipo salvaje en condiciones de restriccion de hierro, es sustancialmente menos expresada, o incluso no expresada en absoluto, cuando la bacteria se cultiva en condiciones de replecion de hierro. Se cree que la expresion de tales protemas induce proteccion activa contra las bacterias Haemophilus parasuis de otros serotipos, en particular del serotipo 4. Dada la tecnica anterior que, de manera espedfica y persistente, instruye acerca de que una vacuna que contiene celulas inactivadas de la bacteria Haemophilus parasuis serotipo 5 no proporciona proteccion activa contra la bacteria Haemophilus parasuis de serotipo 4, esto podria no haberse esperado de manera razonable. Observese que se pueden idear muchas realizaciones para obtener una vacuna usando la nueva bacteria de la presente invencion. Por ejemplo, las bacterias inactivadas podrian introducirse en la vacuna como tales o podrian usarse para obtener derivados de las mismas para constituir una vacuna. A la vista de los derivados citados anteriormente, se conoce habitualmente, en particular para componentes asociados a la membrana externa, incluso mas particularmente para protemas espedficamente o cada vez mas expresadas en condiciones de restriccion de hierro, que estas subunidades pueden contribuir en gran medida a la respuesta inmunologica eficaz del animal objetivo a la vacuna. Como tal, estos y otros derivados de la bacteria original podrian usarse en muchos casos como los unicos componentes de la vacuna. Como se conoce habitualmente, se pueden usar varios metodos conocidos en la tecnica para obtener tales derivados en forma (sustancialmente) pura, por ejemplo, fabricandolos mediante una tecnica recombinante, mediante sintesis del componente o mediante purificacion del componente del caldo de fermentacion. Se podrian usar una o mas subunidades (preferentemente recombinantes) de la bacteria como el antigeno real para formular una vacuna. Tales subunidades podrian expresarse en organismos distintos de Haemophilus parasuis, por ejemplo en especies de Escherichia coli, Salmonella enterica o Apicomplexan, como medio de produccion o como vector cuando se inmuniza a un animal.

Una vacuna en el sentido de la presente invencion es una constitucion adecuada para su aplicacion a un animal, que comprende uno o mas antigenos tales como microorganismos atenuados o muertos y/o derivados de los mismos en una cantidad inmunologicamente eficaz (es decir, capaz de estimular el sistema inmunologico del animal diana de manera suficiente para reducir al menos los efectos negativos de una exposicion a microorganismos patogenos), normalmente combinados con un vehiculo farmaceuticamente aceptable, tal como un liquido que contiene agua, que comprende opcionalmente agentes inmunoestimulantes (adyuvantes), que, al administrar al animal, induce una respuesta inmunologica para tratar una enfermedad o trastorno asociado con un microorganismo patogeno (a menudo de tipo salvaje), es decir, al menos, ayuda a prevenir, mejorar o curar la enfermedad o trastorno. Esto evita, o al menos disminuye, el nivel de infeccion o los signos clinicos de la enfermedad o trastorno en el animal diana y, en consecuencia, la gravedad de la enfermedad o trastorno. Tambien se puede detener o disminuir la propagacion de la enfermedad o trastorno en el medio ambiente.

Se observa que, a partir del documento WO 2009/118330, se sabe que los descendientes de cerdas o lechonas vacunadas con bacterias Haemophilus parasuis del serotipo estan protegidos pasivamente contra Haemophilus

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Parasuis del serotipo 4. Sin embargo, no hay ninguna prueba en este documento de que las cerdas vacunadas esten protegidas contra el serotipo 4. Por el contrario, de la tecnica anterior (vease el articulo de Rapp-Gabrielson mencionado anteriormente) se sabe que este no es el caso. Por lo tanto, no es claro a partir de la referencia WO 2009/118330 que se pueda inducir proteccion activa contra bacterias del serotipo 4 en un animal diana mediante la inmunizacion de ese animal con bacterias Haemophilus parasuis del serotipo 5, cultivadas en condiciones de restriction de hierro. Dado el hecho de que en la tecnica nadie ha explorado o ni siquiera sugerido la ruta de cultivo de Haemophilus parasuis de serotipo 5 en condiciones de restriccion de hierro para inducir proteccion cruzada contra bacterias del serotipo 4, aunque esta ruta ha sido explorada para otras bacterias desde hace muchos anos (veanse los documentos Ep 749 321 y EP 389 347), esta claro que esta ruta siempre se ha considerado sin exito para Haemophilus parasuis por los especialistas en vacunas.

