CN110404065B

CN110404065B - 一种猪用佐剂组合物及其制备方法

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Publication number: CN110404065B
Application number: CN201810395104.5A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 闫张若平; 张许科
Original assignee: Luoyang Seiwei Biotechnologies Co ltd
Current assignee: Luoyang Seiwei Biotechnologies Co ltd
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2018-04-27
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2038-04-27
Also published as: CN110404065A

Abstract

本发明涉及一种猪用佐剂组合物以及含有该佐剂组合物的疫苗，该猪用佐剂组合物包括维生素E和/或HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和丙烯酸聚合物。该猪用佐剂组合物具有较好的免疫活性，稳定性良好，可实现大规模生产，克服了注射时的副反应与油佐剂残留造成的生物安全风险。

Description

一种猪用佐剂组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及佐剂组合物。

背景技术

免疫佐剂(immunologic adjuvant)是制备蛋白类灭活疫苗的重要组成成份，能提高抗原(免疫原)的免疫原性和免疫反应的可持续性，引导机体的免疫系统对抗原产生体液免疫或细胞免疫反应。佐剂的作用主要包括：①免疫调节作用。②抗原提呈作用。③抗原贮存作用。④靶向作用。⑤诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)应答。选择合适的佐剂是提高动物疫苗免疫活性的关键因素。目前，我国猪用灭活疫苗主要用油包水体系制备而成。油包水体系佐剂制备的疫苗具有较强的免疫效果，但是具有较强的副作用，特别是皮下注射时在注射部位会引起强烈的炎症和溃疡，油佐剂的残留液液存在生物安全风险。另外，由于某些活疫苗本身免疫刺激能力不够强，或在特定条件下其能力不足以激发机体产生有效应答，仍需要借助佐剂辅助提高免疫效力，而经典的油包水型佐剂会对菌体细胞膜造成溶解破坏，而不能用于活疫苗的研发。因此，以水为连续相的佐剂和水性佐剂的研发极为紧迫。其中，以水为连续相的水包油佐剂受到了研究者的关注。但是，个别水包油佐剂制备时包封不好，油相外露，会对疫苗毒性造成一定影响；且水油易分层，在稳定性方面存在隐患。水性佐剂安全性好、副反应少，但目前水佐剂主要依赖国外进口，成本昂贵，我国缺乏拥有自主知识产权的免疫活性好、稳定性佳、能够实现商品化生产的水佐剂。

专利CN107375922A发明了一种水溶性复合免疫佐剂，其中含有卡波姆、氢氧化钠、副猪嗜血杆菌莱膜多糖、(副猪嗜血杆菌)蛋白OMP、生育酚、副猪嗜血杆菌DNA，由其制成的猪圆环病毒疫苗具有较好的免疫活性。论文“不同水性及水包油型佐剂对猪支原体肺炎灭活疫苗的免疫增强作用”解海东等介绍了一种水佐剂，其在卡波姆中添加左旋咪唑混合物、黄芪多糖、壳聚糖、免疫刺激复合物基质混合物等，制得的疫苗组合物可增加细胞及体液免疫应答，为猪支原体肺炎灭活疫苗的佐剂研发提供了数据基础。但是，上述水佐剂成分复杂，成本较高，稳定性较差，不易实现工业上的大规模生产使用。

发明内容

为克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种猪用佐剂组合物，其中，所述猪用佐剂组合物包括维生素E和/或HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和丙烯酸聚合物。

本发明所述的猪用免疫佐剂组合物具有与油佐剂相同或相当的增强免疫效力的作用，且均为水佐剂组分，避免了传统油佐剂带来疫苗注射对动物产生的副作用问题。本发明的所述的猪用免疫佐剂组合物制备过程简单，易于在产业上推广。

本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括抗原和所述佐剂组合物。

本发明的疫苗组合物其不含油佐剂，降低了由油佐剂引发的安全隐患，且免疫效力与使用油佐剂的疫苗相同或相当。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

