CN106177939B - 一种疫苗用佐剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种疫苗用佐剂,该佐剂包括铝胶、左旋咪唑或其衍生物,还包括聚丙烯酸盐。本发明还公开了含该佐剂的疫苗组合物及其应用。该佐剂不仅可用作灭活疫苗的佐剂,还可用于制备蛋白稳定液。含该佐剂的疫苗组合物不仅能使机体产生体液免疫还能产生细胞免疫,在抗原含量较低、单次免疫时也能产生较好的免疫应答;还可使蛋白稳定不发生降解或不可逆变化。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域,具体涉及用于增强抗原免疫应答的佐剂,该佐剂包含铝胶、左旋咪唑或其衍生物,还包括聚丙烯酸盐,用于疫苗组合物和蛋白中,但不在受试者中产生毒性或不想要的副反应。
背景技术
细菌、病毒及寄生虫感染广泛分布于人和动物,由这些感染剂引起的疾病通常对抗微生物学疗法具有抗性,使得无有效的治疗方法。因此,愈来愈多人使用疫苗学方法以控制传染,具体是通过用活的病原体、经灭活的病原体或其产物、或经基因工程手段将病原体蛋白质亚基制备成疫苗进行疫苗接种来诱导特异性免疫。然而,当单独给予某些抗原时不对免疫系统产生足够的刺激作用。因此,必须加入能够使机体免疫应答增加的免疫佐剂来获得足够量的保护性抗体。
免疫佐剂是疫苗必不可少的组成部分,不仅能影响机体对疫苗免疫应答的强度,而且能针对特定病原体诱导最有效的免疫应答类型(Mbow ML,De Gregorio E,ValianteNM,et al.New adjuvants for human vaccines.Current opinion in immunology,2010,22(3):411-416)。目前,研究的免疫佐剂类型很多,如铝胶、油佐剂、弗氏佐剂、微生物及其代谢产物、核酸及其类似物、细胞因子、脂质体等(Dey AK,Srivastava IK.Noveladjuvants and delivery systems for enhancing immune responses induced byimmunogens.Expert review of vaccines,2011,10:227-251),但由 于存在不同程度的毒副作用或安全隐患等一些不可避免的缺陷而难以实际应用(Mbow ML,De Gregorio E,Valiante NM,Rappuoli R.New adjuvants for human vaccines.Current opinion inimmunology,2010,22(3):411-416;Batista-Duharte A,Lindblad EB,Oviedo-OrtaE.Progress in understanding adjuvant immunotoxicity mechanisms.Toxicologyletters,2011,203(2):97-105),导致这些佐剂远远不能满足新型疫苗发展的需求。特别地,大量的临床免疫试验认为铝胶佐剂存在一些问题:(1)对Th2介导的体液免疫反应具有很强的激发作用,而对Th1介导的细胞免疫反应的作用较弱,只适用于以抗体为主要保护性免疫的疫苗(Exley C,Siesjo P,Eriksson H.The immunobiology of aluminumadjuvants:how do they really work?Trends in immunology,2010,31:103-109);(2)可促进IgE抗体产生,容易诱导机体产生过敏反应;(3)有局部反应,会形成肉芽肿,极个别可发生局部无菌性脓肿;(4)因其理化性质,含铝胶疫苗怕冻,冻后铝胶疫苗容易变性;(5)对人、畜神经系统可能有影响(见中国专利CN102526724A、CN101402666A)。因而,寻找安全、有效、新型的免疫佐剂是当前疫苗研究领域的一个热点(Schijins VEJC,Lavelle EC.Teendsin vaccine adjuvants.Expert review of vaccines,2011,10(4):539-550)。并且,免疫佐剂研究现已被列为疫苗研究的优先领域(Harandi AM,Medaglini D,ShattockRJ.Vaccine adjuvants:A priority for vaccine research.Vaccine,2010,28(12):2363-2366;Harand AM,Brewe J,Schijn V.Conference scene:recent advancements inimmunopotentiators for modern vaccines.Immunotherapy,2011,3(11):1297-1301)。
另外,目前商品化的菌苗(如猪肺炎支原体菌苗、副猪嗜血杆菌菌苗)是通过在含血清的培养基上生长所得的生物体制备而成,引起了对于免疫物质中存在的血清组分(如免疫复合物或非 免疫原性特异性蛋白)诱导副反应发生(见中国专利CN104334186A)。并且在兽用生物制品技术领域临床试验的研究中,发现蛋白的重复性和稳定性十分重要,良好的稳定性是数据可靠的一个重要标志。但是,在临床试验中,一些蛋白的稳定性较差,在一般条件下极易降解或变性,直接影响试验结果的准确性。因此,如何保持蛋白的稳定性是临床试验中的关键技术。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本发明提供了一种疫苗用佐剂及其应用。