La vacuna comprende celulas inactivadas de la nueva bacteria Haemophilus parasuis de serotipo 5. Parece que una vacuna que comprende celulas inactivadas proporciona proteccion suficiente. La ventaja de un antigeno inactivo es la seguridad. La bacteria Haemophilus parasuis de serotipo 5 pueden inactivarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como usando inactivadores quimicos tales como beta-propiolactona, timerosal (u otro agente donante de mercurio), formaldehido, etc., aplicando metodos fisicos tales como calor, luz UV, microondas, etc., usando metodos biologicos tales como metodos basados en enzimas para destruir a la bacteria y cualquier otro metodo aplicado normalmente en la tecnica. Se sabe que usando tales metodos, partes de las celulas bacterianas pueden perder su asociacion con las celulas. En particular, esto podria ser el caso con los componentes asociados a la membrana celular tales como la propia membrana externa o proteinas de la membrana externa.

En una realization, la vacuna comprende antigenos adicionales que corresponden a uno o mas microorganismos del grupo que consiste en Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, Streptococcus suis, Salmonella serovars, Erysipelothrix rhusiopathiae, circovirus porcino y v virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino (SRRP). En una realizacion especifica, la vacuna comprende, junto a los antigenos de las bacterias of Haemophilus parasuis de acuerdo con la presente invention, antigenos de Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, circovirus porcino y, opcionalmente, Erysipelothrix rhusiopathiae. Esta vacuna podria obtenerse, por ejemplo, mezclando los antigenos de la bacteria Haemophilus parasuis (inmediatamente) antes de la administration con una vacuna que contiene antigenos de los otros patogenos. Con el fin de evitar que la ultima vacuna combinada comprenda demasiado diluyente, los antigenos de las bacterias Haemophilus parasuis, preferiblemente celulas inactivadas, deberian estar presentes en forma liofilizada. De esta manera, la mezcla no implica un aumento en la cantidad de diluyente.

Tambien se describe una proteina aislada de la bacteria Haemophilus parasuis del serotipo 5, cultivada en condiciones de restriccion de hierro, siendo la proteina visible en una transferencia Western cuando se hace reaccionar con suero de un animal convaleciente que se ha recuperado de una infection por bacterias Haemophilus parasuis de serotipo 4, y no son visibles en una transferencia Western cuando se hacen reaccionar las bacterias Haemophilus parasuis del serotipo 5, que crecen bajo condiciones de repletion de hierro repleto, en las mismas condiciones. Esta proteina puede utilizarse, por ejemplo, en una prueba de diagnostico para permitir la discrimination entre las bacterias Haemophilus cultivadas en condiciones de restriccion de hierro y bacterias Haemophilus cultivadas en condiciones de replecion de hierro. Ademas, la proteina puede ser util como antigeno en una vacuna para proteger contra las bacterias Haemophilus paraseis.

La invencion se explicara mediante los siguientes ejemplos que pertenecen a una realizacion preferida de la presente invencion.

La Figura 1 muestra un analisis del antigeno de la vacuna de Haemophilus parasuis de serotipo 5 producido en condiciones de cultivo de replecion de hierro (indicado como "+ Fe") y en condiciones de restriccion de hierro (indicado como "-Fe") mediante SDS-PAGE.

La Figura 2 muestra un analisis del antigeno de la vacuna de Haemophilus parasuis de serotipo 5 producido en condiciones de cultivo de replecion de hierro (indicado como "+ Fe") y en condiciones de restriccion de hierro (indicado como "-Fe") mediante transferencia de tipo Western.

DISENO EXPERIMENTAL

Cultivos bacterianos

Para la preparation de los antigenos vacunales, se utilizan existencias de glicerol de una cepa de Haemophilus parasuis de serotipo 4 y de Haemophilus parasuis de serotipo 5. Para cada lote de antigeno de la vacuna, se descongela 1 ampolla de las existencias de glicerol y se anade a 100 ml de RPMI (medio de cultivo, disponible comercialmente de Invitrogen) + 10 g/l de extracto de levadura + 0,4 % v/v de NAD en un matraz de agitation de 500 ml y se cultivan a 100 rpm, 37 °C durante 16-24 horas. A continuation se subcultiva en 125 ml del mismo medio + 10 g/l de extracto de levadura + 0,4% v/v de NAD en un matraz de agitacion de 500 ml a una velocidad de inoculation al 10 % v/v y se cultivan a 100 rpm, 37 °C durante 18-24 horas. Para cada lote de antigeno vacunal, se preparan 2-4 matraces de agitacion con 125 ml de cultivo cada uno y se combinan al final del cultivo.