本发明涉及一种禽用佐剂组合物，其中，所述禽用佐剂组合物包括维生素E和/或HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和丙烯酸聚合物。

术语“佐剂”是指当连同抗原投与时，使受试者对这一抗原的免疫反应增强的化合物。佐剂介导的免疫反应增强可通过所属技术领域中已知的任何方法评估，包括(不限于)以下一种或多种方法：(i)与对单独抗原免疫作用起反应所产生的抗体数相比，对佐剂/抗原组合免疫作用起反应所产生的抗体数增加；(ii)识别抗原或佐剂的T细胞数增加；(iii)一种或多种I型细胞因子的含量增加；和(iv)活激发之后，体内(in vivo)的保护作用。与经单独抗原激发的受试者相比，当受试者经抗原与佐剂激发时，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数(例如抗体效价或T细胞产生增加至少10％，则认为免疫反应增强。在本发明的某些实施例中，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数增加至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少225％、至少250％、至少275％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％或至少1000％，则免疫反应增强。

如本文所述“HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物”：是指蔗糖与脂肪酸经过酯化反应所得的混合物，蔗糖有8个-OH基团，可以与脂肪酸反应形成不同HLB值的蔗糖脂肪酸酯组合物，本发明所述的脂肪酸酯优选碳原子为8-28的脂肪酸，可以举例，辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、花生四烯酸。HLB值为5以下的蔗糖脂肪酸酯组合物可以举例商品化的，例如日本三菱Ryoto蔗糖酯，可以选择的型号，L195，蔗糖酯的月桂酸组合物，其HLB值为1，L595，蔗糖酯的月桂酸组合物，其HLB值5；蔗糖酯s170，蔗糖酯的硬脂酸组合物其HLB值为1，中国对应的蔗糖酯型号为SE-1，蔗糖酯s370，蔗糖酯的硬脂酸组合物其HLB值为3s，中国对应的蔗糖酯型号为SE-3，蔗糖酯s570，蔗糖酯的硬脂酸组合物其HLB值为5，中国对应的蔗糖酯型号为SE-5。

术语“HLB值(Hydrophile-Lipophile Balance Number)”称亲水疏水平衡值，也称水油度。表面活性剂为具有亲水基团和亲油基团的两亲分子，HLB值是表面活性剂分子中亲水基和亲油基之间的大小和力量平衡程度的量，也称为表面活性剂的亲水亲油平衡值。

聚氧乙烯氢化蓖麻油又称为氢化蓖麻油聚氧乙烯醚、乙氧基化氢化蓖麻油、PEG-n氢化蓖麻油，包括氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-11、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-20、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-30、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-50、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-60、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-75、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-80、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-100；聚氧乙烯氢化蓖麻油可以举例商品化的，例如BASF的Cremophor RH40、Cremophor RH20或Cremophor RH60其组合，其包括了结构相同但不同商品名的类似物。

“丙烯酸系聚合物”是指含有丙烯酸系部分的任何聚合物或共聚物。示范性丙烯酸系聚合物包括例如聚丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、丙烯腈和聚丙烯酸的烷基酯。丙烯酸系共聚物的实例包括例如聚丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸-甲基丙烯酸、丙烯酸-丙烯酰胺和聚甲基丙烯酸酯。市售丙烯酸系聚合物的实例包括卡波姆，它是在所属技术领域中通常还指并且已知是与聚烯丙基蔗糖交联的丙烯酸的水溶性聚合物。

本发明的猪用水佐剂，具有与油佐剂相同或相当的增强免疫效力的作用，且均为水佐剂组分，避免了传统油佐剂带来疫苗注射对动物产生的刺激问题及油佐剂成分残留引起的生物安全风险。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪用佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物为碳原子为8-28的脂肪酸酯。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪用佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯选自蔗糖辛酸酯、蔗糖癸酸酯、蔗糖月桂酸酯、蔗糖肉豆蔻酸酯、蔗糖硬脂酸酯、蔗糖油酸酯、或蔗糖花生四烯酸酯。