本发明的第一方面在于提供一种疫苗用佐剂,所述佐剂包括铝胶、左旋咪唑或其衍生物。
作为本发明的一种优选实施方式,所述铝胶包括氢氧化铝、磷酸铝中的至少一种。
作为本发明的一种优选实施方式,所述左旋咪唑或其衍生物包括左旋咪唑、盐酸左旋咪唑、磷酸左旋咪唑中的至少一种。
术语“佐剂”是指当与抗原连同投与时,使受试者对这一抗原的免疫反应增强的化合物。
术语“铝胶”(Aluminium oxide)又称铝佐剂(Aluminum-containing adjuvants),包括氢氧化铝佐剂(Aluminium hydroxide adjuvant)和磷酸铝佐剂(Aluminiumphosphate)。所述铝胶还可以包括以下任一产品如 HPA(GeneralChemical,LLC)、M9400SP(J.M.Huber Corporation)、(Merck)、(Brenntag Biosector)、Aluminum hydroxide(Sigma-aldrich、Watson、Bisely&Company Pty Ltd.、Noah thchnologies corporation或CellMark USA,LLC)、氢氧化铝凝胶(内蒙古新宏生物科技有限公司)、20%氢氧化铝胶生理盐水(中牧实业股份有限公司)。
术语“左旋咪唑或其衍生物”包括左旋咪唑、左旋咪唑衍生物如盐酸左旋咪唑(Levamisole Hydrochloride)或磷酸左旋咪唑(Levamisole phosphate)中的至少一种;所述左旋咪唑(Levamisole,LMS)又称左咪唑(L-Tetramisol)或左旋四咪唑,为四咪唑的左旋光学异构体,是一种广谱驱虫药。所述左旋咪唑或其衍生物还可以包括以下任一产品如TotalonTM Topical Cattle Anthelmintic(Pitman-Moore,Inc.)、(Intervet,Inc.)、 (Schering-Plough)、(JanssenPharmaceuticals,Inc.)、Levamisole Hydrochloride(Bimeda,Inc.)、Plus(Fort Dodge Animal Health)、ProhibitTM Soluble Drench Power(Agri laboratories,Ltd.)、Levamisole phosphate(Agri laboratories,Ltd.)、Levamisole HydrochlorideSoluble Pig Wormer(Cross Vetpharm Group Ltd.)、左旋咪唑原料药(西安帅诺生物科技有限公司)、盐酸左旋咪唑(陕西汉江药业集团股份有限公司)、盐酸左旋咪唑注射液(广西南宁市桃源兽药厂)、左旋咪唑搽剂(参见中国专利CN1048399A)。
在本发明的一个优选实施方式中,所述佐剂还包括聚丙烯酸盐。
在本发明的一个优选实施方式中,所述聚丙烯酸盐包括聚丙烯酸钠、聚丙烯酸钾、聚丙烯酸钙。
在本发明的一个优选实施方式中,所述聚丙烯酸盐为聚丙烯酸钠。
术语“聚丙烯酸盐”包括但不限于聚丙烯酸钠、聚丙烯酸钾、聚丙烯酸钙,优选为聚丙烯酸钠;所述聚丙烯酸钠(Sodium polyacrylate或acrylic sodium salt polymer),别名2-丙烯酸纳均聚物、S聚丙烯酸钠,简称ASAP或PAA-Na,又称super-slurper,是水溶性高分子化合物,溶于水形成极粘稠的透明溶液。所述聚丙烯酸钠还可以包括以下任一产品如Sodium polyacrylate (Sigma-Aldrich、Flinn Scientific,Inc.、Kowa India Pvt.Ltd.、上海一基实业有限公司或湖北巨胜科技有限公司)、聚丙烯酸钠(参见中国专利CN104292375A、CN101423577A或CN1112380A)。
在本发明的一个优选实施方式中,所述佐剂中所述铝胶为5%-30%V/V,所述左旋咪唑或其衍生物为0.1-8mg/ml。
在本发明的一个优选实施方式中,所述佐剂中所述铝胶为8%-20%V/V,所述左旋咪唑或其衍生物为2-5mg/ml。
在本发明的一个优选实施方式中,所述佐剂中所述铝胶为5%-30%V/V,所述左旋咪唑或其衍生物为0.1-8mg/ml,所述聚丙烯酸盐为0.1-8mg/ml。
在本发明的一个优选实施方式中,所述佐剂中所述铝胶为8%-20%V/V,所述左旋咪唑或其衍生物为2-5mg/ml,所述聚丙烯酸盐为0.5-6mg/ml。
本发明的第二方面在于提供一种疫苗组合物,所述疫苗组合物含所述佐剂和免疫有效量的抗原。
在本发明的一个优选实施方式中,所述疫苗组合物中所述抗原为灭活的或亚单位抗原。
在本发明的一个优选实施方式中,所述疫苗组合物中所述佐剂包含所述铝胶为5%-30%V/V,所述左旋咪唑或其衍生物为0.1-8mg/ml。