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Para inducir condiciones de restriction de hierro, se anade dipiridilo 10 mM a una concentration final de 80 |jM cuando el cultivo ha alcanzado una densidad optica a 660 nm de 0,6. Para inactivar las bacterias, se agrega formalina a una concentracion final de 0,6 % v/v, seguido de incubation durante 2 horas a temperatura ambiente. Los cultivos inactivados se centrifugan durante 10 minutos a 13.000 g. El sobrenadante se desecha y los sedimentos de celulas bacterianas se resuspenden en PBS a 1/6 del volumen de cultivo original. Las suspensiones se usan como antigenos vacunales. Para poder formular las vacunas finales a iguales concentraciones de antigeno de la vacuna, se determina el contenido de nitrogeno total de estas suspensiones.

Analisis de los antigenos vacunales para la production de proteinas con restriccion de hierro

Los antigenos de la vacuna se analizan mediante tecnicas de transferencia estandar, electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), seguido de transferencia Western sobre una membrana de PVDF, en este caso de un lisado de celulas enteras (por ejemplo, tambien se podria usar un extracto de membrana externa). Se utiliza un antisuero de convalecencia derivado de un cerdo que ha sufrido una infection natural con el serotipo 4 de Haemophilus parasuis para sondear la membrana de PVDF. Mas especificamente, se realizo SDS-PAGE usando un gel de Bis-Tris NuPage 10 % (1,0 mm) en condiciones reductoras con un tampon SDS MOPS/MES, a 200 V/125 mA durante 64 minutos. Para transferir el gel a una membrana de transferencia Immobilon P PVDF 0,45 um (Millipore), se uso el metodo de transferencia Western semiseco de acuerdo con Towbin (Towbin, H, Staehlin, T. y Gordon, J. Proc. Nat. Acad. 76, 4350, 1979). La transferencia se bloqueo con 100 ml de pBs 0,04 M que contenia Tween 20 al 0,5 % (pH = 7,2) y polvo lacteo al 1 % m/v durante una hora a 37 °C. La transferencia se lavo una vez con PBS 0,04 M y Tween 20 al 0,5 % (pH = 7,2) durante 30 segundos. Posteriormente, la transferencia se incubo durante una hora a 37 °C en 20 ml de PBS 0,04 M que contenia Tween 20 al 0,05 % y polvo de leche al 1 % que contenia una dilution de 125 veces del suero de cerdo, seguido de lavado tres veces durante cinco minutos con 100 ml 0,04 M de PBS que contenia Tween 20 al 0,5 % (pH = 7,2) A continuation, la transferencia se incubo durante una hora a 37 °C con 20 ml de PBS 0,04 M que contenia Tween 20 al 0,05 % y polvo de leche al 1 % y 1000 veces (IgG)-HRP, anti-cerdo de conejo diluida, seguido de lavado tres veces durante cinco minutos con 100 ml 0,04 M de PBS que contenia Tween 20 al 0,5 % (pH = 7,2) La transferencia se incubo en la solution de Vector SG de sustrato (kit de sustrato Vector SG para peroxidasa (Vector, SK-4700)) hasta que hubo suficiente desarrollo de color, es decir, una banda visible a simple vista alrededor de 60 kDa para la muestra de restriccion de hierro- La reaction se detuvo lavando durante cinco minutos en agua destilada.

Formulation de vacuna

Los antigenos de la vacuna que se van a analizar en los cerdos (Haemophilus parasuis de serotipo 4 producido en condiciones de repletion de hierro y Haemophilus parasuis de serotipo 5 producido bajo condiciones de restriccion de hierro, estando esta ultima tambien indicada como bacterias "IRP") se diluyen en PBS hasta una concentracion de nitrogeno total de 0,05 jg/ml y se mezclan 1:1 con un adyuvante basado en acetato de dl-a-tocoferilo (Diluvac Forte, disponible en Intervet/Schering-Plough Animal Health). En general, cualquier otra vacuna que comprende antigenos de H. parasuis de serotipo 5 producidos en condiciones de restriccion de hierro puede formularse usando metodos conocidos en la tecnica que comprenden basicamente la mezcla de antigenos adecuados de H. parasuis (vivos o inactivados, de celulas enteras, extracto fraction o subunidad purificada) con un vehiculo farmaceuticamente aceptable, por ejemplo un vehiculo liquido tal como agua (opcionalmente tamponada) o un vehiculo solido tal como el utilizado habitualmente para obtener vacunas liofilizadas. Opcionalmente se anaden otras sustancias tales como adyuvantes, estabilizantes, modificadores de la viscosidad u otros componentes dependiendo del uso pretendido o de las propiedades requeridas de la vacuna.