作为本发明的一种进一步优选的实施方式，本发明所述的猪用佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯为日本三菱Ryoto蔗糖酯L195、L595、蔗糖酯s170、蔗糖酯SE-1，蔗糖酯s370、蔗糖酯SE-3，蔗糖酯s570、或蔗糖酯SE-5。

作为本发明的一种进一步优选的实施方式，本发明所述的猪用佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯选自HLB为1的蔗糖酯的月桂酸组合物、HLB为5的蔗糖酯的月桂酸组合物、HLB为1的蔗糖酯的硬脂酸组合物、HLB为的蔗糖酯的硬脂酸组合物、或HLB为5的蔗糖酯的硬脂酸组合物。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪用佐剂组合物中，聚氧乙烯氢化蓖麻油为氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-11、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-20、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-30、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-50、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-60、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-75、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-80、或氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-100。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪用佐剂组合物中，聚氧乙烯氢化蓖麻油为BASF的Cremophor RH40、Cremophor RH20或Cremophor RH60或其组合。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪用佐剂组合物中，丙烯酸聚合物为聚丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸-甲基丙烯酸、丙烯酸-丙烯酰胺或聚甲基丙烯酸酯。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪用佐剂组合物中，丙烯酸系聚合物为卡波姆。

HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物的浓度范围为0.25％W/V-10.0％W/V，优选1.0％W/V-5％W/V。蔗糖脂肪酸酯组合物与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例为1:0.1-1:1.8，优选1:1-1:1.75。

HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物的浓度可以任意选自0.25％W/V、0.30％W/V、0.35％W/V、0.40％W/V、0.45％W/V、0.50％W/V、0.55％W/V、0.60％W/V、0.65％W/V、0.70％W/V、0.75％W/V、0.80％W/V、0.85％W/V、0.90％W/V、0.95％W/V、1.0％W/V、1.5％W/V、2.0％W/V、2.5％W/V、3.0％W/V、3.5％W/V、4.0％W/V、4.5％W/V、5.0％W/V、5.5％W/V、6.0％W/V、6.5％W/V、7.0％W/V、7.5％W/V、8.0％W/V、8.5％W/V、9.0％W/V、9.5％W/V、10.0％W/V。

蔗糖脂肪酸酯组合物与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例可以任意选自1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.15、1:1.2、1:1.25、1:1.3、1:1.35、1:1.4、1:1.45、1:1.5、1:1.55、1:1.6、1:1.65、1:1.7、1:1.75、1:1.8。

维生素E的浓度范围为0.25％W/V-10.0％W/V，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物的浓度范围为0.25％W/V-10.0％W/V优选1.0％W/V-5％W/V维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例为1:0.1-1:1.8，优选1:1-1:1.75。

维生素E的浓度可以任意选自0.25％W/V、0.30％W/V、0.35％W/V、0.40％W/V、0.45％W/V、0.45％W/V、0.50％W/V、0.55％W/V、0.60％W/V、0.65％W/V、0.70％W/V、0.75％W/V、0.80％W/V、0.85％W/V、0.90％W/V、0.95％W/V、1.0％W/V、1.5％W/V、2.0％W/V、2.5％W/V、3.0％W/V、3.5％W/V、4.0％W/V、4.5％W/V、5.0％W/V、5.5％W/V、6.0％W/V、6.5％W/V、7.0％W/V、7.5％W/V、8.0％W/V、8.5％W/V、9.0％W/V、9.5％W/V、10.0％W/V。

维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例可以任意选自1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.15、1:1.2、1:1.25、1:1.3、1:1.35、1:1.4、1:1.45、1:1.5、1:1.55、1:1.6、1:1.65、1:1.7、1:1.75、1.8。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪用佐剂组合物中，维生素E、HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物的浓度范围分别为0.25％W/V-10.0％W/V；维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例为1:0.1-1:1.8，优选为1:1-1:1.75；或HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例为1:0.1-1:1.8，优选为1:1-1:1.75；丙烯酸聚合物浓度为0.4％-2％W/V。