在本发明的一个优选实施方式中,所述疫苗组合物中所述佐剂包含所述铝胶为8%-20%V/V,所述左旋咪唑或其衍生物为2-5mg/ml。
在本发明的一个优选实施方式中,所述疫苗组合物中所述佐剂包含所述铝胶为5%-30%V/V,所述左旋咪唑或其衍生物为0.1-8mg/ml,所述聚丙烯酸盐为0.1-8mg/ml。
在本发明的一个优选实施方式中,所述疫苗组合物中所述佐剂包含所述铝胶为8%-20%V/V,所述左旋咪唑或其衍生物为 2-5mg/ml,所述聚丙烯酸盐为0.5-6mg/ml。
术语“免疫有效量”又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量,为可在接受者体内有效诱导免疫原性应答的量。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验,或可能适合用于预防疾病的征兆或症状,包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估,或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估,而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。
术语“抗原”又称免疫原,是指任何刺激免疫应答的物质,是一种能够被抗体结合的分子,还能够诱导产生B-和/或T-细胞的体液免疫应答和/或细胞免疫应答,还具有一个或多个表位(B-和T-表位)。所述抗原包括杀死的、灭活的细菌、病毒或寄生虫,或其培养细胞制剂、上清液;还包括亚单位抗原,所述亚单位抗原为个别的或其任何组合的多核苷酸、多肽、重组蛋白质、合成的肽、蛋白质提取物、细胞、组织、多糖、脂质或其片段,亦包括抗体如抗受试者遗传型抗体或其片段以及可模拟抗原或抗原决定簇(表位)的合成肽模拟位mimotopes。其中,所述杀死的、灭活的细菌、病毒或寄生虫是指含有不再能够复制或生长的感染性生物体或病原体,病原体可通过各种方法包括冻融、化学处理(如用硫柳汞或福尔马林处理)、声处理、照射、热或任何其它足以阻止生物体复制或生长的常用方法来实现灭活而维持其免疫原性。
在本发明的一个优选实施方式中,所述抗原包括猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪繁殖与呼吸综合 征病毒抗原、猪细小病毒抗原、多杀巴斯德菌抗原、猪链球菌抗原、猪葡萄球菌抗原、支气管炎博德特菌抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、肠炎沙门氏菌抗原、猪红斑丹毒丝菌抗原、猪鼻支原体抗原、猪滑液支原体抗原、猪钩端螺旋体细菌抗原、猪呼吸道冠状病毒抗原、猪流行性腹泻病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪细环病毒抗原、猪巨细胞病毒抗原、猪肠病毒抗原、脑心肌炎病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪瘟病毒抗原中的一种或多种。
在本发明的一个优选实施方式中,所述抗原为猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌抗原中的一种或多种。
术语“猪圆环病毒抗原”是指含有至少一种猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)抗原形式的任何组合物,所述猪圆环病毒抗原可诱导、刺激或增强抵抗猪圆环病毒感染的免疫应答,所述抗原形式包括但不限于灭活的或亚单位的抗原。所述猪圆环病毒抗原包含SH株(保藏号为CGMCC No.23890,参见中国专利CN101240264A)、SD株(保藏号为CGMCCNo.7707,参见中国专利CN103421748A)、D株(保藏号为CGMCC No.7245,参见中国专利CN103275938A)、WH株(保藏号为CCTCC No.V201333,参见中国专利CN103409374A)、ZJ/H株(保藏号为CGMCC No.6391,参见中国专利CN102787100A)、DBN-SX07株(保藏号为CGMCCNo.3064,参见中国专利CN101549155A)、V201312株(保藏号为CCTCC No.V201312,参见中国专利CN103436498A),还可以包含以下组合物的任一种抗原如梅里亚公司Merial的、辉瑞公司Pfizer的PCV2、哈尔滨维科生物技术开发公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)、浙江诺倍威生物技术有限公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(ZJ/C株)、勃林格殷格翰公司Boehringer-Ingelheim的Ingelvac