Vacunacion

Se utilizaron tres grupos de 10 lechones de una piara libre de Haemophilus paraseis. Dos vacunas (serotipo 4 de Haemophilus parasuis producido en condiciones de replecion de hierro y serotipo 5 de Haemophilus parasuis producido en condiciones de restriccion de hierro) se administraron por via intramuscular en una dosis de 2 ml a una y cuatro semanas de edad. Los 10 lechones restantes se utilizaron como grupo control negativo no vacunado. Uno de los lechones en el gripo de control negativo murio antes de la exposition a la infeccion.

Infeccion por exposition a Haemophilus parasuis de serotipo 4

Aproximadamente a las siete semanas de edad, los 29 lechones recibieron una infeccion por exposicion. El compuesto de exposicion es un aislado de campo (cepa viva) de Haemophilus parasuis de serotipo 4. El aislado se obtiene usando un metodo conocido de la referencia de Oliveira como se ha mencionado anteriormente en el presente documento. El cultivo de exposicion se preparo poco antes de la exposicion. Haemophilus parasuis se cultivo en placas de agar chocolate con NAD a 37 °C durante 24-72 horas. Las bacterias se recogieron con de 2 a 5 ml de medio CYS por placa y esto se uso para inocular medio CYS con NAD (de 2 a 5 ml por 100 ml de medio). A esto le siguio a 37 °C durante ± 5 horas. Despues, el cultivo se centrifugo durante 10 minutos a 2.000 g y el sedimento se resuspendio en PBS 0, 04 M. Los materiales de exposicion se conservaron en hielo hasta su uso, cuyo uso se realizo en 2 horas. Los lechones se expusieron a Haemophilus parasuis a traves de aerosol en un compartimento para aerosol. Esto se realizo en grupos de 10 lechones cada uno. El aerosol se proporciono

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mediante un nebulizador de tipo Devilbis. La cantidad total de cultivo de exposicion por grupo de 10 lechones fue de 50 ml. El cultivo de exposicion contenia ± 108 ufc/ml. Se dejo a los lechones en el compartimento para aerosol durante aproximadamente 30 minutos.

Despues de la exposicion, se puntuaron diariamente la temperatura rectal, el estado general, anomalias en cuanto a locomocion, el sistema nervioso y otras anomaKas, durante un periodo de 10 dias.

El sistema de puntuacion en cuanto al estado general fue el siguiente

0= normal 1 = inapetente 2= inapetente y deprimido 3= deprimido y lento para levantarse 4= moribundo.

El sistema de puntuacion en cuanto a la locomocion fue el siguiente:

0= comportamiento normal

1 = articulaciones inflamadas, ardientes o dolorosas 2= cojera en una o mas patas

3 = incapacidad para apoyarse en el suelo

4 = negativa a levantarse, incluso moribundo.

El sistema de puntuacion en cuanto al sistema nervioso fue el siguiente:

0= comportamiento normal 1 = cabeza inclinada 2= perdida de equilibrio 4= convulsiones

El sistema de puntuacion para otras anomalias fue el siguiente:

0= sin anomalias

2= anomalias de menor importancia 4= anomalia grave que requiere eutanasia.

De manera automatica, cualquier lechon con una puntuacion de 4 para la categoria de signo clinico que conducia a la decision del criterio de valoracion desde el punto de vista humano se sacrifico. La puntuacion clinica total por lechon fue la suma de las puntuaciones clinicas diarias desde la exposicion hasta la necropsia.

Se realizo necropsia en todos los animales que murieron despues de la exposicion y se realizo la necropsia de los animales supervivientes a los 10 dias de la exposicion.

En el examen posmortem, las lesiones patologicas macroscopicas de la cavidad peritoneal, pleural y pericardica y las articulaciones afectadas se puntuaron del siguiente modo:

0 = no se detectaron anomalias.

1 = depositos minimos de fibrina y/o cantidad minima de liquido transparente

2 = serositis fibrinosa leve y/o leve acumulacion de liquido claro/aumento de la sinovia

3 = serositis fibrinosa moderada y/o acumulacion moderada de liquido claro/aumento de la sinovia o signos leves de exudacion purulenta.

4 = serositis fibrinosa grave y/o acumulacion intensa de liquido claro/aumento de la sinovia o signos moderados de exudacion purulenta.

La puntuacion post mortem total por lechon es la suma de la puntuacion individual para cada cavidad (abdominal, pleural y pericardica) y las articulaciones afectadas.