丙烯酸聚合物浓度可以任意选自0.40％W/V、0.41％W/V、0.42％W/V、0.43％W/V、0.44％W/V、0.45％W/V、0.46％W/V、0.47％W/V、0.48％W/V、0.49％W/V、0.50％W/V、0.55％W/V、0.60％W/V、0.65％W/V、0.70％W/V、0.75％W/V、0.80％W/V、0.85％W/V、0.90％W/V、0.95％W/V、1.0％W/V、1.1％W/V、1.2％W/V、1.3％W/V、1.4％W/V、1.5％W/V、1.6％W/V、1.7％W/V、1.8％W/V、1.9％W/V、2.0％W/V。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪用佐剂组合物中，维生素E、HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物的浓度范围分别为1.0％W/V-10％W/V；维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例为1:1-1:1.8，优选为1:1-1:1.75；或HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例为1:1-1:1.8，优选为1:1-1:1.75。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪用佐剂组合物中，所述猪用佐剂组合物包括10％w/v维生素E、2％w/v的卡波姆934、维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1.2。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪用佐剂组合物中，所述猪用佐剂组合物包括6％w/v RyotoL195、2％w/v的卡波姆934、RyotoL195与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1.33。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪用佐剂组合物中，所述猪用佐剂组合物包括8％w/v维生素E、8％w/v RyotoL195、2％w/v的卡波姆934、维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1.75。

本发明还涉及所述佐剂组合物的制备方法：

a)丙烯酸聚合物在水中溶解制备成丙烯酸聚合物溶液，制备成丙烯酸水溶液A；

b)维生素E、聚氧乙烯氢化蓖麻油混合均匀，制备成B溶液；

c)将A溶液加入到B溶液中。

本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括抗原和所述佐剂组合物，所述的佐剂组合物的量为30％W/V-70％W/V。

术语“疫苗组合物”是可用于在接受者中诱发保护性免疫的组合物。因此，在受试者已接种抗原之后，疫苗可阻止、延缓或减轻暴露给相同或相关抗原的受试者的疾病发展严重程度(相对于未接种疫苗的受试者)。通过疫苗所提供的保护性免疫可以是体液(抗体介导)免疫或细胞免疫，或两者均能产生。

术语“抗原”是指当引入受试者中时，可由宿主的免疫系统识别并且能够诱发免疫反应和产生保护性免疫的药剂。抗原包括(不限于)在病原体的表面或受感染细胞的表面或肿瘤细胞的表面上天然表达的“表面抗原”。抗原可诱发保护性免疫的疾病病原体和/或病状的非限制性实例为猪圆环病毒、猪肺炎支原体、猪伪狂犬病毒、副猪嗜血杆菌、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪口蹄疫病毒、猪细小病毒、多杀巴斯德菌、猪链球菌、猪葡萄球菌、支气管炎博德特菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细环病毒、猪巨细胞病毒、脑心肌炎病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒。

在某些实施例中，抗原是猪圆环病毒。

在某些实施例中，抗原是猪肺炎支原体。

在某些实施例中，抗原是猪伪狂犬病毒。

本发明制备的灭活疫苗在注射中不会引起猪注射部位发炎红肿，且具有较好的稳定性，与疫苗联用可获得较好的免疫效力，可实现大规模生产使用。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述抗原选自猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体、猪伪狂犬病毒抗原、副猪嗜血杆菌、猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原、猪口蹄疫病毒抗原、猪细小病毒抗原、多杀巴斯德菌、猪链球菌、猪葡萄球菌、支气管炎博德特菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪呼吸道冠状病毒抗原、猪流行性腹泻病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪细环病毒抗原、猪巨细胞病毒抗原、脑心肌炎病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪瘟病毒抗原。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述抗原为猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、猪伪狂犬病毒抗原中的一种或多种。

在本发明的某些实施例中，疫苗组合物可包括一种或多种其它组分，诸如表面活性剂、缓冲剂和稳定化合物。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物进一步包括表面活性剂、缓冲剂和稳定化合物。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、制备卡波姆溶液