术语“猪肺炎支原体抗原”是指含有至少一种猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)抗原形式的任何组合物,所述猪肺炎支原体抗原可诱导、刺激或增强抵抗猪肺炎支原体感染的免疫应答,所述抗原形式包括但不限于灭活的或亚单位的抗原,或其培养上清液。所述猪肺炎支原体抗原包含HN0613株(保藏号为CCTCC No.M2012230,参见中国专利CN103083655A)、J株(购自美国典型培养物保藏中心ATCC,ATCC编号为25934)、NJ株(保藏号为CCTCC No.M2012286,参见中国专利CN103585622A)、HDZK-Mhp57株(保藏号为CGMCC No.8096,参见中国专利CN103484414A)、AN306株(保藏号为CCTCC No.M2012431,参见中国专利CN103740625A)、DJ-166株(保藏号为CGMCC No.4545,参见中国专利CN103184171A)和NM04/41259株(保藏号为NM04/41259株,参见中国专利CN102458462A),还可以包含以下组合物的任一种抗原如哈药集团公司的瑞倍适Respisure和瑞倍适-旺RespisureOne、英特威公司的安百克M+PAC、勃林格殷格翰公司的M.hyo、美国普泰克公司的MycoGard、美国辉瑞公司的RespiFend MH、硕腾(上海)动物保健品有限公司的瑞富特-旺Suvaxyn MH-one、梅里亚动物保健公司的猪克喘SprintVac、海博莱公司的喜宜丰Mypravac Suis。
术语“副猪嗜血杆菌抗原”是指含有至少一种副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)抗原形式的任何组合物,所述副猪嗜血杆菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗副猪嗜血杆菌感染的免疫应答,所述抗原形式包括但不限于灭活的或亚单位的抗原,或其培养上清液。所述副猪嗜血杆菌抗原包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株,包含目前已鉴定的1-15个血清型或无法测定血清型的副猪嗜血杆菌,包含至少两个血清型的混合抗 原如4型(如JS株,保藏号为CCTCC No.M2011172,参见中国专利CN103083655A)和5型(如ZJ株,保藏号为CCTCC No.M2011173,参见中国专利CN103083655A)的混合抗原,还可以包含以下组合物的任一种抗原如勃林格殷格翰公司的Ingelvac HP-1、海博莱公司Hipra的Hiprasuis-Glasser、中牧实业股份有限公司成都药械厂和武汉科前动物生物制品有限责任公司的副猪嗜血杆菌灭活疫苗(4型MD0322株+5型SHO165株)。
术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物,即小猪(piglets),swine,pigs,porcine,大母猪(sows),小母猪(gilts),barrows,公猪(boars)以及猪科的成员。
本发明第三方面在于提供所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗的药物中的应用。
术语“预防和/或治疗”在涉及细菌、病毒或寄生虫感染时是指抑制细菌、病毒或寄生虫的复制、抑制细菌、病毒或寄生虫的传播或防止细菌、病毒或寄生虫在其宿主体内定居,以及减轻细菌、病毒或寄生虫感染所之疾病或病症的症状。若细菌、病毒或寄生虫荷载量减少、感染症状减轻和/或摄食量和/或生长增加,那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
本发明的第四方面在于提供所述佐剂在制备蛋白稳定液中的应用。
术语“蛋白”包括化学合成的蛋白、培养细胞的基因编码的天然合成的蛋白以及由细胞分泌的重组蛋白。所述重组蛋白是由分子生物技术引入细胞的转基因编码的那些,可通过化学方法或翻译后过程中的酶进行修饰。所述蛋白包括动物蛋白,是通过细胞培养产生的那些,也包括其他来源例如昆虫、细菌、植物等表达的蛋白,以及突变的、人工的、合成的、融合的或嵌合的蛋白。根据本发明,所述蛋白包括但不限于兔病毒性出血症病毒RHDV的VP60蛋白,犬细小病毒PPV的VP2蛋白,猪圆环病毒PCV2 的Cap、Rep蛋白,猪肺炎支原体的P46、P65、NrdF、P97R1、P102、PdhA、XylF、P78、EutD、Mhp145、P132、Mhp389蛋白,副猪嗜血杆菌HPS的PilA、OMP、HbpA、OppA、PalA蛋白,猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的Nsp2、GP3、GP4、GP5、M、N蛋白,猪细小病毒PPV的VP2蛋白,多杀巴斯德菌P.multocide的hyaE蛋白,猪链球菌S.suis的38KDa、SaoA、MRP、HM6、GAPDH、Omp40、VirB4、SLY蛋白,猪葡萄球菌S,hyicus的ExhA、ExhB、ExhC、ExhD蛋白,支气管炎博德特菌Bb的P68蛋白,大叶性肺炎放线杆菌APP的Omp20、OmpW、Omp27、Omp27、OmpA1和OmpA2蛋白,大肠杆菌E.coli的K88、K99、987P、F41、F17、LTB、Orf353、TolC蛋白,猪萎缩性鼻炎AR的PMT,猪伪狂犬病毒PRV的gB、gC、gD、gE,肠炎沙门氏菌S.enteria的Hfq蛋白,猪红斑丹毒丝菌E.rhusiopathiae的SpaA、Lipo蛋白,猪鼻支原体Mhr的P37蛋白,猪呼吸道冠状病毒PRCV的S、N蛋白,猪流行性腹泻病毒PEDV的S、M、N蛋白,猪轮状病毒PRV的VP4、VP6、VP7蛋白,猪传染性胃肠炎病毒TGEV的S、M、N蛋白,猪细环病毒TTSuV的Cap蛋白,猪巨细胞病毒PCMV的gB蛋白,猪脑心肌炎病毒EMCV的VP1、VP2、3AB蛋白,猪流感病毒的HA、NP、NA、M、NS蛋白,猪瘟病毒CSFV的E0、E1、E2蛋白中的一种或多种。