RESULTADOS

La Figura 1 muestra un analisis del antigeno de la vacuna de Haemophilus parasuis de serotipo 5 producido en condiciones de cultivo de replecion de hierro (indicado como "+ Fe") y en condiciones de restriccion de hierro (indicado como ""-Fe") mediante SDS-PAGE. La Figura 2 muestra un analisis correspondiente mediante transferencia Western adicional. Mediante SDS-PAGE y transferencia Western se observan diferencias en la expresion de proteinas (indicadas por las flechas). Lo mas notable es la reaccion de anticuerpos en el suero del cerdo convaleciente a una banda de proteina con un peso molecular aparente de aproximadamente 60 kDa en el antigeno de vacuna cultivado en condiciones de restriccion de hierro, transferido como se ha indicado anteriormente en el presente documento. En estas condiciones de transferencia no se observa ninguna banda en el antigeno de

vacuna cultivado en condiciones de replecion de hierro a 60 kDa (puede ser, sin embargo, que una banda vaga finalmente se hara visible cuando el desarrollo del color no se detiene en cuanto una banda transparente sea visible para la muestra de restriccion de hierro). Esta proteina de 60 kDa no se observa cuando Haemophilus parasuis de serotipo 4 se cultiva en condiciones estandar (datos no mostrados).

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La Tabla 1 muestra los efectos de la infeccion por Haemophilus parasuis de serotipo 4 en los dos grupos vacunados y en los controles no vacunados. Se observaron reducciones significativas de las puntuaciones de los signos clinicos, la mortalidad y posmortem en los animales inmunizados activamente con la vacuna de Haemophilus parasuis de tipo 4 o con la vacuna de Haemophilus parasuis de tipo 5 IRP en comparacion con los lechones de 10 control. La temperatura media despues de la exposicion (datos no mostrados) fue comparable para ambas vacunas y significativamente menor que la de los controles. Aunque la vacuna IRP de serotipo 5 parecia proporcionar una proteccion aun mejor que la vacuna de serotipo 4 frente a una exposicion de serotipo 4, la diferencia entre los dos grupos de vacunas no fue estadisticamente significativa. Sin embargo, puede concluirse que usando bacterias de Haemophilus parasuis de serotipo 5 IRP para constituir una vacuna para cerdos, se les puede proteger al menos al 15 mismo nivel contra una infeccion con Haemophilus parasuis de serotipo 4, en comparacion con una situacion en la que se usa la vacuna con Haemophilus parasuis de serotipo 4.

Tabla 1. Resultados de proteccion de los lechones

Vacuna: N.° de lechones Puntuacion clinica media Mortalidad [n/ntot| Puntuacion media posmortem

H. parasuis de serotipo 4: 10 14.2* 2/10* 2.8*

H. parasuis de serotipo 5 IRP: 10 6.5* 1 /10* 1.9*

Ninguno: 9 52.2 7/9 7.0

*: significativamente diferente de los controles (p <0,05, prueba U de Mann-Whitney para las puntuaciones y prueba exacta de Fischer para la tasa de mortalidad)

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una vacuna que comprende celulas inactivadas de bacterias Haemophilus parasuis de serotipo 5 obtenidas mediante cultivo en condiciones de restriccion de hierro, o derivados de las mismas, expresando dichas bacterias

5 una proteina cuya expresion se regula positivamente cuando la bacteria que expresa se cultiva en condiciones de restriccion de hierro, visible en una transferencia Western cuando se hace reaccionar con suero de un animal convaleciente que se ha recuperado de una infeccion por bacterias Haemophilus parasuis de serotipo 4, no siendo dicha proteina visible en una transferencia Western cuando las bacterias Haemophilus parasuis de tipo salvaje de serotipo 5 cultivadas en condiciones de replecion de hierro se hacen reaccionar en las mismas condiciones, de 10 modo que la vacuna proporciona proteccion contra un trastorno que se origina de las bacterias Haemophilus parasuis de serotipo 4.
2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que la vacuna comprende antigenos adicionales que corresponden a uno o mas microorganismos del grupo que consiste en Actinobacillus

15 pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, Streptococcus suis, Salmonella serovars, Erysipelothrix rhusiopathiae, circovirus porcino y virus SRRP.
3. Una vacuna de acuerdo con la reivindicacion 2, caracterizada por que la vacuna comprende antigenos adicionales de Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, circovirus porcino y, opcionalmente, Erysipelothrix

20 rhusiopathiae.
4. Una vacuna de acuerdo con la reivindicacion 3, caracterizada por que la vacuna se obtiene mezclando celulas inactivadas de la bacteria Haemophilus parasuis, opcionalmente en forma liofilizada, con una vacuna que contiene antigenos de Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis y circovirus porcino.

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