卡波姆934 1g加入到50ml水中，搅拌使其溶解，再加入1.5g氯化钠溶液，用氢氧化钠调PH至7.0。

实施例2、佐剂的制备

试验例1称取维生素E 5g、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40 6.0g、搅拌均匀，加入实施例1制备的卡波姆溶液50ml，制备佐剂A。

试验例2称取蔗糖酯(日本三菱RyotoL195)3g、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40 4.0g搅拌均匀，加入实施例1制备的卡波姆溶液50ml，制备佐剂B。

试验例3称取维生素E 4g、蔗糖酯(日本三菱RyotoL195)4g、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40 7.0g搅拌均匀，加入实施例1制备的卡波姆溶液50ml，制备佐剂C。

对比佐剂1

不完全弗氏佐剂。

对比佐剂2

按照专利CN107375922A制备的CP974S水性佐剂。

对比佐剂3

按照论文“不用水性及水包油型佐剂对猪支原体肺炎灭活疫苗的免疫增强作用”中制备的G2号水佐剂。

对比佐剂4

卡波姆934溶液，制备成2％浓度的水佐剂。

对比佐剂5

称取维生素E 5g，聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40 6.0g，搅拌均匀。

实施例3制备疫苗

实验例1圆环2型疫苗组合物的制备

在灭菌烧杯中按照0.1g/ml的比例加入实施例2制备的佐剂。按照专利CN103173470A制备PCV2蛋白病毒样颗粒抗原，含量为1.3mg/ml。将30μg/ml Cap蛋白用Cap蛋白稳定缓冲液稀释，按照专利CN104623653A的方法制备PCV2亚单位疫苗组合物。

实验例2猪支原体肺炎疫苗组合物的制备

选用猪肺炎支原体HN0613株作为抗原，按照专利CN104450559A实施例2的方法制备抗原液，将抗原液与实施例2制备的佐剂按照90：10(V/V)混合，然后将用pH为7.2的PBS液补充体积以300转/分钟搅拌30分钟即可。

实验例3伪狂犬疫苗组合物的制备

选用猪伪狂犬HN1201株抗原，与实施例2制备的佐剂按照54：46混合，在30℃下120转/分钟搅拌15分钟，按照专利CN104004774A实施4制备猪伪狂犬灭活苗。

实施例4本发明的佐剂制备疫苗组合物对猪圆环病毒的防治作用

本实施例测试了用8种佐剂制得的PCV2候选疫苗的效果，将50只初生不吃初乳的9-14日龄小猪随机分成相同大小的10组，每组5头。第1组颈部肌肉注射用实施例2中实验例1制得佐剂制备的PCV2亚单位疫苗1ml，第2组颈部肌肉注射用实施例2中实验例2制得佐剂制备的PCV2亚单位疫苗1ml，第3组颈部肌肉注射用实施例2中实验例3制得佐剂制备的PCV2亚单位疫苗1ml，第4组颈部肌肉注射用实施例2中对比例1制得佐剂制备的PCV2亚单位疫苗1ml，第5组颈部肌肉注射用实施例2中对比例2制得佐剂制备的PCV2亚单位疫苗1ml，第6组颈部肌肉注射用实施例2中对比例3制得佐剂制备的PCV2亚单位疫苗1ml，第7组颈部肌肉注射用实施例2中对比例4制得佐剂制备的PCV2亚单位疫苗1ml，第8组颈部肌肉注射用实施例2中对比例5制得佐剂制备的PCV2亚单位疫苗1ml，第9组不免疫，作为攻毒对照组，第10组不免疫、不攻毒，作为空白对照组。免疫前及免疫后7d、14d、21d、28d各采血，分离血清。免疫后25日，对所有猪只分别两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)，每个点接种1ml(4ml/头)。免疫后28日称重、攻毒，第1、2、3、4、5、6、7、8组各用PCV2SH株(含10^6.0TCID₅₀/ml)滴鼻2.5ml、肌肉注射2.5ml。攻毒后第4、7日，对所有猪再次分别两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)，每个点接种1ml(4ml/头)。攻毒后7、14、21、28日对所有猪只采血。攻毒后连续观察28日，每日测量体温及记录临床症状，于第28日称重，剖杀，观察病理变化并取新鲜组织(扁桃体、肺脏、肠系膜淋巴结、气管支气管淋巴结及腹股沟淋巴结)一份置-20℃保存，一份用10％福尔马林固定。对新鲜组织和福尔马林固定组织分别进行PCV2PCR检测(普通PCR及荧光定量PCR检测)和IHC检测，对采集的血清进行PCV2PCR检测(普通PCR及荧光定量PCR检测)和PCV2抗体检测(ELISA和IFA)。根据增重情况和PCV2抗原检测结果来评估保护效果。表1为本实施例的总体研究设计。