术语“蛋白稳定液”是指使免疫原性蛋白成分的稳定性得以显著改善,在制备过程中和适当条件下长期(例如数月至数年)优选地超过12个月(例如24个月或30个月)保存后,保持蛋白原有分子量、结构和/或生物活性的至少80%优选至少90%不变,保持蛋白生物稳定性、物理稳定性、化学稳定性,不会形成化学降解产物,不会发生不可逆变化(例如聚集、沉淀或变性)。所述化学降解产物与天然蛋白结构相比具有潜在的更低生物效价和/或潜在的更低免疫原性。
本发明具有以下突出的优点:
(1)所述佐剂具有成本低廉、使用方便、免疫活性强等优点,既能使动物机体产生体液免疫又能提供细胞免疫,免疫持续时间长,并且在抗原含量较低、单次免疫时也能使动物获得较好的免疫应答水平,且无副反应发生;
(2)所述佐剂冻存也不变性,可用作蛋白稳定液保存蛋白,使蛋白稳定不降解或不发生不可逆变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中猪圆环病毒抗原以灭活的猪圆环病毒2型SH株,猪肺炎支原体抗原以灭活的猪肺炎支原体HN0613株,副猪嗜血杆菌抗原以灭活的4型副猪嗜血杆菌JS株和5型副猪嗜血杆菌ZJ株为例进行阐述,但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明实施例中肺病变指数采用28分法进行评判。所述28分法是根据猪支原体肺炎的典型肺部眼观病变,对发病程度进行量化判定,包括肺尖叶、心叶、膈叶、中间叶出现的实质样病变,如“肉样变”、“胰样变”。肺炎病变评分标准为:2个尖叶、2个心叶、2个膈叶、1个中间叶共计7个肺叶,每个肺叶满分为4分,共计28分。根据发生实质病变的肺叶面积所占该叶的比例,分别对每个肺叶进行打分。无肺炎病变记为0分;病变面积比例为1%-25%,记为1分;病变面积比例26%-50%,记为2分;病 变面积比例为51%-75%,记为3分;病变面积比例为76%-100%,记为4分。如肺叶正反两面均有病变,以病变面积大的一面进行记分。各个肺叶打分总和即为该发病株的肺炎病变得分。分别对免疫组猪和对照组猪进行记分后,按照以下公式计算免疫组猪的肺叶病变减少率:
本发明实施例统计分析方法为:统计7个肺叶的肺病变指数,确定病变程度。用SPSS计算机软件进行ANOVA分析,比较各组间差异,确定病变差异的有效性。
本发明中所用的pH7.2PBS溶液配方为:1000ml蒸馏水中加入NaCl 9g、Na2HPO4·12H2O 6g、NaH2PO4·2H2O 0.4g,经121℃高压灭菌30分钟后使用,但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明中所用到的化学试剂均为分析纯,购自国药集团,但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
为使本发明更加容易理解,下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法,若无特殊说明,均为常规方法;所述的生物材料,若无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1抗原的制备
1.1猪圆环病毒抗原的制备
按照中国专利CN103083655A制备猪圆环病毒2型SH株病毒液及测定病毒液含量,结果:猪圆环病毒2型SH株的含量为5×106.0TCID50/ml;并对病毒液进行灭活及用间接免疫荧光法IFA检测灭活效果,结果:无绿色PCV2阳性细胞产生,表明猪圆环病毒2型SH株病毒液灭活成功。
1.2猪肺炎支原体抗原的制备
按照中国专利CN103083655A进行制备猪肺炎支原体HN0613株菌液及测定菌液的含量,结果:猪肺炎支原体HN0613株的含量为1×109CCU/ml;并对菌液进行灭活及检验,结果:培养基着色未发生变化,培养基pH值不降低,表明猪肺炎支原体HN0613株菌液灭活成功。
1.3副猪嗜血杆菌抗原的制备
按照中国专利CN103083655A分别制备副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株菌液及测定菌液含量,结果:副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株的含量均为5×109CFU/ml;并对菌液进行灭活及检验,结果:平皿中无任何细菌生长,表明副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株菌液灭活均成功。
实施例2佐剂的制备