表1仔猪分组及处理

例2中对比例5制

结果

平均每日体重增量(ADWG)结果见表2。第10组作为不免疫、不攻毒阴性对照组其ADWG最高(1.07+0.20kg/日)，第1、2、3组其ADWG(1.05+0.22kg/日)与第10组没有明显差别，最低的是不免疫的第9组(0.48+0.30kg/日)，其余不同抗原含量疫苗免疫组ADWG较第10组有不同程度差异。由此可见，实施例2中实验例1、2、3组制备的佐剂与圆环2型亚单位疫苗配合使用，对于仔猪的ADWG免疫效果最优。

表2组间平均每日体重增量(ADWG)结果比较

PCV2抗体检测结果见表4。在免疫0日所有仔猪都是PCV2抗体阴性，免疫后14日、28日以及攻毒后14日和28日，第1组、第2组和第3组仔猪PCV2抗体效价最高，第10组仔猪PCV2抗体一直为阴性。

PCV2抗原检测结果见表3。攻毒前所有组别仔猪血清PCV2抗体检测均为阴性。攻毒后第14日，第10组PCV2抗原检测为阴性，第1组、第2组和第3组PCV2抗原检出量最低。组间PCV2临床症状及剖检症状比较见表5。

表3组间PCV2抗原检测结果比较(荧光PCR)

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表4组间PCV2抗体检测结果比较(ELISA)

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表5组间PCV2临床症状及剖检症状比较

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实施例5本发明的佐剂制备疫苗组合物对猪支原体肺炎的防治作用

本实施例测试了用实施例2制备的8种佐剂对猪支原体肺炎的防治效果。选14～21日龄仔猪45头，共9组，5头/组。免疫组8组，对照组不免疫，作为对照组。第1组颈部肌肉注射用实施例2中实验例1制得佐剂制备的猪支原体灭活疫苗2ml，第2组颈部肌肉注射用实施例2中实验例2制得佐剂制备的猪支原体灭活疫苗2ml，第3组颈部肌肉注射用实施例2中实验例3制得佐剂制备的猪支原体灭活疫苗2ml，第4组颈部肌肉注射用实施例2中对比例1制得佐剂制备的猪支原体灭活疫苗2ml，第5组颈部肌肉注射用实施例2中对比例2制得佐剂制备的猪支原体灭活疫苗2ml，第6组颈部肌肉注射用实施例2中对比例3制得佐剂制备的猪支原体肺炎灭活疫苗2ml，第7组颈部肌肉注射用实施例2中对比例4制得佐剂制备的猪支原体肺炎灭活疫苗2ml，第8组颈部肌肉注射用实施例2中对比例5制得佐剂制备的猪支原体灭活单位疫苗2ml，第9组不免疫，作为攻毒对照组，具体免疫实施方式见表6。

表6疫苗免疫分组

在免疫后70d，进行猪肺炎支原体进行攻毒试验，免疫组和对照组仔猪用CVCC354株(购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)气管注射5mL/头(100MID)，攻毒后观察30天，剖杀试验猪按根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析。