左旋咪唑母液:将购自西安帅诺生物科技有限公司的左旋咪唑原料药加热溶解成40mg/ml溶液,并进行过滤除菌,即得40mg/ml左旋咪唑母液。
聚丙烯酸钠母液:将购自上海一基实业有限公司的1g聚丙烯酸钠与100蒸馏水混合,加热煮沸直到完全溶解,然后冷却至室温,即配置成浓度为10mg/ml的聚丙烯酸钠母液,并于121℃高压灭菌30分钟后备用。
实施例3灭活疫苗组合物的制备及动物试验
3.1灭活疫苗组合物的制备
将实施例1制备的抗原、实施例2制备的佐剂使用PBS溶液稀释,使稀释后的各抗原溶液与佐剂终浓度按表1中灭活的疫苗组合 物所含组分混合,以500-800转/分钟的转速搅拌10-15分钟,在终止搅拌前加入1%V/V的硫柳汞(购自国药集团化学试剂有限公司)溶液,使其终浓度不超过万分之一,充分振荡混匀、分装,分装后2-8℃保存备用。
3.2灭活疫苗组合物之猪圆环病毒抗原的动物试验
将实施例3.1所制备的疫苗A1、A2、A3、A6、A7、A9、B1、B2、B3、B6、B7、B9以及参考疫苗对照组(PCV2疫苗,由普莱柯生物工程股份有限公司生产)分别颈部肌肉注射免疫14-21日龄仔猪(排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型和猪瘟),5头/组,2ml/头,同时设置空白对照组,共14组(共70头仔猪)。免疫接种后21天、35天、60天、90天对每头猪采血,收集血清,保存在-20℃直到测试。
按照血清学方法对猪圆环病毒抗原部分的免疫效果进行评价,具体为:
(1)ELISA抗体检测用大肠杆菌表达的PCV2ORF2蛋白(按照中国专利CN101101296A制备)作为抗原,通过方阵滴定试验确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板,100μl/孔,后4℃包被过夜;洗涤3次,每次3-5分钟;每孔加200μl的0.15%M/V BSA封闭液封闭板子,37℃作用2小时;洗涤;将待检血清用PBS倍比稀释,每个样品一行,每孔加100μ1,37℃作用1h;洗涤;然后加入酶标的SPA(1:10000倍稀释),100μl/孔,37℃作用1h;洗涤;加底物液TMB显色,最后用2mol/L的H2SO4终止反应。结果判定:待检血清OD450值/阴性血清OD450值≥2.1为阳性。
(2)血清中和试验采用固定病毒稀释血清法。待检血清56℃加热30分钟,10000转/分钟离心5分钟,小心吸出上清,做1:2稀释后进行倍比稀释;分别与等量PCV2病毒液混合,37℃1h,接种于含单层PK15细胞的96孔板内,100μ1/孔,每一稀释度接种4孔,同时设细胞对照和病毒对照孔。37℃培养12h,用300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理,37℃继续培养48h,80%丙酮固定细胞,用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数。以能够抑制50%特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价,并计算每组平均值。
血清学评价结果见表2。
表2 灭活疫苗组合物之猪圆环病毒抗原的血清学评价结果
注:参考疫苗对照组所用的PCV2疫苗由普莱柯生物工程股份有限公司生产,抗原含量为107.0TCID50/ml,按厂家说明书进行两次免疫。
由表2可知:1-3组、7-9组同一含量的PCV2抗原(单苗)不同佐剂含量时,免疫后所产生的抗体随佐剂含量的增大而略升高,且与高抗原含量的PCV2参考单苗所产生的抗体一致甚至更高,并能持续至少60天;4-6组、10-12组含相同含量佐剂的PCV2联苗免疫后所产生的抗体比PCV2参考单苗所产生的抗体更高,并能持续至少60天。表明疫苗A1、A2、A3、A6、A7、A9、B1、B2、B3、B6、B7、B9分别免疫动物后能刺激机体产生PCV2特异性抵抗力,效果确实,并且疫苗A6、A7、A9、B6、B7、B9之其他抗原对PCV2抗原的免疫效果无影响;并且疫苗组合物中佐剂含铝胶、左旋咪唑、聚丙烯酸钠的免疫效果优于含铝胶、左旋咪唑的。
3.3灭活疫苗组合物之猪肺炎支原体抗原的动物试验
将实施例3.1所制备的疫苗组合物A4、A6、A8、A9、B4、B6、B8、B9,分别颈部肌肉注射免疫14-21日龄仔猪(排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环2型和猪瘟),5头/组,2ml/头,同时设置参考疫苗对照组、攻毒对照组,共10组(共50头仔猪)。免疫接种后观察体温、副反应至28日,并于28日按照猪肺炎支原体抗体检测试剂盒(购自IDEXX)说明书进行抗体检测,结果见表3;同时对所有猪气管注射猪肺炎支原体济南系强毒CVCC354株(保藏号为CVCC354,保藏单位为国家兽医微生物菌种保藏管理中心),100MID50/头,观察28天后解剖,并观察肺部病变,按照28分法对肺部病变进行评分。攻毒前后,分别对试验组仔猪进行称重,并计算平均日增重。
攻毒后大约10天左右,攻毒对照组其中4头猪陆续出现咳嗽、 气喘等症状,皮毛不光滑;参考疫苗对照组有1头猪出现了咳嗽的症状、并发生了副反应;其他免疫组的猪未出现气喘病的类似症状。攻毒前后,各试验组猪的肺炎病变平均得分和平均日增重结果见表3。
表3 灭活疫苗组合物之猪肺炎支原体抗原的动物试验结果
注1:参考疫苗对照组所选用的疫苗为现有产品中的猪支原体肺炎灭活疫苗(J株),即安百克(M+PAC),按厂家说明书进行免疫。
注2:体温“无”表明未发生一过性体温升高,“有”表明发生一过性体温升高,其中一过性体温升高是指于二免疫后第1-2天体温会短暂呈现40.5度,并于第3天恢复正常体温。
注3:副反应“无”表明未发生过副反应,“有”表明发生过副反应,其中副反应是指出现过短暂性精神沉郁、食欲减退、过敏反应中的至少一种。
注4:差异性统计分析中,组间比较,字母相同者表示差异不显著,字母不同者表示差异显著(p<0.05)。
由表3可知:1-4组、5-8组分别使用含猪肺炎支原体抗原和同样含量佐剂的单苗或联苗进行免疫,免疫后的血清抗体表明含铝胶、左旋咪唑佐剂的自制疫苗及含铝胶、左旋咪唑、聚丙烯酸钠佐剂的自制疫苗的抗体水平均高于参考疫苗的,且含铝胶、左旋咪唑、聚丙烯酸钠佐剂的高于含铝胶、左旋咪唑佐剂的;之后进行攻毒,结果显示1-4组、5-8组免疫猪均未发生一过性体温升高,也未出现副反应,并且肺炎病变减少率分别均>73%、>84%,平均日增重分别为0.0411-0.0414kg、0.0421-0.0423kg,虽1-4组各小组、5-8各小组之间差异不显著(p>0.05),但1-4组与5-8组相比差异均显著(p<0.05);与参考疫苗对照组相比,差异也均显著(p<0.05);与攻毒对照组相比,差异也均显著(p<0.05)。表明疫苗组合物中佐剂含铝胶、左旋咪唑、聚丙烯酸钠的免疫效果显著优于含铝胶、左旋咪唑的。
3.4灭活疫苗组合物之副猪嗜血杆菌抗原的动物试验
将实施例3.1所制备的疫苗组合物A5、A7、A8、A9、B5、B7、B8、B9,分别颈部肌肉注射免疫14-21日龄仔猪(排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环2型和猪瘟),5头/组,2ml/头,同时设置参考疫苗对照组、攻毒对照组,共10组(命名为1、2、3、4、5、6、7、8、参考疫苗对照组1、攻毒对照组1);同时做重复试验,共10组(命名为11、12、13、14、15、16、17、18、参考疫苗对照组2、攻毒对照组2),详见表4。
免疫接种后28天时用副猪嗜血杆菌抗体检测试剂盒(购自Biovet)进行抗体检测,同时进行攻毒,前10组用副猪嗜血杆菌4型腹腔注射3ml进行攻毒,攻毒剂量为9.0×109CFU/头;后10组用副猪嗜血杆菌5型腹腔注射3ml进行攻毒,攻毒剂量为6.0×109CFU/头,攻毒后观察各组猪临床表现,观察14天后剖杀进行病理观察。攻毒前后分别对试验组仔猪进行称重,以计算平均日增重。
表4 灭活疫苗组合物之副猪嗜血杆菌抗原的动物试验结果
注1:参考疫苗对照组所用副猪嗜血杆菌病灭活疫苗为中牧实业股份有限公司成都药械厂生产的,抗原含量为4.0×109CFU/头份,按照厂家说明书进行两次免疫。
注2:差异性统计分析中,组间比较,字母相同者表示差异不显著,字母不同者表示差异显著(p<0.05)。
由表4可知:1-4与5-8组、11-14与15-18组使用含副猪嗜血杆菌抗原和同样含量佐剂的单苗或联苗进行免疫,免疫后的血清抗体表明含铝胶、左旋咪唑佐剂的自制疫苗及含铝胶、左旋咪唑、聚丙烯酸钠佐剂的自制疫苗抗体水平高于参考疫苗的,且含铝胶、左旋咪唑、聚丙烯酸钠佐剂的高于含铝胶、左旋咪唑佐剂的;之后进行攻毒,结果显示1-4与5-8组、11-14与15-18组免疫猪均获得完全保护,平均日增重为0.0311-0.0342kg,1-4、5-8、11-14、15-18各小组之间差异不显著(p>0.05),而1-4组与5-8组相比差异显著(p<0.05)、11-14与15-18组相比差异显著(p<0.05);与参考疫苗对照组相比,抗原含量低还能使免疫保护效率高,并且平均日增重差异均显著(p<0.05);与攻毒对照组相比,平均日增重差异均显著(p<0.05)。表明疫苗组合物中含铝胶、左旋咪唑、聚丙烯酸钠佐剂的免疫效果显著优于含铝胶、左旋咪唑佐剂的。
实施例4蛋白稳定液的应用
4.1RHDV VP60蛋白稳定性研究
按照中国专利CN103555766A中所描述的方法制备兔出血症病毒(Rbabbithemorrhagic disease virus,RHDV)的免疫原性VP60蛋 白,对表达后的VP60蛋白进行鉴定确认无疑后进行纯化,并用人的O型红细胞的凝集价进行检测,检测结果表明VP60蛋白的血凝价HA为1:217。
将实施例2制备的佐剂各成分即铝胶、左旋咪唑、聚丙烯酸钠母液用以制备VP60蛋白稳定液,用PBS稀释制备RHDV VP60蛋白溶液(溶液1-2),使各组分终浓度为:VP60HA为1:214,铝胶为10%V/V,左旋咪唑为4mg/ml。同时,制备溶液3-4使各组分终浓度为:VP60HA为1:214,铝胶为10%V/V,左旋咪唑为4mg/ml,聚丙烯酸钠为4mg/ml。取同样剂量的RHDV VP60蛋白溶液各2份在2-8℃分别存放6、12、18、24、30、36个月,并用PBS稀释的VP60蛋白溶液2份做对照,对不同保存条件下的蛋白溶液进行血凝检测,结果见表5。