各试验组仔猪均在攻毒前称重，观察结束时称重，计算攻毒后至观察结束时的平均日增重。

猪肺炎支原体攻毒后肺病变指数结果见表7。结果表明，疫苗1、2、3、4、5、6、7、8组免疫仔猪平均肺病变指数分别为2.92、2.99、2.67、3.83、5.86、6.43、7.37、7.99，本发明的水佐剂与猪支原体肺炎疫苗联用免疫效果好，优于不完全弗氏佐剂。

攻毒保护情况见表8，疫苗1、2、3组免疫组仔猪攻毒后免疫保护效果达5/5，同油佐剂制备的4组疫苗免疫效果相当，增重略优于免疫4组。疫苗5、6免疫组仔猪攻毒后免疫保护效果分别为4/5、4/5，疫苗7、8组免疫组仔猪攻毒后免疫效果为3/5、3/5。

以上结果表明，由本发明制备的水佐剂制备的HN0613株猪肺炎支原体具有良好的免疫原性。

表7猪肺炎支原体攻毒各试验组猪肺损伤得分情况

表8猪肺炎支原体攻毒保护情况

实施例6本发明的佐剂制备疫苗组合物对猪伪狂犬病的防治作用

本实施例测试了用实施例2制备的8种佐剂对猪伪狂犬病的防治效果。将21日龄PRV抗体阴性仔猪45头随机分成9组，5头/组，按照表9注射实施例2制备的疫苗，免疫猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗2ml/头。对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株2×10^8.0TCID₅₀/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况(结果见表9)。

表9免疫原性试验动物分组

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疫苗免疫后，每周参照GB/T18641-2002方法血清中和试验的方法测定灭活疫苗组的中和抗体效价，结果见表10。

表10猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后不同时间的抗体情况

免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株2×10^8.0TCID₅₀/头，观察临床症状和死亡情况见表11。

表11猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗免疫仔猪后的攻毒情况

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表11的结果显示，猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗免疫仔猪后，虽然不能阻断病毒感染(出现临床症状)，但能为仔猪提供100％(5/4)保护，而对照仔猪攻毒后4日后全部死亡，显示出很好的免疫保护，免疫效果优于疫苗5、6、7、8组。

实施例7、本发明制备的佐剂稳定性评价

将实施例2制备的实验例1、实验例2、实验例3及对比佐剂2、对比佐剂3、对比佐剂4、对比佐剂5分别用蒸馏水溶胀，在4℃和37℃下分别观察30天、60天，观察其黏度。结果如表12所示。

表12

备注：由“-”至“++++”随着“+”增多，黏度依次递增。

结果表明，实施例2中实验例1、2、3制备的佐剂经蒸馏水溶胀后，在4℃和37℃下放置60天，黏度未发生变化，具有较好的稳定性，优于实施例制备的对比例佐剂。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括抗原和佐剂组合物，所述的佐剂组合物的量为30％W/V-70％W/V；

所述抗原选自猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、猪伪狂犬病毒抗原中的一种或几种；

所述佐剂组合物为维生素E和/或日本三菱Ryoto蔗糖酯L195、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40以及卡波姆934，溶剂为水；

其中，维生素E和/或日本三菱Ryoto蔗糖酯L195的含量为0.25％W/V-10.0％W/V，维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:0.1-1:1.8，日本三菱Ryoto蔗糖酯L195与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:0.1-1:1.8，卡波姆934的含量为0.4％-2％W/V。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，维生素E和/或日本三菱Ryoto蔗糖酯L195的含量为1.0％W/V-5％W/V；维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1-1:1.75，日本三菱Ryoto蔗糖酯L195与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1-1:1.75。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂组合物为10％w/v维生素E、2％w/v的卡波姆934、以及维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1.2；或

所述佐剂组合物为6％w/v日本三菱Ryoto蔗糖酯L195、2％w/v的卡波姆934、以及日本三菱Ryoto蔗糖酯L195与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1.33；或

所述佐剂组合物为8％w/v维生素E、8％w/v日本三菱Ryoto蔗糖酯L195、2％w/v的卡波姆934、以及维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1.75。

4.根据权利要求1-3任一项所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物进一步包括表面活性剂、缓冲剂和稳定化合物。