表5 RHDV VP60蛋白稳定性试验结果
由表5可知:含铝胶、左旋咪唑的溶液作为RHDV VP60蛋白稳定液使VP60蛋白稳定至少24个月,含铝胶、左旋咪唑、聚丙烯酸钠的溶液作为RHDV VP60蛋白稳定液使VP60蛋白稳定至少30个月,而以PBS作为保存溶液的对照组HA随时间的延长而逐渐降低,表明蛋白出现了一定程度的降解或发生了不可逆变化。
4.2PCV2Cap蛋白稳定性研究
按照中国专利CN104017813A中所描述的方法制备猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus type 2,PCV2)的免疫原性Cap蛋白,对表达后的Cap蛋白进行鉴定确认无疑后进行纯化,按照BCA蛋白定量试剂盒(购自Merck公司)说明书的方法定量Cap蛋白的浓度,结果表明:Cap蛋白的浓度为2mg/ml。
将实施例2制备的佐剂各成分即铝胶、左旋咪唑母液、用以制备Cap蛋白稳定液,用PBS稀释制备PCV2Cap蛋白溶液1-2,使各组分终浓度为:Cap蛋白浓度为0.40mg/ml,铝胶为10%V/V,左旋咪唑为4mg/ml。同时制备溶液3-4使各组分终浓度为:Cap蛋白浓度为0.40mg/ml,铝胶为10%V/V,左旋咪唑为4mg/ml,聚丙烯酸钠为4mg/ml。
取同样剂量的PCV2Cap蛋白溶液各2份在2-8℃分别存放6、12、18、24、30、36个月,并用PBS稀释的Cap蛋白溶液2份做对照,对不同保存条件下的蛋白溶液分别进行BCA测定,结果见表6。
表6 PCV2Cap蛋白稳定性试验结果
由表6可知:含铝胶、左旋咪唑的溶液作为PCV2Cap蛋白稳定液,使Cap蛋白稳定至少24个月,含铝胶、左旋咪唑、聚丙烯酸钠的溶液作为PCV2Cap蛋白稳定液,使Cap蛋白稳定至少30个月,而以PBS作为保存溶液的对照组中Cap蛋白的浓度随保存时间的延长而逐渐降低,蛋白出现了一定程度的降解或发生了不可逆变化。
综上所述,含铝胶、左旋咪唑、聚丙烯酸钠佐剂的疫苗组合物的免疫效果显著优于含铝胶、左旋咪唑佐剂的,这些疫苗组合物(1)免疫动物后的免疫应答水平随佐剂含量的增加而升高,且与现有商品化疫苗的免疫应答水平相当甚至较高,抗体持续时间也较长,效果确实;(2)在抗原含量较低时也能使动物获得较好的免疫效果,免疫次数少使猪的应激反应减少甚至无,且无副反应发生;(3)所含佐剂冻存也不变性,可作为蛋白稳定液使用,使蛋白稳定不降解或不发生了不可逆变化。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已,并非对本发明做任何形式上的限制,虽然本发明已以优选实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发 明技术方案的范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (4)
1.疫苗用佐剂在制备增强灭活抗原免疫应答的疫苗中的应用,其特征在于,所述佐剂由铝胶、左旋咪唑组成,铝胶为5%V/V,左旋咪唑为0.1mg/ml;或
铝胶为10%V/V,左旋咪唑为4mg/ml;或
铝胶为30%V/V,左旋咪唑为8mg/ml;
其中,所述疫苗含猪圆环病毒灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原中的一种或多种抗原。
2.疫苗用佐剂在制备增强灭活抗原免疫应答的疫苗中的应用,其特征在于,所述佐剂由铝胶、左旋咪唑、聚丙烯酸盐组成,所述聚丙烯酸盐为聚丙烯酸钠,铝胶为5%V/V,左旋咪唑为0.1mg/ml,聚丙烯酸钠为0.1mg/ml;或
铝胶为10%V/V,左旋咪唑为4mg/ml,聚丙烯酸钠为4mg/ml;或
铝胶为30%V/V,左旋咪唑为8mg/ml,聚丙烯酸钠为8mg/ml;
其中,所述疫苗含猪圆环病毒灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原中的一种或多种抗原。
3.根据权利要求2所述应用,其特征在于,所述猪圆环病毒灭活抗原为猪圆环病毒SH株灭活抗原,
所述猪肺炎支原体灭活抗原为猪肺炎支原体HN0613株灭活抗原,
所述副猪嗜血杆菌灭活抗原为副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株的混合灭活抗原;
所述猪圆环病毒SH株保藏号为CGMCC No.2389,所述猪肺炎支原体HN0613株保藏号为CCTCC No. M2012230,所述副猪嗜血杆菌4型JS株保藏号为CCTCC No.M2011172,所述副猪嗜血杆菌5型ZJ株保藏号为CCTCC No.M2011173。
4.一种佐剂在制备蛋白稳定液中的应用,其中,所述佐剂由铝胶、左旋咪唑组成,铝胶为10%V/V,左旋咪唑为4mg/ml;或所述佐剂由铝胶、左旋咪唑、聚丙烯酸钠组成,铝胶为10%V/V,左旋咪唑为4mg/ml,聚丙烯酸钠为4mg/ml;其中,所述蛋白为兔病毒性出血症病毒RHDV的VP60蛋白,或猪圆环病毒PCV2的Cap蛋白。
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